Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Använder mänskliga inducerade pluripotenta stamceller-derived Hepatocyte-liknande celler för läkemedelsutveckling

Published: May 19, 2018 doi: 10.3791/57194
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Regenerative Medicine and Cell Biology, Medical University of South Carolina

Summary

Det protokoll som presenteras här beskriver en plattform för identifiering av små molekyler för behandling av leversjukdom. En stegvis beskrivning presenteras beskriver hur att skilja iPSCs till celler med hepatocyte egenskaper i 96 brunnar och använda cellerna till skärmen för små molekyler med potentiell terapeutisk aktivitet.

Abstract

Förmågan att skilja mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) till hepatocyte-liknande celler (HLCs) ger nya möjligheter att studera medfödda rubbningar i levermetabolism. Förfarandet kräver dock för att tillhandahålla en plattform som stöder identifiering av små molekyler som kan användas för att behandla leversjukdom, en kultur-format som är kompatibelt med screening tusentals föreningar. Här beskriver vi ett protokoll som använder helt definierade kultur förhållanden, att reproducerbara differentiering av mänskliga iPSCs hepatocyte-liknande celler i 96 brunnar vävnadsodling plattor. Vi ger också ett exempel på att använda plattformen för att skärmen föreningar för sin förmåga till lägre Apolipoprotein B (APOB) produceras från iPSC-derived hepatocyter som genereras från en familjär hyperkolesterolemi patient. Tillgången till en plattform som är kompatibel med läkemedelsutveckling bör göra det möjligt för forskare att identifiera nya behandlingar för sjukdomar som påverkar levern.

Introduction

Framgång i att identifiera läkemedel som kan användas för att rikta en sällsynt sjukdom är beroende av utvecklingen av testmetoder som kan användas för screening. Hypotesen eller mål-baserade skärmar (omvänd farmakologi) är användbara, men kräver en detaljerad förståelse av den molekylära basen för sjukdomen. Fenotypiska skärmar (klassiskt farmakologi) undvika behovet av en detaljerad förståelse av biokemiska vägar, men i stället förlita sig på att utveckla modeller som exakt speglar patofysiologin bakom sjukdomen. Trots entusiasmen för mål-baserade metoder avslöja analyser av FDA-godkända först-i-klass läkemedel att fenotypiska skärmar har varit långt mer framgångsrik1. Det övergripande målet med denna metod är att inrätta en plattform för high throughput screening som kan användas för att identifiera små molekyler för behandling av metabola leversjukdom. Flera in vitro- modeller har beskrivits inklusive primära hepatocyter, hepatom celler och levern progenitor celler2. Men de flesta av dessa modeller har begränsningar och det finns ett behov för nya modeller som exakt kan sammanfatta patofysiologin av metabolisk lever brister i kultur. Nyligen, mänskliga pluripotenta stamceller kombinerat med gen editering har erbjudit en möjlighet att modellera även den mest sällsynta av sällsynta sjukdomar i kultur utan att behöva tillgång patienter direkt3. Medan användningen av patientspecifika iPSCs som ett verktyg att upptäcka små molekyler för behandling av sällsynta leversjukdomar är begreppsmässigt rimliga, finns det endast ett fåtal rapporter demonstrera genomförbarheten av denna metod4. Vi har dock nyligen etablerat en plattform som används för iPSC-derived hepatocyter att framgångsrikt identifiera läkemedel som kan vara repurposed för behandling av brister i metabolism i levern5.

Detta protokoll förklarar processen att skilja mänskliga iPSCs hepatocyte-liknande celler i 96 brunnar och använda dem för att skärmen ett bibliotek av små molekyler. Här beskrivs också endpoint analysen med hyperkolesterolemi som exempel metabolisk leversjukdom. Denna strategi bör vara användbart att studera roll och tillämpning av små molekyler i samband med smittsam leversjukdom, metabolisk leversjukdom, drug toxicitet och andra leversjukdomar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. kultur av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller

  1. Beläggning rekombinant humant E-Cadherin Fc Fusion Protein (E-cad-Fc) eller andra matriser som är lämplig för hPSC kultur 6
    1. Späd E-cad-Fc till 15 μg/mL med Dulbecco's Phosphate-Buffered saltlösning som innehåller kalcium och magnesium (DPBS (+)).
    2. Coat 100 mm fjädring vävnadsodling rätter med 5 mL utspädd E-cad-Fc och inkubera vid 37 ° c för minst 1 h. ta bort substrat och ersätta med 5 mL av medium (t.ex. mTeSR1 som kallas M-medelstora hädanefter)7.
      Obs: De odlingssubstrat som används i detta protokoll är förberedd efter publicerade protokoll7. Men flera andra medier preparat har beskrivits, eller finns kommersiellt, som är sannolikt förenlig med förfarandet.
    3. Hämta en flaska av frysförvarade iPSCs från flytande kväve. Tina på 37 ˚C tills en liten iskristall. Pipettera försiktigt celler i ett sterilt 15 mL koniska rör som innehåller 4 mL av M-medium.
    4. Centrifugera vid 300 x g för 5 min. avlägsna supernatanten och försiktigt resuspendera cellerna med 5 mL av det medium som kompletteras med 10 µM av Y-27632, en selektiv hämmare av Rho-associerade, dubbeltvinnade innehållande proteinkinas (ROCK).
    5. Ta bort M-mediet från steg 1.1.2, och över 5 mL av celler från steg 1.1.4 till E-cad-Fc-coated 100 mm fjädring vävnadsodling rätter.
  2. Att upprätthålla mänskliga iPSCs i kultur
    1. När iPSCs når runt 80% konfluens, ta bort odlingsmedium och tvätta en gång med kalcium och magnesium gratis DPBS (-). Aspirera på DPBS (-) och lägga till en tillräcklig mängd av 0,02% EDTA-lösning att täcka pläterar, sedan Inkubera i upp till 3 min i rumstemperatur.
      Obs: På 80% confluence, bör plattan innehålla omkring 2 x 107 celler. Det är viktigt att inte växa över cellerna och att säkerställa att cellerna behålla en odifferentierad morfologi. Pluripotenta celler kan bestämmas genom färgning med stamcells markör Tra-1-60 eller motsvarande8.
    2. Så snart cellerna börjar släppa, ta bort 0,02% EDTA-lösningen och översvämma skålen med 10 mL av M-medium att släppa celler. Stöd avskildheten av iPSCs genom att försiktigt pipettering.
      Obs: Genomsnittliga inkubationstiden för celler lossna är runt 3 min, men detta måste fastställas empiriskt för varje rad i iPSC. Cellerna bör släppas som små kluster som innehåller runt 5-10 iPSCs per kluster.
    3. Överföra 1/10 av de suspenderade cellerna per ny E-cad-Fc belagda 100 mm fjädring vävnadsodling maträtt innehållande 5 mL av M-medium. Inkubera kulturer vid 37 ° c under 4% O2/5% CO2 och ändra mediet dagligen.
      Obs: Även om iPSCs odlas rutinmässigt under fysiologiska Syreförhållandena att främja pluripotens, kan iPSCs också odlas med omgivande syre.

2. differentiering av mänskliga iPSCs Hepatocyte-liknande celler i 96 brunnar

Obs: Detta avsnitt beskriver differentiering av iPSCs i ett format som är kompatibelt med screening. Med detta synsätt, är det möjligt att inducera human iPSCs att differentiera och bilda hepatocyte-liknande celler i 20 dagar. Medan detta är lämplig för de flesta analyser, kan av kultur förlängas för att förbättra mognaden av cellerna.

  1. Beläggning 96 brunnar vävnadsodling plattor med reducerad tillväxtfaktor basalmembranet matris
    1. Förbereda beståndet genom att späda ut matrisen till 2 mg/mL med iskall sterila DMEM/F12 vävnadsodling medium. Dela matrisen i 250 μl portioner och förvaras vid-80 ° c tills krävs. Chill 10 mL DMEM/F12 på is för 30 min. Hämta en 250 μl alikvot av 2 mg/mL matris lager och Tina på is.
    2. Kombinera matrisen med 10 mL kall DMEM/F12 genom att blanda försiktigt med pre kylda pipett för att göra slutliga koncentration på 0,05 mg/mL.
    3. Överför 100 μL av utspädda matris till varje brunn 96 brunnar vävnadsodling platta. Inkubera vid 37 ° c, 4% O2/5% CO2 för minst 1 h. kasta matrisen och ersätta med M-medelstora 50 μl per brunn. Lagra vid 37 ° C, 4% O2/5% CO2 tills behövs.
  2. Platta celler för differentiering
    1. Kultur iPSCs på 100 mm tallrikar tills cellerna närma sig 80% sammanflödet. Se till att plattan innehåller cirka 2 x 107 celler. Bestämma cell nummer av cell flödescytometer eller hemocytometer.
      Obs: Med erfarenhet, kan kvalitet iPSCs cellerna bedömas av mikroskopi; dock bör nära 98% av cellerna uttrycka pluripotency markörer såsom den TRA-1-60 epitop mätt med FACS eller immunfärgning. Det är viktigt att cellerna förblir aktivt delande och är inte övervuxna.
    2. För att skörda iPSCs från varje 100 mm platta, sug ut odlingsmediet och skölj med 5 mL av DPBS (-). Ersätta sköljningen med 3 mL cell avlossning lösning (t.ex., accutase) och Inkubera under cirka 2 minuter vid 37 ° C, 4% O2/5% CO2.
      Obs: Det är viktigt att följa avskildheten av celler genom mikroskopi. Göra inte över digest med accutase. Målet är att frigöra cellerna som små kluster med minimal behandling.
    3. Så snart cellerna börjar lossna, skörda genom att lägga till 7 mL av M-medium. Pipettera flera gånger för att separera cell kolonierna i små kluster av runt 3-6 celler (figur 1A).
    4. Samla in iPSCs i en 15 mL sterilt centrifugrör och centrifugera vid 300 x g för 5 min. avlägsna supernatanten och slamma cellpelleten i 5 mL M-medium.
    5. Jämnt fördela cellerna på 96 brunnar matrix-belagda plattor av pipettering 50 μL av suspension celler i varje brunn. Ställ in varje plattan med 96 brunnar, Använd en 100 mm platta av iPSCs med celler på cirka 80% konfluens som innehåller cirka 5 x 106 celler för att ställa differentiering. Använd en flerkanalspipett för att påskynda denna process. Odla cellerna över natten vid 37 ° c, 4% O2/5% CO2.
      Obs: Det är viktigt att ett lika stort antal celler är insatta på varje brunn för att säkerställa reproducerbar differentieringar.
  3. Inducera differentiering av celler
    1. Undersöka de 96 brunnar genom mikroskopi att se till att celler täcka minst 70% av ytan av varje individ väl. Om täckningen är mindre än 70%, ersätta mediet med färska medium och inkubera i en ytterligare 24 h vid 37 ° c, 4% O2/5% CO2.
      Obs: Ruva celler för mer än 48 h efter plätering utan inducerar differentiering vanligen minskar effektiviteten av differentiering. Differentiering sker även med omgivande syre, även om effektiviteten kan vara drabbade.
    2. För dag 1 till dag 2 av differentiering, ersätta odlingssubstratet med RPMI kompletteras med 2% B27 (utan insulin), 100 ng/mL Activin A, 10 ng/mL BMP4 och 20 ng/mL FGF2. Tillsätt 100 μL av medium per brunn och inkubera vid 37 ° c, i omgivande O2/5% CO2 med en daglig medium förändring i 2 dagar.
      Obs: Att hantera ett stort antal 96 brunnar kräver användning av en assisterad pipett eller robot. 12-kanals och 96-kanal pipetter är idealisk för daglig medium förändring.
    3. För dag 3 till dag 5 av differentiering kompletteras Ersätt odlingssubstratet med RPMI med 2% B27 (utan insulin) och 100 ng/mL Activin A. Culture celler vid 37 ° c, i omgivande O2/5% CO2 med dagliga medium förändring för 3 dagar.
    4. Differentiering dag 5, innan du byter med färskt odlingssubstrat, behandla varje brunn med 100 μL 0,02% EDTA-lösningen för 30 s, sedan ta bort och ersätta med färsk odlingsmedium.
      Obs: Om differentiering till endoderm är effektivt, är enskiktslager skilja celler benägna att peeling från plattan. En kort behandling med 0,02% EDTA-lösning hjälper till att lindra cell avlossning. Denna behandling påverkar inte differentieringen till hepatocyter.
    5. För differentiering mellan dagar 6 till 10, ersätta odlingssubstratet med RPMI / 2% B27 (med insulin) kompletteras med 20 ng/mL BMP4 och 10 ng/mL FGF2 och inkubera vid 37 ° c, 4% O2/5% CO2 i 5 dagar med dagliga medium förändring. Detta skede framkallar cellerna differentieras till nedsatt stamceller.
    6. För differentiering mellan dagar 11 till 15, ersätta odlingssubstratet med RPMI / 2% B27 (med insulin) kompletteras med 20 ng/mL HGF. Inkubera vid 37 ° c, 4% O2/5% CO2 i 5 dagar med dagliga medium förändring.
    7. För differentiering mellan dagar 16 till 20, ersätta odlingssubstratet med en hepatocyte-cellodlingsmedium (HCM) som kompletteras med 20 ng/mL för Oncostatin-M (OSM). Inkubera cellerna vid 37 ° c, i omgivande O2/5% CO2 med dagliga medium förändring i 5 dagar.
      Obs: Reproducerbarheten för differentiering mellan enskilda brunnar kan effektivt bestämmas genom att mäta den relativa nivån av Albumin, AFP eller APOB utsöndras till medium av ELISA (se 3.2).

3. liten molekyl Screening

Obs: Följande beskrivs det förfarande som används för att identifiera substanser som kan användas för att sänka nivån av APOB i medlet av hepatocyte-liknande celler från iPSCs familjär hyperkolesterolemi. En beskrivning av modellen och dess användning i identifiering av kolesterolsänkande läkemedel har beskrivits i detalj tidigare5,9. I det aktuella exemplet screenades 1000 föreningar från South Carolina sammansatta samling (SC3) biblioteket. Varje förening har testats vid en koncentration på 2 μg/mL.

  1. Behandling av iPSC - härledda hepatocyter med små molekyler
    1. Späd det master sammansatta biblioteket för att generera plattor av arbetande bestånd med föreningar med en koncentration på 20 μg/mL i 2% DMSO och förvaras vid-20 ° c.
    2. Förbereda tillräckligt 96 brunnar av iPSC-derived hepatocyter att tillåta varje förening ska testas.
      Obs: Antalet föreningar elektronikkedjan avgör antalet 96 brunnar som krävs. I allmänhet bör en enda väl förberedas för varje förening, plus ytterligare brunnar för någon kontrollprover. De yttersta brunnarna i plattan är vanligen undvikas för att minska risken för kanteffekter som kan korrumpera tolkning. Träffar kan identifieras med hjälp av metoden z-Poäng utan att behöva använda replikat. Om replikat ingår, är det lämpligare att använda t test.
    3. Vid slutförandet av differentiering (dag 20, se 2.3.7), ersätta odlingssubstratet med 100 μL av färska HCMkompletteras med 20 ng/mL Oncostatin-M. Inkubera vid 37 ° c, 4% O2/5% CO2 för exakt 24 h. Hämta odlingssubstratet i en färsk plattan med 96 brunnar och förvaras vid-20 ˚C. Använd det här exemplet för att beräkna nivån av APOB i mediet innan tillägg av läkemedel.
    4. Tillsätt 90 μl av färska HCM kompletteras med 20 ng/mL Oncostatin-M i varje brunn. Tillsätt 10 μL av varje förening från arbetande lager efter blandning av pipettering. Lägg till DMSO till 0,2% till kontrollbrunnar för att matcha slutliga koncentration i de behandlade proverna och inkubera vid 37 ° c, omgivande O2/5% CO2 för exakt 24 h. samla odlingsmediet och förvaras vid-20 ˚C. Använd detta prov för att bestämma nivån på APOB efter behandling med föreningar.
    5. Tillval - återstående cellerna kan bearbetas för immunfärgning, cellernas viabilitet eller analyser av mRNA nivåer med hjälp av standardmetoder.
      Obs: Denna skärm var avsedd att identifiera läkemedel som hade en snabb effekt på APOB nivåer. Dock beroende på sjukdom modell, nedströms analyser, eller drog verkningsmekanism, kan det vara fördelaktigt att behandla provet i flera dagar.
  2. Fastställa APOB nivåer av ELISA
    1. Bestämma Apolipoprotein B (APOB) koncentration från både före och efter drogen behandlade proverna med ett mänskligt APOB ELISA development kit efter tillverkarens protokollen.
    2. Förbereda följande lösningar
      1. Tvättbuffert, sammansatt av 0,05% Tween-20 i PBS, pH 7,4. Förvaras vid 4 ° c fram till användning.
      2. Inkubation buffert, består av 0,05% Tween-20 och 0,1% bovint serumalbumin (BSA) i PBS, pH 7,4. Förvaras vid 4 ° c fram till användning.
    3. Förbereda APOB (mAB 20/17) antikropp genom spädning till 2 µg/mL i PBS, pH 7,4. Tillsätt 100 μL av utspädda antikroppen per brunn och inkubera vid 4 ° c över natten.
    4. Ta bort antikroppen från assay plattorna och tvätta vart väl två gånger med 200 μL av PBS, pH 7,4.
    5. Lägga till 200 μL/brunn 0,05% Tween-20, 0,1% bovint serumalbumin (BSA) i PBS, pH 7,4 och inkubera i en skakande plattform för 1 h i rumstemperatur.
    6. Förbereda en 8-point standardkurvan med 0,05% Tween-20 och 0,1% BSA i PBS, pH 7,4 med följande koncentrationer av APOB: 300 ng/mL, 200 ng/mL, 175 ng/mL, 150 ng/mL, 125 ng/mL, 100 ng/mL, 75 ng/mL och 50 ng/mL.
    7. Späd provet prover 1:4 med 0,05% Tween-20 och 0,1% BSA i PBS, pH 7,4.
    8. Efter 1 h av blockering med inkubation buffert, kassera bufferten och tvätta assay plattorna fem gånger med 200 μL av 0,05% Tween-20 i PBS, pH 7,4.
    9. Helt ta bort eventuella kvarvarande tvätt buffert och överföra 90 μl utspädda proven och de APOB normerna till assay plattorna. Odla i rumstemperatur på en shaker för 1 h.
    10. Ignorera provet och tvätta med 200 μL 0,05% Tween-20 i PBS, pH 7,4 per brunn. Upprepa tvättarna sammanlagt 5 gånger. Tillsätt 100 μl per brunn av mAB LDL 11-biotin utspädda 1:1,000 i 0,05% Tween-20 och 0,1% BSA i PBS, pH 7,4. Odla i rumstemperatur på en skakande plattform för 1 h.
    11. Kassera reagensen och tvätta med 200 μl per brunn tvätt buffert 5 gånger. Tillsätt 100 μl per brunn streptividin-HRP antikroppar (1:1, 000 utspädning med inkubation buffert), sedan odla i rumstemperatur på en skakande plattform för 1 h.
    12. Kassera reagensen och tvätta med 200 μL 0,05% Tween-20 i PBS, pH 7,4 per brunn. Upprepa tvättarna sammanlagt 5 gånger. Helt ta bort kvarvarande tvätt bufferten från assay plattorna och tillsätt 100 μl per brunn Tetramethylbenzidin (TMB) substratlösning och odla i rumstemperatur i 8 min.
    13. Utan att ta bort på TMB-substratet, direkt Tillsätt 100 μl per brunn av stopplösning (1N HCl).
    14. Bestäm absorbansen vid 450 nm med en spektrofotometer.
    15. En standardkurva kan fastställas med hjälp av metoden fyra Parameter Logistic Regression, sedan används för att definiera koncentrationen av APOB i varje prov10.
    16. Undersöka före drogen: efter drogen förhållandet APOB i varje prov att identifiera föreningar med potential att sänka APOB nivåer i mediet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Generation av hepatocyte - som celler: Figur 1 beskriver tidsramen för de förändringar som sker under differentieringen av mänskliga iPSCs hepatocyte-liknande celler. Kulturen av iPSCs på E-Cad-Fc ger cirka 2 mm diameter kolonier som express pluripotenta markören OCT4 (figur 1A-B). Morfologi av celler odlas på en E-cadherin matris blir något annorlunda till de odlade på andra ytor. De tenderar att ha en tillplattad morfologi med en större cytoplasmiska yta (figur 1A). Även om mänskliga pluripotenta stamceller kan vara effektivt odlade på ett antal olika matriser11, kulturen av iPSCs på en E-cadherin matris tros öka enhetligheten av pluripotenta cell befolkningen och tillåter enzym-gratis manipulation av celler under passagen12. Dock flera alternativa matriser, inklusive basalmembranet matris, lamininer, Aktiebolaget Trav & galopp och mus embryonala fibroblaster (MEF), kan också användas för att upprätthålla mänskliga iPSCs och alla bör vara förenliga med de beskrivna förfarande13. I alla fall, kan den cell pluripotency bekräftas genom Tra-1-60 eller motsvarande8.

För att initiera differentiering, bör iPSCs samlas in som små kluster (figur 1A). I början av differentiering, bör guldpläterade cellerna täcka ca 80% av ytan av plattan. Efter 5 dagars behandling med tillväxtfaktorer, cellerna express proteiner som uttrycks egenskapt i slutgiltig endoderm såsom SOX17 och FOXA2 (figur 1B). I detta skede uttrycka över 90% av cellerna normalt dessa markörer. Efter 5 dagar av differentiering, endoderm konverteras till ett nedsatt öde, och förutom FOXA2, cellerna express HNF4a, som kan identifieras under återstoden av differentiering processen (figur 1B). Som cellerna anta ett nedsatt öde, de bör täcka ytan av plattan som en enskiktslager. Efter tillägg av HGF börjar cellerna att uttrycka proteiner som finns i fostrets hepatocyter inklusive AFP (figur 1B). Lipid droppar kan observeras inom cytoplasman i celler. Vid slutförandet av differentiering anta cellerna ett kubiskt morfologi med en kärna som innehåller framträdande nukleolerna och en stor cytoplasman med flera lipid droppar. En delmängd av hepatocyte-liknande cellerna blir flera kärnförsedda. De flesta av cellerna uttrycker en bred repertoar av hepatocyte proteiner inklusive Albumin (figur 1B)14.

Effektiv hög genomströmning skärmen med hyperkolesterolemi som sjukdom modell: Hyperkolesterolemi avspeglar alltför stora koncentrationer av Low density lipoprotein-kolesterol (LDL-C) i serum. I familjär hyperkolesterolemi (FH) beror ökade nivån av LDL-C serum främst på mutationer i LDL-receptorn (Receptorn) som medierar upptaget av LDL-C för clearance av hepatocyterna. Vi har tidigare beskrivit generationen av iPSCs från en patient med homozygot familjär hyperkolesterolemi och deras användning i generera hepatocyter som speglade patientens leversjukdom i kultur9. Det visades att dessa celler kan användas framgångsrikt som en plattform för läkemedelsutveckling. När ett bibliotek av ~ 2500 narkotika visades, konstaterades det att hjärtglykosider hade en oväntad förmåga att sänka LDL-C i iPSC-derived hepatocyter, primära humana hepatocyter, och i möss med humaniserad lever. Dessutom vid undersöka patientens patientjournal hittade vi som kolesterol nivåer föll hos patienter som har ordinerats en hjärt glykosid för behandling av hjärtsjukdom. Dessa studier bekräftat att iPSC-derived hepatocyter kan framgångsrikt användas i skärmar för att identifiera therapeutics.

För att ge en plattform som är kompatibel med screening, är det viktigt att differentieringar är reproducerbara och att väl till väl variation minimeras. Figur 2 visar resultaten av immunfärgning på varje brunn en plattan med 96 brunnar att upptäcka HNF4a och Albumin i dag 20 av differentiering. Som kan ses i figuren, är fördelningen av dessa hepatocyte proteiner liknande i alla brunnar.

Den centrala protein komponenten av LDL-C är APOB. Här har vi använt iPSCs till skärmen för APOB sänka föreningar att ge ett exempel för att använda iPSC-derived hepatocyter för småmolekylära screening (figur 3A). APOB kan lätt mätas i lösning av ELISA. Eftersom ELISA kan utföras på stort antal prover, kan det användas som underlag för en skärm. Lämpligheten av någon analysmetod för high throughput screening är bäst bestäms med hjälp av ett mått som kallas Z-faktorn (eller Z')15. Denna statistiska parametern beräknar effektiviteten av ett test att skilja mellan positiva och negativa kontrollprover. Ett test med en Z-faktor > 0,5 är förenligt med en skärm15. Som kan ses i figur 3B, Z' APOB analysens = 0,73, vilket bekräftar lämplighet med en plattform för läkemedelsutveckling.

Identifiering av föreningar som har kapacitet att sänka APOB nivåer i odlingsmediet av iPSC - härrör hepatocyter: för att avgöra om plattformen kan användas till att identifiera nya föreningar som påverkar APOB nivåer, vi 1000 små molekyler från South Carolina sammansatta samling (SC3) representant ställa Lite (RSL). RSL genererades av MUSC South Carolina Center för terapeutiska upptäckt, och innehåller ämnen som är strukturellt varierande och speglar överordnade biblioteket.

Efter drogen: före drog kvoten mellan APOB fastställdes för varje förening (figur 3 c) och identifiering av träffar uppnåddes genom z-Poäng analys (figur 3D)16. I det här fallet ansågs små molekyler som minskat APOB med ett z-score ≤-2.0 som potentiella hits. När screening 1000 små molekyler, är antalet potentiella träffar med en z-Poäng ≤-2.0 oftast relativt hanterbart. Men när de utför en större skärm, skulle vi lita på en mer konservativ Poäng ≤-3.0, baserat på 3-sigma regeln, att öka förtroendet för potentiella mål. I det här exemplet identifierat vi 24 potentiella hits med en APOB förhållande som varierade från 0,86 till 0,44 (figur 4A). En sekundär analys utfördes på quadruplicate prov (n = 4 biologiska replikat) att utesluta föreningar som hade en negativ inverkan på cellernas viabilitet och bestämma vilka föreningar kunde reproducibly lägre APOB i mediet. Av de ursprungliga 24 kandidat föreningarna, fyra befanns vara reproducerbara (p ≤0.05) (figur 4B-C). Vid ytterligare en studie, 2 av dessa föreningar befanns negativt påverkar cellernas viabilitet, vilket tyder på att den observerade minskningen av APOB var sannolikt att en vara en konsekvens av cellförlust. De återstående två föreningarna skulle anses vara bra kandidater för uppföljande studier.

Figure 1
Figur 1 : Överläggsgrafer nedsatt differentiering av mänskliga iPSCs. (A) Morfologi av iPSC kolonier omedelbart före skörd (till vänster) och iPSCs efter att samla celler för differentiering (höger panel) - efter accutase behandling, cellerna bör särskiljas i 3-6 celler/kluster. Skalstapeln = 50 µm. (B) tabell visar odlingsbetingelser i varje skede av differentiering (övre). Immunfärgning (lägre paneler) utfördes för att identifiera markör uttryck i varje skede av differentiering. Paneler visar OCT4 och DAPI missfärgade kärnor i iPSCs, SOX17 och FOXA2 i slutgiltig endoderm, HNF4a och FOXA2 i nedsatt progenitorceller, HNF4a och AFP i omogna hepatocyte-liknande celler, och HNF4a och Albumin i relativt mogen hepatocyte-liknande celler. Skala barer = 100 µm (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Homogen nedsatt differentiering av mänskliga iPSCs i 96 brunnar. Immunfärgning utfördes på varje enskild brunn en plattan med 96 brunnar innehållande iPSC-derived hepatocyter dag 20 av differentiering att upptäcka (A) Albumin och (B) HNF4a. Skalstapeln = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Liten molekyl screening med hjälp av humana iPSC-derived hepatocyter. (A) Schematisk översikt över den strategi som används för att identifiera substanser som kan minska nivåerna av ABOB i medlet av iPSC-derived hepatocyter. (B) diagram visar resultatet av ett ELISA test att upptäcka nivån på APOB i medlet av 87 wells (n = 87) av iPSC-derived hepatocyter (blå) eller odifferentierade iPSCs (orange). Dessa uppgifter användes för att beräkna en Z-faktor (Z' = 0,73). (C) diagrammet visar efter drogen: före drog förhållandet mellan koncentrationen av APOB i odlingsmediet av iPSC-derived hepatocyter behandlas för 24 h med 998 föreningar från SC3 RSL uppsättningen. (D) diagram som visar z-poäng av de data som presenteras i (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Validering av primära träffar. (A) tabell visar föreningar identifierats i den primära skärmen som att kunna minska APOB. (B, C) Stapeldiagram som visar effekterna av föreningar på efter drogen: före drog APOB koncentrationsförhållandet ()B) och cellernas viabilitet (C) i iPSC-derived hepatocyter behandlas med föreningar i uppföljande analys. Felstaplar återspeglar ± SEM (n = 4 biologiska replikat); * p ≤0.05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mål baserat läkemedelsutveckling, där små molekyler identifieras som påverkar aktiviteten av ett specifikt protein, har varit fokus i många befintliga screening insatser. Även om detta tillvägagångssätt har lämnat många läkemedel, skärmar baserat på att vända en fenotyp, klassiskt farmakologi, har varit mer framgångsrika i att identifiera först-i-klass föreningar som varit kliniskt effektiva1. En nackdel till fenotypiska läkemedelsutveckling är att det är beroende av tillgången på lämpliga sjukdomsmodeller. Detta kan vara en utmaning när cellmodeller av sjukdomen är inte tillgängliga, eller när gemensamma forskning djurarter misslyckas med att sammanfatta de kliniska symtomen. Förmågan att generera iPSCs från patientens somatiska celler har emellertid lämnat nya möjligheter att modellen mänskliga sjukdomar i kultur3. För vissa sjukdomar, såsom sällsynta genetiska sjukdomar, kan patienter vara få till antalet, och svårt att komma åt och samtycke. Med tillkomsten av genomet engineering är det dock relativt enkelt att införa orsakande mutationer i iPSC genomet, vilket gör det möjligt att modellera även den mest sällsynta av sällsynta sjukdomar.

När iPSCs är i hand, är det nödvändigt att producera en cell lämplig typ där uppenbara symtom på sjukdomen. Till exempel kan sjukdomar som drabbar neurala funktion kräva generering av nervceller eller glia17, medan de som drabbar levern kan behöva hepatocyter9,18 eller galla epitelceller för studera19, 20 , 21. Detta krav införs ett antal varningar när man överväger användning av iPSCs för läkemedelsutveckling. Först, är det viktigt att förstå den cellulära grunden av sjukdomen. Detta kan vara utmanande, särskilt när celler anta egenskaper baserat på plats eller miljö. Det kan vara sant för hepatocyter som har skillnader i gen uttryck profiler och enzymatiska funktion som är beroende av deras läge inom de lever lobule. För det andra, arbeta med celler i isolering kan förhindra studiet av sjukdomar som återspeglar en störning till vävnad struktur såsom cirros, cell-cell kommunikation såsom neuromuskulära sjukdom eller de som påverkas av inflammation såsom inflammatoriska tarmsjukdom.

För att studera leversjukdom, har flera forskargrupper beskrivit protokoll för att generera hepatocyte-liknande celler från iPSCs13,22,23,24,25. Medan de flesta av dessa protokoll är effektiv, är begränsningen av tekniken att cellerna fullt inte sammanfatta funktionen av färska hepatocyter. Detta innebär att det är viktigt att avgöra huruvida celler genereras från iPSCs display fungerar nödvändigt att utvärdera effekterna av en viss mutation. Bland de gener vars uttryck inte matchar fullt som finns i färska hepatocyter är de kodning CYP450-proteiner25,26. Flera av dessa proteiner har roller i läkemedelsmetabolism och xenobiotiska svar. Detta är viktigt när man överväger utformningen av en skärm eftersom många läkemedel kräva generering av aktiva metaboliter, och detta skulle kunna påverkas i iPSC-derived hepatocyter. Insatser för att förbättra kvaliteten på hepatocyterna håller på att aktivt förfölde27. Trots förbehåll, har flera studier visat att iPSCs härrör från patienter med medfödda rubbningar i levermetabolism kan användas framgångsrikt att generera hepatocyte-liknande celler som speglar patofysiologin bakom sjukdomen i kultur9 , 18 , 28 , 29.

För skärmar ska lyckas, är det viktigt att säkerställa homogen differentiering av hepatocyter från iPSCs. När differentieringar i 96 brunnar misslyckas att ge hög kvalitet hepatocyter, är det oftast beror antingen till den dåliga kvaliteten på de föräldrarnas iPSCs eller kultur av iPSCs under optimala förhållanden. Pluripotency av iPSCs måste underhållas noggrant av kultur i en hög kvalitet medium med dagliga förändringar som beskrivs i protokollet 1.2. Tätheten av pluripotenta celler i kultur skålen bör övervakas noga, eftersom om cellerna blir över konfluenta de tenderar att förlora pluripotency och spontant differentiera. Vi finner också att odla cellerna i fysiologiska syrehalter främjar pluripotency och är fördelaktigt under vissa stadier av differentiering. Dock om lämplig utrustning inte finns, är det fortfarande möjligt att använda omgivande syre att både odla pluripotenta cellerna och inducerar differentiering. Vi föreslår att rutinmässigt definiera pluripotency av den lager iPSCs genom att mäta uttryck av flera pluripotency markörer inklusive OCT-3/4, NANOG och TRA-1-60 innan du utför omfattande differentieringar oavsett kultur. Vi har också observerat att när cellerna bildar endoderm på hög effektivitet, de har en tendens att klockringning från ytan av plattorna som cellen ark. Vi har funnit att kortfattat behandla iPSC-derived endoderm celler med 0,02% EDTA-lösning kan bidra till att minska cell avlossning. Slutligen, den optimala koncentrationen av celler som krävs för effektiv differentieringar kan skilja sig mellan iPSC linjer och kan påverka cell avlossning. Därför är det viktigt att empiriskt fastställa koncentrationen av celler som behövs för effektiv differentieringar, särskilt när du arbetar med en ny iPSC-kultur.

Sammanfattningsvis har vi beskrivit ett stegvis differentiering protokoll som genererar hepatocyte-liknande celler från iPSCs som är kompatibla med kemiska skärmar. Hepatocyte-liknande celler produceras som enskiktslager i 96 brunnar, och processen är effektiv och reproducerbara. Vi demonstrera genomförbarheten av screening föreningar för sin förmåga att sänka nivåerna av APOB i odlingssubstratet. Det differentiering-formatet är kompatibelt med flera analyser inklusive ELISA, qRT-PCR och hög innehåll imaging. Vi tror att fältet hittar metoden användbar att identifiera potentiella therapeutics och för farmakologiska identifiering av vägar som påverkar hepatocyte differentiering och funktion i framtida tillämpningar5,30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av National Institutes of Health (DK55743, DK087377, DK102716 och HG006398 till S.A.D). Vi vill tacka Dr Behshad Pournasr, Dr James Heslop och Ran Jing för deras bidrag.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm x 20 mm sterile tissue culture dishes  Corning 430167
100 mm x 20 mm sterile suspension culture dishes Corning 430591
96-wells tissue culture plate  Corning 3595
Anti-human Albumin Dako A 0001
Anti-human FOXA2(6C12) Novus Biological H00003170-M12
Anti-human HNF4 alpha Santa Cruz SC-6556
Anti-human Oct-3/4 antibody Santa Cruz SC-9081
Anti-human SOX17 R&D AF1924
Anti-human TRA-1-60 FITC conjugated Millipore FCMAB115F
Activin A Recombinant Human Protein  Invitrogen PHC9563
B-27 Supplement, minus insulin  Invitrogen 0050129SA
B-27 Supplement, serum free  Invitrogen 17504044
BMP4 Recombinant Human Protein  Invitrogen PHC9533
Cell Dissociation Reagent StemPro  Accutase  Invitrogen A1110501
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay  Promega 7572
DPBS+(calcium, magnesium) Invitrogen 14040-133
DPBS-(no calcium, no magnesium) Invitrogen 14190-144
DMEM/F-12, HEPES  Invitrogen 11330057
ELISA human APOB ELISA development kit Mabtech 3715-1H-20
Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2) Invitrogen PHG0023
Hepatocyte Culture Medium (HCM Bullet Kit)  Lonza CC-3198
Hepatocyte Growth Factor  (HGF) Invitrogen PHC0321
L-Glutamine  Invitrogen 25030081
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Invitrogen 11140076
Oncostatin M (OSM) Recombinant Human Protein  Invitrogen PHC5015
Penicillin-Streptomycin  Invitrogen 15140163
Feeder free pluripotent stem cell medium: mTesR1  STEMCELL technologies 5850
Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix  Invitrogen A1413301
RPMI 1640 Medium, HEPES  Invitrogen 22400105
StemAdhere Defined Matrix for hPSC (E-cad-Fc) Primorigen Biosciences S2071
TMB-ELISA Substrate Solution Thermo Scientific  34022
Anti-TRA-1-60 FITC conjugated Millipore FCMAB115F
Versene (EDTA) 0.02%  Lonza 17-711E
Y-27632 ROCK inhibitor STEMCELL Technologies 72302

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered? Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).
  2. Zeilinger, K., Freyer, N., Damm, G., Seehofer, D., Knospel, F. Cell sources for in vitro human liver cell culture models. Exp Biol Med (Maywood. 241 (15), 1684-1698 (2016).
  3. Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).
  4. Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).
  5. Cayo, M. A., et al. A Drug Screen using Human iPSC-Derived Hepatocyte-like Cells Reveals Cardiac Glycosides as a Potential Treatment for Hypercholesterolemia. Cell Stem Cell. 20 (4), 478-489 (2017).
  6. Nagaoka, M., et al. E-cadherin-coated plates maintain pluripotent ES cells without colony formation. PLoS One. 1, e15 (2006).
  7. Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
  8. International Stem Cell Initiative. Characterization of human embryonic stem cell lines by International Stem Cell Initiative. Nat Biotechnol. 25 (7), 803-816 (2007).
  9. Cayo, M. A., et al. JD induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes faithfully recapitulate the pathophysiology of familial hypercholesterolemia. Hepatology. 56 (6), 2163-2171 (2012).
  10. DeSilva, B., et al. Recommendations for the bioanalytical method validation of ligand-binding assays to support pharmacokinetic assessments of macromolecules. Pharm Res. 20 (11), 1885-1900 (2003).
  11. Rowland, T. J., et al. Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin. Stem Cells Dev. 19 (8), 1231-1240 (2010).
  12. Nagaoka, M., Si-Tayeb, K., Akaike, T., Duncan, S. A. Culture of human pluripotent stem cells using completely defined conditions on a recombinant E-cadherin substratum. BMC Dev Biol. 10, 60 (2010).
  13. Hay, D. C., et al. Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo. Stem Cells. 26 (4), 894-902 (2008).
  14. Mallanna, S. K., Cayo, M. A., Twaroski, K., Gundry, R. L., Duncan, S. A. Mapping the Cell-Surface N-Glycoproteome of Human Hepatocytes Reveals Markers for Selecting a Homogeneous Population of iPSC-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 7 (3), 543-556 (2016).
  15. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  16. Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J Biomol Screen. 16 (7), 775-785 (2011).
  17. Lorenz, C., et al. Human iPSC-Derived Neural Progenitors Are an Effective Drug Discovery Model for Neurological mtDNA Disorders. Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).
  18. Rashid, S. T., et al. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest. 120 (9), 3127-3136 (2010).
  19. Lu, W. Y., et al. Hepatic progenitor cells of biliary origin with liver repopulation capacity. Nat Cell Biol. 17 (8), 971-983 (2015).
  20. Ogawa, M., et al. Directed differentiation of cholangiocytes from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 33 (8), 853-861 (2015).
  21. Sampaziotis, F., et al. Cholangiocytes derived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling and drug validation. Nat Biotechnol. 33 (8), 845-852 (2015).
  22. Mallanna, S. K., Duncan, S. A. Differentiation of hepatocytes from pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 26 (Unit 1G 4), (2013).
  23. Song, Z., et al. Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells. Cell Res. 19 (11), 1233-1242 (2009).
  24. Cai, J., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells. Hepatology. 45 (5), 1229-1239 (2007).
  25. Si-Tayeb, K., et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).
  26. Pashos, E. E., et al. Diverse Population Cohorts of hiPSCs and Derived Hepatocyte-like Cells Reveal Functional Genetic Variation at Blood Lipid-Associated Loci. Cell Stem Cell. 20 (4), 558-570 (2017).
  27. Davidson, M. D., Ware, B. R., Khetani, S. R. Stem cell-derived liver cells for drug testing and disease modeling. Discov Med. 19 (106), 349-358 (2015).
  28. Choi, S. M., et al. Efficient drug screening and gene correction for treating liver disease using patient-specific stem cells. Hepatology. 57 (6), 2458-2468 (2013).
  29. Tafaleng, E. N., et al. Induced pluripotent stem cells model personalized variations in liver disease resulting from alpha1-antitrypsin deficiency. Hepatology. 62 (1), 147-157 (2015).
  30. Jing, R., Duncan, C. B., Duncan, S. A. A small-molecule screen reveals that HSP90beta promotes the conversion of induced pluripotent stem cell-derived endoderm to a hepatic fate and regulates HNF4A turnover. Development. 144 (10), 1764-1774 (2017).

Tags

Utvecklingsbiologi fråga 135 inducerade pluripotenta stamceller celler cellodling Hepatocyte differentiering High Throughput Screening Hepatocyte-liknande celler hyperkolesterolemi
Använder mänskliga inducerade pluripotenta stamceller-derived Hepatocyte-liknande celler för läkemedelsutveckling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, J. T., Lamprecht, M. P.,… More

Liu, J. T., Lamprecht, M. P., Duncan, S. A. Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery. J. Vis. Exp. (135), e57194, doi:10.3791/57194 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter