Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

İnsan kullanarak Pluripotent kök hücre kaynaklı hepatosit benzeri hücreler indüklenen ilaç bulma için

Published: May 19, 2018 doi: 10.3791/57194
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Regenerative Medicine and Cell Biology, Medical University of South Carolina

Summary

Burada sunulan Protokolü küçük moleküller karaciğer hastalığının tedavisi için tanımlamak için bir platform açıklar. Adım adım açıklamasını nasıl iPSCs hücrelere 96-şey plakaları hepatosit özellikleri ile ayırt etmek ve küçük moleküller için potansiyel terapötik etkinlik ile ekran için hücreleri kullanmak için ayrıntılı sunulmaktadır.

Abstract

Hepatosit benzeri hücreler (HLCs) insan indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSCs) ayırt etmek hepatik metabolizma doğuştan hataları incelemek için yeni fırsatlar sağlar. Ancak, karaciğer hastalığı tedavi etmek için kullanılabilir küçük moleküller tanımlaması destekleyen bir platform sağlamak için yordamı bileşikler binlerce eleme ile uyumlu bir kültür biçimi gerektirir. Burada, 96-iyi doku kültürü plakaları hepatosit benzeri hücreleri insan iPSCs tekrarlanabilir farklılaşma izin tamamen tanımlanmış kültür koşulları bir iletişim kuralı'nı açıklar. Ayrıca, Apolipoprotein B (APOB) düşürmek için yeteneklerini için ekran bileşikler platforma kullanarak örnek bir ailesel hiperkolesterolemi hastanın oluşturulan IPSC kaynaklı tetkikine üretilen sağlamaktayız. İlaç keşif ile uyumlu olan bir platform kullanılabilirliğini araştırmacılar roman karaciğeri etkileyen hastalıklar therapeutics tanımlamak izin vermelidir.

Introduction

Tarama için kullanılabilir deneyleri gelişimi başarı nadir bir hastalık hedeflemek için kullanılan ilaçlar belirlenmesinde esas alır. Hipotez veya hedef tabanlı ekranlar (ters farmakoloji) yararlıdır, ancak hastalığın moleküler temeli detaylı bir anlayış gerektirir. Fenotipik ekranlar (klasik farmakoloji) biyokimyasal yollar ayrıntılı bir anlayış gerekir ama bunun yerine doğru hastalığın patofizyolojisi ayna modelleri geliştirilmesi üzerinde güveniyor. Hedef tabanlı yaklaşımlar için coşku rağmen fenotipik ekranları daha başarılı1olmuştur FDA onaylı ilk sınıfındaki ilaç analizleri ortaya koyuyor. Bu yöntem genel amacı bu eleme yüksek üretilen iş için bir platform kurmak için metabolik karaciğer hastalığının tedavisi için küçük moleküller tanımlamak için kullanılabilir. Birkaç vitro modelleri birincil tetkikine, hepatoma hücreleri ve karaciğer progenitör hücre2gibi tarif edilmiştir. Ancak, bu modellerin çoğu kısıtlamalar bulunmaktadır ve doğru bir şekilde kültür metabolik karaciğer eksiklikleri Patofizyoloji özetlemek yeni modeller için bir ihtiyaç. Son zamanlarda, insan pluripotent kök hücreler gen düzenleme ile kombine-si olmak teklif etmek bile nadir hastalıklar kültür ezelî belgili tanımlık lüzum erişim hastalara en nadide modellemek için bir fırsat doğrudan3. Hasta özel iPSCs kullanımı sırasında nadir karaciğer hastalıklarının tedavisi için küçük moleküller keşfetmek için bir araç kavramsal olarak makul olduğu gibi sadece bu yaklaşım4fizibilite gösteren birkaç rapor ediliyor. Ancak, son zamanlarda IPSC kaynaklı tetkikine başarıyla karaciğer metabolizması5eksiklikleri tedavisi için güvenilemez uyuşturucu tanımlamak için kullanılan bir platform kurduk.

Bu iletişim kuralı 96-şey plakaları hepatosit benzeri hücreleri insan iPSCs ayırt ve küçük moleküller içeren bir kitaplık ekranı için onları kullanarak işlemi açıklar. Ayrıca hiperkolesterolemi metabolik karaciğer hastalığı örnek olarak kullanarak bitiş noktası analizi açıklar. Bu yaklaşım rolünü ve uygulama bağlamında bulaşıcı karaciğer hastalığı, metabolik karaciğer hastalığı, ilaç toksisitesi ve diğer karaciğer bozuklukları, küçük moleküllerin çalışma yararlı olmalıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. insan kültürünü Pluripotent kök hücreler indüklenen

  1. Rekombinant insan E-Cadherin Fc füzyon proteini (E-cad-Fc) veya diğer matrisler hPSC kültür için uygun kaplama 6
    1. E-cad-Fc 15 μg/mL Dulbecco'nın Phosphate-Buffered kalsiyum ve magnezyum (DPBS (+)) içeren serum fizyolojik ile oranında seyreltin.
    2. Kat 100-mm süspansiyon doku kültürü yemekleri ile seyreltilmiş E-cad-FC 5 mL için en az 1 h. Kaldır substrat 37 ˚C, kuluçkaya ve Orta (Örneğin, mTeSR1 bundan sonra M-aracı olarak anılacaktır) ile 5 mL yerine7.
      Not: Bu protokol için kullanılan kültür orta yayımlanmış protokolleri7takip hazırlanır. Ancak, diğer birçok medya hazırlıklar tarif var veya ticari, are elde edilebilir bu yordamı ile büyük olasılıkla uyumludur.
    3. Cryopreserved iPSCs bir şişe sıvı azot almak. Kadar küçük buz kristal kalır 37 ˚C çözülme. Yavaşça hücreleri M-Orta 4 mL içeren bir steril 15 mL konik tüp pipet.
    4. 5 dk. süpernatant kaldır ve yavaşça Y-27632, selektif inhibitörü olan Rho ilişkili, kıvrılmış-coil içeren protein kinaz (ROCK) 10 µM ile desteklenmiş orta 5 mL içeren hücreleri yeniden askıya almak için de 300 x g santrifüj kapasitesi.
    5. Ve hücre 5 mL adımından 1.1.4 E-cad-Fc-kaplı 100-mm süspansiyon doku kültürü yemekleri için transfer M-orta adım 1.1.2 den çıkarın.
  2. Kültür insan iPSCs Bakımı
    1. Çevresinde iPSCs ulaştıktan sonra % 80 confluency, kültür orta kaldırmak ve bir kez kalsiyum ile yıkayın ve magnezyum ücretsiz DPBS (-). DPBS (-) Aspire edin ve kuruyucu, sonra 3 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya %0.02 EDTA çözüm yeterli miktarda ekleyin.
      Not: % 80 izdiham plaka 2 x 107 hücreleri içermelidir. Hücreleri sarmak değil ve hücreleri bir farklılaşmamış morfoloji korunmasını sağlamak için önemlidir. Hücreler pluripotent kök hücre işaretçisi Tra-1-60 veya eşdeğer8ile boyama tarafından belirlenebilir.
    2. Serbest bırakmak hücrelere başlar başlamaz, %0.02 EDTA çözeltisi kaldırmak ve hücreleri serbest bırakmak için M Orta 10 mL ile çanak su basması. İPSCs dekolmanı yavaşça pipetting tarafından yardım.
      Not: Yaklaşık 3 dakika ortalama kuluçka zamanı ayırmak hücreler için ama bu her IPSC satırı için ampirik olarak belirlenecek ihtiyacı var. Hücreleri çevresinde içeren küçük kümeleri olarak piyasaya sürülmelidir küme başına 5-10 iPSCs.
    3. 1/10 temiz E-cad-Fc kaplamalı 100 mm süspansiyon doku kültürü çanak M-orta 5 mL içeren başına askıya alınan hücre / aktarın. 37 ˚C altında %4 O, kültürler kuluçkaya2/5% CO2 ve değişim orta günlük.
      Not: Her ne kadar iPSCs rutin Nanog teşvik için fizyolojik oksijen koşullarında kültürlü, iPSCs ortam oksijen kullanarak da yetiştirilir.

2. insan iPSCs 96-şey plakaları hepatosit benzeri hücrelere farklılaşma

Not: Bu bölümde iPSCs tarama ile uyumlu bir biçimde farklılaşma açıklanmaktadır. Bu yaklaşımı kullanarak, ayırmak ve 20 gün içinde hepatosit benzeri hücreleri oluşturmak için insan iPSCs ikna etmek mümkündür. Bu çoğu deneyleri için uygun olmakla birlikte, kültür uzunluğu hücreleri olgunluk geliştirmek için genişletilebilir.

  1. 96-iyi doku kültürü pilakalar ve düşük büyüme faktörü membran matris kaplama
    1. Hisse senedi 2 mg/ml steril buz gibi DMEM/F12 doku kültürü orta ile matris sulandrarak hazırlayın. Matrisin 250 μL aliquots bölmek ve gerekli kadar-80 ˚C saklayın. DMEM/F12 buz 30 dk. almak için 10 mL 250 μL aliquot 2 mg/mL matris stokunun ve tezcan buza chill.
    2. Matrix yavaşça olarak 0,05 mg/mL nihai toplama yapmak için önceden soğutulmuş bir pipet kullanarak karıştırarak 10 mL soğuk DMEM/F12 ile birleştirin.
    3. 100 μL seyreltilmiş matrisinin bir 96-iyi doku kültürü tabak her şey için transfer. 37 ˚C kuluçkaya, en az 1 h için %4 O2/5% CO2 matrisin atmak ve iyi 50 M-Orta μL ile değiştirin. 37 ° C'de, %4 O2/5% CO2 gerekinceye kadar saklayın.
  2. Plaka hücre farklılaşması için
    1. Hücrelerin % 80 izdiham e varana kadar 100-mm plakalar üzerinde iPSCs kültür. Plaka 2 x 107 hücreler içerdiğinden emin olun. Hücre sayıları hücre akış sitometresi veya hemasitometre belirler.
      Not: Tecrübesiyle, kalite iPSCs hücrelerinin mikroskopisi tarafından değerlendirilecektir olabilir; Ancak, hücreleri % 98'i yakın pluripotency işaretleri FACS veya immunostaining kullanılarak ölçülen TRA-1-60 epitope gibi hızlı. Bu hücreler aktif bölme kalır ve değil büyümüş önemlidir.
    2. Her 100-mm plaka iPSCs hasat için kültür orta Aspire edin ve 5 mL DPBS (-) ile durulayın. Durulama 3 mL hücre dekolmanı çözeltisi (Örneğin, accutase) ile değiştirin ve yaklaşık 2 dak 37 ° c, % 4 O2/5% CO2için kuluçkaya.
      Not: Dekolmanı hücrelerinin mikroskopisi tarafından takip etmek önemlidir. Özet accutase ile bitmedi yapmak. Hücreleri en az tedavi ile küçük kümeleri olarak serbest bırakmak için hedeftir.
    3. Ayırmak hücreleri başlar başlamaz M-orta 7 mL ekleyerek hasat. Birkaç kez pipet hücre kolonileri küçük kümeler halinde ayırmak için 3-6 hücreler (Şekil 1A).
    4. 5 dk. süpernatant kaldırmak ve yeniden 5 mL M-Orta hücre Pelet askıya iPSCs 15 mL steril santrifüj tüpü ve santrifüj 300 x g de içine toplamak.
    5. 96-şey matris kaplı plakalar üzerine hücreleri tarafından süspansiyon hücre pipetting 50 μL her kuyuya eşit olarak dağıtabilmenizi. Her 96-şey tabak ayarlamak için hücreleri, farklılaşma kurulum için yaklaşık 5 x 106 hücreler içeren yaklaşık % 80'i confluency ile iPSCs bir 100-mm tabak kullanın. Bu süreci hızlandırmak için bir çok kanallı pipet kullanın. Gecede, 37 ˚C, %4 O2/5% CO2hücre kültür.
      Not: Bu hücreler eşit sayıda tekrarlanabilir saptamaları emin olmak için her kuyuya yatırılır önemlidir.
  3. Hücrelere farklılaşma teşvik
    1. 96-şey plakaları mikroskobu tarafından hücre yüzey her bireyin en az % 70'i de kapak emin olmak için incelemek. Kapsama alanı % 70'den az ise, orta ile taze orta yerine ve 37 ˚C, %4 O2/5% CO2de ek bir 24 h için kuluçkaya.
      Not: Yaygın olarak farklılaşma inducing olmadan kaplama sonra hücreler daha 48 h için kuluçka farklılaşma verimliliğini azaltır. Her ne kadar verim olabilir etkilenen. farklılaşma ortam oksijen kullanarak yapılır
    2. Gün 1 gün 2 farklılaşma, (olmadan insülin), % 2 ' B27 ile takıma RPMI kültür orta yerine 100 ng/mL aktivin A, 10 ng/mL BMP4 ve 20 ng/mL FGF2. Orta iyi başına 100 μL ekleyin ve ortam O2/5% CO2 2 gün için bir günlük orta değişiklikle 37 ˚C, kuluçkaya.
      Not: 96-şey tabak çok sayıda ile ilgili bir yardımlı pipet veya robot kullanımı gerektirir. 12 kanallı ve 96-kanal pipetler günlük orta değiştirmek için idealdir.
    3. 3. gün için günlük 5 farklılaşma Değiştir RPMI ile kültür orta %2 B27 (insülin) olmadan ve 100 ng/mL aktivin A. Kültür ile ortam O2/5% CO2 3 gün için günlük orta değiştirmek ile 37 ˚C hücreleri takıma.
    4. Taze kültür orta, tedavi her takmadan önce farklılaşma günde 5, iyi 100 μL %0.02 EDTA çözüm 30 s, o zaman kaldır ve Değiştir ile taze kültür orta ile.
      Not: Farklılaşma endoderm için verimli ise, hücre ayırt monolayer plaka için peeling eğilimli olur. %0,02 EDTA çözeltisi kısa bir tedaviyle hücre dekolmanı hafifletmeye yardımcı olur. Bu tedavi için tetkikine farklılaşma etkilemez.
    5. Gün 6-10 arasında ayırt etme için kültür B27 (insülin ile) 20 ng/mL BMP4 ve 10 ng/mL FGF2 ile desteklenmiş ve 37 ˚C, %4 O2/5% CO2 günlük orta değiştirmek ile 5 gün boyunca, kuluçkaya Orta % 2 / RPMI ile değiştirin. Bu aşamada hücreleri hepatik progenitör hücre içine ayırt etmek için neden olmaktadır.
    6. Gün 11-15 arasındaki farklılaşma için kültür B27 (insülin ile) desteklenmiş orta RPMI / %2 20 ng/mL ile HGF değiştirin. 37 ˚C, %4 O2/5% CO2 günlük orta değiştirmek ile 5 gün boyunca, kuluçkaya.
    7. Gün 16-20 arasındaki farklılaşma için bir hepatosit hücre kültür 20 ng/mL ile Oncostatin-M (OSM) takıma Orta (HKM) kültür orta yerine. Senaryo Özeti ortam O2/5% CO2 5 gün için günlük orta değiştirmek ile 37 ˚C kuluçkaya.
      Not: Bireysel wells arasındaki farklılaşma tekrarlanabilirlik verimli albümin, AFP veya orta ELISA tarafından salgılanan APOB göreli düzeyi ölçülerek belirlenebilir (bkz: 3.2).

3. küçük molekül tarama

Not: Aşağıdaki APOB düzeyini Orta ailesel hiperkolesterolemi iPSCs türetilmiş hepatosit benzeri hücre düşürmek için kullanılan bileşenleri tanımlamak için kullanılan yordamı açıklar. Açıklanan model ve kullanımı kolesterol düşürücü ilaçlar tanımlaması ile bir açıklama ayrıntılı olarak daha önce5,9. Geçerli örnek, Güney Carolina bileşik toplama (SC3) kitaplığından 1.000 bileşikler gösterildi. Her bileşik 2 μg/mL konsantrasyonu test edildi.

  1. IPSC - küçük moleküller ile türetilmiş tetkikine tedavisinde
    1. Tabak bileşikleri, 20 μg/mL bir konsantrasyon ile çalışma stoklarının % 2 DMSO ve -20 ˚C mağazasında oluşturmak için ana bileşik kitaplık sulandırmak.
    2. IPSC kaynaklı tetkikine test edilecek her bileşik izin vermek için yeterli 96-şey plakaları hazırlayın.
      Not: Taranacak bileşikler sayısı gereklidir 96-şey tabak sayısını belirleyecektir. Genel olarak, bir tek de herhangi bir kontrol örnekleri için her bileşik, artı ek kuyuları için hazırlanmalıdır. Plaka en dıştaki kuyu sık yorumu bozuk kenar efektleri olasılığını azaltmak için kaçınılmalıdır. Sayısı çoğaltır kullanmaya gerek kalmadan z-skor yöntemi kullanılarak belirlenebilir. Çoğaltır varsa, t testi kullanmak daha uygundur.
    3. Farklılaşma (gün 20, bakın 2.3.7) bitiminde, taze HCM 100 μL ile kültür orta yerine20 ng/mL ile Oncostatin-M desteklenmiştir. 37 ˚C kuluçkaya, tam olarak 24 h için %4 O2/5% CO2 taze 96-şey plaka ve -20 ˚C mağazasında içine kültür orta almak. Bu örnek APOB düzey ilaç eklenmesi önce Orta hesaplamak için kullanın.
    4. 20 ng/mL Oncostatin-M her kuyuya ile takıma taze HCM 90 μL ekleyin. Her bileşik 10 μL çalışma stoktan pipetting tarafından karıştırdıktan sonra ekleyin. Tedavi örnekleri son konsantrasyon maç ve 37 ˚C kuluçkaya wells denetlemek için % 0,2 DMSO eklemek, ortam O2/5% CO2 tam olarak 24 h için kültür orta toplamanız ve -20 ˚C. Bu örnek bileşikler ile tedaviden sonra APOB düzeyini belirlemek için kullanın.
    5. İsteğe bağlı - kalan hücreleri immunostaining, hücre canlılığı veya standart yaklaşımları kullanarak mRNA düzeylerinin analizleri için işlenebilir.
      Not: Bu ekran APOB düzeyleri üzerinde hızlı bir etkisi vardı uyuşturucu tanımlamak için tasarlanmıştır. Ancak, hastalık modeli, aşağı akım deneyleri veya ilaç etki mekanizmaları bağlı olarak, bu örnek için birden fazla gün tedavisi faydalı olabilir.
  2. ELISA tarafından APOB düzeylerini belirlemek
    1. Üreticinin iletişim kuralları takip insan APOB ELISA geliştirme seti kullanarak her iki öncesi ve sonrası uyuşturucu tedavi örneklerinden apolipoprotein B (APOB) konsantrasyonu belirlemek.
    2. Aşağıdaki çözümleri hazırlanıyor
      1. Yıkama arabellek, %0.05 oluşan ara 20 dakika sonra PBS, pH 7.4. 4 ˚C kullanmak kadar saklamak.
      2. Kuluçka arabellek, % 0.05 arası 20 ve % 0.1 sığır serum albümin (BSA) PBS, pH 7.4 içinde oluşur. 4 ˚C kullanmak kadar saklamak.
    3. PBS, pH 7.4 2 µg/ml sulandrarak APOB (mAB 20/17) antikor hazırlayın. Seyreltilmiş antikor iyi başına 100 μL ekleyin ve 4 ˚C gecede kuluçkaya.
    4. Antikor tahlil plakalar kaldırmak ve her biri de iki kez PBS, pH 7.4 200 μL yıkayın.
    5. %0,05 200 μL/iyi eklemek ara 20, % 0,1 sığır serum albümin (BSA) PBS, pH 7.4 içinde ve oda sıcaklığında 1s için titreyen bir platform üzerinde kuluçkaya.
    6. PBS, APOB aşağıdaki konsantrasyonları ile pH %7,4 0.05 arası 20 ve % 0.1 BSA kullanılarak bir 8-nokta standart eğri hazırlamak: 300 ng/mL, 200 ng/mL, 175 ng/mL, 150 ng/mL, 125 ng/mL, 100 ng/mL, 75 ng/mL ve 50 ng/mL.
    7. Test örnekleri 1:4 ile % 0.05 arası 20 ve % 0.1 BSA içinde PBS, pH 7.4 oranında seyreltin.
    8. Kuluçka arabellek ile engelleme 1 h sonra arabellek atmak ve beş kez ile %0,05 200 μL tahlil tabak yıkama PBS, pH 7.4 Ara 20.
    9. Tamamen ve 90 μL seyreltilmiş örnekleri ve APOB standartları için tahlil tabak transfer herhangi bir kalıntı çamaşır arabellek çıkarın. Bir shaker 1 h için oda sıcaklığında kuluçkaya.
    10. Örnek atmak ve yıkama 200 μL %0,05 ile ara 20 dakika sonra PBS, pH İyi 7.4. Yıkama toplam 5 kez tekrarlayın. MAB LDL 11-biotin seyreltilmiş 1:1,000 kuyu başına 100 μL % 0.05 arası 20 ve % 0.1 BSA PBS, pH 7.4 olarak ekleyin. 1s için titreyen bir platformda oda sıcaklığında kuluçkaya.
    11. Reaktif atın ve 5 kez de çamaşır arabellek başına 200 μL yıkayın. Streptavidin-HRP antikor kuyu başına 100 μL eklemek (1:1, 000 seyreltme kuluçka tampon kullanarak), o zaman 1s için titreyen bir platformda oda sıcaklığında kuluçkaya.
    12. Reaktif atmak ve yıkama 200 μL %0,05 ile ara 20 dakika sonra PBS, pH İyi 7.4. Yıkama toplam 5 kez tekrarlayın. Tamamen artık çamaşır arabellek tahlil plakalar kaldır ve Tetramethylbenzidin (TMB) substrat çözeltisi kuyu başına 100 μL ekleyin ve 8 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
    13. TMB substrat kaldırmadan, doğrudan durmak eriyik (1N HCl) kuyu başına 100 μL ekleyin.
    14. 450 absorbans belirlemek bir plaka okuyucu kullanarak nm.
    15. Sonra dört parametre Logistic regresyon yöntemi kullanarak APOB konsantrasyonu her örnek10dakika sonra tanımlamak için kullanılan standart bir eğri kurulabilir.
    16. Öncesi uyuşturucu inceleyin: APOB sonrası uyuşturucu oranını bileşikler APOB düşürmek için potansiyeli ile tanımlamak için her örnek içinde orta düzeyde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hepatosit nesil - tarihlerde hücreleri: Şekil 1 insan iPSCs hepatosit benzeri hücrelere farklılaşma sırasında meydana gelen değişiklikler süre açıklar. İPSCs E-Cad-Fc Tarih kültür yaklaşık 2 mm pluripotent işaretçiyi OCT4 hızlı çapı kolonileri sağlar (Şekil 1A-B). Bir E-cadherin matris üzerinde yetiştirilen hücre morfolojisi bu diğer yüzeylerde kültürlü biraz farklı olacaktır. Onlar bir büyük sitoplazmik yüzey alanı (Şekil 1A) ile düzleştirilmiş bir morfoloji sahip olmaya eğilimlidirler. Her ne kadar insan pluripotent kök hücreler verimli bir şekilde farklı matrisler11sayısına kültürlü, iPSCs bir E-cadherin matris kültür pluripotent hücre nüfus polimerlerin artırmak inanılıyor ve enzim ücretsiz sağlar hücreleri düzenleme sırasında geçiş12. Ancak, birkaç alternatif matrisler membran matris, laminins, vitronectin ve fare embriyonik fibroblastlar (MEF), dahil olmak üzere, insan iPSCs korumak için de kullanılabilir ve tüm açıklanan yordamı13ile uyumlu olmalıdır. Her durumda, hücre pluripotency Tra-1-60 veya eşdeğer8tarafından onaylanabilir.

Farklılaşma başlatmak için iPSCs küçük kümeleri (Şekil 1A) toplanmalıdır. Farklılaşma başında kaplama hücreleri plaka yüzeyi yaklaşık % 80'i kapsamalıdır. Büyüme faktörleri ile tedavinin 5 gün sonra hücreleri karakteristik SOX17 ve FOXA2 gibi kesin endoderm ifade edilir proteinler hızlı (Şekil 1B). Bu aşamada, üzerinde hücreleri yüzde 90'ını genellikle bu işaretleri hızlı. 5 daha fazla gün sonra farklılaşma, hepatik bir kader endoderm dönüştürür ve FOXA2 yanı sıra, hücrelere Farklılaşma süreci (Şekil 1B) geri kalanı tespit HNF4a hızlı. Hepatik kader hücreler olarak kabul, onlar bir monolayer olarak plaka yüzeyi kapsamalıdır. HGF eklenmesinden sonra hücreleri fetal tetkikine AFP (Şekil 1B) dahil olmak üzere bulunan proteinler hızlı başlar. Lipid damlacıkları hücrelerin sitoplazma içinde görülebilir. Farklılaşma bitiminde, hücreleri belirgin nükleulus ve birden çok lipid damlacıkları ile büyük bir sitoplazma içeren bir çekirdek ile bir tetrahedron morfoloji benimsenmesi. Hepatosit benzeri hücre alt grubunu çok çekirdekli olacak. Hücrelerin çoğu hepatosit proteinler Albumin (Şekil 1B)14dahil olmak üzere geniş bir repertuar hızlı.

Bir hastalık model olarak hiperkolesterolemi kullanarak etkili yüksek üretilen iş ekran: Hiperkolesterolemi aşırı düşük yoğunluklu lipoprotein-kolesterol (LDL-C) serum konsantrasyonları yansıtır. Ailesel hiperkolesterolemi (FH), serum LDL-C artan düzeyde LDL-C alımı için izni hepatositler tarafından aracılık düşük yoğunluklu lipoprotein reseptör (LDLR) mutasyonlar için öncelikle kaynaklanmaktadır. Homozigoz ailesel hiperkolesterolemi ve kültür9hastanın karaciğer hastalığında yansıtılmış tetkikine oluşturma kullanımları ile bir hastadan iPSCs nesil daha önce anlatmıştık. Bu hücreler bir platform olarak başarıyla ilaç keşfi için kullanılabilir olduğu gösterilmiştir. Ne zaman bir kütüphane ~ 2500 uyuşturucu gösterildi, kalp glikosidler LDL-C daha düşük IPSC kaynaklı tetkikine, birincil insan tetkikine ve fareler insanlaşmış karaciğerler ile beklenmeyen bir yetenek vardı bulundu. Ayrıca, muayene hasta tıbbi kayıtları, o kolesterol seviyeleri düştü hastalarda kardiyak glikozit kalp hastalığı tedavisi için reçete bulduk. Bu çalışmalar IPSC kaynaklı tetkikine başarıyla ekranları tedavi tanımlamak için kullanılan olabilir doğruladı.

Tarama ile uyumlu olan bir platform sağlamak için önemli saptamaları tekrarlanabilir ve iyi-iyi varyasyon küçültülür. Şekil 2 immunostaining üzerine HNF4a ve albümin farklılaşma 20 gün algılamak için 96-şey plaka her iyi sonuçlarını gösterir. Resimde görüldüğü gibi bu hepatosit proteinler dağılımı arasında bütün wells benzer.

APOB LDL-C, merkezi protein bileşenidir. Burada, biz iPSCs ekrana bileşikler düşürücü APOB IPSC kaynaklı tetkikine (Şekil 3A) eleme küçük molekül için kullanarak örnek sağlamak kullanılmaktadır. APOB ELISA tarafından kolayca çözümde ölçülebilir. ELISA örnekler çok sayıda yapılabilir beri bir ekran için temel olarak kullanılabilir. Herhangi bir tahlil yüksek aktarım tarama için uygunluğu en iyi Z-faktör olarak adlandırılan bir ölçü birimi kullanılarak belirlenir (veya Z')15. Bu istatistiksel parametre pozitif ve negatif kontrol örnekleri arasında ayırt etmek için bir tahlil etkinliği hesaplar. Bir tahlil Z faktörle > 0,5 ile ekran15uyumlu kabul edilir. Şekil 3B', z. görüldüğü gibi ' APOB tahlil için ilaç keşif platformu kullanarak uygunluğu teyit 0.73 =.

Bu IPSC kültür orta APOB düzeyleri daha düşük kapasiteye sahip bileşikler tanımlaması - hepatositlerin türetilmiş: platform APOB düzeyleri etkisi yeni bileşikler belirlemek için kullanılabilir olup olmadığını belirlemek için biz 1000 küçük moleküller üzerinden Güney Carolina bileşik toplama (SC3) temsilcisi ayarla Lite (RSL) gösterildi. RSL müzk Güney Carolina Merkezi tarafından tedavi bulma için oluşturulan ve yapısal olarak çeşitlidir bileşikleri içerir ve üst kitaplık yansıtmaktadır.

Sonrası ilaç: APOB öncesi ilaç oranı her bileşik (Şekil 3 c) için kararlı ve sayısı tanımlaması z-score analiz (şekil 3D)16tarafından elde. Bu durumda, APOB bir z-score ≤ 2.0 ile potansiyel sayısı azaltılmış küçük moleküller kabul edildi. Ne zaman 1000 küçük moleküller eleme, potansiyel sayısı z-score ≤-2.0 ile genellikle nispeten yönetilebilir. Ancak, daha büyük bir ekran iletken zaman biz ≤-3.0, daha muhafazakar bir konuda güvenmek istiyorsunuz potansiyel hedeflere güven artırmak için 3-sigma kuralın temel. Bu örnekte, 0.86 0.44 (Şekil 4A) farklı bir APOB oranı ile 24 potansiyel sayısı tespit. İkincil bir tahlil quadruplicate örnekleri üzerinde gerçekleştirildi (n = 4 biyolojik çoğaltır) hücre canlılığı üzerinde olumsuz bir etkisi oldu bileşikler dışlamak için ve hangi bileşikleri tekrarlanarak APOB ortamda daha düşük belirlemek için. Orijinal 24 aday bileşikleri dört tekrarlanabilir bulunmuştur (p ≤0.05) (Şekil 4B-C). İleri çalışmalar APOB gözlenen azalma olasılığı olduğunu mu ima olumsuz yönde etkileyen hücre canlılığı, bu bileşiklerin 2 bulundu bir hücre kaybı bir sonucu olabilir. Kalan iki bileşikler takip çalışmaları için iyi bir aday olarak değerlendirilir.

Figure 1
Resim 1 : Step-wise insan iPSCs hepatik farklılaşma. (A) Morfoloji IPSC kolonileri hemen önce hasat (sol paneli) ve toplama sonra iPSCs hücrelere farklılaşma (doğru kapı aynası) - accutase tedaviden sonra hücreleri 3-6 hücreler/küme ayrışmış. Ölçek çubuğu 50 µm. (B) tablo gösteren kültür koşulları farklılaşma (üst) her aşamasında =. Immunostaining (alt panelleri) farklılaşma her aşamada marker ifade tanımlamak için gerçekleştirildi. OCT4 ve iPSCs, SOX17 ve FOXA2 kesin endoderm, HNF4a ve hepatik progenitör hücrelerin, HNF4a ve AFP olgunlaşmamış hepatosit benzeri hücrelerde FOXA2 içinde çekirdek lekeli DAPI panelleri göstermek ve HNF4a ve albümin içinde nispeten hepatosit benzeri hücreler olgun. Ölçek çubukları 100 µm (B) =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : Hepatik farklılaşma homojen: 96-şey tabak içinde insan iPSCs. Immunostaining üzerine her bireysel iyi IPSC kaynaklı tetkikine farklılaşma(a)algılamak için 20 gün içeren bir 96-şey plaka gerçekleştirilen albümin ve (B) HNF4a. Ölçek çubuğu 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : İnsan IPSC kaynaklı tetkikine kullanarak küçük molekül tarama. (A)ABOB seviyelerinde IPSC kaynaklı tetkikine orta azaltabilir bileşikler tanımlamak için kullanılan yaklaşım şematik bakış. (B) grafik gösteren theresults 87 wells ortamda APOB düzeyini tespit etmek için bir ELISA testin (n = 87) IPSC kaynaklı tetkikine (mavi), ve/veya iPSCs (turuncu) farklılaşmamış. Bu veriler bir Z-faktör hesaplamak için kullanılan (Z' 0.73 =). Sonrası uyuşturucu gösteren (C) grafik: öncesi uyuşturucu oranları APOB konsantrasyon IPSC kaynaklı tetkikine kültür orta SC3 RSL kümesinden 998 bileşikler ile 24 h için tedavi. (D) z-score (C) sunulan veri gösteren grafik. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : Birincil sayısı doğrulanmasını. (A)birincil ekranın APOB azaltmak için güçlü olmak olarak tanımlanan bileşikler gösteren tablo. (B, C) Sonrası ilaçtan bileşikler etkisini gösteren çubuk grafikler: öncesi uyuşturucu APOB konsantrasyon oranı ()B) ve hücre canlılığı (C) IPSC kaynaklı tetkikine takip analiz bileşikler ile tedavi. Hata çubukları yansıtmak ± SEM (n = 4 biyolojik çoğaltır); * p ≤0.05. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Belirli bir protein aktivitesini etkileyen nerede küçük moleküller tanımlanır temel hedef ilaç bulma, birçok varolan tarama çalışmalarının odak noktası olmuştur. Bu yaklaşım çok sayıda ilaç, ekranlar üzerinde ters bir fenotip, klasik Farmakoloji, dayalı sağlamıştır, ancak klinik olarak etkili1olmuştur ilk sınıfındaki bileşikler belirlenmesinde daha başarılı olmuştur. Bir dezavantajı fenotipik ilaç keşif için uygun hastalık modelleri kullanılabilirliğine dayanır olmasıdır. Bu hücre modelleri hastalığın kullanılamaz olduğunda bir meydan okuma, ya da ne zaman ortak araştırma hayvan türleri klinik belirtiler özetlemek başarısız olabilir. Ancak, iPSCs bir hastanın somatik hücrelerden oluşturma yeteneği modeli kültür3insan hastalığında yeni fırsatlara sağlamıştır. Nadir genetik hastalıkları gibi bazı hastalıklar için hasta numarası ve zor-e doğru erişmek ve rıza kaç olabilir. Ancak, genom mühendislik ortaya çıkmasıyla, etken mutasyonlar bile nadir hastalıklar en nadide model edinerek IPSC genom içine tanıtmak için nispeten basit.

İPSCs el olduğunda, hangi hastalığın belirtileri apaçık bir uygun hücre tipi üretmek gereklidir. Örneğin, sinirsel işlev etkileyen hastalıklar nöronların veya glia17, nesil ise bu karaciğeri etkileyen tetkikine9,18 gerekebilir veya19, safraya ait epitelyal hücreler için çalışma gerektirebilir 20 , 21. Bu gereksinim uyarılar ilaç keşfi için iPSCs kullanımını göz önünde bulundurarak getirir. İlk olarak, hastalığın hücresel temelini anlamak önemlidir. Ne zaman özellikle hücre konumu veya çevre temel özellikleri evlat edinmek bu zorlu, olabilir. Bu gen ifade profilleri farklılıkları var tetkikine ve konumlarını karaciğer lobül içinde bağımlı enzimatik fonksiyon için doğru olabilir. İkinci olarak, herhangi bir hücre izolasyon ile çalışma bir bozulma doku yapısına siroz, hücre-hücre iletişim nöromüsküler hastalığı gibi ya da bu gibi iltihap tarafından etkilenmiştir gibi yansıtmak hastalıkları çalışma engelleyebilirsiniz inflamatuar bağırsak hastalığı.

Karaciğer hastalığı çalışmaya, birkaç araştırma grubu iPSCs13,22,23,24,25hepatosit benzeri hücreler üretmek için protokolleri anlatmıştık. Bu iletişim kurallarının en etkili olmakla birlikte, teknik hücreleri tamamen taze tetkikine fonksiyonu özetlemek değil kısıtlamasıdır. Bu hücreleri belirli bir mutasyon etkisini değerlendirmek gerekli işlevleri iPSCs ekrandan yaratılıp karar vermek önemlidir anlamına gelir. Ifade tam olarak eşleşmiyor genler arasında taze tetkikine bulduğu bu CYP450 proteinler25,26kodlama vardır. Bu proteinler ilaç metabolizması ve xenobiotic yanıt olduğunu. Bu bir ekran tasarımı birçok ilaç aktif metabolitleri nesil gerektirir ve bu IPSC kaynaklı tetkikine etkilenebilir çünkü göz önünde bulundurarak önemlidir. Hepatositlerin kalitesini artırmak için çaba27aktif olarak takip ediliyor. Uyarılar rağmen hepatik metabolizma doğuştan hatalı hastalardan elde edilen iPSCs başarıyla kültür9 hastalığında Patofizyoloji ayna hepatosit benzeri hücreler üretmek için kullanılabilir çeşitli çalışmalar göstermiştir , 18 , 28 , 29.

Başarılı olmak ekranları için tetkikine iPSCs üzerinden homojen farklılaşma emin olmak önemlidir. Yüksek kaliteli tetkikine vermeye saptamaları 96-şey tabak içinde başarısız, en sık ya da ebeveyn iPSCs düşük kaliteli veya iPSCs alt-optimal koşullar altında kültür nedeniyle olmasıdır. İPSCs pluripotency dikkatle Kültür günlük değişimleri ile yüksek kaliteli ortamda 1.2 iletişim kuralında tanımlandığı gibi muhafaza edilmelidir. Hücreleri birleşmesi haline Eğer onlar pluripotency kaybetmek ve kendiliğinden ayırt etmek eğilimindedir çünkü pluripotent hücreler kültür tabağına yoğunluğu dikkatlice izlenmelidir. Ayrıca fizyolojik oksijen konsantrasyonları hücrelerde kültür Nanog teşvik ve farklılaşma bazı aşamalarında yararlı bulabilirsiniz. Ancak, uygun ekipman kullanılabilir değilse, pluripotent hücreler kültür hem farklılaşma ikna etmek için ortam oksijen kullanımı mümkün. Biz düzenli olarak hisse senedi iPSCs pluripotency ifade OCT-3/4, MİCRORNAS ve TRA-1-60 kültür koşullarından bağımsız olarak geniş saptamaları gerçekleştirmeden önce dahil olmak üzere birden çok pluripotency işaretlerinin ölçerek tanımlama öneririz. Aynı zamanda hücreleri yüksek verimlilikle endoderm oluşturduğunuzda, hücre yapraklardaki etiketlerle plakaların yüzeyinden peal bir eğilim var gözlemledim. Biz kısaca %0,02 EDTA çözeltisi içeren hücreleri hücre dekolmanı azaltmaya yardımcı olabilir IPSC kaynaklı endoderm tedavi bulduk. Son olarak, hücre verimli saptamaları için gerekli en iyi konsantrasyon IPSC satır aralarını farklı olabilir ve hücre dekolmanı etkileyebilir. Bu nedenle, ampirik olarak verimli saptamaları için özellikle yeni bir IPSC kültür ile çalışırken gerekli hücre konsantrasyonu belirlemek önemlidir.

Özet olarak, kimyasal ekranlarında ile uyumlu olan iPSCs hepatosit benzeri hücreler oluşturur bir step-wise farklılaşma protokol anlatmıştık. Hepatosit benzeri hücreleri 96-şey tabak içinde monolayers olarak üretilen ve verimli ve tekrarlanabilir bir süreçtir. Biz bileşenleri, APOB seviyelerinde kültür orta düşürmek yeteneklerini için eleme fizibilite göstermek. ELISA, qRT-PCR ve yüksek içerik görüntüleme dahil olmak üzere birden çok deneyleri ile uyumlu ayırt etme biçimidir. Biz inanıyoruz alan yaklaşım potansiyel tedavi tanımlamak yararlı bulacaksınız ve yolları hepatosit farklılaşma ve gelecekteki uygulamalar5,30işlevinde etkileyen farmakolojik tanımlanması için.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Acknowledgments

Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüleri (DK55743, DK087377, DK102716 ve HG006398 S.A.D için) tarafından desteklenmiştir. Dr. Behshad Pournasr, Dr. James Heslop ve Ran Jing katkılarından dolayı teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm x 20 mm sterile tissue culture dishes  Corning 430167
100 mm x 20 mm sterile suspension culture dishes Corning 430591
96-wells tissue culture plate  Corning 3595
Anti-human Albumin Dako A 0001
Anti-human FOXA2(6C12) Novus Biological H00003170-M12
Anti-human HNF4 alpha Santa Cruz SC-6556
Anti-human Oct-3/4 antibody Santa Cruz SC-9081
Anti-human SOX17 R&D AF1924
Anti-human TRA-1-60 FITC conjugated Millipore FCMAB115F
Activin A Recombinant Human Protein  Invitrogen PHC9563
B-27 Supplement, minus insulin  Invitrogen 0050129SA
B-27 Supplement, serum free  Invitrogen 17504044
BMP4 Recombinant Human Protein  Invitrogen PHC9533
Cell Dissociation Reagent StemPro  Accutase  Invitrogen A1110501
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay  Promega 7572
DPBS+(calcium, magnesium) Invitrogen 14040-133
DPBS-(no calcium, no magnesium) Invitrogen 14190-144
DMEM/F-12, HEPES  Invitrogen 11330057
ELISA human APOB ELISA development kit Mabtech 3715-1H-20
Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2) Invitrogen PHG0023
Hepatocyte Culture Medium (HCM Bullet Kit)  Lonza CC-3198
Hepatocyte Growth Factor  (HGF) Invitrogen PHC0321
L-Glutamine  Invitrogen 25030081
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Invitrogen 11140076
Oncostatin M (OSM) Recombinant Human Protein  Invitrogen PHC5015
Penicillin-Streptomycin  Invitrogen 15140163
Feeder free pluripotent stem cell medium: mTesR1  STEMCELL technologies 5850
Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix  Invitrogen A1413301
RPMI 1640 Medium, HEPES  Invitrogen 22400105
StemAdhere Defined Matrix for hPSC (E-cad-Fc) Primorigen Biosciences S2071
TMB-ELISA Substrate Solution Thermo Scientific  34022
Anti-TRA-1-60 FITC conjugated Millipore FCMAB115F
Versene (EDTA) 0.02%  Lonza 17-711E
Y-27632 ROCK inhibitor STEMCELL Technologies 72302

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered? Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).
  2. Zeilinger, K., Freyer, N., Damm, G., Seehofer, D., Knospel, F. Cell sources for in vitro human liver cell culture models. Exp Biol Med (Maywood. 241 (15), 1684-1698 (2016).
  3. Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).
  4. Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).
  5. Cayo, M. A., et al. A Drug Screen using Human iPSC-Derived Hepatocyte-like Cells Reveals Cardiac Glycosides as a Potential Treatment for Hypercholesterolemia. Cell Stem Cell. 20 (4), 478-489 (2017).
  6. Nagaoka, M., et al. E-cadherin-coated plates maintain pluripotent ES cells without colony formation. PLoS One. 1, e15 (2006).
  7. Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
  8. International Stem Cell Initiative. Characterization of human embryonic stem cell lines by International Stem Cell Initiative. Nat Biotechnol. 25 (7), 803-816 (2007).
  9. Cayo, M. A., et al. JD induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes faithfully recapitulate the pathophysiology of familial hypercholesterolemia. Hepatology. 56 (6), 2163-2171 (2012).
  10. DeSilva, B., et al. Recommendations for the bioanalytical method validation of ligand-binding assays to support pharmacokinetic assessments of macromolecules. Pharm Res. 20 (11), 1885-1900 (2003).
  11. Rowland, T. J., et al. Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin. Stem Cells Dev. 19 (8), 1231-1240 (2010).
  12. Nagaoka, M., Si-Tayeb, K., Akaike, T., Duncan, S. A. Culture of human pluripotent stem cells using completely defined conditions on a recombinant E-cadherin substratum. BMC Dev Biol. 10, 60 (2010).
  13. Hay, D. C., et al. Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo. Stem Cells. 26 (4), 894-902 (2008).
  14. Mallanna, S. K., Cayo, M. A., Twaroski, K., Gundry, R. L., Duncan, S. A. Mapping the Cell-Surface N-Glycoproteome of Human Hepatocytes Reveals Markers for Selecting a Homogeneous Population of iPSC-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 7 (3), 543-556 (2016).
  15. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  16. Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J Biomol Screen. 16 (7), 775-785 (2011).
  17. Lorenz, C., et al. Human iPSC-Derived Neural Progenitors Are an Effective Drug Discovery Model for Neurological mtDNA Disorders. Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).
  18. Rashid, S. T., et al. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest. 120 (9), 3127-3136 (2010).
  19. Lu, W. Y., et al. Hepatic progenitor cells of biliary origin with liver repopulation capacity. Nat Cell Biol. 17 (8), 971-983 (2015).
  20. Ogawa, M., et al. Directed differentiation of cholangiocytes from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 33 (8), 853-861 (2015).
  21. Sampaziotis, F., et al. Cholangiocytes derived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling and drug validation. Nat Biotechnol. 33 (8), 845-852 (2015).
  22. Mallanna, S. K., Duncan, S. A. Differentiation of hepatocytes from pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 26 (Unit 1G 4), (2013).
  23. Song, Z., et al. Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells. Cell Res. 19 (11), 1233-1242 (2009).
  24. Cai, J., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells. Hepatology. 45 (5), 1229-1239 (2007).
  25. Si-Tayeb, K., et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).
  26. Pashos, E. E., et al. Diverse Population Cohorts of hiPSCs and Derived Hepatocyte-like Cells Reveal Functional Genetic Variation at Blood Lipid-Associated Loci. Cell Stem Cell. 20 (4), 558-570 (2017).
  27. Davidson, M. D., Ware, B. R., Khetani, S. R. Stem cell-derived liver cells for drug testing and disease modeling. Discov Med. 19 (106), 349-358 (2015).
  28. Choi, S. M., et al. Efficient drug screening and gene correction for treating liver disease using patient-specific stem cells. Hepatology. 57 (6), 2458-2468 (2013).
  29. Tafaleng, E. N., et al. Induced pluripotent stem cells model personalized variations in liver disease resulting from alpha1-antitrypsin deficiency. Hepatology. 62 (1), 147-157 (2015).
  30. Jing, R., Duncan, C. B., Duncan, S. A. A small-molecule screen reveals that HSP90beta promotes the conversion of induced pluripotent stem cell-derived endoderm to a hepatic fate and regulates HNF4A turnover. Development. 144 (10), 1764-1774 (2017).

Tags

Pluripotent kök hücreler hücre kültürü hepatosit farklılaşma tarama hepatosit benzeri hücreler hiperkolesterolemi yüksek üretilen iş gelişim biyolojisi sorunu 135 indüklenen
İnsan kullanarak Pluripotent kök hücre kaynaklı hepatosit benzeri hücreler indüklenen ilaç bulma için
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, J. T., Lamprecht, M. P.,… More

Liu, J. T., Lamprecht, M. P., Duncan, S. A. Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery. J. Vis. Exp. (135), e57194, doi:10.3791/57194 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter