Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Ved hjælp af menneskelige induceret pluripotente stamceller-afledt hepatocyt-lignende celler for Drug Discovery

Published: May 19, 2018 doi: 10.3791/57194
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Regenerative Medicine and Cell Biology, Medical University of South Carolina

Summary

Protokollen præsenteres her beskriver en platform for at identificere små molekyler for behandlingen af leversygdom. En trinvis beskrivelse præsenteres beskriver hvordan at differentiere iPSCs i celler med hepatocyt egenskaber i 96-brønd plader og bruger cellerne til at screene for små molekyler med potentielle terapeutiske aktivitet.

Abstract

Evnen til at skelne menneskelig inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) i hepatocyt-lignende celler (HLCs) giver nye muligheder for at studere medfødte fejl i hepatisk metabolisme. Men for at skabe en platform, der understøtter identifikation af små molekyler, der potentielt kan bruges til at behandle sygdomme i leveren, proceduren kræver en kultur-format, der er kompatibel med screening tusindvis af forbindelser. Her, beskriver vi en protokol bruger helt defineret kultur betingelser, som tillader den reproducerbare differentiering af menneskelige iPSCs til hepatocyt-lignende celler i 96-brønd vævskultur plader. Vi leverer også et eksempel på brugen af platform skærmen forbindelser for deres evne til at sænke Apolipoprotein B (APOB) produceret fra iPSC-afledte hepatocytter genereret fra en familiær hyperkolesterolæmi patient. Tilgængeligheden af en platform, der er kompatibel med drug discovery bør tillade forskere til at identificere nye lægemidler til sygdomme, der påvirker leveren.

Introduction

Succes i at identificere stoffer, der kan bruges til at målrette en sjælden sygdom er afhængig af udviklingen af assays, der kan bruges til screening. Hypotese eller target-baserede skærme (reverse farmakologi) er nyttige, men kræver en detaljeret forståelse af det molekylære grundlag af sygdommen. Fænotypisk skærme (klassisk farmakologi) undgå behovet for en detaljeret forståelse af biokemiske veje, men i stedet stole på udviklingen af modeller, der præcist afspejler Patofysiologi af sygdommen. Trods begejstringen for mål-baserede tilgange afsløre analyser af FDA godkendt i førsteklasses narkotika at fænotypiske skærme har været langt mere vellykket1. Det overordnede mål med denne metode er at etablere en platform for high throughput screening, kan bruges til at identificere små molekyler til behandling af metaboliske leversygdom. Flere in vitro- modeller har været beskrevet herunder primære hepatocytter, hepatoma celler og lever stamfader celler2. Men de fleste af disse modeller har begrænsninger, og der er behov for nye modeller, der kan præcist sammenfatte Patofysiologi af metaboliske leversygdom mangler i kultur. For nylig, humane pluripotente stamceller kombineret med gen redigering har tilbudt mulighed for at modellere selv de sjældneste af sjældne sygdomme i kultur uden savn hen til adgang patienter direkte3. Mens brugen af patient-specifikke iPSCs som et redskab til at opdage små molekyler til behandling af sjældne leversygdomme er begrebsmæssigt rimelig, er der kun få rapporter påviser gennemførligheden af denne metode4. Dog har vi for nylig etableret en platform, der bruges iPSC-afledte hepatocytter til at kunne identificere lægemidler, der kan repurposed til behandling af mangler i lever metabolisme5.

Denne protokol forklarer processen med at skelne menneskelige iPSCs til hepatocyt-lignende celler i 96-brønd plader og bruge dem til at screene et bibliotek af små molekyler. Det beskriver også slutpunkt analyse ved hjælp af hyperkolesterolæmi som et eksempel på metabolisk leversygdom. Denne tilgang bør være nyttige at studere den rolle og anvendelsen af små molekyler i forbindelse med smitsomme sygdomme i leveren, metabolisk leversygdom, lægemiddeltoksicitet og andre leversygdomme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. kultur af Human induceret pluripotente stamceller

  1. Belægning rekombinant humant E-Cadherin Fc Fusion Protein (E-cad-Fc) eller andre matrixer, der er egnet til hPSC kultur 6
    1. Fortyndes E-cad-Fc til 15 μg/mL med Dulbecco's Phosphate-Buffered saltvand indeholder calcium og magnesium (DPBS (+)).
    2. Pels 100-mm suspension vævskultur retter med 5 mL fortyndet E-cad-Fc og inkuberes ved 37 ˚C for mindst 1 h. Fjern substrat og erstatte med 5 mL af medium (f.eks. mTeSR1 kaldet M-medium fremover)7.
      Bemærk: Næringssubstratet bruges i denne protokol er udarbejdet efter publicerede protokoller7. Dog flere andre medier præparater er blevet beskrevet, eller findes i handelen, der er sandsynligvis kompatibel med proceduren.
    3. Hente et hætteglas af befrugtede iPSCs fra flydende kvælstof. Tø på 37 ˚C indtil en lille is krystal tilbage. Forsigtigt afpipetteres celler i en steril 15 mL konisk rør indeholdende 4 mL af M-medium.
    4. Der centrifugeres ved 300 x g for 5 min. Fjern supernatanten og forsigtigt genopslæmmes celler med 5 mL af substratet suppleret med 10 µM af Y-27632, en selektiv hæmmer af Rho-associerede, oprullet-coil indeholdende protein kinase (ROCK).
    5. Fjern M-medium fra trin 1.1.2, og overføre 5 mL af celler fra trin 1.1.4 til E-cad-Fc-belagt 100-mm suspension vævskultur retter.
  2. Opretholdelse af menneskelige iPSCs i kultur
    1. Når iPSCs når omkring 80% confluency, fjerne næringssubstratet og vaske en gang med calcium og magnesium gratis DPBS (-). Opsug DPBS (-) og tilføje en tilstrækkelig mængde af 0,02% EDTA løsning til at dække pladerne, derefter inkuberes i op til 3 min. ved stuetemperatur.
      Bemærk: På 80% confluence, skal pladen indeholde omkring 2 x 107 celler. Det er vigtigt ikke at vokse hen over cellerne, og at sikre at cellerne beholde et unuanceret morfologi. Pluripotency celler kan bestemmes ved farvning med stamcelle markør Tra-1-60 eller tilsvarende8.
    2. Så snart cellerne begynder at frigive, fjerne 0,02% EDTA-oploesning og oversvømme parabol med 10 mL af M-medium til at frigive cellerne. Støtte udstationering af iPSCs ved forsigtigt pipettering.
      Bemærk: Den gennemsnitlige inkubationstiden for celler at løsrive er omkring 3 min, men dette skal bestemmes empirisk for hver iPSC linje. Cellerne frigives som små klynger som indeholder omkring 5-10 iPSCs pr. klynge.
    3. Overføre 1/10 af de suspenderede celler pr. frisk E-cad-Fc belagt 100 mm suspension vævskultur parabol der indeholder 5 mL af M-medium. Inkuber kulturer på 37 ˚C under 4% O2/5% CO2 og ændre mediet dagligt.
      Bemærk: Selv om iPSCs er rutinemæssigt kulturperler betingelser fysiologiske ilt at fremme pluripotency, kan iPSCs også dyrkes ved hjælp af luftens ilt.

2. differentiering af menneskelige iPSCs til hepatocyt-lignende celler på 96-brønd plader

Bemærk: Dette afsnit beskriver differentieringen af iPSCs i et format, der er kompatibel med screening. Med denne tilgang, er det muligt at inducere menneskelige iPSCs at differentiere og danne hepatocyt-lignende celler i 20 dage. Mens dette er egnet til de fleste assays, kan længden af kultur udvides for at forbedre modenhed af celler.

  1. Belægning 96-brønd vævskultur plader med nedsat vækst faktor basalmembranen matrix
    1. Forberede bestanden ved at fortynde matrix til 2 mg/mL med iskold sterile DMEM/F12 vævskultur medium. Opdele matrixen i 250 μL delprøver og opbevar ved-80 ˚C indtil kræves. Chill 10 mL af DMEM/F12 på is i 30 min. apportere en 250 μL alikvot af 2 mg/mL matrix lager og tø på is.
    2. Kombinere matrixen med 10 mL af kolde DMEM/F12 ved at blande forsigtigt bruge en pre kølet pipette til at gøre endelig koncentration på 0,05 mg/mL.
    3. Overfør 100 μL fortyndet matrix til hvert hul i en 96-brønd vævskultur plade. Der inkuberes ved 37 ˚C, 4% O2/5% CO2 for mindst 1 h. kassere matrix og erstatte med 50 μL af M-medium pr. brønd. Opbevar ved 37 ° C, 4% O2/5% CO2 indtil det skal bruges.
  2. Plade celler for differentiering
    1. Kultur iPSCs på 100-mm plader, indtil cellerne nærmer sig 80% sammenløb. Sikre at pladen indeholder omkring 2 x 107 celler. Bestemme celle numre af celle flow Flowcytometret eller hemocytometer.
      Bemærk: Med erfaring, kan kvaliteten af iPSCs cellerne blive bedømt ved mikroskopi; dog bør næsten 98% af cellerne udtryk pluripotency markører som TRA-1-60 epitop målt ved FACS eller immunfarvning. Det er vigtigt, at cellerne forbliver aktivt dividere og er ikke tilgroet.
    2. At høste iPSCs fra hver 100-mm plade, Aspirér næringssubstratet og skylles med 5 mL af DPBS (-). Erstatte skylles med 3 mL af celle detachement løsning (fx, accutase) og Inkuber i ca 2 minutter ved 37 ° C, 4% O2/5% CO2.
      Bemærk: Det er vigtigt at følge udstationering af celler ved mikroskopi. Må ikke over digest med accutase. Målet er at frigive cellerne som små klynger med minimal behandling.
    3. Så snart cellerne begynder at løsne, høst ved at tilføje 7 mL af M-medium. Med pipette udtages flere gange for at adskille celle kolonier i små klynger af omkring 3-6 celler (figur 1A).
    4. Indsamle iPSCs i en 15 mL sterilt centrifugeglas, og der centrifugeres ved 300 x g for 5 min. Fjern supernatanten og genopslæmmes celle pellet i 5 mL M-medium.
    5. Jævnt distribuere celler på 96-brønd matrix-belagte plader af pipettering 50 μL af suspension celler i hver brønd. Konfigurer hver 96-brønd plade, skal du bruge en 100-mm plade af iPSCs med celler på ca 80% confluency, som indeholder ca 5 x 106 cellerne installationsprogrammet differentiering. Brug en multikanalpipette til at fremskynde denne proces. Kultur cellerne natten over ved 37 ˚C, 4% O2/5% CO2.
      Bemærk: Det er vigtigt, at et tilsvarende antal celler er deponeret i hver brønd at sikre reproducerbar differentieringer.
  3. Inducere differentiering af celler
    1. Undersøge 96-brønd plader ved mikroskopi til at sikre, at celler omfatter mindst 70% af overfladen af hver enkelt godt. Hvis dækningen er mindre end 70%, erstatte mediet med friske medium og inkuberes i en yderligere 24 timer ved 37 ˚C, 4% O2/5% CO2.
      Bemærk: Inkubere celler i mere end 48 timer efter plating uden inducere differentiering almindeligt mindsker effektiviteten af differentiering. Differentiering vil også forekomme ved hjælp af luftens ilt, selv om effektiviteten kan være ramt.
    2. For dag 1 til dag 2 af differentiering, erstatte næringssubstratet med RPMI suppleret med 2% B27 (uden insulin), 100 ng/mL Activin A, 10 ng/mL BMP4 og 20 ng/mL FGF2. Tilsæt 100 μL af medium pr. brønd og inkuberes ved 37 ˚C, i omgivende O2/5% CO2 med en daglig medium forandring i 2 dage.
      Bemærk: Beskæftiger sig med et stort antal 96-brønd plader kræver brug af en assisteret pipette eller robot. 12-kanal og 96-kanal pipetter er ideel til daglig medium forandring.
    3. For dag 3 til dag 5 af differentiering suppleret Erstat næringssubstratet med RPMI med 2% B27 (uden insulin) og 100 ng/mL Activin A. Culture celler på 37 ˚C, i omgivende O2/5% CO2 med daglige medium forandring i 3 dage.
    4. På differentiering dag 5, før du udskifter med friske næringssubstrat, behandle hver godt med 100 μL 0,02% EDTA-oploesning til 30 s, og derefter fjerne og erstatte med frisk næringssubstratet.
      Bemærk: Hvis differentiering til endoderm er effektiv, er éncellelag af at differentiere celler tilbøjelige til peeling fra pladen. En kort behandling med 0,02% EDTA løsning hjælper lindre celle detachement. Denne behandling har ikke indvirkning differentiering til hepatocytter.
    5. Differentiering mellem dage 6 til 10, erstatte næringssubstratet med RPMI / 2% B27 (med insulin) suppleret med 20 ng/mL BMP4 og 10 ng/mL FGF2 og inkuberes ved 37 ˚C, 4% O2/5% CO2 i 5 dage med daglige medium forandring. Denne fase inducerer cellerne til at differentiere i hepatisk stamceller.
    6. Differentiering mellem dage 11-15, skal du erstatte næringssubstratet med RPMI / 2% B27 (med insulin) suppleret med 20 ng/mL HGF. Der inkuberes ved 37 ˚C, 4% O2/5% CO2 i 5 dage med daglige medium forandring.
    7. Differentiering mellem dage 16 til 20, erstatte næringssubstratet med en hepatocyt cellekulturmedium (HCM), der er suppleret med 20 ng/mL af Oncostatin-M (OSM). Inkuber celler på 37 ˚C, i omgivende O2/5% CO2 med daglige medium forandring i 5 dage.
      Bemærk: Reproducerbarhed af differentiering mellem individuelle brønde kan effektivt bestemmes ved at måle den relative niveau af Albumin, AFP eller APOB udskilles i medium af ELISA (se punkt 3.2).

3. lille molekyle Screening

Bemærk: I det følgende beskrives den procedure, der anvendes til at identificere stoffer, der kan bruges til at sænke niveauet af APOB i medium af hepatocyt-lignende celler, der stammer fra familiær hyperkolesterolæmi iPSCs. En beskrivelse af modellen og dens brug i identifikationen af kolesterolsænkende medicin er blevet beskrevet i detaljer tidligere5,9. I det aktuelle eksempel, blev 1.000 forbindelser fra South Carolina sammensatte samling (SC3) bibliotek screenet. Hver sammensatte blev testet ved en koncentration på 2 μg/mL.

  1. Behandling af iPSC - afledte hepatocytter med små molekyler
    1. Fortynd den master sammensatte bibliotek til at generere plader af arbejder bestande med forbindelser i en koncentration på 20 μg/mL i 2% DMSO og opbevares ved-20 ˚C.
    2. Forberede nok 96-brønd plader af iPSC-afledte hepatocytter tillade hver sammensatte skal testes.
      Bemærk: Antallet af forbindelser til screenes vil diktere antallet af 96-brønd plader, der er nødvendige. Generelt, bør en enkelt være velforberedte for hver sammensat, plus yderligere brønde for enhver kontrolprøver. De yderste brønde af pladen er almindeligvis undgås for at mindske risikoen for kant effekter, der kan beskadige fortolkning. Hits kan identificeres ved hjælp af metoden z-score uden behovet for at bruge replikater. Hvis replikater er inkluderet, er det mere hensigtsmæssigt at bruge t-testen.
    3. Ved afslutningen af differentiering (dag 20, se 2.3.7), erstatte næringssubstratet med 100 μL af frisk HCMsuppleret med 20 ng/mL af Oncostatin-M. Der inkuberes ved 37 ˚C, 4% O2/5% CO2 for præcis 24 h. hente næringssubstratet i en frisk 96-brønd plade og opbevares ved-20 ˚C. Bruge dette eksempel til at beregne niveauet af APOB i medium før tilsætning af narkotika.
    4. Tilføje 90 μL af frisk HCM suppleret med 20 ng/mL af Oncostatin-M i hver brønd. Tilføje 10 μL af hver sammensatte fra arbejde lager efter blanding af pipettering. Tilføje DMSO til 0,2% til at styre wells for at matche den endelige koncentration i de behandlede prøver og inkuberes ved 37 ˚C, omgivende O2/5% CO2 for præcis 24 h. indsamle næringssubstratet og opbevares ved-20 ˚C. Bruge dette eksempel til at bestemme niveauet for APOB efter behandling med forbindelser.
    5. Valgfri - de resterende celler kan blive behandlet for immunfarvning, cellernes levedygtighed eller analyser af mRNA niveauer ved hjælp af standard metoder.
      Bemærk: Denne skærm er designet til at identificere stoffer, der havde en hurtig effekt på APOB niveauer. Afhængigt af sygdom model, downstream assays eller narkotika virkningsmekanisme, kan det imidlertid være gavnligt til behandling af prøven i flere dage.
  2. Bestemme APOB niveauer af ELISA
    1. Bestemmelse af Apolipoprotein B (APOB) koncentration fra både før og efter narkotika behandlede prøverne ved hjælp af en menneskelig APOB ELISA development kit efter producentens protokoller.
    2. Forbereder følgende løsninger
      1. Vaskebuffer, sammensat af 0,05% Tween 20 i PBS, pH 7,4. Opbevares ved 4 ˚C indtil brug.
      2. Inkubation buffer, sammensat af 0,05% Tween 20 og 0,1% bovint serumalbumin (BSA) i PBS, pH 7,4. Opbevares ved 4 ˚C indtil brug.
    3. Forberede APOB (mAB 20/17) antistof ved fortynding til 2 µg/mL i PBS, pH 7,4. Tilsæt 100 μl af de fortyndede antistof pr. brønd og inkuberes ved 4 ˚C natten over.
    4. Fjern antistoffet fra assay plader og vaske hver godt to gange med 200 μl af PBS, pH 7,4.
    5. Tilføje 200 μl/brønd på 0,05% Tween 20, 0,1% bovint serumalbumin (BSA) i PBS, pH 7,4 og Ruger på et rystende platform i 1 time ved stuetemperatur.
    6. Forberede en 8-punkts standardkurve ved hjælp af 0,05% Tween 20 og 0,1% BSA i PBS, pH 7,4 med følgende koncentrationer af APOB: 300 ng/mL, 200 ng/mL, 175 ng/mL, 150 ng/mL, 125 ng/mL, 100 ng/mL, 75 ng/mL og 50 ng/mL.
    7. Fortyndes prøven prøver 1:4 med 0,05% Tween 20 og 0,1% BSA i PBS, pH 7,4.
    8. Efter 1 time for at blokere med inkubation buffer, kassere bufferen og vaske assay pladerne fem gange med 200 μl af 0,05% Tween 20 i PBS, pH 7,4.
    9. Helt fjerne enhver resterende vask bufferen og overføre 90 μl af de fortyndede prøver og APOB standarder til assay plader. Inkuber ved stuetemperatur på en shaker til 1 h.
    10. Kassere prøven og skylles med 200 μl 0,05% Tween 20 i PBS, pH 7,4 pr. brønd. Gentag vasker alt 5 gange. Tilsæt 100 μl pr. brønd af mAB LDL 11-biotin fortyndet 1:1,000 i 0,05% Tween 20 og 0,1% BSA i PBS, pH 7,4. Inkuber ved stuetemperatur på en rystende platform for 1 h.
    11. Kassér reagenset og skylles med 200 μl pr. godt vask buffer 5 gange. Tilsæt 100 μl pr. brønd Streptavidin-HRP antistof (1:1, 000 ved hjælp af inkubation buffer), derefter inkuberes ved stuetemperatur på en rystende platform for 1 h.
    12. Kassér reagenset og skylles med 200 μl 0,05% Tween 20 i PBS, pH 7,4 pr. brønd. Gentag vasker alt 5 gange. Helt fjerne de resterende vask buffer fra assay plader og tilsættes 100 μl pr. brønd i Tetramethylbenzidin (TMB) substratopløsning, og Inkuber ved stuetemperatur i 8 min.
    13. Uden at fjerne TMB-substratet, direkte tilføje 100 μl pr. brønd af stopopløsning (1N HCl).
    14. Bestemme absorbans ved 450 nm med en pladelæseren.
    15. En standardkurve kan oprettes, ved hjælp af metoden fire Parameter logistisk Regression, så bruges til at definere koncentrationen af APOB i hver prøve10.
    16. Undersøge pre-stoffet: efter narkotika forholdet mellem APOB i hver prøve at identificere forbindelser med potentiale til at sænke APOB niveauer i medium.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Generation af hepatocyt - indkvartering celler: Figur 1 beskriver tidsrammen for de ændringer, der opstår under differentiering af menneskelige iPSCs til hepatocyt-lignende celler. Kulturen af iPSCs på E-Cad-Fc giver ca. 2 mm diameter kolonier, der udtrykker pluripotente markør OCT4 (figur 1A-B). Morfologi af celler dyrkes på en E-cadherin matrix vil være lidt anderledes end dem kulturperler på andre overflader. De har tendens til at have en flad morfologi med en større cytoplasmatisk areal (figur 1A). Selv om humane pluripotente stamceller kan effektivt kulturperler på en række forskellige matricer11, kultur af iPSCs på en E-cadherin matrix menes at øge homogeniteten af pluripotente celle befolkning og giver mulighed for enzym-fri manipulation af cellerne under passage12. Men flere alternative matricer, herunder basalmembranen matrix, laminins, vitronectin og mus embryonale fibroblaster (MEF), kan også bruges til at fastholde menneskers iPSCs og alle skal være forenelig med den beskrevne procedure13. I alle tilfælde, kan celle pluripotency bekræftes af Tra-1-60 eller tilsvarende8.

Hen til indlede differentieringen, bør iPSCs indsamles som små klynger (figur 1A). I begyndelsen af differentieringen, bør forgyldt cellerne omfatte ca. 80% af overfladen af pladen. Efter 5 dage efter behandling med vækstfaktorer, cellerne udtrykke proteiner, der er karakteristisk udtrykt i den endelige endoderm som SOX17 og FOXA2 (figur 1B). På dette tidspunkt udtryk over 90% af cellerne typisk for disse markører. Efter 5 dage af differentiering, endoderm konverterer til en hepatisk skæbne, og ud over FOXA2, cellerne udtrykke HNF4a, der kan identificeres i resten af differentiering proces (figur 1B). Som cellerne vedtage en hepatisk skæbne, de bør dække overfladen af pladen som en éncellelag. Efter tilsætning af HGF begynde cellerne at udtrykke proteiner, der findes i føtal hepatocytter herunder AFP (figur 1B). Lipid dråber kan observeres i cytoplasma af celler. Ved afslutningen af differentiering vedtage cellerne en cuboidal morfologi med en kerne, som indeholder fremtrædende nucleoli og en stor cytoplasma med flere lipid dråber. Et undersæt af hepatocyt-lignende celler vil være flere nucleated. De fleste af cellerne udtrykke et omfattende repertoire af hepatocyt proteiner herunder Albumin (figur 1B)14.

Effektiv høj overførselshastighed skærmen ved hjælp af hyperkolesterolæmi som sygdom model: Hyperkolesterolæmi afspejler uforholdsmæssigt store koncentrationer af Low density lipoprotein-kolesterol (LDL-C) i serum. I familiær hyperkolesterolæmi (FH) er øget serum LDL-C primært på grund af mutationer i Low-density lipoprotein receptor (LDLR) der medierer optagelsen af LDL-C for clearance af hepatocytter. Vi har tidligere beskrevet generation af iPSCs fra en patient med homozygot familiær hyperkolesterolæmi og deres brug generere hepatocytter, at spejlet patientens leversygdom hos kultur9. Det blev påvist, at disse celler kunne være anvendt med succes som en platform for drug discovery. Når et bibliotek af ~ 2.500 narkotika blev screenet, konstateredes det, at hjerteglykosider havde en uventet evne til at sænke LDL-C i iPSC-afledte hepatocytter, primære humane hepatocytter, og i mus med humaniseret lever. Derudover ved undersøge patientens medicinske journaler fandt vi at kolesterol faldt niveauet hos patienter, der blev ordineret en hjerteglykosid til behandling af hjertesygdomme. Disse undersøgelser bekræftet at iPSC-afledte hepatocytter kunne anvendes med succes og skærme til at identificere therapeutics.

For at give en platform, der er kompatibel med screening, er det vigtigt at differentieringer er reproducerbare og at nå til godt variation er minimeret. Figur 2 viser resultaterne af at immunfarvning på hvert hul i en 96-brønd plade til at opdage HNF4a og Albumin i dag 20 af differentiering. Som det kan ses i figur, er fordelingen af disse hepatocyt proteiner ens på tværs af alle brønde.

Den centrale protein komponent af LDL-C er APOB. Her har vi brugt iPSCs til skærmen for APOB sænke forbindelser til at give et eksempel på brugen af iPSC-afledte hepatocytter for små molekyle screening (figur 3A). APOB kan let måles i løsning ved ELISA. Da ELISA kan udføres på store mængder prøver, kan det bruges som grundlag for en skærm. Egnetheden af enhver assay for high throughput screening bestemmes bedst ved hjælp af en måling kaldes Z-faktor (eller Z')15. Denne statistiske parameter beregner effektiviteten af en analyse til at skelne mellem positive og negative kontrolprøver. En analyse med en Z-faktor > 0,5 er betragtes som forenelig med en skærm15. Som det ses i figur 3B, Z' af APOB assay = 0,73, som bekræfter egnetheden af med platformen for drug discovery.

Identifikation af forbindelser, der har kapacitet til at sænke APOB niveauer i dyrkningsmediet af iPSC - afledt hepatocytter: for at afgøre, om platformen kunne bruges til at identificere nye forbindelser, der påvirker APOB niveauer, vi screenet 1.000 små molekyler fra den Syd Carolina sammensatte samling (SC3) repræsentativt sæt Lite (RSL). RSL blev genereret af MUSC South Carolina Center for terapeutisk opdagelse, og indeholder stoffer, der er strukturelt forskelligartede og afspejler det overordnede bibliotek.

Efter stoffet: før drug forholdet mellem APOB blev fastsat for hvert stof (figur 3 c) og identifikation af hits blev opnået af z-score analyse (figur 3D)16. I dette tilfælde anset for små molekyler, der reducerede APOB med en z-score ≤-2.0 som potentielle hits. Når screening 1.000 små molekyler, er antallet af potentielle hits med en z-score ≤-2.0 normalt relativt overskueligt. Men, når der udføres en større skærm, ville vi stole på en mere konservativ score ≤-3.0, baseret på den 3-sigma reglen, at øge tilliden til potentielle mål. I dette eksempel identificeret vi 24 potentielle hits med en APOB ratio, der varierede fra 0,86 til 0,44 (figur 4A). En sekundær analyse blev udført på forsøgsbetingelse prøver (n = 4 biologiske replikater) at udelukke forbindelser, der havde en negativ indvirkning på cellernes levedygtighed og til at bestemme, hvilke forbindelser kunne reproducerbar sænke APOB i mediet. Af de oprindelige 24 kandidat forbindelser, fire fandtes for at være reproducerbare (p ≤0.05) (figur 4B-C). Efter yderligere undersøgelse, 2 af disse stoffer fandtes at negativt påvirker cellernes levedygtighed, tyder på, at den observerede reduktion i APOB var sandsynligt, at en være en konsekvens af celletab. De resterende to forbindelser ville blive betragtet som gode kandidater til opfølgende undersøgelser.

Figure 1
Figur 1 : Trinvis hepatisk differentiering af menneskelige iPSCs. (A) Morfologi af iPSC kolonier umiddelbart før høst (venstre panel) og iPSCs efter indsamling celler for differentiering (højre panel) - efter accutase behandling, cellerne skal adskilles i 3-6 celler/klynge. Skalalinjen = 50 µm. (B) tabel viser dyrkningsbetingelser i hver fase af differentiering (øverste). Immunfarvning (lavere paneler) blev udført for at identificere markør udtryk på alle stadier af differentiering. Paneler viser OCT4 og DAPI farves kerner i iPSCs, SOX17 og FOXA2 i endelige endoderm, HNF4a og FOXA2 i hepatisk stamceller, HNF4a og AFP i umodne hepatocyt-lignende celler, og HNF4a og Albumin i relativt modne hepatocyt-lignende celler. Skalere barer = 100 µm (B). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Homogen hepatisk differentiering af humane iPSCs i 96-brønd plader. Immunfarvning blev udført på hvert enkelt hul i en 96-brønd plade der indeholder iPSC-afledte hepatocytter på dag 20 af differentiering til at opdage (A) Albumin og (B) HNF4a. Skalalinjen = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Lille molekyle screening ved hjælp af menneskelige iPSC-afledte hepatocytter. (A) skematisk oversigt over den fremgangsmåde, der bruges til at identificere stoffer, der kan reducere niveauet af ABOB i medium af iPSC-afledte hepatocytter. (B) graf viser resultaterne af en ELISA assay til at opdage niveauet af APOB i medium af 87 brønde (n = 87) af iPSC-afledte hepatocytter (blå) og/eller udifferentierede iPSCs (orange). Disse data blev brugt til at beregne en Z-faktor (Z' = 0,73). (C) graf viser post stoffet: før drug forhold mellem koncentration af APOB dyrkningsmedium af iPSC-afledte hepatocytter behandlet i 24 timer med 998 forbindelser fra SC3 RSL sæt. (D) graf viser z-score af oplysningerne i litra C. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Validering af primære hits. (A) tabel viser forbindelser identificeret i den primære skærm som værende i stand til at reducere APOB. (B, C) Bar grafer viser virkningen af forbindelser på post stof: før drug APOB koncentrationsgrad ()B) og cellernes levedygtighed (C) i iPSC-afledte hepatocytter behandlet med forbindelser i opfølgning analyse. Fejllinjer afspejler ± SEM (n = 4 biologiske replikater); * p ≤0.05. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Target baseret drug discovery, hvor små molekyler identificeres der påvirker aktiviteten af et bestemt protein, har været genstand for mange eksisterende screening indsats. Selv om denne tilgang har givet talrige lægemidler, skærme baseret på at vende en fænotype, klassisk farmakologi, har haft større succes med at identificere i førsteklasses forbindelser, der er blevet klinisk virkningsfuldt1. En ulempe for fænotypisk drug discovery er, at det er afhængig af tilgængeligheden af passende sygdomsmodeller. Dette kan være en udfordring, når cell modeller af sygdommen er utilgængelige, eller når fælles forskning dyrearter undlader at sammenfatte de kliniske symptomer. Men evnen til at generere iPSCs fra patientens somatiske celler har givet nye muligheder at model menneskelige sygdom i kultur3. For nogle sygdomme, som sjældne genetiske sygdomme, kan patienter få i antal, og vanskeligt at få adgang til og samtykke. Med fremkomsten af genom engineering, er det dog relativt let at indføre forårsagende mutationer i iPSC genom, gør det muligt at modellere selv de sjældneste af sjældne sygdomme.

Når iPSCs er i hånden, er det nødvendigt at udarbejde en passende celletype, hvor symptomerne på sygdommen manifestere. For eksempel, kan sygdomme påvirker neurale funktion kræve generation af neuroner og glia17, mens dem, der påvirker leveren muligvis hepatocytter9,18 eller galde epitelceller for studere19, 20 , 21. dette krav introducerer en række forbehold, når de overvejer brugen af iPSCs for drug discovery. For det første er det vigtigt at forstå de cellulære grundlag af sygdommen. Dette kan være udfordrende, især når cellerne vedtage egenskaber baseret på placering eller miljø. Dette kunne være tilfældet for hepatocytter, der har forskelle i gen expression profiler og enzymatisk funktion, der er afhængige af deres placering i den lever lobule. Andet arbejde med celler i isolation kan forhindre studiet af sygdomme, der afspejler en afbrydelse af væv struktur som skrumpelever, celle-celle kommunikation såsom neuromuskulære sygdomme, eller dem, der er påvirket af betændelse som inflammatoriske tarmsygdom.

For at studere leversygdom, har flere forskergrupper beskrevet protokoller for at generere hepatocyt-lignende celler fra iPSCs13,22,23,24,25. Mens de fleste af disse protokoller er effektiv, er begrænsning af teknikken at celler fuldt ikke sammenfatte funktion af frisk hepatocytter. Dette betyder, at det er vigtigt at fastslå, om celler genereret fra iPSCs display funktioner nødvendige for at vurdere effekten af en given mutation. Blandt de gener, hvis udtryk ikke svarer fuldt ud er, findes i friske hepatocytter dem kodning CYP450 proteiner25,26. Flere af disse proteiner har roller i drug metabolisme og de xenobiotiske svar. Dette er vigtigt, når man overvejer udformningen af en skærm, fordi mange lægemidler kræver generation af aktive metabolitter, og dette kunne blive berørt i iPSC-afledte hepatocytter. Bestræbelser på at forbedre kvaliteten af hepatocytter bliver aktivt ført27. På trods af forbehold, har adskillige undersøgelser vist, at iPSCs stammer fra patienter med medfødte fejl i hepatisk metabolisme kan bruges med succes til at generere hepatocyt-lignende celler, der afspejler Patofysiologi af sygdommen i kultur9 , 18 , 28 , 29.

For skærme skal lykkes, er det vigtigt at sikre ensartet differentiering af hepatocytter fra iPSCs. Når differentieringer i 96-brønd plader undlader at give høj kvalitet hepatocytter, er det oftest skyldes enten til den dårlige kvalitet af den parental iPSCs eller kultur af iPSCs under optimale betingelser. Pluripotency af iPSCs skal holdes omhyggeligt af kultur i en høj kvalitet medium med daglige ændringer som beskrevet i protokollen 1.2. Tætheden af pluripotente celler i kultur parabol bør overvåges nøje, fordi hvis cellerne bliver over sammenflydende de tendens til at miste pluripotency og spontant differentiere. Vi finder også, at dyrkning af celler i fysiologiske ilt koncentrationer fremmer pluripotency og er fordelagtigt i nogle faser af differentiering. Hvis passende udstyr ikke er tilgængelig, er det imidlertid stadig være muligt at bruge luftens ilt til både kultur pluripotente celler og inducerer differentiering. Vi foreslår, at rutinemæssigt definere pluripotency af stock iPSCs ved at måle udtryk for flere pluripotency markører herunder OCT-3/4, NANOG og TRA-1-60 før du udfører omfattende differentieringer uanset kultur betingelser. Vi har også konstateret, at når cellerne danner endoderm på høj effektivitet, de har en tendens til at skræl fra overfladen af pladerne som celle ark. Vi har konstateret, at kort behandle de iPSC-afledte endoderm celler med 0,02% EDTA-oploesning kan bidrage til at reducere celle detachement. Endelig, den optimale koncentration af celler kræves til effektiv differentieringer kan variere mellem iPSC linjer og kan påvirke celle detachement. Derfor er det vigtigt at empirisk bestemmes koncentrationen af celler brug for effektiv differentieringer, især når du arbejder med en ny iPSC kultur.

I sammendrag, har vi beskrevet en trinvis differentiering protokol, der genererer hepatocyt-lignende celler fra iPSCs, der er kompatible med kemiske skærme. Hepatocyt-lignende celler er produceret som encellelag i 96-brønd plader, og processen er effektiv og reproducerbar. Vi demonstrere mulighederne for screening forbindelser for deres evne til at sænke niveauet af APOB i dyrkningsmediet. Den differentiering er kompatibelt med flere assays herunder ELISA, qRT-PCR og høje indhold billeddannelse. Vi mener, at feltet vil finde fremgangsmåde bruges til at identificere potentielle therapeutics og farmakologiske identifikation af veje påvirker hepatocyt differentiering og funktion i den fremtidige programmer5,30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (DK55743, DK087377, DK102716 og HG006398 til sad). Vi vil gerne takke Dr. Behshad Pournasr, Dr. James Heslop og Ran Jing for deres bidrag.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm x 20 mm sterile tissue culture dishes  Corning 430167
100 mm x 20 mm sterile suspension culture dishes Corning 430591
96-wells tissue culture plate  Corning 3595
Anti-human Albumin Dako A 0001
Anti-human FOXA2(6C12) Novus Biological H00003170-M12
Anti-human HNF4 alpha Santa Cruz SC-6556
Anti-human Oct-3/4 antibody Santa Cruz SC-9081
Anti-human SOX17 R&D AF1924
Anti-human TRA-1-60 FITC conjugated Millipore FCMAB115F
Activin A Recombinant Human Protein  Invitrogen PHC9563
B-27 Supplement, minus insulin  Invitrogen 0050129SA
B-27 Supplement, serum free  Invitrogen 17504044
BMP4 Recombinant Human Protein  Invitrogen PHC9533
Cell Dissociation Reagent StemPro  Accutase  Invitrogen A1110501
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay  Promega 7572
DPBS+(calcium, magnesium) Invitrogen 14040-133
DPBS-(no calcium, no magnesium) Invitrogen 14190-144
DMEM/F-12, HEPES  Invitrogen 11330057
ELISA human APOB ELISA development kit Mabtech 3715-1H-20
Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2) Invitrogen PHG0023
Hepatocyte Culture Medium (HCM Bullet Kit)  Lonza CC-3198
Hepatocyte Growth Factor  (HGF) Invitrogen PHC0321
L-Glutamine  Invitrogen 25030081
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Invitrogen 11140076
Oncostatin M (OSM) Recombinant Human Protein  Invitrogen PHC5015
Penicillin-Streptomycin  Invitrogen 15140163
Feeder free pluripotent stem cell medium: mTesR1  STEMCELL technologies 5850
Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix  Invitrogen A1413301
RPMI 1640 Medium, HEPES  Invitrogen 22400105
StemAdhere Defined Matrix for hPSC (E-cad-Fc) Primorigen Biosciences S2071
TMB-ELISA Substrate Solution Thermo Scientific  34022
Anti-TRA-1-60 FITC conjugated Millipore FCMAB115F
Versene (EDTA) 0.02%  Lonza 17-711E
Y-27632 ROCK inhibitor STEMCELL Technologies 72302

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered? Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).
  2. Zeilinger, K., Freyer, N., Damm, G., Seehofer, D., Knospel, F. Cell sources for in vitro human liver cell culture models. Exp Biol Med (Maywood. 241 (15), 1684-1698 (2016).
  3. Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).
  4. Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).
  5. Cayo, M. A., et al. A Drug Screen using Human iPSC-Derived Hepatocyte-like Cells Reveals Cardiac Glycosides as a Potential Treatment for Hypercholesterolemia. Cell Stem Cell. 20 (4), 478-489 (2017).
  6. Nagaoka, M., et al. E-cadherin-coated plates maintain pluripotent ES cells without colony formation. PLoS One. 1, e15 (2006).
  7. Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
  8. International Stem Cell Initiative. Characterization of human embryonic stem cell lines by International Stem Cell Initiative. Nat Biotechnol. 25 (7), 803-816 (2007).
  9. Cayo, M. A., et al. JD induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes faithfully recapitulate the pathophysiology of familial hypercholesterolemia. Hepatology. 56 (6), 2163-2171 (2012).
  10. DeSilva, B., et al. Recommendations for the bioanalytical method validation of ligand-binding assays to support pharmacokinetic assessments of macromolecules. Pharm Res. 20 (11), 1885-1900 (2003).
  11. Rowland, T. J., et al. Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin. Stem Cells Dev. 19 (8), 1231-1240 (2010).
  12. Nagaoka, M., Si-Tayeb, K., Akaike, T., Duncan, S. A. Culture of human pluripotent stem cells using completely defined conditions on a recombinant E-cadherin substratum. BMC Dev Biol. 10, 60 (2010).
  13. Hay, D. C., et al. Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo. Stem Cells. 26 (4), 894-902 (2008).
  14. Mallanna, S. K., Cayo, M. A., Twaroski, K., Gundry, R. L., Duncan, S. A. Mapping the Cell-Surface N-Glycoproteome of Human Hepatocytes Reveals Markers for Selecting a Homogeneous Population of iPSC-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 7 (3), 543-556 (2016).
  15. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  16. Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J Biomol Screen. 16 (7), 775-785 (2011).
  17. Lorenz, C., et al. Human iPSC-Derived Neural Progenitors Are an Effective Drug Discovery Model for Neurological mtDNA Disorders. Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).
  18. Rashid, S. T., et al. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest. 120 (9), 3127-3136 (2010).
  19. Lu, W. Y., et al. Hepatic progenitor cells of biliary origin with liver repopulation capacity. Nat Cell Biol. 17 (8), 971-983 (2015).
  20. Ogawa, M., et al. Directed differentiation of cholangiocytes from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 33 (8), 853-861 (2015).
  21. Sampaziotis, F., et al. Cholangiocytes derived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling and drug validation. Nat Biotechnol. 33 (8), 845-852 (2015).
  22. Mallanna, S. K., Duncan, S. A. Differentiation of hepatocytes from pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 26 (Unit 1G 4), (2013).
  23. Song, Z., et al. Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells. Cell Res. 19 (11), 1233-1242 (2009).
  24. Cai, J., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells. Hepatology. 45 (5), 1229-1239 (2007).
  25. Si-Tayeb, K., et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).
  26. Pashos, E. E., et al. Diverse Population Cohorts of hiPSCs and Derived Hepatocyte-like Cells Reveal Functional Genetic Variation at Blood Lipid-Associated Loci. Cell Stem Cell. 20 (4), 558-570 (2017).
  27. Davidson, M. D., Ware, B. R., Khetani, S. R. Stem cell-derived liver cells for drug testing and disease modeling. Discov Med. 19 (106), 349-358 (2015).
  28. Choi, S. M., et al. Efficient drug screening and gene correction for treating liver disease using patient-specific stem cells. Hepatology. 57 (6), 2458-2468 (2013).
  29. Tafaleng, E. N., et al. Induced pluripotent stem cells model personalized variations in liver disease resulting from alpha1-antitrypsin deficiency. Hepatology. 62 (1), 147-157 (2015).
  30. Jing, R., Duncan, C. B., Duncan, S. A. A small-molecule screen reveals that HSP90beta promotes the conversion of induced pluripotent stem cell-derived endoderm to a hepatic fate and regulates HNF4A turnover. Development. 144 (10), 1764-1774 (2017).

Tags

Udviklingsmæssige biologi spørgsmålet 135 induceret pluripotente stamceller celler cellekultur hepatocyt differentiering High Throughput Screening hepatocyt-lignende celler hyperkolesterolæmi
Ved hjælp af menneskelige induceret pluripotente stamceller-afledt hepatocyt-lignende celler for Drug Discovery
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, J. T., Lamprecht, M. P.,… More

Liu, J. T., Lamprecht, M. P., Duncan, S. A. Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery. J. Vis. Exp. (135), e57194, doi:10.3791/57194 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter