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Developmental Biology

मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल का उपयोग-व्युत्पंन Hepatocyte-दवा की खोज के लिए कोशिकाओं की तरह

Published: May 19, 2018 doi: 10.3791/57194
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Regenerative Medicine and Cell Biology, Medical University of South Carolina

Summary

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल यकृत रोग के उपचार के लिए छोटे अणुओं की पहचान के लिए एक मंच का वर्णन करता है । एक कदम दर कदम विवरण कैसे ९६-अच्छी तरह से प्लेटों में hepatocyte विशेषताओं के साथ कोशिकाओं में iPSCs अंतर करने के लिए प्रस्तुत किया है, और कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए संभावित चिकित्सीय गतिविधि के साथ छोटे अणुओं के लिए स्क्रीन ।

Abstract

hepatocyte की तरह कोशिकाओं (HLCs) में मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs) अंतर करने की क्षमता यकृत चयापचय में अजन्मा त्रुटियों का अध्ययन करने के लिए नए अवसर प्रदान करता है । हालांकि, एक मंच है कि संभवतः जिगर की बीमारी के इलाज के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि छोटे अणुओं की पहचान का समर्थन प्रदान करने के लिए, प्रक्रिया एक संस्कृति प्रारूप है कि यौगिकों के हजारों स्क्रीनिंग के साथ संगत है की आवश्यकता है । यहां, हम एक पूरी तरह से परिभाषित संस्कृति की स्थिति है, जो मानव iPSCs के reproducible भेदभाव की अनुमति का उपयोग कर प्रोटोकॉल का वर्णन hepatocyte-की तरह कोशिकाओं को ९६ में अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेटें । हम भी Apolipoprotein बी कम करने के लिए उनके लिए स्क्रीन यौगिकों के लिए मंच का उपयोग करने का एक उदाहरण प्रदान (APOB) iPSC से उत्पादित-व्युत्पंन हेपैटोसाइट्स एक पारिवारिक विटिलिगो रोगी से उत्पंन । एक मंच है कि दवा की खोज के साथ संगत है की उपलब्धता शोधकर्ताओं को रोगों है कि जिगर को प्रभावित करने के लिए उपंयास चिकित्सकीय पहचान की अनुमति चाहिए ।

Introduction

दवाओं है कि एक दुर्लभ बीमारी को लक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की पहचान करने में सफलता परख है कि स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के विकास पर निर्भर करता है । परिकल्पना या लक्ष्य आधारित स्क्रीन (रिवर्स औषध विज्ञान) उपयोगी होते हैं, लेकिन रोग के आणविक आधार की एक विस्तृत समझ की आवश्यकता होती है. Phenotypic स्क्रीन (शास्त्रीय औषध विज्ञान) जैव रासायनिक रास्ते की एक विस्तृत समझ की आवश्यकता से बचें, लेकिन बजाय मॉडल है कि सही ढंग से रोग के pathophysiology दर्पण के विकास पर भरोसा करते हैं । लक्ष्य आधारित दृष्टिकोण के लिए उत्साह के बावजूद, एफडीए अनुमोदित प्रथम श्रेणी में दवाओं के विश्लेषण से पता चलता है कि phenotypic स्क्रीन गया है अब तक अधिक सफल1। इस विधि का समग्र लक्ष्य उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग कि चयापचय जिगर की बीमारी के उपचार के लिए छोटे अणुओं की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के लिए एक मंच स्थापित करने के लिए है । कई इन विट्रो मॉडल प्राथमिक हेपैटोसाइट्स, hepatoma कोशिकाओं, और जिगर जनक कोशिकाओं2सहित वर्णित किया गया है । हालांकि, इन मॉडलों की सबसे सीमाएं हैं, और वहां नए मॉडल है कि सही ढंग से संस्कृति में चयापचय जिगर की कमी के pathophysiology दोहराऊंगा कर सकते है के लिए एक की जरूरत है । हाल ही में, मानव pluripotent स्टेम जीन संपादन के साथ संयुक्त कोशिकाओं को भी एक अवसर की पेशकश की है मॉडल को सीधे रोगियों का उपयोग करने की आवश्यकता के बिना संस्कृति में दुर्लभ रोगों के नायाब3। जबकि रोगी के प्रयोग विशिष्ट iPSCs एक उपकरण के रूप में दुर्लभ यकृत रोगों के उपचार के लिए छोटे अणुओं की खोज के लिए धारणात्मक उचित है, वहां केवल कुछ इस दृष्टिकोण की व्यवहार्यता का प्रदर्शन रिपोर्ट कर रहे है4। हालांकि, हम हाल ही में एक मंच है कि इस्तेमाल किया iPSC-व्युत्पंन हेपैटोसाइट्स सफलतापूर्वक दवाओं कि जिगर चयापचय में कमी के उपचार के लिए reपर्पज किया जा सकता है की पहचान की स्थापना की है5।

यह प्रोटोकॉल मानव iPSCs को hepatocyte-तरह की कोशिकाओं को ९६-अच्छी तरह प्लेटों में अंतर करने की प्रक्रिया को बताता है और उन्हें छोटे अणुओं के पुस्तकालय को स्क्रीन करने का उपयोग करता है । यह भी समापन बिंदु विश्लेषण चयापचय जिगर की बीमारी का एक उदाहरण के रूप में विटिलिगो का उपयोग करते हुए वर्णन । इस दृष्टिकोण की भूमिका और संक्रामक यकृत रोग के संदर्भ में छोटे अणुओं के आवेदन का अध्ययन करने के लिए उपयोगी होना चाहिए, चयापचय जिगर की बीमारी, दवा विषाक्तता, और अन्य जिगर विकारों.

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Protocol

1. मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम कोशिकाओं की संस्कृति

  1. कोटिंग रिकॉमबिनेंट मानव ई-Cadherin एफसी फ्यूजन प्रोटीन (ई-सीएडी-एफसी) या अन्य मैट्रिक्स hPSC संस्कृति के लिए उपयुक्त ६
    1. पतला E-सीएडी-एफसी के लिए 15 μg/एमएल Dulbecco के फास्फेट के साथ कैल्शियम और मैग्नीशियम युक्त खारा (DPBS (+)) ।
    2. कोट १००-mm सस्पेंशन ऊतक के साथ संस्कृति व्यंजन पतला ई के 5 मिलीलीटर-सीएडी-एफसी और ३७ ˚ सी पर कम से 1 ज के लिए गर्मी । सब्सट्रेट निकालें और मध्यम के 5 मिलीलीटर के साथ प्रतिस्थापित करें (उदा, mTeSR1 के रूप में कहा जाता है एम माध्यम से)7.
      नोट: इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त कल्चरल मीडियम को प्रकाशित प्रोटोकॉल7के बाद तैयार किया जाता है । हालांकि, कई अंय मीडिया तैयारियों का वर्णन किया गया है, या उपलब्ध है व्यावसायिक रूप से, कि संभावना प्रक्रिया के साथ संगत कर रहे हैं ।
    3. तरल नाइट्रोजन से cryopreserved iPSCs की एक शीशी निकालते हैं । एक छोटे से बर्फ क्रिस्टल रहता है जब तक ३७ ˚ सी पर गल । धीरे से एक बाँझ 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में पिपेट कोशिकाओं एम मध्यम के 4 मिलीलीटर युक्त.
    4. 5 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक । supernatant निकालें और धीरे से पुनः निलंबित कोशिकाओं के 10 Y-२७६३२, Rho के एक चयनात्मक अवरोधक से संबद्ध, कुंडलित-प्रोटीन युक्त कुंडल कळेनासे (रॉक) के µ एम के साथ पूरक के 5 मिलीलीटर ।
    5. एम-मध्यम से कदम 1.1.2 निकालें, और स्थानांतरण के 5 कोशिकाओं के कदम से 1.1.4 ई-cad-Fc-लेपित १००-mm सस्पेंशन ऊतक संस्कृति व्यंजन ।
  2. संस्कृति में मानव iPSCs को बनाए रखना
    1. एक बार iPSCs के आसपास पहुंच ८०% प्रवाह, संस्कृति मध्यम हटाने और कैल्शियम और मैग्नीशियम मुक्त DPBS (-) के साथ एक बार धोने । महाप्राण DPBS (-) और ०.०२% EDTA समाधान की एक पर्याप्त राशि जोड़ने के लिए प्लेटों को कवर, तो कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए मशीन ।
      नोट: ८०% संगम पर, प्लेट के आसपास 2 x 107 कोशिकाओं को शामिल करना चाहिए । यह कोशिकाओं को तबदील नहीं करने के लिए महत्वपूर्ण है, और यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोशिकाओं को एक अंतर आकृति विज्ञान बनाए रखने । कोशिकाओं के pluripotency स्टेम सेल मार्कर तर्-1-60 या समकक्ष8के साथ धुंधला द्वारा निर्धारित किया जा सकता है ।
    2. जैसे ही कोशिकाओं को रिलीज करने के लिए शुरू, ०.०२% EDTA समाधान निकालें और एम के 10 मिलीलीटर के साथ पकवान बाढ़-मध्यम कोशिकाओं को रिहा करने के लिए । धीरे pipetting द्वारा iPSCs की टुकड़ी सहायता ।
      नोट: कोशिकाओं को अलग करने के लिए औसत गर्मी समय 3 मिनट के आसपास है, लेकिन यह प्रत्येक iPSC लाइन के लिए empirically निर्धारित किया जाना चाहिए । कक्षों के रूप में छोटे समूहों के आसपास 5-10 iPSCs प्रति क्लस्टर युक्त जारी किया जाना चाहिए ।
    3. ताजा ई-सीएडी-एफसी लेपित १०० मिमी निलंबन ऊतक संस्कृति एम के 5 मिलीलीटर मध्यम से युक्त डिश प्रति निलंबित कोशिकाओं के 1/10 स्थानांतरण । 4% हे2/5% CO2 के तहत ३७ ˚ C पर संस्कृतियों की मशीन और मध्यम दैनिक बदल जाते हैं ।
      नोट: हालांकि iPSCs नियमित शारीरिक ऑक्सीजन शर्तों के तहत pluripotency को बढ़ावा देने के लिए, iPSCs भी परिवेश ऑक्सीजन का उपयोग कर उगाया जा सकता है ।

2. ९६-अच्छी तरह से प्लेटों पर Hepatocyte-like कोशिकाओं को मानव iPSCs का भेदभाव

नोट: यह खंड एक स्वरूप है कि स्क्रीनिंग के साथ संगत है में iPSCs के भेदभाव का वर्णन । इस दृष्टिकोण का उपयोग करना, यह मानव iPSCs पैदा करने के लिए अंतर करने के लिए और 20 दिनों में hepatocyte की तरह कोशिकाओं के रूप में संभव है । हालांकि यह सबसे परख के लिए उपयुक्त है, संस्कृति की लंबाई कोशिकाओं की परिपक्वता में सुधार करने के लिए बढ़ाया जा सकता है ।

  1. कोटिंग ९६-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेटें कम वृद्धि कारक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के साथ
    1. कमजोर मैट्रिक्स को 2 मिलीग्राम/एमएल के साथ बर्फ ठंडा बाँझ DMEM/F12 ऊतक संस्कृति माध्यम से शेयर तैयार करें । मैट्रिक्स में विभाजित २५० μL aliquots और स्टोर में-८० ˚ C जब तक की आवश्यकता है । चिल बर्फ पर DMEM/F12 के 10 मिलीलीटर 30 मिनट के लिए एक २५० μL aliquot 2 मिलीग्राम/एमएल मैट्रिक्स शेयर और बर्फ पर गल के लिए पुनः प्राप्त ।
    2. मिश्रण धीरे से एक पूर्व ठंडा पिपेट का उपयोग कर ०.०५ मिलीग्राम/एमएल के अंतिम एकाग्रता बनाने के लिए मैट्रिक्स ठंड DMEM/F12 के 10 मिलीलीटर के साथ गठबंधन ।
    3. एक ९६-well टिशू कल्चर प्लेट के प्रत्येक अच्छी तरह से पतला मैट्रिक्स के १०० μL स्थानांतरण । ३७ ˚ सी पर मशीन, 4% हे2/5% सह के लिए 2 से कम 1 ज । मैट्रिक्स को छोड़दो और एम के ५० μL के साथ प्रतिस्थापित-मध्यम प्रति अच्छी तरह से । ३७ डिग्री सेल्सियस पर स्टोर, 4% हे2/
  2. भेदभाव के लिए प्लेट कोशिकाओं
    1. संस्कृति १००-mm प्लेट्स पर iPSCs जब तक कोशिकाओं ८०% संगम दृष्टिकोण । सुनिश्चित करें कि प्लेट में लगभग 2 x 107 कक्ष हैं । कक्ष संख्याओं को सेल फ़्लो cytometer या hemocytometer द्वारा निर्धारित करें ।
      नोट: अनुभव के साथ, iPSCs कोशिकाओं की गुणवत्ता माइक्रोस्कोपी द्वारा ंयाय किया जा सकता है; हालांकि, करीब ९८% कोशिकाओं के pluripotency मार्करों जैसे तर्-1-60 epitope जब FACS या immunostaining द्वारा मापा के रूप में व्यक्त करना चाहिए । यह महत्वपूर्ण है कि कोशिकाओं को सक्रिय रूप से विभाजित रहते है और ऊंचा नहीं कर रहे हैं ।
    2. प्रत्येक १०० मिमी प्लेट से iPSCs फसल के लिए, संस्कृति माध्यम महाप्राण और DPBS के 5 मिलीलीटर के साथ कुल्ला (-) । सेल टुकड़ी समाधान के 3 मिलीलीटर के साथ कुल्ला बदलें (उदा, accutase) और ३७ ° c, 4% O2/5% सह2में लगभग 2 मिनट के लिए मशीन ।
      नोट: यह माइक्रोस्कोप द्वारा कोशिकाओं की टुकड़ी का पालन करने के लिए महत्वपूर्ण है । accutase के साथ पचा नहीं है । लक्ष्य ंयूनतम उपचार के साथ छोटे समूहों के रूप में कोशिकाओं को रिहा करने के लिए है ।
    3. जैसे ही कोशिकाओं को अलग करने के लिए शुरू, एम मध्यम के 7 मिलीलीटर जोड़कर फसल । सेल कालोनियों को लगभग 3-6 कक्षों के छोटे समूहों में अलग कर देना करने के लिए कईबार पिपेट(चित्र 1a) ।
    4. एक 15 मिलीलीटर बाँझ केंद्रापसारक ट्यूब में iPSCs लीजिए और 5 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक । supernatant निकालें और 5 मिलीलीटर एम मध्यम में सेल गोली पुनः निलंबित ।
    5. समान रूप से एक अच्छी तरह से निलंबन कोशिकाओं के pipetting ५० μL द्वारा ९६-अच्छी मैट्रिक्स-लेपित प्लेटों पर कोशिकाओं को वितरित । प्रत्येक ९६-well प्लेट सेट अप करने के लिए, iPSCs के १ १००-mm प्लेट का उपयोग लगभग ८०% पर कोशिकाओं के साथ प्रवाह जो करीब 5 x 10 6 कोशिकाओं को भेदभाव सेटअप करने के लिए शामिल हैं । इस प्रक्रिया को गति देने के लिए मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करें । संस्कृति ३७ ˚ सी पर रात भर कोशिकाओं, 4% O2/
      नोट: यह महत्वपूर्ण है कि reproducible विभेदों को सुनिश्चित करने के लिए कोशिकाओं की एक बराबर संख्या में एक अच्छी तरह से जमा किया जाता है ।
  3. कोशिकाओं के विभेद को प्रेरित
    1. जांच ९६-अच्छी तरह से प्लेटें माइक्रोस्कोपी से यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोशिकाएं प्रत्येक व्यक्ति की सतह का कम से ७०% कवर अच्छी तरह से । यदि कवरेज से कम ७०% है, ताजा माध्यम के साथ माध्यम की जगह और एक अतिरिक्त 24 के लिए मशीन ३७ ˚ C, 4% O2/5% CO2पर ।
      नोट: अधिक से अधिक ४८ के लिए कोशिकाओं की मशीनिंग विभेद प्रेरित किए बिना चढ़ाना के बाद आमतौर पर भेदभाव की दक्षता कम कर देता है । भेदभाव भी परिवेश ऑक्सीजन का उपयोग हो जाएगा, हालांकि दक्षता प्रभावित हो सकता है।
    2. 1 दिन के लिए भेदभाव के 2 दिन के लिए, 2% B27 (इंसुलिन के बिना), १०० एनजी/एमएल Activin एक, 10 एनजी/एमएल BMP4, और 20 एनजी/एमएल FGF2 के साथ पूरक RPMI के साथ संस्कृति माध्यम की जगह । जोड़ें १०० μL प्रति अच्छी तरह से मध्यम और ३७ ˚ सी पर मशीन, परिवेश हे2/5% सह 2 दिनों के लिए एक दैनिक माध्यम परिवर्तन के साथ2 में ।
      नोट: ९६ की बड़ी संख्या के साथ लेनदेन-अच्छी तरह से प्लेटें एक सहायता पिपेट या रोबोट के उपयोग की आवश्यकता है । 12 चैनल और ९६ चैनल पिपेट दैनिक माध्यम परिवर्तन के लिए आदर्श होते हैं ।
    3. 3 दिन के लिए भेदभाव के 5 दिन के लिए, संस्कृति माध्यम को 2% B27 (इंसुलिन के बिना) और १०० एनजी/एमएल Activin A. culture cells at ३७ ˚ C, परिवेश हे2/5% CO2 में 3 दिनों के लिए दैनिक माध्यम परिवर्तन के साथ पूरक RPMI के साथ बदलें ।
    4. भिंनता दिन 5 पर, ताजा संस्कृति माध्यम के साथ बदलने से पहले, 30 एस के लिए १०० μL ०.०२% EDTA समाधान के साथ एक अच्छी तरह से इलाज, तो निकालें और ताजा संस्कृति माध्यम के साथ बदलें ।
      नोट: यदि अन्तः करने के लिए भेदभाव कुशल है, कोशिकाओं अंतर की monolayer प्लेट से छीलने के लिए प्रवण है । ०.०२% EDTA समाधान के साथ एक संक्षिप्त उपचार सेल टुकड़ी को कम करने में मदद करता है । इस उपचार हेपैटोसाइट्स करने के लिए भेदभाव को प्रभावित नहीं करता है ।
    5. 6 से 10 दिनों के बीच विभेदन के लिए, RPMI के साथ संस्कृति माध्यम बदलें/2% B27 (इंसुलिन के साथ) 20 एनजी/एमएल BMP4 और 10 एनजी/एमएल FGF2 और ३७ ˚ सी पर मशीन, 4% हे2/5% सह दैनिक माध्यम परिवर्तन के साथ 5 दिनों के लिए2 पूरक । इस चरण में कोशिकाओं को यकृत जनक कोशिकाओं में अंतर लाती है ।
    6. 11 से 15 दिनों के बीच भेदभाव के लिए, RPMI/2% B27 (इंसुलिन के साथ) 20 एनजी/एमएल एचजीएफ के साथ पूरक के साथ संस्कृति माध्यम की जगह । ३७ ˚ सी पर मशीन, 4% O2/5% सह दैनिक माध्यम परिवर्तन के साथ 5 दिनों के लिए2 ।
    7. 16 से 20 दिनों के बीच भेदभाव के लिए, एक hepatocyte सेल संस्कृति माध्यम (HCM) Oncostatin-M (OSM) के 20 एनजी/एमएल के साथ पूरक के साथ संस्कृति माध्यम की जगह । ३७ ˚ सी में कोशिकाओं की मशीन, परिवेश हे2/5 में 5 दिनों के लिए दैनिक माध्यम परिवर्तन के साथ% सह2 ।
      नोट: व्यक्तिगत कुओं के बीच भेदभाव के reproducibility कुशलतापूर्वक एल्ब्युमिन, एएफपी, या एलिसा द्वारा माध्यम में secreted APOB के सापेक्ष स्तर को मापने के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है (३.२ देखें) ।

3. लघु अणु स्क्रीनिंग

नोट: निंनलिखित प्रक्रिया का वर्णन करता है यौगिकों कि hepatocyte की तरह पारिवारिक विटिलिगो iPSCs से व्युत्पंन की कोशिकाओं के माध्यम में APOB के स्तर को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की पहचान । कोलेस्ट्रॉल कम करने वाली दवाओं की पहचान में मॉडल और उसके उपयोग का विवरण पहले से5,9विस्तार से बताया गया है । वर्तमान उदाहरण में, दक्षिण कैरोलिना यौगिक संग्रह (SC3) लाइब्रेरी से १,००० यौगिकों की जांच की गई । प्रत्येक यौगिक 2 μg/एमएल की एकाग्रता पर परीक्षण किया गया ।

  1. छोटे अणुओं के साथ iPSC-व्युत्पन्न हेपैटोसाइट्स का उपचार
    1. 2% DMSO में 20 μg/एमएल की एकाग्रता पर यौगिकों के साथ काम कर शेयरों की प्लेटें उत्पंन करने के लिए मास्टर यौगिक पुस्तकालय को पतला करें और-20 ˚ C पर स्टोर करें ।
    2. पर्याप्त ९६-अच्छी तरह से iPSC-व्युत्पंन हेपैटोसाइट्स की प्लेटें प्रत्येक यौगिक परीक्षण किया जा करने की अनुमति के लिए तैयार करें ।
      नोट: यौगिकों की संख्या ९६ की संख्या-अच्छी तरह से प्लेटें कि आवश्यक है हुक्म चलाना होगा । सामांय में, एक अच्छी तरह से प्रत्येक यौगिक के लिए तैयार किया जाना चाहिए, प्लस अतिरिक्त कुओं किसी भी नियंत्रण के नमूने के लिए । प्लेट के सबसे बाहरी कुएँ सामान्यतः बढ़त प्रभाव की संभावना को कम करने से बचते हैं जो व्याख्या को भ्रष्ट कर सकते हैं. हिट्स z-स्कोर विधि का उपयोग करने की आवश्यकता के बिना प्रतिकृति का उपयोग कर पहचाना जा सकता है । यदि प्रतिकृति शामिल हैं, तो यह t परीक्षण का उपयोग करने के लिए अधिक उपयुक्त है ।
    3. अंतर के पूरा होने पर (20 दिवस, 2.3.7 देखें), १०० μL के साथ संस्कृति माध्यम की जगह ताजा HCM के साथ पूरक है 20 Oncostatin के एनजी/ ३७ ˚ सी में मशीन, 4% हे2/5% सह2 ठीक है 24 घंटे के लिए एक ताजा ९६-अच्छी तरह से प्लेट में संस्कृति माध्यम पुनः प्राप्त करने और दुकान पर-20 ˚ सी । दवा के अलावा पहले माध्यम में APOB के स्तर की गणना करने के लिए इस नमूने का उपयोग करें ।
    4. एक अच्छी तरह से Oncostatin-M के 20 एनजी/एमएल के साथ पूरक ९० ताजा HCM के μL जोड़ें । pipetting द्वारा मिश्रण करने के बाद वर्किंग स्टॉक से प्रत्येक यौगिक के 10 μL जोड़ें । कुओं को नियंत्रित करने के लिए ०.२% करने के लिए DMSO जोड़ें इलाज के नमूनों में अंतिम एकाग्रता मैच और ३७ ˚ सी पर मशीन, परिवेश ओ2/5% सह2 के लिए बिल्कुल 24 ज. संस्कृति माध्यम और स्टोर में लीजिए-20 ˚ c. यौगिकों के साथ उपचार के बाद APOB का स्तर निर्धारित करने के लिए इस नमूने का उपयोग करें ।
    5. वैकल्पिक-शेष कोशिकाओं मानक दृष्टिकोण का उपयोग कर immunostaining, कोशिका व्यवहार्यता, या mRNA स्तर के विश्लेषण के लिए संसाधित किया जा सकता है ।
      नोट: इस स्क्रीन APOB स्तरों पर तेजी से प्रभाव पड़ा है कि दवाओं की पहचान करने के लिए डिजाइन किया गया था । हालांकि, रोग मॉडल, बहाव परख, या दवा कार्रवाई के तंत्र पर निर्भर करता है, यह कई दिनों के लिए नमूने का इलाज करने के लिए फायदेमंद हो सकता है ।
  2. एलिसा द्वारा APOB स्तरों का निर्धारण
    1. निर्धारित Apolipoprotein बी (APOB) एकाग्रता दोनों पूर्व और बाद दवा एक मानव APOB एलिसा विकास के निर्माता प्रोटोकॉल के बाद किट का उपयोग कर नमूनों का इलाज ।
    2. निंन समाधान तैयार कर रहा है
      1. धो बफर, ०.०५% के बीच पंजाब में 20, पीएच ७.४ से बना । उपयोग करने तक 4 ˚ C पर संग्रहीत करें ।
      2. , ०.०५% के बीच 20 और ०.१% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) में पंजाब, पीएच ७.४ से बना मशीन बफर । उपयोग करने तक 4 ˚ C पर संग्रहीत करें ।
    3. तैयार APOB (मॉब 20/17) एंटीबॉडी से कमजोर तक 2 µ g/mL में, पीएच ७.४ । अच्छी तरह से प्रति पतला एंटीबॉडी के १०० μL जोड़ें और 4 ˚ सी पर गर्मी रात भर ।
    4. परख प्लेटों से एंटीबॉडी निकालें और एक अच्छी तरह से दो बार २०० पंजाबियों, पीएच ७.४ के μL के साथ धो लो ।
    5. जोड़ें २०० μL/०.०५% के बीच 20, ०.१% पंजाब में गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA), पीएच ७.४ और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए एक मिलाकर मंच पर मशीन ।
    6. एक 8 सूत्री मानक वक्र ०.०५% के बीच का उपयोग कर तैयार 20 और ०.१% BSA में पंजाबियों, APOB की निम्न सांद्रता के साथ pH ७.४:३०० एनजी/एमएल, २०० एनजी/एमएल, १७५ एनजी/एमएल, १५० एनजी/एमएल, १२५ एनजी/एमएल, १०० एनजी/एमएल, ७५ एनजी/एमएल, और ५० एनजी/
    7. परीक्षण नमूनों 1:4 ०.०५% के बीच 20 और पंजाब में ०.१% BSA, पीएच ७.४ के साथ पतला ।
    8. 1 के बाद मशीन बफर के साथ अवरुद्ध की ज, बफर त्याग और परख प्लेटें धो पांच बार ०.०५% के २०० μL के साथ 20 के बीच में पंजाब, पीएच ७.४ ।
    9. पूरी तरह से किसी भी अवशिष्ट धोने बफर और स्थानांतरण ९० पतला नमूनों की μL और परख प्लेटों के लिए APOB मानकों को हटा दें । 1 घंटे के लिए एक शेखर पर कमरे के तापमान पर मशीन
    10. नमूने को त्यागें और २०० μL ०.०५% के बीच 20 के बीच पंजाब, पीएच ७.४ प्रति अच्छी तरह से धो लें । इस बहाकर को कुल 5 बार दोहराएं । जोड़ें १०० μL के प्रति अच्छी तरह से मॉब एलडीएल 11-बायोटिन पतला 1:1000 में ०.०५% के बीच 20 और ०.१% BSA में पंजाब, पीएच ७.४ । 1 एच के लिए एक मिलाते हुए मंच पर कमरे के तापमान पर मशीन ।
    11. पुनर्अभिकर्ता को त्यागें और अच्छी तरह से धोने बफर प्रति २०० μL के साथ धो 5 बार । जोड़ें १०० μL Streptavidin के प्रति अच्छी तरह से-एचआरपी एंटीबॉडी (1:1000 कमजोर पड़ने मशीन बफर का उपयोग), तो 1 एच के लिए एक मिलाते हुए मंच पर कमरे के तापमान पर गर्मी ।
    12. त्यागें और २०० μL ०.०५% पंजाबियों में 20 के बीच, अच्छी तरह से प्रति पीएच ७.४ के साथ धो छोड़ें । इस बहाकर को कुल 5 बार दोहराएं । पूरी तरह से परख प्लेटों से अवशिष्ट धोने बफर निकालें और Tetramethylbenzidin (TMB) सब्सट्रेट समाधान के प्रति अच्छी तरह से १०० μL जोड़ें, और 8 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी ।
    13. TMB सब्सट्रेट को हटाने के बिना, सीधे रोक समाधान (1N HCl) के प्रति अच्छी तरह से १०० μL जोड़ें ।
    14. ४५० एनएम में एक प्लेट रीडर का उपयोग कर अवशोषक निर्धारित करते हैं ।
    15. एक मानक वक्र, चार पैरामीटर रसद प्रतिगमन विधि का उपयोग कर स्थापित किया जा सकता है, तो प्रत्येक नमूने में APOB की एकाग्रता को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया10.
    16. पूर्व दवा की जांच करें: प्रत्येक नमूने में APOB के बाद दवा अनुपात मध्यम में APOB के स्तर को कम करने की क्षमता के साथ यौगिकों की पहचान करने के लिए.

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Representative Results

hepatocyte की पीढ़ी - कक्षों की तरह: चित्रा 1 hepatocyte की तरह कोशिकाओं के लिए मानव iPSCs के भेदभाव के दौरान होने वाले परिवर्तनों की समय सीमा का वर्णन करता है । E-सीएडी-एफसी पर iPSCs की संस्कृति लगभग 2 मिमी व्यास कालोनियों प्रदान करता है कि pluripotent मार्कर OCT4 (चित्र 1a-बी) व्यक्त करते हैं । एक E-cadherin मैट्रिक्स पर उगाई गई कोशिकाओं की आकृति विज्ञान अंय सतहों पर उन लोगों के लिए थोड़ा अलग हो जाएगा । वे एक बड़ा cytoplasmic सतह क्षेत्र (चित्र 1a) के साथ एक चपटा आकृति विज्ञान है करते हैं । हालांकि मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं को कुशलतापूर्वक अलग मैट्रिक्स की संख्या11पर किया जा सकता है, एक E-cadherin मैट्रिक्स पर iPSCs की संस्कृति pluripotent सेल जनसंख्या की एकरूपता बढ़ाने के लिए माना जाता है और एंजाइम मुक्त अनुमति देता है 12बीतने के दौरान कोशिकाओं में हेरफेर । हालांकि, कई वैकल्पिक मैट्रिक्स, तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स, laminins, vitronectin, और माउस भ्रूण fibroblasts (MEF) सहित, भी मानव iPSCs बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और सभी वर्णित प्रक्रिया13के साथ संगत होना चाहिए । सभी मामलों में, कक्ष pluripotency को तर्-1-60 या समतुल्य8द्वारा पुष्ट किया जा सकता है ।

भेदभाव शुरू करने के लिए, iPSCs छोटे समूहों के रूप में एकत्र किया जाना चाहिए (चित्र 1a) । भेदभाव की शुरुआत में, मढ़वाया कोशिकाओं प्लेट की सतह के लगभग ८०% कवर करना चाहिए । विकास कारकों के साथ उपचार के 5 दिनों के बाद, कोशिकाओं को विशिष्ट रूप से ऐसे SOX17 और FOXA2 (चित्र 1b) के रूप में निश्चित अन्तः में व्यक्त कर रहे हैं कि प्रोटीन व्यक्त करते हैं । इस स्तर पर, कोशिकाओं के ९०% से अधिक आम तौर पर इन मार्करों व्यक्त करते हैं । भेदभाव के 5 अधिक दिनों के बाद, अन्तः एक यकृत भाग्य में धर्मांतरित, और FOXA2 के अलावा, कोशिकाओं HNF4a, जो भेदभाव की प्रक्रिया (आंकड़ा 1b) के शेष भर में पहचाना जा सकता है एक्सप्रेस । के रूप में कोशिकाओं को एक यकृत भाग्य को अपनाने, वे एक monolayer के रूप में थाली की सतह को कवर करना चाहिए । एचजीएफ के अलावा, कोशिकाओं को प्रोटीन है कि एएफपी (चित्र 1b) सहित भ्रूण हेपैटोसाइट्स में पाए जाते है व्यक्त करने के लिए शुरू करते हैं । लिपिड बूंदों कोशिकाओं के कोशिका द्रव्य के भीतर मनाया जा सकता है । भेदभाव के पूरा होने पर, कोशिकाओं को एक प्रमुख nucleoli और कई लिपिड बूंदों के साथ एक बड़े कोशिका द्रव्य युक्त नाभिक के साथ एक cuboidal आकृति विज्ञान को अपनाने । hepatocyte-जैसे कक्षों का सबसेट बहु-nucleated होगा । कोशिकाओं के अधिकांश एल्ब्युमिन (चित्र 1b)14सहित hepatocyte प्रोटीन के एक व्यापक प्रदर्शनों की अनुक्रमांकों को व्यक्त करते हैं ।

प्रभावी उच्च प्रवाह स्क्रीन एक रोग मॉडल के रूप में विटिलिगो का उपयोग: विटिलिगो सीरम में कम घनत्व लिपोप्रोटीन-कोलेस्ट्रॉल (एलडीएल-सी) की अत्यधिक सांद्रता को दर्शाता है । पारिवारिक विटिलिगो (एफ एच) में, सीरम एलडीएल के बढ़े हुए स्तर सी के कारण मुख्य रूप से कम घनत्व लिपोप्रोटीन रिसेप्टर (LDLR) में उत्परिवर्तनों के लिए है कि मध्यस्थता के हेपैटोसाइट्स द्वारा मंजूरी के लिए एलडीएल सी की वृद्धि हुई है । हम पहले homozygous पारिवारिक विटिलिगो और हेपैटोसाइट्स है कि संस्कृति में रोगी के जिगर की बीमारी को प्रतिबिंबित में उनके उपयोग के साथ एक रोगी से iPSCs की पीढ़ी का वर्णन किया है9। यह प्रदर्शन किया है कि इन कोशिकाओं को दवा की खोज के लिए एक मंच के रूप में सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया जा सकता था । जब ~ २,५०० दवाओं के एक पुस्तकालय की जांच की थी, यह पाया गया कि कार्डियक glycosides एक अप्रत्याशित को कम एलडीएल iPSC में सी-व्युत्पंन हेपैटोसाइट्स, प्राथमिक मानव हेपैटोसाइट्स, और मानव जिगर के साथ चूहों में करने की क्षमता थी । इसके अलावा, रोगी चिकित्सा रिकॉर्ड की जांच पर, हमने पाया है कि कोलेस्ट्रॉल का स्तर रोगियों कि हृदय रोग के उपचार के लिए एक हृदय ग्लाइकोसाइड निर्धारित किया गया में गिर गया । इन अध्ययनों की पुष्टि की है कि iPSC-व्युत्पंन हेपैटोसाइट्स सफलतापूर्वक स्क्रीन में इस्तेमाल किया जा सकता है चिकित्सकीय पहचान ।

आदेश में एक मंच है कि स्क्रीनिंग के साथ संगत है प्रदान करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि भेदभाव reproducible है और अच्छी तरह से रूपांतरित करने के लिए अच्छा है कि छोटा है । चित्रा 2 एक ९६ के प्रत्येक अच्छी तरह से प्लेट पर immunostaining के परिणाम से पता चलता है HNF4a और एल्ब्युमिन का पता लगाने के लिए 20 दिन में भेदभाव के । के रूप में आंकड़ा में देखा जा सकता है, इन hepatocyte प्रोटीन का वितरण सभी कुओं के पार समान है ।

एलडीएल-सी का सेंट्रल प्रोटीन कंपोनेंट APOB है । यहां, हम उपयोग किया है iPSCs स्क्रीन करने के लिए APOB कम यौगिकों का उपयोग करने का एक उदाहरण प्रदान करने के लिए iPSC-व्युत्पंन हेपैटोसाइट्स छोटे अणु स्क्रीनिंग के लिए (चित्र 3) । APOB एलिसा द्वारा समाधान में आसानी से मापा जा सकता है । चूंकि एलिसा नमूनों की बड़ी संख्या पर प्रदर्शन किया जा सकता है, यह एक स्क्रीन के लिए एक आधार के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग के लिए किसी भी परख की उपयुक्तता सबसे अच्छा z-कारक (या z ')15नामक माप का उपयोग करके निर्धारित किया जाता है । यह सांख्यिकीय पैरामीटर सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण नमूनों के बीच अंतर करने के लिए एक परख की प्रभावशीलता की गणना करता है । एक Z-फैक्टर के साथ एक परख > 0.5 एक स्क्रीन15के साथ संगत माना जाता है । के रूप में चित्र बीमें देखा जा सकता है, Z ' APOB परख = ०.७३, जो दवा की खोज के लिए मंच का उपयोग करने की उपयुक्तता की पुष्टि की ।

यौगिकों कि iPSC के संस्कृति माध्यम में APOB स्तर को कम करने की क्षमता है की पहचान - व्युत्पंन हेपैटोसाइट्स: निर्धारित करने के लिए कि क्या मंच उपंयास यौगिकों कि प्रभाव APOB स्तर की पहचान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, हम दक्षिण कैरोलिना यौगिक संग्रह (अनुसूचित जाति3) प्रतिनिधि सेट लाइट (RSL) से १,००० छोटे अणुओं की जांच की । RSL चिकित्सीय खोज के लिए MUSC दक्षिण कैरोलिना केंद्र द्वारा उत्पंन किया गया था, और यौगिकों कि संरचनात्मक रूप से विविध रहे है और जनक पुस्तकालय को प्रतिबिंबित भी शामिल है ।

बाद दवा: APOB के पूर्व दवा अनुपात प्रत्येक यौगिक (चित्रा3 सी) के लिए निर्धारित किया गया था और हिट की पहचान z-स्कोर विश्लेषण द्वारा प्राप्त किया गया था (चित्रा 3d)16. इस मामले में, छोटे अणुओं है कि एक जेड के साथ APOB कम-स्कोर ≤-२.० संभावित हिट के रूप में विचार किया गया । जब स्क्रीनिंग १,००० छोटे अणुओं, एक जेड के साथ संभावित हिट की संख्या-≤-२.० के स्कोर आमतौर पर अपेक्षाकृत प्रबंधनीय है । हालांकि, जब एक बड़ी स्क्रीन का आयोजन, हम ≤ के एक और अधिक रूढ़िवादी स्कोर-३.०, 3 सिग्मा नियम पर आधारित है, पर भरोसा करने के लिए संभावित लक्ष्यों में विश्वास में वृद्धि होगी । इस उदाहरण में, हम एक APOB अनुपात है कि ०.८६ से ०.४४ (चित्र 4a) के लिए विभिंन के साथ 24 संभावित हिट की पहचान की । एक माध्यमिक परख quadruplicate नमूनों पर किया गया था (n = 4 जैविक प्रतिकृति) यौगिकों कि सेल व्यवहार्यता पर एक नकारात्मक प्रभाव पड़ा है और निर्धारित करने के लिए जो यौगिकों के माध्यम में कम APOB reproducibly सकता है बाहर करने के लिए । मूल 24 प्रत्याशी यौगिकों में से चार को reproducible (पी ≤ ०.०५) (चित्रा 4B-सी) होना पाया गया । आगे के अध्ययन पर, इन यौगिकों के 2 नकारात्मक कोशिका व्यवहार्यता को प्रभावित करने के लिए पाया गया, सुझाव है कि APOB में मनाया कमी सेल नुकसान का एक परिणाम होने की संभावना थी. शेष दो यौगिकों अनुवर्ती अध्ययन के लिए अच्छे उम्मीदवारों पर विचार किया जाएगा.

Figure 1
चित्र 1 : मानव iPSCs के चरण-वार यकृत विभेद. (क) फसल (बाएं पैनल) और iPSCs के लिए कोशिकाओं को इकट्ठा करने के बाद iPSC कालोनियों के तुरंत आकृति विज्ञान (सही पैनल)-accutase उपचार के बाद, कोशिकाओं 3-6 कोशिकाओं में असंबद्ध किया जाना चाहिए/ स्केल बार = ५० µm. (B) भिंनता के प्रत्येक चरण (ऊपरी) पर संस्कृति की स्थितियां दिखाने वाली तालिका । Immunostaining (कम पैनलों) भेदभाव के प्रत्येक चरण में मार्कर अभिव्यक्ति की पहचान करने के लिए किया गया था । पैनलों OCT4 और DAPI iPSCs में सना हुआ नाभिक, SOX17 और निश्चित FOXA2 में अन्तः, HNF4a और यकृत FOXA2 कोशिकाओं में जनक, HNF4a और अपरिपक्व hepatocyte में एएफपी कोशिकाओं की तरह, और HNF4a और एल्ब्युमिन अपेक्षाकृत परिपक्व hepatocyte की तरह कोशिकाओं में दिखा । स्केल पट्टियां = १०० µm (B) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : समरूप ९६ में मानव iPSCs के यकृत भेदभाव-अच्छी तरह से प्लेटें । Immunostaining एक ९६-अच्छी तरह से iPSC युक्त प्लेट के प्रत्येक व्यक्ति को अच्छी तरह से प्रदर्शन किया गया-हेपैटोसाइट्स 20 दिन में विभेदन के लिए पता लगाने के लिए ()एल्ब्युमिन और (ख) HNF4a । स्केल बार = १०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : छोटे अणु स्क्रीनिंग मानव iPSC-व्युत्पंन हेपैटोसाइट्स का उपयोग कर । (क) iPSC-व्युत्पंन हेपैटोसाइट्स के माध्यम में ABOB के स्तर को कम कर सकते हैं कि यौगिकों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल दृष्टिकोण का योजनाबद्ध सिंहावलोकन. (ख) एक एलिसा परख के theresults दिखा ग्राफ ८७ कुओं के माध्यम (n = ८७) में APOB के स्तर का पता लगाने के लिए iPSC-व्युत्पंन हेपैटोसाइट्स (नीला) और/या विभेदित iPSCs (नारंगी) । ये डेटा किसी z-फ़ैक्टर (z ' = ०.७३) की गणना करने के लिए उपयोग किया गया था । ( ग) पोस्ट-ड्रग दिखा ग्राफ: iPSC के संस्कृति माध्यम में APOB की एकाग्रता के पूर्व दवा अनुपात-अनुसूचित जाति3 RSL सेट से ९९८ यौगिकों के साथ 24 एच के लिए इलाज हेपैटोसाइट्स व्युत्पंन । (D) ग्राफ़ में प्रस्तुत डेटा का z-स्कोर दिखा रहा है (C) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : प्राथमिक हिट का सत्यापन. (A) APOB को कम करने में सक्षम होने के रूप में प्राथमिक स्क्रीन में पहचाने गए यौगिकों दिखा तालिका । (B, C) बार-दवा के बाद पर यौगिकों के प्रभाव दिखा रहा है रेखांकन: पूर्व दवा APOB एकाग्रता अनुपात (ख) और कोशिका व्यवहार्यता (सी) iPSC में अनुवर्ती विश्लेषण में यौगिकों के साथ इलाज हेपैटोसाइट्स व्युत्पंन. त्रुटि पट्टियां प्रतिबिंबित ± SEM (n = 4 जैविक प्रतिकृति); * पृ ≤ ०.०५ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

लक्ष्य आधारित दवा की खोज, जहां छोटे अणुओं की पहचान की है कि एक विशिष्ट प्रोटीन की गतिविधि को प्रभावित, कई मौजूदा स्क्रीनिंग के प्रयासों का ध्यान केंद्रित किया गया है । हालांकि इस दृष्टिकोण कई फार्मास्यूटिकल्स प्रदान की गई है, एक phenotype, शास्त्रीय औषध विज्ञान के पीछे के आधार पर स्क्रीन, पहली में वर्ग यौगिकों कि नैदानिक प्रभावोत्पादक गया है की पहचान करने में अधिक सफल रहे हैं1. phenotypic दवा की खोज करने के लिए एक नुकसान यह है कि यह उचित रोग मॉडल की उपलब्धता पर निर्भर करता है । इस बीमारी के सेल मॉडल अनुपलब्ध है जब एक चुनौती हो सकता है, या जब आम अनुसंधान पशु प्रजातियों नैदानिक लक्षण दोहराऊंगा करने में विफल । हालांकि, एक रोगी की दैहिक कोशिकाओं से iPSCs उत्पन्न करने की क्षमता में मॉडल मानव रोग के लिए नए अवसर प्रदान की गई है संस्कृति3. दुर्लभ आनुवंशिक रोगों के रूप में कुछ रोगों के लिए, रोगियों संख्या में कुछ हो सकता है, और पहुँच और सहमति के लिए मुश्किल. हालांकि, जीनोम इंजीनियरिंग के आगमन के साथ, यह अपेक्षाकृत iPSC जीनोम में करणीय उत्परिवर्तनों परिचय सरल है, यह भी दुर्लभ रोगों के नायाब मॉडल को संभव बना ।

एक बार iPSCs हाथ में हैं, यह एक उपयुक्त कोशिका प्रकार है जिसमें रोग के लक्षण प्रकट उत्पादन करने के लिए आवश्यक है । उदाहरण के लिए, तंत्रिका समारोह को प्रभावित करने वाले रोगों न्यूरॉन्स या glia की पीढ़ी की आवश्यकता हो सकती है17, जबकि उन जिगर को प्रभावित करने की आवश्यकता हो सकती है हेपैटोसाइट्स9,18 या पित्त उपकला कोशिकाओं के अध्ययन के लिए19, 20 , 21. इस आवश्यकता निरंतर जब दवा की खोज के लिए iPSCs के उपयोग पर विचार की एक संख्या का परिचय । सबसे पहले, यह रोग के सेलुलर आधार को समझने के लिए महत्वपूर्ण है । यह चुनौतीपूर्ण हो सकता है, खासकर जब कोशिकाओं स्थान या वातावरण के आधार पर विशेषताओं को अपनाने । यह हेपैटोसाइट्स कि जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल और एंजाइमी समारोह में मतभेद है कि जिगर छोटि के भीतर अपने स्थान पर निर्भर कर रहे है के लिए सच हो सकता है । दूसरा, अलगाव में किसी भी कोशिकाओं के साथ काम करने से रोगों के अध्ययन है कि सिरोसिस के रूप में ऊतक संरचना, कोशिका कोशिका संचार जैसे neuromuscular रोग, या उन है कि सूजन से प्रभावित कर रहे है के रूप में एक व्यवधान को प्रतिबिंबित रोक सकता है भड़काऊ जैसे आंत्र रोग ।

यकृत रोग का अध्ययन करने के लिए, कई अनुसंधान समूहों iPSCs13,22,23,24,25से hepatocyte की तरह कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन किया है । हालांकि इन प्रोटोकॉल के अधिकांश कुशल हैं, तकनीक की सीमा है कि कोशिकाओं को पूरी तरह से ताजा हेपैटोसाइट्स के समारोह दोहराऊंगा नहीं है । इसका मतलब यह निर्धारित करने के लिए कि क्या कोशिकाओं iPSCs से उत्पंन एक दिया उत्परिवर्तन के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए आवश्यक कार्यों प्रदर्शन महत्वपूर्ण है । जीन जिनकी अभिव्यक्ति पूरी तरह से मेल नहीं खाती है कि ताजा हेपैटोसाइट्स में पाया के अलावा उन एंकोडिंग CYP450 प्रोटीन25,26हैं । इन प्रोटीन के कई दवा चयापचय और xenobiotic प्रतिक्रिया में भूमिका है । यह महत्वपूर्ण है जब एक स्क्रीन के डिजाइन पर विचार क्योंकि कई दवाओं सक्रिय चयापचयों की पीढ़ी की आवश्यकता है, और यह iPSC में प्रभावित हो सकता है-हेपैटोसाइट्स व्युत्पंन । हेपैटोसाइट्स की गुणवत्ता में सुधार लाने के प्रयासों को सक्रिय रूप से27को आगे बढ़ाया जा रहा है । निरंतर के बावजूद, कई अध्ययनों से दिखा दिया है कि iPSCs यकृत चयापचय में अजन्मा त्रुटियों के साथ रोगियों से व्युत्पंन सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया जा सकता है hepatocyte उत्पंन करने के लिए कोशिकाओं की तरह है कि संस्कृति में रोग के pathophysiology दर्पण9 , 18 , 28 , 29.

स्क्रीन सफल होने के लिए, यह iPSCs से हेपैटोसाइट्स के समरूप भेदभाव सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है । जब ९६ में भिंनता-अच्छी तरह से प्लेटें उच्च गुणवत्ता हेपैटोसाइट्स उपज में विफल, यह सबसे अधिक कारण है या तो पैतृक iPSCs या iPSCs की संस्कृति उप के तहत इष्टतम शर्तों के गरीब गुणवत्ता के लिए । Pluripotency के iPSCs प्रोटोकॉल १.२ में वर्णित के रूप में दैनिक परिवर्तन के साथ एक उच्च गुणवत्ता वाले माध्यम में संस्कृति द्वारा सावधानी से बनाए रखा जाना चाहिए । संस्कृति पकवान में pluripotent कोशिकाओं का घनत्व ध्यान से निगरानी की जानी चाहिए, क्योंकि अगर कोशिकाओं को धाराप्रवाह वे pluripotency खो देते है और अनायास अंतर हो जाते हैं । हम यह भी पाते है कि संवर्धन शारीरिक ऑक्सीजन सांद्रता में कोशिकाओं pluripotency को बढ़ावा देता है और भेदभाव के कुछ चरणों के दौरान लाभप्रद है । हालांकि, अगर उचित उपकरण उपलब्ध नहीं है, यह अभी भी दोनों संस्कृति pluripotent कोशिकाओं को परिवेश ऑक्सीजन का उपयोग करें और विभेद पैदा संभव है । हम नियमित रूप से व्यापक भेदभाव प्रदर्शन करने से पहले OCT-3/4, NANOG, और तर्-1-60 सहित कई pluripotency मार्करों की अभिव्यक्ति को मापने के द्वारा शेयर iPSCs के pluripotency को परिभाषित सुझाव है कि संस्कृति की स्थिति की परवाह किए बिना । हम यह भी देखा है कि जब कोशिकाओं उच्च दक्षता पर अन्तः फार्म, वे एक सेल शीट के रूप में प्लेटों की सतह से peal करने की प्रवृत्ति है । हमने पाया है कि संक्षेप में ०.०२% EDTA समाधान के साथ iPSC-व्युत्पंन अन्तः कोशिकाओं के इलाज के लिए सेल टुकड़ी को कम करने में मदद कर सकते हैं । अंत में, कुशल भेदभाव के लिए आवश्यक कोशिकाओं के इष्टतम एकाग्रता iPSC लाइनों के बीच अलग कर सकते हैं और सेल टुकड़ी को प्रभावित कर सकते हैं । इस कारण से, यह महत्वपूर्ण है empirically कुशल भेदभाव के लिए आवश्यक कोशिकाओं की एकाग्रता निर्धारित करते हैं, खासकर जब एक नई iPSC संस्कृति के साथ काम कर रहे ।

संक्षेप में, हम एक कदम-वार भेदभाव प्रोटोकॉल है कि रासायनिक स्क्रीन के साथ संगत कर रहे हैं iPSCs से hepatocyte की तरह कोशिकाओं को उत्पन्न करता है वर्णित है. hepatocyte की तरह कोशिकाओं ९६ में monolayers-अच्छी तरह से प्लेटों के रूप में उत्पादित कर रहे हैं, और प्रक्रिया कुशल और reproducible है । हम संस्कृति माध्यम में APOB के स्तर को कम करने की क्षमता के लिए स्क्रीनिंग यौगिकों की व्यवहार्यता प्रदर्शित करते हैं । भिंनता प्रारूप एलिसा, qRT-पीसीआर, और उच्च सामग्री इमेजिंग सहित कई परख के साथ संगत है । हमें विश्वास है कि क्षेत्र संभावित चिकित्सीय और hepatocyte भेदभाव और भविष्य के अनुप्रयोगों में समारोह को प्रभावित रास्ते की औषधीय पहचान के लिए5,30की पहचान करने के लिए उपयोगी दृष्टिकोण मिल जाएगा ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

इस कार्य में स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (DK55743, DK087377, DK102716 और HG006398 को एस. ए. डी.) का समर्थन प्राप्त था. हम डॉ Behshad Pournasr, डॉ जेंस Heslop और उनके योगदान के लिए Jing भाग शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm x 20 mm sterile tissue culture dishes  Corning 430167
100 mm x 20 mm sterile suspension culture dishes Corning 430591
96-wells tissue culture plate  Corning 3595
Anti-human Albumin Dako A 0001
Anti-human FOXA2(6C12) Novus Biological H00003170-M12
Anti-human HNF4 alpha Santa Cruz SC-6556
Anti-human Oct-3/4 antibody Santa Cruz SC-9081
Anti-human SOX17 R&D AF1924
Anti-human TRA-1-60 FITC conjugated Millipore FCMAB115F
Activin A Recombinant Human Protein  Invitrogen PHC9563
B-27 Supplement, minus insulin  Invitrogen 0050129SA
B-27 Supplement, serum free  Invitrogen 17504044
BMP4 Recombinant Human Protein  Invitrogen PHC9533
Cell Dissociation Reagent StemPro  Accutase  Invitrogen A1110501
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay  Promega 7572
DPBS+(calcium, magnesium) Invitrogen 14040-133
DPBS-(no calcium, no magnesium) Invitrogen 14190-144
DMEM/F-12, HEPES  Invitrogen 11330057
ELISA human APOB ELISA development kit Mabtech 3715-1H-20
Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2) Invitrogen PHG0023
Hepatocyte Culture Medium (HCM Bullet Kit)  Lonza CC-3198
Hepatocyte Growth Factor  (HGF) Invitrogen PHC0321
L-Glutamine  Invitrogen 25030081
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Invitrogen 11140076
Oncostatin M (OSM) Recombinant Human Protein  Invitrogen PHC5015
Penicillin-Streptomycin  Invitrogen 15140163
Feeder free pluripotent stem cell medium: mTesR1  STEMCELL technologies 5850
Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix  Invitrogen A1413301
RPMI 1640 Medium, HEPES  Invitrogen 22400105
StemAdhere Defined Matrix for hPSC (E-cad-Fc) Primorigen Biosciences S2071
TMB-ELISA Substrate Solution Thermo Scientific  34022
Anti-TRA-1-60 FITC conjugated Millipore FCMAB115F
Versene (EDTA) 0.02%  Lonza 17-711E
Y-27632 ROCK inhibitor STEMCELL Technologies 72302

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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विकास जीवविज्ञान अंक १३५ प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल कोशिका संस्कृति Hepatocyte विभेद उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग Hepatocyte-की तरह कोशिकाओं विटिलिगो
मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल का उपयोग-व्युत्पंन Hepatocyte-दवा की खोज के लिए कोशिकाओं की तरह
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Liu, J. T., Lamprecht, M. P.,… More

Liu, J. T., Lamprecht, M. P., Duncan, S. A. Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery. J. Vis. Exp. (135), e57194, doi:10.3791/57194 (2018).

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