Summary
Het hier gepresenteerde protocol beschrijft een platform voor het identificeren van kleine moleculen voor de behandeling van de leverziekte. Een stapsgewijze beschrijving wordt gepresenteerd detailing how to onderscheiden iPSCs in cellen met hepatocyte kenmerken in 96-wells-platen, en gebruiken van de cellen om te screenen op kleine moleculen met potentiële therapeutische activiteit.
Abstract
De mogelijkheid om te differentiëren van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) in hepatocyte-achtige cellen (HLCs) biedt nieuwe kansen om te studeren van aangeboren fouten in hepatische metabolisme. Echter, om een platform die ondersteuning biedt voor de identificatie van kleine molecules die potentieel kunnen worden gebruikt voor de behandeling van de leverziekte, de procedure vereist een cultuur-indeling die compatibel is met de screening van duizenden verbindingen. Hier beschrijven we de volledig gedefinieerde kweekomstandigheden, waarmee reproduceerbare differentiatie van menselijke iPSCs naar hepatocyte-achtige cellen in de weefselkweek 96-wells-platen die gebruikmaakt van een protocol. We bieden ook een voorbeeld van het gebruik van het platform scherm verbindingen voor hun vermogen tot lagere apolipoproteïne B (APOB) geproduceerd van iPSC afkomstige hepatocyten gegenereerd op basis van een familiale hypercholesterolemie patiënt. De beschikbaarheid van een platform dat compatibel is met drugontdekking mag onderzoekers te identificeren van nieuwe therapieën voor ziekten die invloed hebben op de lever.
Introduction
Succes bij het identificeren van de drugs die kunnen worden gebruikt voor het richten van een zeldzame ziekte is afhankelijk van de ontwikkeling van tests die kunnen worden gebruikt voor de screening. Hypothese of doel gebaseerde schermen (omgekeerde Farmacologie) zijn nuttig, maar vereisen een gedetailleerd inzicht in de moleculaire basis van de ziekte. Fenotypische schermen (klassieke Farmacologie) voorkomen naar de nood voor een gedetailleerd begrip van biochemische pathways, maar in plaats daarvan vertrouwen op de ontwikkeling van modellen die een nauwkeurige afspiegeling van de pathofysiologie van de ziekte. Ondanks het enthousiasme voor doel-gebaseerde benaderingen onthullen analyses van het FDA keurt first-in-class drugs dat fenotypische schermen veel succesvoller1 zijn. Het algemene doel van deze methode is om een platform voor hoge throughput screening die kan worden gebruikt voor het identificeren van kleine moleculen voor de behandeling van metabole leverziekte. Verscheidene in vitro modellen zijn beschreven inclusief primaire hepatocyten, hepatoma cellen en lever voorlopercellen cellen2. Echter de meeste van deze modellen hebben beperkingen, en er is behoefte aan nieuwe modellen die nauwkeurig de pathofysiologie van metabole lever tekortkomingen in cultuur kan herhalen. Onlangs, menselijke pluripotente stamcellen gecombineerd met gen bewerken kunnen model zelfs de zeldzaamste van zeldzame ziekten in cultuur zonder de noodzaak om patiënten toegang hebben aangeboden direct3. Terwijl het gebruik van patiënt-specifieke iPSCs als een instrument om te ontdekken van de kleine moleculen voor de behandeling van zeldzame lever ziekten conceptueel redelijk wordt, zijn er alleen een paar verslagen aantonen van de haalbaarheid van deze aanpak4. Echter hebben we onlangs een platform waarmee iPSC afkomstige hepatocyten succesvol identificeren drugs die andere doelen kunnen worden gebruikt voor de behandeling van tekortkomingen in de lever metabolisme5opgericht.
Dit protocol legt het proces van menselijke iPSCs naar hepatocyte-achtige cellen in 96-wells-platen te differentiëren en ze te gebruiken om het scherm van een bibliotheek van kleine moleculen. Hierin wordt ook de eindpunt-analyse met behulp van hypercholesterolemie als een voorbeeld van stofwisselingsziekte van de lever. Deze aanpak moet nuttig zijn te onderzoeken van de rol en de toepassing van kleine moleculen in het kader van besmettelijke leverziekte, stofwisselingsziekte van de lever, drug toxiciteit en andere leveraandoeningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. cultuur van mensenrechten geïnduceerde pluripotente stamcellen
-
Coating van recombinante menselijke E-cadherine Fc fusieproteïne (E-cad-Fc) of andere matrices geschikt voor hPSC cultuur 6
- E-cad-Fc wordt met Dulbecco de Phosphate-Buffered zoute met calcium en magnesium (DPBS (+)) tot 15 μg/mL verdund.
- Jas van 100 mm vering weefselkweek gerechten met 5 mL verdunde E-cad-Fc en Incubeer bij 37 ˚C voor ten minste 1 h. verwijderen substraat en vervangen met 5 mL medium (b.v., mTeSR1 M-medium voortaan genoemd)7.
Opmerking: Het kweekmedium gebruikt in dit protocol is opgesteld in vervolg op gepubliceerde protocollen7. Echter, verschillende andere media preparaten zijn beschreven of beschikbaar zijn commercieel, die waarschijnlijk compatibel met de procedure. - Een flesje van cryopreserved iPSCs ophalen in vloeibare stikstof. Ontdooien op 37 ˚C tot een kleine ijs kristal blijft. Pipetteer zachtjes cellen in een steriele 15 mL conische buis met 4 mL van het M-medium.
- Centrifugeer bij 300 x g voor 5 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer zachtjes cellen met 5 mL van het medium aangevuld met 10 µM van Y-27632, een selectieve remmer van Rho-geassocieerde, spiraalsnoer-spoel met proteïne kinase (ROCK).
- De M-medium verwijderen uit stap 1.1.2 en 5 mL van cellen uit stap 1.1.4 aan E-cad-Fc-coated 100 mm vering weefselkweek gerechten.
-
Behoud van de menselijke iPSCs in cultuur
- Zodra iPSCs rond bereiken 80% confluentie, verwijder kweekmedium en een keer wassen met calcium en magnesium gratis DPBS (-). De DPBS (-) gecombineerd en voeg een voldoende hoeveelheid van de EDTA-oplossing van 0,02% naar dekking van de platen en incubeer gedurende maximaal 3 minuten bij kamertemperatuur.
Opmerking: Bij 80% samenvloeiing, moet de plaat rond 2 x 107 cellen bevatten. Het is belangrijk niet te overwoekeren de cellen, en om ervoor te zorgen dat de cellen behouden een ongedifferentieerde morfologie. De pluripotent van de cellen kan worden bepaald door de kleuring met marker Tra-1-60 van de cel van de stam of gelijkwaardige8. - Zodra de cellen beginnen te laat, verwijderen van de EDTA-oplossing van 0,02% en overstroming van de schotel met 10 mL van de M-medium om de cellen vrij te geven. Steun het detachement van iPSCs door zachtjes pipetteren.
Opmerking: De gemiddelde incubatietijd voor cellen om los te maken is ongeveer 3 min, maar dit moet worden empirisch bepaald voor elke regel van de iPSC. De cellen moeten worden vrijgelaten als kleine clusters met rond 5-10 iPSCs per cluster. - Overdracht van 1/10 van de zwevende cellen per verse E-cad-Fc gecoat 100 mm vering weefselkweek schotel met 5 mL voor de M-medium. Incubeer de culturen op 37 ˚C minder dan 4% O2/5% CO2 en het medium wijzigen dagelijks.
Opmerking: Hoewel iPSCs routinematig onder fysiologische zuurstof voorwaarden gekweekt worden ter bevordering van pluripotent, kunnen iPSCs ook worden gekweekt met behulp van ambient zuurstof.
- Zodra iPSCs rond bereiken 80% confluentie, verwijder kweekmedium en een keer wassen met calcium en magnesium gratis DPBS (-). De DPBS (-) gecombineerd en voeg een voldoende hoeveelheid van de EDTA-oplossing van 0,02% naar dekking van de platen en incubeer gedurende maximaal 3 minuten bij kamertemperatuur.
2. differentiatie van menselijke iPSCs naar Hepatocyte-achtige cellen in 96-wells-platen
Opmerking: Deze sectie beschrijft de differentiatie van iPSCs in een indeling die compatibel is met de screening. Met deze aanpak, is het mogelijk voor het opwekken van menselijke iPSCs te onderscheiden en vormen van de hepatocyte-achtige cellen in 20 dagen. Terwijl dit geschikt voor de meeste testen is, kan de lengte van cultuur worden uitgebreid om de looptijd van de cellen.
-
Coating van weefselkweek 96-wells-platen met verminderde groeifactor kelder membraan matrix
- Bereid de voorraad door verdunning van de matrix tot 2 mg/mL met ijskoude steriele DMEM/F12 weefselkweek medium. De matrix in 250 μL aliquots verdelen en opslaan bij-80 ˚C totdat vereist. Chill 10 mL DMEM/F12 op ijs voor 30 min. ophalen een 250 μL aliquoot deel van 2 mg/mL matrix materieel en dooi op ijs.
- Combineer de matrix met 10 mL koude DMEM/F12 door het mengen zachtjes met behulp van een vooraf gekoeld pipet om een eindconcentratie van 0,05 mg/mL.
- Breng 100 μl van verdunde matrix aan elk putje van een weefselkweek 96-wells-plaat. Incubeer bij 37 ˚C, 4% O2/5% CO2 voor ten minste 1 h. de matrix verwijderen en vervangen door 50 μl van M-medium per putje. Bewaren bij 37 ° C, 4% O2/5% CO2 totdat het nodig is.
-
Plaat cellen voor differentiatie
- Cultuur van de iPSCs op 100 mm platen totdat de cellen aanpak samenvloeiing van 80%. Ervoor zorgen dat de plaat rond 2 x 107 cellen bevat. Cel nummers door cel stroom cytometer of hemocytometer te bepalen.
Opmerking: Met ervaring, kan de kwaliteit van de iPSCs cellen worden beoordeeld door microscopie; echter, bijna 98% van de cellen moeten uiten pluripotent markeringen zoals de TRA-1-60 epitoop gemeten naar FACS of immunokleuring. Het is belangrijk dat de cellen actief verdelen blijven en zijn niet begroeid. - Oogst van de iPSCs van elke 100 mm plaat, gecombineerd het kweekmedium en spoel met 5 mL DPBS (-). Vervang de spoeling met 3 mL oplossing voor mobiele-detachement (bijvoorbeeld, accutase) en incubeer gedurende ongeveer 2 minuten bij 37 ° C, 4% O2/5% CO2.
Opmerking: Het is belangrijk te volgen van het detachement van cellen door microscopie. Niet via digest met accutase doen. Het doel is om de cellen als kleine clusters met minimale behandeling vrij te geven. - Zodra de cellen beginnen om los te maken, oogsten door toevoeging van 7 mL van het M-medium. Pipetteer van meerdere keren te distantiëren van de cel kolonies in kleine clusters van rond 3-6 cellen (figuur 1A).
- De iPSCs in een 15-mL steriele centrifugebuis en centrifuge op 300 x g verzamelen voor 5 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet cel in 5 mL M-medium.
- Verdeel de cellen op matrix beklede 96-wells-platen door pipetting 50 μl van schorsing cellen in elk putje. Voor het instellen van elke 96-wells-plaat, een 100-mm plaat van iPSCs met cellen op ongeveer 80% confluentie waarin ongeveer 5 x 106 cellen de differentiatie aan opstelling te gebruiken. Een meerkanaalspipet gebruiken om dit proces te versnellen. Cultuur van de cellen 's nachts op 37 ˚C, 4% O2/5% CO2.
Opmerking: Het is belangrijk dat een gelijk aantal cellen wordt gestort in elk putje om reproduceerbare differentiaties.
- Cultuur van de iPSCs op 100 mm platen totdat de cellen aanpak samenvloeiing van 80%. Ervoor zorgen dat de plaat rond 2 x 107 cellen bevat. Cel nummers door cel stroom cytometer of hemocytometer te bepalen.
-
Veroorzaken van de differentiatie van de cellen
- Het bestuderen van de 96-wells-platen met microscopie om ervoor te zorgen dat de cellen ten minste 70% van het oppervlak van elk individu goed dekken. Als de dekking is minder dan 70%, vervangt het medium met verse medium en incubeer gedurende een aanvullende 24 uur bij 37 ˚C, 4% O2/5% CO2.
Opmerking: Het broeden van cellen voor meer dan 48 uur na plating zonder differentiatie algemeen vermindert de efficiëntie van differentiatie. Differentiatie zal zich ook voordoen met behulp van ambient zuurstof, hoewel de efficiëntie mogelijk getroffen. - Voor dag 1 tot dag 2 van differentiatie, vervangen door het kweekmedium RPMI aangevuld met 2% B27 (zonder insuline), 100 ng/mL Activin A 10 ng/mL BMP4 en 20 ng/mL FGF2. Voeg 100 μl van medium per putje en Incubeer bij 37 ˚C, in ambient O2/5% CO,2 met een dagelijkse middellange verandering voor 2 dagen.
Opmerking: Omgaan met grote aantallen 96-wells-platen vereisen het gebruik van een gesubsidieerde pipet of de robot. 12-kanaals en 96-kanaal pipetten zijn ideaal voor de dagelijkse middellange wijzigen. - Voor dag 3 dag 5 van differentiatie, vervang het kweekmedium met RPMI aangevuld met 2% B27 (zonder insuline) en 100 ng/mL Activin A. Culture cellen op 37 ˚C, in ambient O2/5% CO,2 met dagelijkse middellange verandering voor 3 dagen.
- Bij de differentiatie eergisteren 5, vervangen door verse kweekmedium, traktatie, elk goed met 100 μl 0,02% EDTA-oplossing voor 30 s, dan verwijderen en vervangen met verse kweekmedium.
Opmerking: Als de differentiatie naar endoderm efficiënt is, is de enkelgelaagde van differentiatie van cellen gevoelig voor peeling van de plaat. Een korte behandeling met 0,02% EDTA oplossing helpt verlichten van mobiele-detachement. Deze behandeling heeft geen gevolgen voor de differentiatie naar hepatocyten. - Voor differentiatie tussen dagen 6 tot en met 10, vervang het kweekmedium met RPMI / 2% B27 (met insuline) aangevuld met 20 ng/mL BMP4 en 10 ng/mL FGF2 en Incubeer bij 37 ˚C, 4% O2/5% CO2 voor 5 dagen met dagelijkse middellange wijzigen. Dit stadium induceert cellen te onderscheiden in de hepatische voorlopercellen.
- Voor differentiatie tussen dagen 11 tot en met 15, vervangen door het kweekmedium met RPMI / 2% B27 (met insuline) aangevuld met 20 ng/mL HGF. Incubeer bij 37 ˚C, 4% O2/5% CO2 voor 5 dagen met dagelijkse middellange wijzigen.
- Voor differentiatie tussen dagen 16 tot 20, wordt het kweekmedium vervangen door een hepatocyte cel kweekmedium (HCM) aangevuld met 20 ng/mL van Oncostatin-M (OSM). Incubeer de cellen bij 37 ˚C, in ambient O2/5% CO,2 met dagelijkse middellange verandering voor 5 dagen.
Opmerking: De reproduceerbaarheid van differentiatie tussen individuele putten kan efficiënt worden bepaald door het meten van het relatieve niveau van albumine, AFP of APOB uitgescheiden in het medium door ELISA (zie 3.2).
- Het bestuderen van de 96-wells-platen met microscopie om ervoor te zorgen dat de cellen ten minste 70% van het oppervlak van elk individu goed dekken. Als de dekking is minder dan 70%, vervangt het medium met verse medium en incubeer gedurende een aanvullende 24 uur bij 37 ˚C, 4% O2/5% CO2.
3. klein molecuul Screening
Opmerking: Het volgende beschrijft de procedure waarmee verbindingen die kunnen worden gebruikt voor het verlagen van het niveau van APOB in het medium van de hepatocyte-achtige cellen afgeleid van familiale hypercholesterolemie iPSCs wordt aangeduid. Een beschrijving van het model en het gebruik ervan in de identificatie van cholesterolverlagende medicijnen is beschreven in detail eerder5,9. In het huidige voorbeeld werden 1000 stoffen uit de bibliotheek van South Carolina samengestelde collectie (SC3) vertoond. Elke compound werd getest op een concentratie van 2 μg/mL.
-
Behandeling van iPSC - afgeleide hepatocyten met kleine moleculen
- Verdun de master samengestelde bibliotheek wilt genereren platen van werkende voorraden met verbindingen met een concentratie van 20 μg/mL in 2% DMSO en winkel op-20 ˚C.
- Bereiden genoeg 96-wells-platen van iPSC afkomstige hepatocyten toe elke verbinding te beproeven.
Opmerking: Het aantal verbindingen worden vertoond zal bepalen het aantal 96-wells-platen die vereist zijn. In het algemeen, moet een honkslag goed worden voorbereid voor elke samengestelde, plus extra putten voor controlemonsters. De ultraperifere putjes van de plaat zijn meestal vermeden om de mogelijkheden van randeffecten die interpretatie annuleerteken omkoopbaar te beperken. Hits kunnen worden geïdentificeerd met behulp van de methode van de z-score zonder de noodzaak te gebruiken wordt gerepliceerd. Als wordt gerepliceerd opgenomen zijn, is het meer geschikt voor gebruik van de t-test. - Bij de voltooiing van de differentiatie (dag 20, zie 2.3.7), vervangen door het kweekmedium 100 μl van verse HCMaangevuld met 20 ng/mL van Oncostatin-M. Incubeer bij 37 ˚C, 4% O2/5% CO2 voor precies 24 h. het kweekmedium ophalen in een verse 96-wells-plaat en de winkel op-20 ˚C. In dit voorbeeld gebruiken voor het berekenen van het niveau van APOB in het medium voor de toevoeging van drug.
- Voeg 90 l verse HCM aangevuld met 20 ng/mL van Oncostatin-M in elk putje. Voeg 10 μL van elke stof uit de voorraad van de werken na mengen door pipetteren. DMSO toevoegen aan 0.2% controle putten Combineer de uiteindelijke concentratie in de behandelde steekproeven en Incubeer bij 37 ˚C, ambient O2/5% CO2 voor precies 24 h. het kweekmedium verzamelen en opslaan bij-20 ˚C. Gebruik dit voorbeeld om te bepalen van het niveau van APOB na behandeling met verbindingen.
- Optioneel - de resterende cellen kunnen worden verwerkt voor immunokleuring, levensvatbaarheid van de cellen of analyses van mRNA niveaus met behulp van standaard benaderingen.
Opmerking: Dit scherm is ontworpen om te identificeren van geneesmiddelen die een snelle effect gehad op APOB niveaus. Afhankelijk van het model van de ziekte, stroomafwaarts testen of werkingsmechanisme drug, kan het echter nuttig zijn voor de behandeling van het monster voor meerdere dagen.
-
Bepalen van APOB niveaus door ELISA
- Bepaal apolipoproteïne B (APOB) concentratie van zowel de pre- en post drug behandelde steekproeven met een menselijke APOB ELISA development kit van de fabrikant protocollen.
-
Voorbereiding van de volgende oplossingen
- Was buffer, samengesteld van 0,05% Tween-20 in PBS, pH 7.4. Bewaren bij 4 ˚C tot gebruik.
- Incubatie buffer, samengesteld uit 0,05% Tween-20 en 0,1% bovien serumalbumine (BSA) in PBS, pH 7.4. Bewaren bij 4 ˚C tot gebruik.
- Bereiden APOB (mAB 20/17) antilichaam door verder verdunnen tot 2 µg/mL in PBS, pH 7.4. Voeg 100 μl van het verdunde antilichaam per putje en na een nacht bebroeden bij 4 ˚C.
- Verwijder het antilichaam aan de assay platen en wassen elk goed tweemaal met 200 μL van PBS, pH 7.4.
- Toevoegen van 200 μl per putje van 0,05% Tween 20, 0.1% bovien serumalbumine (BSA) in PBS, pH 7.4 en uit te broeden op een schudden platform gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Een 8-punts standaard curve met behulp van 0,05% Tween-20 en 0,1% BSA in PBS, pH 7.4 met de volgende concentraties van APOB bereiden: 300 ng/mL, 200 ng/mL, 175 ng/mL, 150 ng/mL, 125 ng/mL, 100 ng/mL, 75 ng/mL, en 50 ng/mL.
- Verdun de test monsters 1:4 met 0,05% Tween-20 en 0,1% BSA in PBS, pH 7.4.
- Na 1 uur van het blokkeren met incubatie buffer, negeren de buffer en wassen van de platen assay vijfmaal met 200 μL van 0,05% Tween-20 in PBS, pH 7.4.
- Volledig verwijderen van alle resterende wassen buffer en 90 μL van de verdunde monsters en de normen van APOB overbrengen in de assay-platen. Incubeer bij kamertemperatuur op een shaker gedurende 1 uur.
- Negeren van het monster en wassen met 200 μl 0,05% Tween-20 in PBS, pH 7.4 per putje. Herhaal de wasbeurten in totaal 5 keer. Voeg 100 μl per putje van mAB LDL 11-Biotine verdunde 1:1,000 in 0,05% Tween-20 en 0,1% BSA in PBS, pH 7.4. Incubeer bij kamertemperatuur op een schudden platform voor 1 h.
- Negeren van het reagens en wassen met 200 μL per goed wassen buffer 5 keer. Voeg 100 μl per putje van daar-HRP antilichaam (1:1, 000 verdunning met behulp van incubatie buffer), vervolgens Incubeer bij kamertemperatuur op een schudden platform voor 1 h.
- Negeren van het reagens en wassen met 200 μl 0,05% Tween-20 in PBS, pH 7.4 per putje. Herhaal de wasbeurten in totaal 5 keer. Volledig verwijderen van de resterende wassen buffer aan de assay platen 100 μl per putje van Tetramethylbenzidin (TMB) substraat oplossing toevoegen en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 8 minuten.
- Zonder het verwijderen van de TMB substraat, direct Voeg 100 μl per putje van eindeoplossing (1N HCl).
- Bepaal de extinctie bij 450 nm met behulp van een afleesapparaat.
- Een standaard curve kan worden vastgesteld, met behulp van de methode vier Parameter logistische regressie, dan gebruikt voor het definiëren van de concentratie van APOB in elk monster10.
- Onderzoeken van de pre drug: na drug verhouding van APOB in elk monster te identificeren van verbindingen met het potentieel om te verlagen van APOB niveaus in het medium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Generatie van de hepatocyte - cellen zoals: Figuur 1 beschrijft het tijdsbestek van de veranderingen die tijdens de differentiatie van menselijke iPSCs naar hepatocyte-achtige cellen optreden. De cultuur van de iPSCs op E-Cad-Fc biedt ongeveer 2 mm diameter kolonies die uitdrukking geven aan de pluripotente markering OCT4 (figuur 1A-B). De morfologie van de cellen die zijn geteeld op een E-cadherine matrix zal er iets anders aan die gekweekt op andere oppervlakken. Ze hebben de neiging te hebben een afgevlakte morfologie met een grotere cytoplasmatische oppervlakte (figuur 1A). Hoewel menselijke pluripotente stamcellen kan efficiënt worden gekweekt op een aantal verschillende matrices11, de cultuur van de iPSCs op een E-cadherine matrix wordt verondersteld te verhogen van de homogeniteit van de pluripotente-celpopulatie en kunt enzym-gratis manipulatie van de cellen tijdens de passage12. Echter, verschillende alternatieve matrices, met inbegrip van de kelder membraan matrix, laminins, vitronectin en muis embryonale fibroblasten (MEF), kunnen ook worden gebruikt om menselijke iPSCs en alle verenigbaar moeten zijn met de beschreven procedure13. In alle gevallen kan de cel pluripotent Tra-1-60 of gelijkwaardige8worden bevestigd.
Om te beginnen de differentiatie, moet de iPSCs worden verzameld als kleine clusters (figuur 1A). Aan het begin van de differentiatie dient de vergulde cellen ongeveer 80% van het oppervlak van de plaat. Na 5 dagen van de behandeling met groeifactoren, de cellen express eiwitten die typisch op de definitieve endoderm zoals SOX17 en FOXA2 worden uitgedrukt (figuur 1B). In dit stadium express 90% van de cellen meer dan meestal deze markers. Na 5 dagen van differentiatie, de endoderm converteert naar een hepatische lot en naast FOXA2, de cellen express HNF4a, die gedurende de rest van het proces van de differentiatie (figuur 1B) kunnen worden geïdentificeerd. Als de cellen nemen een hepatische lot, zij moeten betrekking hebben op het oppervlak van de plaat als een enkelgelaagde. Na toevoeging van HGF beginnen de cellen uitspreken eiwitten die worden aangetroffen in de foetale hepatocyten met inbegrip van AFP (figuur 1B). Lipide druppels kunnen worden waargenomen in het cytoplasma van de cellen. Bij de voltooiing van de differentiatie nemen de cellen een cuboidal morfologie met een kern met prominente nucleoli en een grote cytoplasma met meerdere lipide druppels. Een subset van de hepatocyte-achtige cellen zullen meerdere genucleëerde. Allermeest naar de cellen express een uitgebreid repertoire van hepatocyte eiwitten met inbegrip van albumine (figuur 1B),14.
Effectief hoge doorvoer scherm met behulp van hypercholesterolemie als een ziekte-model: Hypercholesterolemie weerspiegelt buitensporige concentratie van lage dichtheid lipoproteïne-cholesterol (LDL-C) in het serum. Familiale hypercholesterolemie (FH) is het verhoogde niveau van serum LDL-C vooral het gevolg van mutaties in de receptor Low-density lipoprotein (LDLR) die opname van LDL-C voor inklaring door de hepatocyten bemiddelt. Wij hebben eerder de generatie van iPSCs van een patiënt met homozygoot Familiale hypercholesterolemie en het gebruik ervan in het genereren van hepatocyten die gespiegeld van de patiënt leverziekte bij cultuur9beschreven. Het bleek dat deze cellen met succes als een platform voor drugontdekking kunnen worden gebruikt. Wanneer een bibliotheek van ~ 2.500 drugs werd vertoond, bleek het dat cardiale glycosiden had een onverwachte mogelijkheid tot lagere LDL-C in iPSC-afgeleide hepatocyten, primaire menselijke hepatocyten, en in muizen met gehumaniseerd levers. Bovendien, bij de examencommissie medische patiëntendossiers vonden we dat cholesterol niveaus viel bij patiënten die een hartstilstand glycoside voor de behandeling van hart-en vaatziekten werden voorgeschreven. Deze studies bevestigd dat iPSC afkomstige hepatocyten met succes kunnen worden gebruikt in schermen te identificeren therapeutics.
Om een platform dat compatibel is met screening te bieden, is het belangrijk dat de differentiaties reproduceerbaar zijn en dat goed aan goed variatie wordt geminimaliseerd. Figuur 2 toont de resultaten van immunokleuring op elk putje van een 96-wells-plaat voor het opsporen van HNF4a en albumine op dag 20 van differentiatie. Zoals kan worden gezien in de afbeelding, is de verdeling van deze proteïnen hepatocyte vergelijkbaar in alle putjes.
De centrale eiwit component van LDL-C is APOB. Wij hebben hier, iPSCs naar scherm gebruikt voor APOB verbindingen te verlagen om een voorbeeld van het gebruik van iPSC afkomstige hepatocyten voor klein molecuul screening (figuur 3A) te verstrekken. APOB kan gemakkelijk worden gemeten in oplossing door ELISA. Omdat ELISA kan worden uitgevoerd op grote aantallen monsters, kan het worden gebruikt als basis voor een scherm. De geschiktheid van elke assay voor hoge throughput screening is beste bepaald met behulp van een meting genaamd de Z-factor (of Z')15. Deze statistische parameter berekent de effectiviteit van een bepaling onderscheid maken tussen positieve en negatieve controlemonsters. Een bepaling met een Z-factor > 0,5 wordt beschouwd als compatibel met een scherm15. Zoals te zien is in figuur 3B, de Z' van de bepaling van APOB = 0,73, waarmee de geschiktheid van het gebruik van het platform voor drugontdekking wordt bevestigd.
Identificatie van stoffen die de capaciteit hebben om lagere APOB niveaus in het kweekmedium van iPSC - afgeleid van hepatocyten: om te bepalen of het platform kan worden gebruikt voor het identificeren van nieuwe verbindingen die van invloed zijn APOB niveaus, gescreend we 1000 kleine moleculen van de South Carolina samengestelde collectie (SC3) vertegenwoordiger instellen Lite (RSL). De RSL werd gegenereerd door de MUSC South Carolina Center voor therapeutische ontdekking, en bevat verbindingen die structureel divers zijn en weerspiegelen de bovenliggende bibliotheek.
De post drug: pre drug verhouding van APOB werd bepaald voor elke samengestelde (Figuur 3 c) en identificatie van hits werd bereikt door de z-score analyse (figuur 3D)16. In dit geval werden kleine moleculen die APOB verminderd met een z-score ≤-2.0 als potentiële hits beschouwd. Wanneer screening 1.000 kleine molecules, is het aantal mogelijke hits met een z-score van ≤-2.0 meestal relatief beheersbaar. Echter, bij het uitvoeren van een groter scherm, zouden we rekenen op een meer conservatieve score van ≤-3.0, op basis van de regel van 3-sigma, vertrouwen in doelwit te vergroten. In dit voorbeeld vastgesteld wij 24 potentiële hits met een verhouding van APOB die van 0.86 tot 0.44 (figuur 4A varieerden). Een secundaire test werd uitgevoerd op quadruplicate monsters (n = 4 biologische replicatieonderzoeken) uit te sluiten van verbindingen die een negatieve invloed gehad op de levensvatbaarheid van de cellen en om te bepalen welke stoffen kunnen reproducibly lager APOB in het medium. Van de oorspronkelijke 24 kandidaat-stoffen, vier bleken te zijn reproduceerbaar (p ≤0.05) (figuur 4B-C). Na verdere studie, bleken 2 van deze stoffen te negatief beïnvloeden levensvatbaarheid van de cellen, wat suggereert dat de geconstateerde vermindering van APOB waarschijnlijk was een een gevolg van het verlies van de cel. De resterende twee verbindingen zou worden beschouwd als goede kandidaten voor vervolgstudies.
Figuur 1 : Stapsgewijze hepatische differentiatie van menselijke iPSCs. (A) Morfologie van iPSC kolonies onmiddellijk voorafgaand aan oogst (linkerdeel) en iPSCs na het verzamelen van cellen voor differentiatie (rechtervenster) - na de accutase behandeling, de cellen moeten worden losgekoppeld tot 3-6 cellen/cluster. Schaal bar = 50 µm. (B) tabel weergegeven: kweekomstandigheden in elk stadium van differentiatie (bovenste). Immunokleuring (lagere panelen) werd uitgevoerd ter identificatie van de uitdrukking van de markering in elk stadium van differentiatie. Panelen tonen OCT4 en DAPI kernen in iPSCs, SOX17 en FOXA2 in definitieve endoderm, HNF4a en FOXA2 in de hepatische voorlopercellen, HNF4a en AFP in onrijpe cellen van de hepatocyte-achtige, gekleurd en HNF4a en albumine in relatief oudere hepatocyte-achtige cellen. Schaal bars = 100 µm (B). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Homogene hepatische differentiatie van menselijke iPSCs in 96-wells-platen. Immunokleuring werd uitgevoerd op elk afzonderlijke putje van een 96-wells-plaat met iPSC afkomstige hepatocyten op dag 20 van differentiatie te detecteren (A) albumine en ()B) HNF4a. Schaal bar = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Klein molecuul screening met behulp van menselijke iPSC afkomstige hepatocyten. (A) schematisch overzicht van de wijze waarop het identificeren van stoffen die de niveaus van ABOB in het medium van iPSC afkomstige hepatocyten verminderen kunnen. (B) grafiek weergegeven: theresults van een analyse van de ELISA voor de opsporing van het niveau van APOB in het medium van 87 putten (n = 87) van iPSC afkomstige hepatocyten (blauw) en/of gedifferentieerdeproductie iPSCs (sinaasappel). Deze gegevens werden gebruikt voor de berekening van een Z-factor (Z' = 0,73). (C) grafiek met de post drug: pre drug ratio's van de concentratie van APOB in het kweekmedium van iPSC afkomstige hepatocyten behandeld gedurende 24 uur met 998 verbindingen uit de SC3 RSL set. (D) grafiek die z-scores van de gegevens in (C). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Validatie van primaire hits. (A) tabel met stoffen die zijn geïdentificeerd in het primaire scherm als zijnde kundig voor verminderen van APOB. (B, C) Bar grafieken tonen het effect van verbindingen op na drug: pre drug APOB concentratie-verhouding ()B) en (C) van de levensvatbaarheid van cellen in iPSC-afgeleide hepatocyten behandeld met verbindingen in follow-up analyse. Foutbalken geven ± SEM (n = 4 biologische replicatieonderzoeken); * p ≤0.05. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Doel gebaseerd drugontdekking, waar kleine moleculen worden geïdentificeerd die invloed hebben op de activiteit van een specifieke proteïne, is de focus van vele bestaande screening inspanningen. Hoewel deze benadering heeft verstrekt talrijke geneesmiddelen, schermen op basis van het omkeren van een fenotype, klassieke farmacologie, meer succesvol geweest in het identificeren van first-in-class-verbindingen die klinisch doeltreffend1 zijn. Een nadeel van fenotypische drugontdekking is dat het afhankelijk van de beschikbaarheid van passende ziekte modellen is. Dit kan een uitdaging zijn wanneer cel modellen van de ziekte niet beschikbaar zijn, of als gemeenschappelijk onderzoek diersoorten niet recapituleren de klinische symptomen. De mogelijkheid voor het genereren van iPSCs van een patiënt somatische cellen heeft evenwel nieuwe mogelijkheden om ziekten bij de mens model in cultuur-3. Bij sommige ziekten, zoals zeldzame genetische ziekten, kunnen patiënten gering in aantal, en moeilijk te benaderen en toestemming. Echter met de komst van genoom engineering is het relatief eenvoudig te voeren oorzakelijke mutaties in het genoom van de iPSC, waardoor het kan model zelfs de zeldzaamste van zeldzame ziekten.
Zodra de iPSCs zijn in de hand, is het noodzakelijk over te leggen van een passende celtype waarin de symptomen van de ziekte manifesteren. Bijvoorbeeld, kunnen ziekten van neurale functie vereisen de generatie van neuronen of glia17, overwegende dat degenen die de lever hepatocyten9,18 wellicht of biliaire epitheliale cellen voor19, studeren 20 , 21. deze eis introduceert een aantal kanttekeningen bij het overwegen van het gebruik van iPSCs voor drugontdekking. Ten eerste is het belangrijk om te begrijpen van de cellulaire basis van de ziekte. Dit kan zijn uitdagend, vooral wanneer de cellen aannemen kenmerken op basis van locatie of milieu. Dit zou kunnen gelden voor hepatocyten moeten verschillen in gen expressieprofielen en enzymatische functie die zijn afhankelijk van hun locatie binnen de lever lobule. Ten tweede werken met cellen in isolatie kunt voorkomen dat de studie van ziekten die overeenkomen met een verstoring van weefsel structuur zoals cirrose, cel-cel communicatie zoals neuromusculaire ziekte of die zijn beïnvloed door een ontsteking zoals inflammatoire darmziekte.
Studeren leverziekte, hebben verschillende onderzoeksgroepen beschreven protocollen voor het genereren van de hepatocyte-achtige cellen van iPSCs13,22,23,24,25. Terwijl de meeste van deze protocollen zijn efficiënt, is de beperking van de techniek dat cellen niet volledig de functie van verse hepatocyten recapituleren. Hierdoor is het belangrijk om te bepalen of cellen gegenereerd uit iPSCs display van de functies die nodig zijn voor de evaluatie van het effect van een bepaalde mutatie. De genen waarvan de expressie niet volledig overeenkomt met die gevonden in vers hepatocyten behoren tot degenen CYP450 eiwitten25,26-codering. Verscheidene van deze proteïnen hebben rollen in drug metabolisme en de xenobiotische reactie. Dit is belangrijk bij het overwegen van het ontwerp van een scherm, omdat veel drugs de generatie van actieve metabolieten vereisen, en dit kan worden aangetast in iPSC-afgeleide hepatocyten. Inspanningen ter verbetering van de kwaliteit van de hepatocyten worden actief nagestreefd27. Ondanks de waarschuwingen, hebben verschillende studies aangetoond dat iPSCs afgeleid van patiënten met aangeboren fouten in hepatische metabolisme met succes kan worden gebruikt voor het genereren van de hepatocyte-achtige cellen die een afspiegeling van de pathofysiologie van de ziekte in cultuur9 , 18 , 28 , 29.
Voor schermen om succesvol te zijn, is het belangrijk om ervoor te zorgen de homogene differentiatie van de hepatocyten uit de iPSCs. Wanneer differentiatie in 96-wells-platen niet opbrengst van hoge kwaliteit hepatocyten, is het meestal vanwege de slechte kwaliteit van de ouderlijke iPSCs of cultuur van iPSCs onder suboptimale omstandigheden. Pluripotent van iPSCs moet zorgvuldig worden onderhouden door de cultuur in een kwalitatief hoogwaardig medium met dagelijkse wijzigingen zoals beschreven in protocol 1.2. De dichtheid van pluripotente cellen in de cultuur-schotel moet zorgvuldig worden gecontroleerd, omdat als de cellen over heuvels worden hebben ze de neiging om te verliezen pluripotent en spontaan onderscheiden. Ook vinden we dat het kweken van de cellen in de fysiologische zuurstofconcentraties pluripotent bevordert en gunstig tijdens sommige fasen van differentiatie is. Als de geschikte apparatuur niet beschikbaar is, is het echter nog steeds mogelijk gebruik van ambient zuurstof voor zowel cultuur de pluripotente cellen en veroorzaken van de differentiatie. Het is raadzaam de pluripotent van de voorraad iPSCs routinematig te definiëren door het meten van expressie van meerdere pluripotent markeringen met inbegrip van OCT-3/4, NANOG en TRA-1-60 voordat u uitgebreide differentiaties ongeacht cultuuromstandigheden. We hebben ook waargenomen dat wanneer de cellen endoderm op hoog rendement vormen, ze hebben de neiging om de peal van het oppervlak van de platen als cel bladen. We hebben geconstateerd dat kort behandelen de iPSC-afgeleide endoderm cellen met EDTA-oplossing van 0,02% helpen kunnen om mobiele-detachement. Ten slotte, de optimale concentratie van cellen die nodig zijn voor de efficiënte differentiaties iPSC lijnen kan verschillen en kan van invloed zijn mobiele-detachement. Om deze reden is het belangrijk om de concentratie van cellen die nodig zijn voor de efficiënte differentiaties, vooral bij het werken met een nieuwe cultuur van iPSC empirisch te bepalen.
Kortom, hebben wij beschreven een stapsgewijs differentiatie-protocol dat genereert hepatocyte-achtige cellen van iPSCs die compatibel met chemische schermen zijn. De hepatocyte-achtige cellen worden geproduceerd als monolayers in 96-wells-platen, en het proces is efficiënt en reproduceerbaar. We tonen de haalbaarheid van screening compounds voor hun vermogen om te verlagen de niveaus van APOB in het kweekmedium. De differentiatie-indeling is compatibel met meerdere testen met inbegrip van ELISA, qRT-PCR, en hoge inhoud beeldvorming. Wij zijn van mening dat het veld de aanpak nuttig vindt om te identificeren van potentiële therapeutics en voor de farmacologische identificatie van trajecten op het gebied van differentiatie van de hepatocyte en functie in de toekomstige toepassingen5,30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health (DK55743, DK087377, DK102716 en HG006398 naar S.A.D). Wij wil Dr. Behshad Pournasr, Dr. James Heslop en Ran Jing bedanken voor hun bijdragen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm x 20 mm sterile tissue culture dishes | Corning | 430167 | |
| 100 mm x 20 mm sterile suspension culture dishes | Corning | 430591 | |
| 96-wells tissue culture plate | Corning | 3595 | |
| Anti-human Albumin | Dako | A 0001 | |
| Anti-human FOXA2(6C12) | Novus Biological | H00003170-M12 | |
| Anti-human HNF4 alpha | Santa Cruz | SC-6556 | |
| Anti-human Oct-3/4 antibody | Santa Cruz | SC-9081 | |
| Anti-human SOX17 | R&D | AF1924 | |
| Anti-human TRA-1-60 FITC conjugated | Millipore | FCMAB115F | |
| Activin A Recombinant Human Protein | Invitrogen | PHC9563 | |
| B-27 Supplement, minus insulin | Invitrogen | 0050129SA | |
| B-27 Supplement, serum free | Invitrogen | 17504044 | |
| BMP4 Recombinant Human Protein | Invitrogen | PHC9533 | |
| Cell Dissociation Reagent StemPro Accutase | Invitrogen | A1110501 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | 7572 | |
| DPBS+(calcium, magnesium) | Invitrogen | 14040-133 | |
| DPBS-(no calcium, no magnesium) | Invitrogen | 14190-144 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Invitrogen | 11330057 | |
| ELISA human APOB ELISA development kit | Mabtech | 3715-1H-20 | |
| Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2) | Invitrogen | PHG0023 | |
| Hepatocyte Culture Medium (HCM Bullet Kit) | Lonza | CC-3198 | |
| Hepatocyte Growth Factor (HGF) | Invitrogen | PHC0321 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Invitrogen | 11140076 | |
| Oncostatin M (OSM) Recombinant Human Protein | Invitrogen | PHC5015 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140163 | |
| Feeder free pluripotent stem cell medium: mTesR1 | STEMCELL technologies | 5850 | |
| Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Invitrogen | A1413301 | |
| RPMI 1640 Medium, HEPES | Invitrogen | 22400105 | |
| StemAdhere Defined Matrix for hPSC (E-cad-Fc) | Primorigen Biosciences | S2071 | |
| TMB-ELISA Substrate Solution | Thermo Scientific | 34022 | |
| Anti-TRA-1-60 FITC conjugated | Millipore | FCMAB115F | |
| Versene (EDTA) 0.02% | Lonza | 17-711E | |
| Y-27632 ROCK inhibitor | STEMCELL Technologies | 72302 |
References
- Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered? Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).
- Zeilinger, K., Freyer, N., Damm, G., Seehofer, D., Knospel, F. Cell sources for in vitro human liver cell culture models. Exp Biol Med (Maywood. 241 (15), 1684-1698 (2016).
- Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).
- Cayo, M. A., et al. A Drug Screen using Human iPSC-Derived Hepatocyte-like Cells Reveals Cardiac Glycosides as a Potential Treatment for Hypercholesterolemia. Cell Stem Cell. 20 (4), 478-489 (2017).
- Nagaoka, M., et al. E-cadherin-coated plates maintain pluripotent ES cells without colony formation. PLoS One. 1, e15 (2006).
- Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
- International Stem Cell Initiative. Characterization of human embryonic stem cell lines by International Stem Cell Initiative. Nat Biotechnol. 25 (7), 803-816 (2007).
- Cayo, M. A., et al. JD induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes faithfully recapitulate the pathophysiology of familial hypercholesterolemia. Hepatology. 56 (6), 2163-2171 (2012).
- DeSilva, B., et al. Recommendations for the bioanalytical method validation of ligand-binding assays to support pharmacokinetic assessments of macromolecules. Pharm Res. 20 (11), 1885-1900 (2003).
- Rowland, T. J., et al. Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin. Stem Cells Dev. 19 (8), 1231-1240 (2010).
- Nagaoka, M., Si-Tayeb, K., Akaike, T., Duncan, S. A. Culture of human pluripotent stem cells using completely defined conditions on a recombinant E-cadherin substratum. BMC Dev Biol. 10, 60 (2010).
- Hay, D. C., et al. Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo. Stem Cells. 26 (4), 894-902 (2008).
- Mallanna, S. K., Cayo, M. A., Twaroski, K., Gundry, R. L., Duncan, S. A. Mapping the Cell-Surface N-Glycoproteome of Human Hepatocytes Reveals Markers for Selecting a Homogeneous Population of iPSC-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 7 (3), 543-556 (2016).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
- Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J Biomol Screen. 16 (7), 775-785 (2011).
- Lorenz, C., et al. Human iPSC-Derived Neural Progenitors Are an Effective Drug Discovery Model for Neurological mtDNA Disorders. Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).
- Rashid, S. T., et al. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest. 120 (9), 3127-3136 (2010).
- Lu, W. Y., et al. Hepatic progenitor cells of biliary origin with liver repopulation capacity. Nat Cell Biol. 17 (8), 971-983 (2015).
- Ogawa, M., et al. Directed differentiation of cholangiocytes from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 33 (8), 853-861 (2015).
- Sampaziotis, F., et al. Cholangiocytes derived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling and drug validation. Nat Biotechnol. 33 (8), 845-852 (2015).
- Mallanna, S. K., Duncan, S. A. Differentiation of hepatocytes from pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 26 (Unit 1G 4), (2013).
- Song, Z., et al. Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells. Cell Res. 19 (11), 1233-1242 (2009).
- Cai, J., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells. Hepatology. 45 (5), 1229-1239 (2007).
- Si-Tayeb, K., et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).
- Pashos, E. E., et al. Diverse Population Cohorts of hiPSCs and Derived Hepatocyte-like Cells Reveal Functional Genetic Variation at Blood Lipid-Associated Loci. Cell Stem Cell. 20 (4), 558-570 (2017).
- Davidson, M. D., Ware, B. R., Khetani, S. R. Stem cell-derived liver cells for drug testing and disease modeling. Discov Med. 19 (106), 349-358 (2015).
- Choi, S. M., et al. Efficient drug screening and gene correction for treating liver disease using patient-specific stem cells. Hepatology. 57 (6), 2458-2468 (2013).
- Tafaleng, E. N., et al. Induced pluripotent stem cells model personalized variations in liver disease resulting from alpha1-antitrypsin deficiency. Hepatology. 62 (1), 147-157 (2015).
- Jing, R., Duncan, C. B., Duncan, S. A. A small-molecule screen reveals that HSP90beta promotes the conversion of induced pluripotent stem cell-derived endoderm to a hepatic fate and regulates HNF4A turnover. Development. 144 (10), 1764-1774 (2017).
