Summary
Представленные здесь протокол описывает платформу для выявления мелких молекул для лечения заболеваний печени. Пошаговое описание представлены подробно как различать iPSCs в клетки с характеристиками гепатоцитов в 96-луночных пластин и использовать клетки для экрана для малых молекул с потенциальной терапевтической активностью.
Abstract
Способности различать человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) в гепатоцито как клетки (кг) обеспечивает новые возможности для изучения врожденных печеночный метаболизм. Однако чтобы обеспечить платформу, которая поддерживает определение малых молекул, которые потенциально могут быть использованы для лечения заболеваний печени, процедура требует культуры формат, который совместим с экранирующей тысячи соединений. Здесь мы описываем протокол, с помощью полностью определенной культуры условий, которые позволяют воспроизводимые дифференциация человеческого iPSCs гепатоцито как клетки в культуре ткани 96-луночных пластины. Мы также предоставляем пример использования платформы для экрана соединений для их способности снижать аполипопротеина B (АПОВ) производится из iPSC производные гепатоцитов, созданный из семейной гиперхолестеринемией пациента. Наличие платформы, который совместим с лекарственных препаратов должно позволить исследователи для выявления роман терапии для лечения заболеваний, которые влияют на печень.
Introduction
Успех в выявлении наркотиков, которые могут использоваться для целевой редкое заболевание опирается на развитие анализов, которые могут использоваться для проверки. Гипотеза или целевое экраны (обратный фармакологии) полезны, но требуют детального понимания молекулярные основы этой болезни. Фенотипические экраны (классической фармакологии) избежать необходимости детального понимания биохимические пути, но вместо этого полагаться на разработку моделей, которые точно отражают Патофизиология болезни. Несмотря на энтузиазм для целевых подходов анализ утвержденных FDA первого в класс наркотиков показывают, что Фенотипическая экраны были гораздо более успешным1. Общая цель этого метода заключается, чтобы создать платформу для высокой пропускной способности, скрининг, может использоваться для идентификации малых молекул для лечения метаболических заболеваний печени. Включая первичной гепатоцитов и клетки гепатомы печени прогениторных клеток2были описаны несколько моделей в пробирке . Однако большинство из этих моделей имеют ограничения, и существует потребность в новых моделей, которые можно точно охарактеризовать патофизиологии метаболизма печени недостатков в культуре. Недавно, человеческих плюрипотентных стволовых клеток в сочетании с Джин редактирования предложили возможность моделировать даже самые редкие из редких заболеваний в культуре без необходимости доступа пациентов непосредственно3. Хотя использование конкретного пациента iPSCs как инструмент для обнаружения малых молекул для лечения редких заболеваний печени является концептуально обоснованными, есть лишь несколько докладов, демонстрирующих возможности этот подход4. Однако мы недавно создали платформу, которая позволяет успешно идентифицировать наркотиков, которые можно многократно использовать для лечения недостатков в печени метаболизм5iPSC производные гепатоцитов.
Этот протокол объясняет процесс дифференциации человека iPSCs гепатоцито подобных клеток в 96-луночных пластин и их использование для экран Библиотека малых молекул. Он также описывает анализа конечной точки с помощью гиперхолестеринемии в качестве примера метаболических заболеваний печени. Этот подход должен быть полезным для изучения роли и применения малых молекул в контексте инфекционных заболеваний печени, метаболические заболевания печени, лекарственной токсичности и других расстройств печени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Культура человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток
-
Покрытие рекомбинантного человеческого E-Кадгерины ФК синтез белка (E-cad ФК) или других матриц для hPSC культуры 6
- Разбавляют E-cad ФК 15 мкг/мл физиологическим Phosphate-Buffered Дульбекко содержащие кальция и магния (DPBS (+)).
- Слой 100-мм подвеска культуры ткани блюда с 5 мл разбавленной E-cad-ФК и Инкубируйте на 37 градусов для по крайней мере 1 h. удалить субстрат и заменить с 5 мл средства (например, mTeSR1, отныне называется M-средний)7.
Примечание: Опубликованные протоколы7готовится питательной среды, используемые в настоящем Протоколе. Однако несколько других препаратов СМИ были описаны, доступны или коммерчески, вероятно, совместимы с процедурой. - Получить флакон криоконсервированных iPSCs из жидкого азота. Оттепель в 37 градусов до тех пор, пока остается небольшой ледяной кристалл. Аккуратно Пипетка клетки в стерильных 15 мл конические трубка, содержащая 4 мл М-среды.
- Центрифуга на 300 x g 5 минут удалить супернатант и нежно вновь приостановить клетки с 5 мл среды, дополнена 10 мкм Y-27632, селективный ингибитор Ро связанных, биспиральных содержащих протеин киназы (рок).
- Удалите средство М из шага 1.1.2 и передачи 5 мл клеток из шага 1.1.4 E-cad-Fc покрытием 100-мм подвеска культуры ткани блюда.
-
Сохранение человеческой iPSCs в культуре
- После iPSCs достигает около 80% confluency, удалите питательной среды раз промойте кальция и магния DPBS (-). Аспирационная DPBS (-) и добавьте достаточное количество 0,02% раствора ЭДТА накладки, то инкубации до 3 мин при комнатной температуре.
Примечание: При впадении в 80% плита должна содержать около 2 x 107 клеток. Важно не зарастают клетки и гарантировать, что клетки сохраняют недифференцированные морфологии. Плюрипотентности клетки можно определить путем пятнать с стволовых клеток маркер Tra-1-60 или эквивалентный8. - Как только клетки начинают выпуск, удалить раствор 0,02% ЭДТА и наводнений блюдо с 10 мл М-среды выпустить клетки. Помощь отряд iPSCs, нежно закупорить.
Примечание: Средняя инкубации время для клеток для отсоединения около 3 минут, но это необходимо определить эмпирически для каждой линии iPSC. Клетки должны быть освобождены как небольших кластеров, содержащих около 5-10 iPSCs на кластер. - Передача 1/10 подвесных клеток за свежие культуры ткани блюдо подвеска E-cad ФК покрытием 100 мм, содержащие 5 мл М-средний. Инкубировать культур при 37 ° c под 4% O2/5% CO2 и изменения среды ежедневно.
Примечание: Хотя iPSCs регулярно культивировали в условиях физиологического кислорода для содействия плюрипотентности, iPSCs можно также выращивать с помощью атмосферного кислорода.
- После iPSCs достигает около 80% confluency, удалите питательной среды раз промойте кальция и магния DPBS (-). Аспирационная DPBS (-) и добавьте достаточное количество 0,02% раствора ЭДТА накладки, то инкубации до 3 мин при комнатной температуре.
2. дифференциация человеческого iPSCs гепатоцито подобных клеток на 96-луночных пластины
Примечание: Этот раздел описывает дифференциация iPSCs в формате, который совместим с скрининга. Используя этот подход, можно вызвать человека iPSCs дифференцировать и формируют гепатоцито подобных клеток в течение 20 дней. Хотя это подходит для большинства анализов, длина культуры может продлеваться по улучшению зрелости клеток.
-
Покрытие плиты 96-луночных тканевой культуры с уменьшение фактора роста базальной мембраны матрица
- Подготовьте запас путем разбавления матрицы до 2 мг/мл с ледяной стерильные среде DMEM/F12 культуры ткани. Разделите матрицы на 250 мкл аликвоты и хранить в-80 градусов до тех пор, пока требуется. Холод 10 мл DMEM/F12 на льду на 30 мин получить 250 мкл Алиготе акций матрица 2 мг/мл и оттепели на льду.
- Объединить матрица с 10 мл холодной среде DMEM/F12 путем смешивания аккуратно с помощью предварительно охлажденные пипетки сделать окончательный концентрации 0,05 мг/мл.
- Передачи 100 мкл разбавленного матрицы для каждой скважины плиту 96-луночных культуры ткани. Инкубируйте на 37 градусов, 4% O2/5% CO2 для по крайней мере 1 h. отменить матрицы и заменить 50 мкл M-средний за хорошо. Хранить при 37 ° C, 4% O2/5% CO2 до тех пор, пока требуется.
-
Плита клетки для дифференциации
- Культура iPSCs на 100-мм пластины до тех пор, пока клетки подход 80% слияния. Убедитесь, что пластины содержит около 2 x 107 клеток. Определите число клеток клеток проточный цитометр или Горяева.
Примечание: С опытом работы качество iPSCs клетки можно судить по микроскопии; Однако около 98% клеток выразить плюрипотентности маркеры например TRA-1-60 epitope когда измеряется СУИМ или иммуноокрашивания. Важно, что клетки остаются активного деления и не зарастает. - Урожай iPSCs от каждого 100-мм пластины, аспирационная питательной среды и промыть с 5 мл DPBS (-). Заменить полоскание с 3 мл раствора отряд клеток (например, accutase) и проинкубируйте около 2 минут при 37 ° C, 4% O2/5% CO2.
Примечание: Важно следовать за отрядом клеток при микроскопии. Сделать не на дайджест с accutase. Цель – освобождение клетки как небольших кластеров с минимальной обработкой. - Как только клетки начинают отсоединить, урожай, добавляя 7 мл М-среды. Пипетка несколько раз, чтобы отделить колоний клеток в небольших кластеров вокруг 3-6 клеток (рис. 1A).
- Соберите iPSCs в стерильных пластиковых 15 мл пробирок и центрифуги на 300 x g 5 минут удалить супернатант и вновь приостановить Пелле клеток в 5 мл М-средний.
- Равномерно распределить клетки на 96-луночных матрица покрытием пластин, дозирования 50 мкл подвеска клеток в каждой скважине. Чтобы настроить каждый 96-луночных пластины, используйте один из 100-мм пластины iPSCs с клетки на приблизительно 80% confluency, который содержит около 5 х 106 клеток для установки дифференциации. Используйте многоканальные пипетки ускорить этот процесс. Культура клетки на ночь на 37 градусов, 4% O2/5% CO2.
Примечание: Важно, что равное количество клеток осаждается в каждой скважине обеспечить воспроизводимость дифференцирования.
- Культура iPSCs на 100-мм пластины до тех пор, пока клетки подход 80% слияния. Убедитесь, что пластины содержит около 2 x 107 клеток. Определите число клеток клеток проточный цитометр или Горяева.
-
Побудить дифференцировки клеток
- Изучите 96-луночных пластины по микроскопии для обеспечения что клетки охватывать по меньшей мере 70% поверхности каждого человека хорошо. Если охват составляет менее 70%, замените свежим среднего среднего и проинкубируйте дополнительные 24 ч при 37 ° c, 4% O2/5% CO2.
Примечание: Инкубации клеток в течение более чем 48 часов после покрытия не вызывая дифференциация обычно снижает эффективность дифференциации. Дифференциация также произойдет с помощью атмосферного кислорода, хотя эффективность может быть пострадавших. - День 1, день 2 дифференциации, замените питательной среды RPMI дополнена 2% B27 (без инсулина), 100 нг/мл Activin A, BMP4 10 нг/мл и 20 нг/мл FGF2. Добавьте 100 мкл среды в колодец и Инкубируйте на 37 градусов, окружающего O2/5% CO2 с ежедневно среднего изменения за 2 суток.
Примечание: Борьбы с большим количеством пластин 96-луночных требуют использования помощи пипетки или робот. 12- и 96-канальные пипетки идеально подходят для ежедневного среднего изменения. - На 3 день к день 5 дифференцировки заменить питательной среды с RPMI дополнена 2% B27 (без инсулина) и 100 нг/мл Activin а. культуры клеток в 37 градусов, окружающего O2/5% CO2 с ежедневно среднего изменения за 3 суток.
- В день 5, дифференциация перед заменой свежей питательной среды, лечить каждый также с 100 мкл 0,02% раствора ЭДТА для 30 сек, затем удалить и заменить с свежей питательной среды.
Примечание: Если дифференциация чтобы эндодермы является эффективным, однослойная дифференциации клеток подвержен пилинг от пластины. Краткое обращение с 0,02% раствора ЭДТА помогает облегчить мобильный отряд. Это лечение не влияет на дифференциации в гепатоцитах. - Для дифференциации между 6 дней 10 замените питательной среды с RPMI / 2% B27 (с инсулином) дополнены 20 нг/мл BMP4 и 10 нг/мл FGF2 и Инкубируйте на 37 градусов, 4% O2/5% CO2 на 5 дней с ежедневной среднего изменения. Этот этап стимулирует клетки дифференцироваться в клетки печени прародителя.
- Для дифференциации между 11 дней до 15 замените питательной среды с RPMI / 2% B27 (с инсулином) дополнены HGF 20 нг/мл. Инкубируйте на 37 градусов, 4% O2/5% CO2 на 5 дней с ежедневной среднего изменения.
- Для дифференциации между 16 дней до 20 замените гепатоцитов клеток питательной среды (HCM) дополнены 20 нг/мл Oncostatin-M (OSM) питательной среды. Инкубируйте клетки на 37 градусов, окружающего O2/5% CO2 с ежедневно среднего изменения на 5 дней.
Примечание: Воспроизводимость дифференциации между отдельными скважин эффективно может определяться посредством измерения относительного уровня альбумина, AFP или АПОВ, выделяемый ELISA в среду (см. 3.2).
- Изучите 96-луночных пластины по микроскопии для обеспечения что клетки охватывать по меньшей мере 70% поверхности каждого человека хорошо. Если охват составляет менее 70%, замените свежим среднего среднего и проинкубируйте дополнительные 24 ч при 37 ° c, 4% O2/5% CO2.
3. малые молекулы скрининг
Примечание: Ниже описывается процедура, используемая для выявления соединений, которые могут использоваться для снижения уровня АПОВ в среде гепатоцито как клетки, полученные из семейной гиперхолестеринемией iPSCs. Описание модели и ее использование в определении снижения холестерина наркотики подробно ранее5,9. В текущем примере были проверены 1000 соединений из библиотеки коллекции соединения Южная Каролина (SC3). Каждое соединение был испытан в концентрации 2 мкг/мл.
-
Лечение iPSC - производных гепатоцитов с малых молекул
- Разбавьте мастер соединения библиотека для создания пластины рабочих запасов с соединениями в концентрации 20 мкг/мл в 2% ДМСО и хранить на уровне-20 ° c.
- Подготовьте достаточно 96-луночных пластины iPSC производные гепатоцитов, чтобы позволить каждого соединения для проверки.
Примечание: Количество соединений для проверяться будут диктовать количество 96-луночных пластин, которые требуются. В общем сингл также должны быть готовы для каждого соединения, а также дополнительных скважин для любых элементов управления. Внешний скважин пластины обычно избежать уменьшить возможность краевых эффектов, которые могут повредить интерпретации. Ответы могут быть определены с помощью метода z скор без необходимости использовать реплицирует. Если репликация включена, это более целесообразно использовать t-тест. - В связи с завершением дифференциации (день 20, см. 2.3.7), заменить питательной среды с 100 мкл свежих HCMдополнены 20 нг/мл Oncostatin-м. Инкубируйте на 37 градусов, 4% O2/5% CO2 для точно 24 h. получить питательной среды в свежий 96-луночных пластины и хранить на уровне-20 ° c. Используйте этот пример для вычисления уровня АПОВ в среде перед добавлением наркотиков.
- Добавление 90 мкл свежих HCM, дополнены 20 нг/мл Oncostatin-м в каждую лунку. Добавьте 10 мкл каждого соединения из рабочей партии после смешивания, закупорить. Добавить ДМСО на 0,2% до контроля скважин матч конечная концентрация в обработанных образцов и Инкубируйте на 37 градусов, окружающего O2/5% CO2 для точно 24 h. собирать питательной среды и хранить на уровне-20 ° c. Используйте этот пример для определения уровня АПОВ после лечения с соединениями.
- Дополнительно - остальные ячейки могут быть обработаны иммуноокрашивания, жизнеспособность клеток или анализ уровня мРНК, с использованием стандартных подходов.
Примечание: Этот экран был разработан для выявления наркотиков, которые имели быстрое воздействие на уровни АПОВ. Однако в зависимости от модели болезни, вниз по течению анализов или механизм действия препарата, он может быть полезным для лечения образца для нескольких дней.
-
Определить уровни АПОВ, Элиза
- Определения аполипопротеина B (АПОВ) концентрации от обоих пред- и пост наркотиков обработанных образцов с использованием человеческого развития АПОВ ELISA комплекта следующие протоколы производителя.
-
Подготовка следующие решения
- Мыть буфера, состоящий из 0,05% 20 анимации в PBS, рН 7,4. Хранить при 4 ° c до использования.
- Инкубационный буфер, составленные из 0,05% 20 анимации и 0,1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в PBS, рН 7,4. Хранить при 4 ° c до использования.
- Подготовка антител АПОВ (МАБ 20/17) путем разбавления до 2 мкг/мл в PBS, рН 7,4. Добавьте 100 мкл разбавленного антитела на хорошо и Инкубируйте на 4 ° c на ночь.
- Удалите антитела от пластины пробирного и мыть каждый хорошо дважды с 200 мкл PBS, рН 7,4.
- Добавить 200 мкл/хорошо 0,05% Tween-20, 0.1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в PBS, рН 7,4 и инкубировать на тряску платформе за 1 ч при комнатной температуре.
- Подготовка 8-точка калибровочной кривой с помощью 0,05% 20 анимации и 0,1% BSA в PBS, рН 7,4 с следующих концентраций АПОВ: 300 нг/мл, 200 нг/мл, 175 нг/мл, 150 нг/мл, 125 нг/мл, 100 нг/мл, 75 нг/мл и 50 нг/мл.
- Разбавляют тестирования образцы 1:4 с 0,05% 20 анимации и 0,1% BSA в PBS, рН 7,4.
- После 1 h блокировки с буфером инкубации, сбросить буфер и мыть пробирного пластины пять раз с 200 мкл 0,05% 20 анимации в PBS, рН 7,4.
- Полностью удалить любые остаточные Отмывающий буфер и передаче 90 мкл разбавленного образцов и стандартов АПОВ пробирного пластины. Инкубации при комнатной температуре на шейкер для 1 h.
- Удалить образец и мыть с 200 мкл 0,05% 20 анимации в PBS, рН 7,4 в колодец. Повторите стирок в общей сложности 5 раз. Добавьте 100 мкл на хорошо МАБ ЛПНП 11-биотин разбавленных 1:1,000 0,05% 20 анимации и 0,1% BSA в PBS, рН 7,4. Инкубации при комнатной температуре на тряску платформу для 1 h.
- Отменить реагент и мыть с 200 мкл на хорошо Отмывающий буфер 5 раз. Добавить 100 мкл на хорошо антитела стрептавидина-ПХ (1:1, 000 разрежения с помощью инкубации буфера), затем инкубации при комнатной температуре на тряску платформу для 1 h.
- Отменить реагент и мыть с 200 мкл 0,05% 20 анимации в PBS, рН 7,4 в колодец. Повторите стирок в общей сложности 5 раз. Полностью удалить остаточные Отмывающий буфер из плит пробирного и добавить 100 мкл на хорошо Tetramethylbenzidin (ТМБ) раствора субстрата и инкубации при комнатной температуре за 8 мин.
- Без удаления субстрата ТМБ, напрямую добавьте 100 мкл на хорошо стоп раствора (1N HCl).
- Определить поглощения в 450 Нм, с помощью пластины читателя.
- С помощью метода четыре параметра логистической регрессии, а затем используется для определения концентрации АПОВ в каждом образце10может устанавливаться калибровочной кривой.
- Изучить до наркотиков: после наркотиков соотношение АПОВ в каждом примере для определения соединений с потенциалом для снижения АПОВ уровнях в среде.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Поколение гепатоцитов - как клетки: Рисунок 1 описывает сроки изменения, которые происходят во время дифференциация человеческого iPSCs гепатоцито подобных клеток. Культура iPSCs на E-Cad-ФК обеспечивает примерно 2 мм диаметр колоний, которые выражают плюрипотентных маркер OCT4 (рис. 1A-B). Морфология клеток, выращенных на E-Кадгерины матрица будет немного отличаться тем, культивируемых на других поверхностях. Они, как правило, имеют плоский морфология с большей площадью цитоплазматических поверхности (рис. 1A). Хотя человеческих плюрипотентных стволовых клеток может эффективно культивированный на целый ряд различных матриц11, культура iPSCs на E-Кадгерины матрица считается для повышения однородности населения плюрипотентных клеток и позволяет фермента бесплатно Манипуляция клеток во время прохождения12. Однако несколько альтернативных матриц, включая матрицы базальной мембраны, laminins, vitronectin и мышь эмбриональных фибробластов (MEF), также могут использоваться для поддержания человеческого iPSCs, и все должны быть совместимы с описанной процедуре13. Во всех случаях плюрипотентности клетки могут быть подтверждены Tra-1-60 или эквивалентный8.
Чтобы инициировать дифференциации, iPSCs должны быть собраны как небольших кластеров (рис. 1A). В начале дифференциации, хромированный клетки должны охватывать примерно 80% из поверхности пластины. После 5 дней лечения с факторами роста, клетки Экспресс белки, которые характерно выраженное в окончательное энтодермы, таких как SOX17 и FOXA2 (рис. 1B). На этом этапе свыше 90% клеток обычно выразить эти маркеры. После 5 дней дифференциации эндодермы преобразует в печени судьбы, и в дополнение к FOXA2, клетки выразить HNF4a, которые могут быть определены на протяжении оставшейся части процесса дифференцировки (рис. 1B). Как клетки принять печеночная судьбы, они должны покрывать поверхности пластины как монослоя. После добавления HGF клетки начинают выражать белки, которые находятся в фетальных гепатоцитов, включая AFP (рис. 1B). Липидного капель можно наблюдать в цитоплазме клеток. В связи с завершением дифференциации клетки принять шестигранника морфология с ядром, содержащие известные ядрышек и большой цитоплазмой с несколькими каплями липидов. Подмножество гепатоцито подобных клеток будет несколько ядерных. Большинство клеток выразить обширный репертуар гепатоцитов белков, включая альбумин (рис. 1B)14.
Эффективной высокая пропускная способность экрана с помощью гиперхолестеринемии как болезнь модель: Гиперхолестеринемия отражает чрезмерной концентрации липопротеидов низкой плотности-холестерина (LDL-C) в сыворотке крови. В семейной гиперхолестеринемией (FH) повышенный уровень сыворотки LDL-C объясняется главным образом мутации в рецептор липопротеинов низкой плотности (LDLR), которая опосредует поглощение LDL-C для разминирования, гепатоциты. Ранее мы описали поколения iPSCs от пациента с гомозиготной семейной гиперхолестеринемией и их использование при формировании гепатоцитов, которые отражали пациента заболевания печени в культуре9. Было продемонстрировано, что эти клетки могут использоваться успешно, как платформа для обнаружения наркотиков. Когда библиотека ~ 2500 наркотиков был показан, было установлено, что неожиданные возможность снижения LDL-C в iPSC производные гепатоцитов, основного человеческого гепатоцитов и мышей с гуманизированные печень сердечными гликозидами. Кроме того после следственный медицинских записей пациента, мы нашли что холестерин, упал уровень у пациентов, которые были предписаны сердечный гликозид для лечения сердечных заболеваний. Эти исследования подтвердили, что iPSC производные гепатоцитов могут успешно использоваться в экраны для идентификации терапии.
Для того, чтобы обеспечить платформу, которая совместима с скрининга, важно, что дифференцирования воспроизводимость и что для скважины вариации сводится к минимуму. Рисунок 2 показывает результаты иммуноокрашивания на каждой скважине 96-луночных пластины для обнаружения HNF4a и альбумина в день 20 дифференциации. Как видно на рисунке, распределение этих белков гепатоцитов похож на всех скважинах.
Центральный белковый компонент LDL-C-АПОВ. Здесь мы использовали iPSCs экран для АПОВ, снижение соединений предоставить пример использования iPSC производные гепатоцитов для малых молекул, скрининг (рис. 3A). АПОВ может быть легко измерено в растворе ELISA. Так как ELISA может выполняться на большое количество образцов, она может использоваться как основа для экрана. Пригодности любого assay для высокой пропускной способности скрининг лучше всего определяется с помощью измерения под названием Z-фактор (или Z')15. Этот статистический параметр вычисляет эффективности assay различать положительных и отрицательных контрольных образцов. Assay с Z-фактор > 0.5 считается совместимым с экраном15. Как видно на рисунке 3B, Z' АПОВ пробирного = 0,73, который подтверждает пригодность использования платформы для обнаружения наркотиков.
Определение соединений, которые способны снизить уровни АПОВ в среде культуры iPSC - производные гепатоцитов: чтобы определить, является ли платформа может использоваться для выявления новых соединений, которые влияют на уровни АПОВ, мы экранированный 1000 малых молекул из коллекции соединения Южная Каролина (SC3) представитель набор Lite (RSL). РГБ был создан центр Южная Каролина MUSC для терапевтических обнаружения и включает в себя соединений, которые структурно разнообразны и отражают родительская библиотека.
После наркотиками: предварительно наркотиков соотношение АПОВ был определен для каждого соединения (рис. 3 c) и идентификации хитов было достигнуто на z скор анализ (рис. 3D)16. В этом случае малые молекулы, которые сократили АПОВ с z скор ≤-2.0 как потенциальных хитов были рассмотрены. При отборе 1000 малых молекул, количество потенциальных хитов с z скор ≤-2.0 обычно относительно управляемой. Однако, при проведении большего экрана, мы будет опираться на более консервативных Оценка ≤-3.0, основанные на правиле 3-Сигма, чтобы увеличить уверенность в потенциальных целей. В этом примере мы определили 24 потенциальных хитов с соотношение АПОВ, который варьируется от 0,86 до 0,44 (рис. 4A). Вторичные пробирного была выполнена на quadruplicate образцах (n = 4 биологические реплицирует) исключить соединений, которые оказывают негативное воздействие на жизнеспособность клеток и определить, какие соединения можно воспроизвести может снизить АПОВ в среде. Оригинальные 24 кандидата соединений, четыре были найдены быть воспроизводимость (p ≤0.05) (рис. 4B-C). После дальнейшего изучения, были найдены 2 этих соединений к отрицательно влияет на жизнеспособность клеток, предполагая, что наблюдаемое сокращение АПОВ, скорее всего является следствием потери клеток. Оставшиеся два соединения будет считаться хорошими кандидатами для последующих исследований.
Рисунок 1 : Пошагово печеночная дифференциация человеческого iPSCs. (A) Морфология iPSC колоний непосредственно перед урожая (левая панель) и iPSCs после сбора клеток для дифференциации (правая панель) - после accutase лечения, клетки должны быть отделены в 3-6 клеток/кластер. Шкалы бар = 50 µm. (B) таблицы показаны культуры условий на каждом этапе дифференциации (верхний). Иммуноокрашивания (нижняя панели) была выполнена для выявления маркер выражения на каждой стадии дифференцировки. Панели показывают OCT4 и DAPI окрашенных ядер в iPSCs, SOX17 и FOXA2 в окончательное энтодермы, HNF4a и FOXA2 в клетках печени прародителя, HNF4a и АФП в незрелых гепатоцито подобных клеток, и HNF4a и альбумина в относительно зрелые гепатоцито подобных клеток. Масштаб баров = 100 мкм (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Однородных печеночная дифференциация человека iPSCs в 96-луночных пластин. Иммуноокрашивания была выполнена на каждый отдельным хорошо 96-луночных пластины, содержащие производные iPSC гепатоцитов в день 20 дифференциация для обнаружения (A) альбумина и ()B) HNF4a. Шкалы бар = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Малые молекулы скрининг с использованием человеческого iPSC производные гепатоцитов. (A) Схематичный обзор подход, используемый для идентификации соединений, которые могут уменьшить уровни ABOB в среде iPSC производные гепатоцитов. (B) графа показ результатов анализа ELISA для определения уровня АПОВ в средне-87 скважин (n = 87) iPSC производные гепатоцитов (синий) и/или недифференцированные iPSCs (оранжевый). Эти данные были использованы для расчета фактора Z (Z' = 0,73). (C) график, показывающий после наркотиков: предварительно наркотиков соотношения концентрации АПОВ в среде культуры iPSC производные гепатоцитов лечение за 24 часа 998 соединениями из набора RSL3 SC. (D) график, показывающий z десятки данные, представленные в (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Проверка первичных хитов. (A) таблица соединений, выявленных в основном экране как возможность уменьшить АПОВ. (B, C) Бар графики, показывающие влияние соединений на пост наркотиков: коэффициент концентрации АПОВ до препарата ()B) и жизнеспособность клеток (C) в гепатоцитах iPSC производные относились с соединениями в последующий анализ. Планки погрешностей отражают ± SEM (n = 4 биологические реплицирует); * p ≤0.05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Целевой основе лекарств, где выявлены небольшие молекулы которые влияют на активность определенного белка, был в центре внимания многих существующих скрининг усилия. Хотя этот подход предоставил многочисленные Фармацевтика, экраны, основанные на натяжном фенотип, классической фармакологии, были более успешными в выявлении первого в класс соединений, которые были клинически эффективным1. Недостаток фенотипические лекарств является, что она зависит от наличия соответствующей болезни моделей. Это может быть проблемой, когда ячейки модели болезни недоступны, или когда общих видов животных исследования не резюмировать клинических симптомов. Однако способность генерировать iPSCs от пациента соматические клетки предоставила новые возможности для модели болезни человека в культуре3. Для некоторых заболеваний, таких как редкие генетические заболевания пациенты могут быть несколько, и трудно получить доступ и согласия. Однако с появлением генома инженерии, это относительно простой способ ввести причинный мутации в iPSC генома, что позволяет моделировать даже самые редкие из редких заболеваний.
После того как iPSCs в руке, это необходимо для получения соответствующей ячейки типа, в котором проявляются симптомы болезни. К примеру заболеваний нервной функция может потребовать поколения нейронов и глии17, тогда как те, которые затрагивают печени может потребоваться гепатоцитов9,18 или желчных эпителиальных клеток для изучения19, 20 , 21. это требование вводит ряд предостережений при рассмотрении использования iPSCs для обнаружения наркотиков. Во-первых важно понять сотовой основу этой болезни. Это может быть сложной, особенно когда клетки принять характеристики на основе местоположения или окружающей среды. Это может быть верно для гепатоцитов, которые имеют различия в профилях выражение гена и ферментативные функции, которые зависят от их расположения в печени дольки. Во-вторых, работа с любой клетки в изоляции может предотвратить исследование заболеваний, которые отражают нарушения структуры ткани как цирроз печени, связи ячеек, такие как нервно-мышечные заболевания или те, которые находятся под влиянием воспаления таких как воспалительные заболевания кишечника.
Для изучения болезни печени, несколько исследовательских групп описал протоколы для создания гепатоцито подобных клеток от iPSCs13,,2223,24,25. Хотя большинство из этих протоколов являются эффективным, ограничение техника является, что клетки не полностью охарактеризовать функции свежие гепатоцитов. Это означает, что важно определить ли клетки от iPSCs отображения функций, необходимых для оценки влияния данной мутации. Среди генов, экспрессия которых не соответствует полностью в свежих гепатоцитов являются те кодирования CYP450 белки25,26. Некоторые из этих белков у роли метаболизма препарата и ксенобиотиков ответа. Это имеет важное значение при рассмотрении Дизайн экрана, потому что многие препараты требуют поколение активных метаболитов, и это могут быть затронуты в iPSC производные гепатоцитов. Усилия по улучшению качества гепатоцитов в настоящее время активно осуществляться27. Несмотря на предостережения несколько исследований показали, что iPSCs, полученных от пациентов с врожденным ошибки в печеночный метаболизм может использоваться успешно для создания ячеек гепатоцито как зеркало Патофизиология болезни в культуры9 , 18 , 28 , 29.
Для экранов, чтобы быть успешным это важно для обеспечения однородной дифференциация гепатоцитов из iPSCs. Когда дифференцирования в 96-луночных пластины не дают высокое качество гепатоцитов, это чаще всего из-за низкого качества родительских iPSCs или культуры iPSCs югу оптимальных условиях. Плюрипотентности iPSCs тщательно должна поддерживаться культуры в среде высокого качества с ежедневных изменений, как описано в протоколе 1.2. Плотность плюрипотентных клеток в культуре блюдо должно контролироваться тщательно, потому что если клетки становятся более притока они, как правило, теряют плюрипотентность и спонтанно дифференцировать. Мы также считаем, что культивирование клеток в концентрации физиологического кислорода способствует плюрипотентности и выгодно некоторых стадиях дифференцировки. Однако если соответствующее оборудование не доступен, он все еще можно использовать атмосферного кислорода как культура плюрипотентных клеток и побудить дифференциации. Мы рекомендуем регулярно определение плюрипотентности фондовых iPSCs путем измерения выражение несколько маркеров плюрипотентности, включая OCT-3/4, NANOG и тра-1-60 перед выполнением обширные дифференцирования независимо от условий культуры. Мы также отмечаем, что когда клетки образуют Эндодерма в высокой эффективности, они имеют тенденцию к звон от поверхности плит, как ячейки листов. Мы обнаружили, что кратко лечении iPSC производные эндодермы клеток с 0,02% раствора ЭДТА может помочь уменьшить отрыв ячеек. Наконец оптимальная концентрация клеток, необходимых для эффективного дифференцирования могут отличаться между линиями iPSC и может повлиять на мобильный отряд. По этой причине важно, чтобы эмпирически определить концентрацию клеток, необходимых для эффективного дифференцирования, особенно при работе с новой культуры iPSC.
В целом мы описали поэтапный дифференциация протокол, который генерирует гепатоцито подобных клеток от iPSCs, которые совместимы с химической экранов. Гепатоцито как клетки производятся как монослои в 96-луночных пластины, и этот процесс является эффективным и воспроизводимость. Мы продемонстрировать возможности установления соединений для их способностью снижать уровни АПОВ в культурной среде. Дифференциация формат совместим с несколько анализов, включая ELISA, qRT-PCR и высокое содержание изображений. Мы считаем, что поле будет найти подход полезным для выявления потенциальных терапии и фармакологические идентификации путей, затрагивающих гепатоцитов дифференциации и функции в будущем приложения5,30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана национальных институтов здравоохранения (DK55743, DK087377, DK102716 и HG006398 к САР). Мы хотели бы поблагодарить д-ра Behshad Pournasr, д-р Джеймс Хеслоп и Цзин побежал за их вклад.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm x 20 mm sterile tissue culture dishes | Corning | 430167 | |
| 100 mm x 20 mm sterile suspension culture dishes | Corning | 430591 | |
| 96-wells tissue culture plate | Corning | 3595 | |
| Anti-human Albumin | Dako | A 0001 | |
| Anti-human FOXA2(6C12) | Novus Biological | H00003170-M12 | |
| Anti-human HNF4 alpha | Santa Cruz | SC-6556 | |
| Anti-human Oct-3/4 antibody | Santa Cruz | SC-9081 | |
| Anti-human SOX17 | R&D | AF1924 | |
| Anti-human TRA-1-60 FITC conjugated | Millipore | FCMAB115F | |
| Activin A Recombinant Human Protein | Invitrogen | PHC9563 | |
| B-27 Supplement, minus insulin | Invitrogen | 0050129SA | |
| B-27 Supplement, serum free | Invitrogen | 17504044 | |
| BMP4 Recombinant Human Protein | Invitrogen | PHC9533 | |
| Cell Dissociation Reagent StemPro Accutase | Invitrogen | A1110501 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | 7572 | |
| DPBS+(calcium, magnesium) | Invitrogen | 14040-133 | |
| DPBS-(no calcium, no magnesium) | Invitrogen | 14190-144 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Invitrogen | 11330057 | |
| ELISA human APOB ELISA development kit | Mabtech | 3715-1H-20 | |
| Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2) | Invitrogen | PHG0023 | |
| Hepatocyte Culture Medium (HCM Bullet Kit) | Lonza | CC-3198 | |
| Hepatocyte Growth Factor (HGF) | Invitrogen | PHC0321 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Invitrogen | 11140076 | |
| Oncostatin M (OSM) Recombinant Human Protein | Invitrogen | PHC5015 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140163 | |
| Feeder free pluripotent stem cell medium: mTesR1 | STEMCELL technologies | 5850 | |
| Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Invitrogen | A1413301 | |
| RPMI 1640 Medium, HEPES | Invitrogen | 22400105 | |
| StemAdhere Defined Matrix for hPSC (E-cad-Fc) | Primorigen Biosciences | S2071 | |
| TMB-ELISA Substrate Solution | Thermo Scientific | 34022 | |
| Anti-TRA-1-60 FITC conjugated | Millipore | FCMAB115F | |
| Versene (EDTA) 0.02% | Lonza | 17-711E | |
| Y-27632 ROCK inhibitor | STEMCELL Technologies | 72302 |
References
- Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered? Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).
- Zeilinger, K., Freyer, N., Damm, G., Seehofer, D., Knospel, F. Cell sources for in vitro human liver cell culture models. Exp Biol Med (Maywood. 241 (15), 1684-1698 (2016).
- Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).
- Cayo, M. A., et al. A Drug Screen using Human iPSC-Derived Hepatocyte-like Cells Reveals Cardiac Glycosides as a Potential Treatment for Hypercholesterolemia. Cell Stem Cell. 20 (4), 478-489 (2017).
- Nagaoka, M., et al. E-cadherin-coated plates maintain pluripotent ES cells without colony formation. PLoS One. 1, e15 (2006).
- Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
- International Stem Cell Initiative. Characterization of human embryonic stem cell lines by International Stem Cell Initiative. Nat Biotechnol. 25 (7), 803-816 (2007).
- Cayo, M. A., et al. JD induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes faithfully recapitulate the pathophysiology of familial hypercholesterolemia. Hepatology. 56 (6), 2163-2171 (2012).
- DeSilva, B., et al. Recommendations for the bioanalytical method validation of ligand-binding assays to support pharmacokinetic assessments of macromolecules. Pharm Res. 20 (11), 1885-1900 (2003).
- Rowland, T. J., et al. Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin. Stem Cells Dev. 19 (8), 1231-1240 (2010).
- Nagaoka, M., Si-Tayeb, K., Akaike, T., Duncan, S. A. Culture of human pluripotent stem cells using completely defined conditions on a recombinant E-cadherin substratum. BMC Dev Biol. 10, 60 (2010).
- Hay, D. C., et al. Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo. Stem Cells. 26 (4), 894-902 (2008).
- Mallanna, S. K., Cayo, M. A., Twaroski, K., Gundry, R. L., Duncan, S. A. Mapping the Cell-Surface N-Glycoproteome of Human Hepatocytes Reveals Markers for Selecting a Homogeneous Population of iPSC-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 7 (3), 543-556 (2016).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
- Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J Biomol Screen. 16 (7), 775-785 (2011).
- Lorenz, C., et al. Human iPSC-Derived Neural Progenitors Are an Effective Drug Discovery Model for Neurological mtDNA Disorders. Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).
- Rashid, S. T., et al. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest. 120 (9), 3127-3136 (2010).
- Lu, W. Y., et al. Hepatic progenitor cells of biliary origin with liver repopulation capacity. Nat Cell Biol. 17 (8), 971-983 (2015).
- Ogawa, M., et al. Directed differentiation of cholangiocytes from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 33 (8), 853-861 (2015).
- Sampaziotis, F., et al. Cholangiocytes derived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling and drug validation. Nat Biotechnol. 33 (8), 845-852 (2015).
- Mallanna, S. K., Duncan, S. A. Differentiation of hepatocytes from pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 26 (Unit 1G 4), (2013).
- Song, Z., et al. Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells. Cell Res. 19 (11), 1233-1242 (2009).
- Cai, J., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells. Hepatology. 45 (5), 1229-1239 (2007).
- Si-Tayeb, K., et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).
- Pashos, E. E., et al. Diverse Population Cohorts of hiPSCs and Derived Hepatocyte-like Cells Reveal Functional Genetic Variation at Blood Lipid-Associated Loci. Cell Stem Cell. 20 (4), 558-570 (2017).
- Davidson, M. D., Ware, B. R., Khetani, S. R. Stem cell-derived liver cells for drug testing and disease modeling. Discov Med. 19 (106), 349-358 (2015).
- Choi, S. M., et al. Efficient drug screening and gene correction for treating liver disease using patient-specific stem cells. Hepatology. 57 (6), 2458-2468 (2013).
- Tafaleng, E. N., et al. Induced pluripotent stem cells model personalized variations in liver disease resulting from alpha1-antitrypsin deficiency. Hepatology. 62 (1), 147-157 (2015).
- Jing, R., Duncan, C. B., Duncan, S. A. A small-molecule screen reveals that HSP90beta promotes the conversion of induced pluripotent stem cell-derived endoderm to a hepatic fate and regulates HNF4A turnover. Development. 144 (10), 1764-1774 (2017).
