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Immunology and Infection

Erhebung und Verarbeitung von Lymphknoten von großen Tieren für RNA-Analyse: Vorbereitung auf Lymphknoten Transkriptomischen Studien der großen Tierarten

doi: 10.3791/57195 Published: May 19, 2018

Summary

Dieses Protokoll bietet einen Überblick über Verfahren zur Isolierung von RNA für die transkriptomischen Profilierung der Lymphknoten Gewebe von großen Tieren, einschließlich Schritte bei der Identifizierung und Entfernung der Lymphknoten von Vieh und Wildtiere, Probenahme Ansätze Konsistenz über mehrere Tiere, und Überlegungen sowie repräsentative Ergebnisse für die Post-Sammlung, Erhaltung und Verarbeitung für RNA-Analyse zu schaffen.

Abstract

Große Tiere (Vieh und Wildtiere) dienen als wichtiges Reservoir von Zoonoseerregern, einschließlich Brucella, Mycobacterium Bovis, Salmonellenund Escherichia Coli, und eignen sich für die Untersuchung der Pathogenese und/oder Ausbreitung der Bakterien in natürlichen Wirte. Mit der wichtigen Funktion der Lymphknoten in der Host-Immunantwort dienen Lymphknoten Gewebe als eine potentielle Quelle von RNA für nachgeschaltete transkriptomischen Analysen, um die zeitlichen Veränderungen in der Genexpression in Zellen im Verlauf einer Infektion zu bewerten. Dieser Artikel bietet eine Übersicht über den Prozess der Lymphknoten Sammlung, Gewebe-Sampling und nachgelagerten RNA Verarbeitung in Vieh, weitere Beispiele zur Verfügung gestellt von der amerikanischen Bison (Bison Bison Rind (Bos Taurus) als ein Modell mit ). Das Protokoll enthält Informationen über die Lage, Ermittlung und Entfernung der Lymphknoten aus mehreren wichtigen Standorten im Körper. Darüber hinaus wird eine Biopsie Sampling-Methode vorgestellt, die für eine Konsistenz der Probenahme über mehrere Tiere ermöglicht. Einige Überlegungen zur Probe Erhaltung werden diskutiert, einschließlich der Erzeugung von RNA geeignet für nachgeschaltete Methoden wie RNA-Sequenzierung und RT-PCR. Aufgrund der langen Verzögerungen große Tier vs. Maus Zeitstudien Kurs innewohnt sind repräsentative Ergebnisse von Bisons und Rinder Lymphknoten Gewebe präsentiert um zu beschreiben, den zeitlichen Verlauf der Abbau in diesem Gewebetyp, im Rahmen einer Überprüfung der methodische Vorarbeiten auf RNA-Abbau in anderen Geweben. Insgesamt wird dieses Protokoll sinnvoll, beide tierärztliche Forscher Anfang Transkriptom Projekte auf große Tiere Proben und Molekularbiologen Lerntechniken für in Vivo Gewebe-Probeentnahme und in-vitro- Verarbeitung interessiert sein.

Introduction

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RNA-Sequenzierung Analyse des transkriptoms Lymphknoten bietet die Möglichkeit, die Immunantwort von Tieren zu einer Vielzahl von Krankheitserregern zu charakterisieren. Während diese Methode bei Mäusen ausgiebig genutzt wurden, haben vor kurzem Analysen in größeren Säugetiere1,2ausgebaut. Vieh/großes Tier Lymphknoten kann verwendet werden, um Host Reaktion auf eine Infektion, nicht nur für den Gebrauch im Impfstoff oder genetische Anfälligkeit Studien und für die Identifizierung von Zielen für die Entwicklung von Medikamenten, sondern auch als Modellsysteme für Studien am Menschen zu charakterisieren über Zoonosen. Zum Beispiel im Falle von Brucellose (eine bakterielle Zoonose, dass Auswirkungen eine halbe Million auf der ganzen Welt jedes Jahr Menschen), trotz deutlich erhöhte Kosten, Studien bei Schafen oder Ziegen sind relevanter für die Infektion beim Menschen und menschliche Impfstoff Entwicklung als Labor Tiermodelle. Maus Infektionsmodelle rekapitulieren die retikuloendothelialen System Infektion aber nicht die charakteristischen klinischen Symptome3.

Im großen Tierversuch im Vergleich zu tierischen Laborstudien umfasst den Prozess des Gewebes Ernte unbedingt eine längere Verzögerung zwischen der Euthanasie und die Gewebe-Kollektion, die eine mögliche für die Erhaltung der Herausforderung qualitativ hochwertige RNA. Intakte RNA ist essentiell für die Generation der biologisch relevanten transkriptomischen Daten. Die Erzeugung von qualitativ hochwertigen RNA aus Gewebeproben erfolgt im Containment Einrichtungen für große Tiere Pathogen Studien besonders kritisch. Solche Studien sind von Natur aus schwieriger durchzuführen, da sie nicht nur genehmigte Anlagen und hoch qualifiziertes Personal erfordern aber auch erhebliche finanzielle Kosten, die abhängig von der Arbeit von Dutzende bis Hunderte von Tausenden von Dollar reichen können. Diese Arten von Studien beinhalten auch eine interdisziplinäre Zusammenarbeit und fachübergreifende Kenntnisse für ihren Abschluss, ihre Komplexität hinzufügen. Daher bietet Ausbildung auf, Entwicklung und Einhaltung ein optimiertes System für die Entnahme von Proben und Erhaltung erhebliche Vorteile für nachgeschaltete molekulare Untersuchungen von Geweben von infizierten Tieren.

Die Sammlung von größeren Lymphknoten präsentiert zusätzliche Herausforderungen für die Gewebe-Sammlung im Vergleich zu ähnlichen Probenahme von murinen Lymphknoten. Die Vorbereitung auf die Probe-Exzision erfordert ein grundlegendes Verständnis der Anatomie des Lymphknotens, einschließlich der relevanten internen Strukturen. Die Struktur eines Lymphknotens besteht aus lymphoiden Läppchen umgeben von Nebenhöhlen mit Lymphe gefüllt. Diese Strukturen sind in eine zähe, fibröse Kapsel eingeschlossen. 4 eine lymphoide Lobule ist die "grundlegende anatomische und funktionelle Einheit des Lymphknotens" und besteht aus Follikel, eine tief kortikale Einheit und medulläre Schnüre und Nebenhöhlen4 (Abbildung 1A). B- und T-Lymphozyten sind Heimat der Follikel und tiefen kortikalen Einheiten. Diese Strukturen bieten eine 3D Gerüst und der Interaktion zwischen Lymphozyten und Antigen oder antigenpräsentierende Zellen.

Grob, Follikel und tiefen kortikalen Einheiten identifiziert werden können auf Schnittfläche als sie eine dichtere netzartige Geflecht enthalten und dunkler als die Nebenhöhlen, die bestehen aus einem zarteren netzartige Geflecht und heller erscheinen (Abbildung 1 b). Gemäß der Konvention beziehen sich Pathologen auf die Regionen der Lymphknoten als oberflächliche Kortex (Follikel), Parakortex (tief kortikalen Einheiten) und der Medulla (medulläre Schnüre und Nebenhöhlen). Eine ordnungsgemäße Untersuchung aller drei Regionen wurde als beste Praxis in Routine pathologischen Untersuchung Leitlinien für Lymphknoten5angesehen. Beachten Sie, dass es erhebliche Unterschiede in der Konsistenz, Größe und Farbe der Lymphknoten, auch innerhalb eines einzelnen Tieres. Zunehmendem Alter der Tiere ihre Lymphknoten wird tendenziell kleiner und werden fester als bei jüngeren Tieren, in der Regel auf eine Erhöhung ihrer Bindegewebe und eine Verminderung der normalen lymphatischen Struktur6,7.

Figure 1
Abbildung 1. Anatomie des Lymphknotens. (A) Diese Karikatur zeigt die Anatomie des Lymphknotens, Schlüsselstrukturen darstellt. (B) dieses noch Bild zeigt einen bovinen Lymphknoten schneiden im Querschnitt. Die relevanten Strukturen/Layer, die mit dem bloßen Auge sichtbar sind, werden hervorgehoben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abhängig von der experimentellen Frage wird verschiedenen Lymphknoten für die Erhebung und Analyse von Interesse sein. Peripheren Lymphknoten sind diejenigen befindet sich tief im subkutanen Gewebe. Bei Rindern, periphere oder oberflächlichen Lymphknoten oft verwendet in der klinischen und experimentellen Praxis umfassen Parotis, mandibulären, retropharyngeal, prescapular, Thymus (precrural) und oberflächlichen inguinalen (Supramammary bei Frauen, bei Männern scrotal) () ( Abbildung 2). In Tabelle 1sind die Eigenschaften der wichtigsten oberflächlichen Lymphknoten, wie beschrieben in die Rinder System8beschrieben. Im folgenden sind einige mögliche Lymphknoten Sammlung Pläne für bakterielle Infektionskrankheiten von Rindern als Ausgangspunkt für die Untersuchung vorgestellt.

Brucella Abortus/Brucella Melitensis: Standard necropsies für B. Abortus-infizierten Rindern und B. Melitensis-infizierten Ziegen am National Animal Disease Center zu erholen, Supramammary, Prescapular und Parotis Lymphknoten Gewebe , sowohl für das Schleifen für die bakterielle Enumeration und für die RNA-Vorbereitung für den Host RNA Ausdruck profilieren. B. Abortus zurückgewonnen werden regelmäßig in jedem der diese Lymphknoten in experimentell infizierten Rindern9. Das Vorhandensein von Bakterien in jedem solcher Lymphknoten nachweisbar in B. Melitensis-infiziert Ziegen bis zu mindestens neun Monate nach der Infektion mit der RNA-basierten Methoden aus unseren Studien (Boggiatto Et Al., unveröffentlicht). Salmonellen SP.: Prescapular, subiliac (Thymus), mesenterialen Lymphknoten nützlich erwiesen haben, während die Profilierung der Rinder Kadaver Salmonellen Prävalenz10,11,12 und wäre von Interesse für transkriptomischen Studien. E. Coli O157: H7: mesenterialen Lymphknoten (in den mittleren Dünndarm und distalen Dünndarm Standorten) sind die Niederlassungen einer gelegentlichen Erholung der Bakterien im infizierten Kälbern (aber nicht bei infizierten Erwachsenen Rindern)13. Leptospirose (Leptospira SP.): eine chronische Persistenz der Bakterien in den Lymphknoten Entwässerung der Brustdrüse14beobachtet worden. Mycobacterium bovis : Bei Rindern wurden die Bakterien wieder Post-experimentelle Infektion von mediastinalen und tracheobronchialer Lymphknoten Kälber15. Darüber hinaus ist Lymphknoten RNA verwendet worden, um große Tier Host Reaktionen auf Viren, wie die Schweine reproduktive und respiratorische Syndrom Virus2zu untersuchen. Abbildung 2 zeigt den Speicherort der eine Teilmenge von diesen großen Lymphknoten im Körper Rinder.

Figure 2
Abbildung 2: Cartoon Darstellung ausgewählter Lymphknoten Standorte in Bos taurus . Die nummerierten Lymphknoten sind kommentiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

In diesem Papier und das zugehörige Video präsentieren wir ein Protokoll für die Isolierung von großen Tieren Lymphknoten für RNA-Studien, soll informativ für Molekularbiologen transkriptomischen Studien von großen Tieren Infektionen beteiligt sein. Erstens bieten wir einen Überblick über die Isolierung-Verfahren für die Lymphknoten mit Probenahme von Rindern und Bisons Gewebe als Beispiele. Gepaart mit dieser Demo, wie im Video dargestellt, ist ein Workflow für eine reproduzierbare Gewebe Probenahme zur RNA-Isolierung. Anschließend beschreiben wir wichtige Überlegungen für die Verarbeitung eines infizierten Lymphknotens mit Fokus auf Sicherheit, Beständigkeit und RNS-Qualität.

Die Vorbereitung der RNA aus dem Gewebe mit einem versauerten Phenol-Guanidin erfolgt Reagenz basiert auf der Originalmethode von Chomczynski und Sacchi16,17, mit einer Reinigung über Silica-basierten Spin Spalten in Anwesenheit von chaotropen Agenten basierend auf der ursprünglichen Arbeit von Vogelstein und Gillespie18. Wir untersuchen auch das Potenzial für die Verwertung von RNA für Transkriptom von Rindern Lymphknoten durch alternative Methoden haltbar gemacht. Schließlich beschäftigen wir die Auswirkungen der Zeitvariablen RNS-Qualität in großen Tier Autopsien, einschließlich eine repräsentativere Experiment Darstellung der Wirkung einer Erhöhung in der Zeit zwischen der Euthanasie und die Probenahme auf dem wiederhergestellten RNA-Profil von Bison und Bovine Lymphknoten. Dieser Artikel wird nicht nur Molekulare Biologen, sondern auch zu tierärztliche Forscher beginnend transkriptomischen Studien nützlich.

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Protocol

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Die hier abgebildeten Tier Autopsie-Verfahren fallen unter zugelassenen IACUC Protokolle an die National Animal Disease Center, Ames, IA. Alle Experimente wurden gemäß den genehmigten Richtlinien für Tierhaltung und Tierschutz.

1. Vorplanung vor der Autopsie

  1. Bereiten Sie vor der Autopsie die folgenden Materialien für den Transport nach der Autopsie-Suite:
    1. 1,5 oder 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen gefüllt mit ~ 1,0 mL RNA-Erhaltung-Lösung in einem Rack oder Transport-Container. Achten Sie darauf, die Anweisungen des Herstellers für das Verhältnis des Volumens der Bewahrung Lösung auf das Volumen des Gewebes zu folgen.
    2. Einweg-Skalpelle und saubere, autoklaviert Zange: einen Satz für sezieren die Haut und einen anderen Satz für das Sammeln der Lymphknoten (eine für jede Lymphknoten, pro Tier), und verhindert so eine Cross-Kontamination der Haut und der Umwelt Flora mit den Lymphknoten Gewebe.
    3. 3 Stanzen mm Biopsie Werkzeuge, Autopsie Messer, Sharps Container für gebrauchte Skalpelle und Biopsie Werkzeuge und Schneidbretter oder Einweg-Schalen für den Einsatz in den Lymphknoten-Dissektion.
    4. Verwenden Sie persönliche schützende Ausrüstung, einschließlich der EVP für die Arbeit auf der entsprechenden BSL-Ebene für das System erforderlich.
    5. Autoklaven wieder verwendbare Metallwerkzeuge, einschließlich der Zange in Metall Töpfe vor der Autopsie, die Utensilien/trockene Ware einstellen.

2. Identifikation und Auswahl von Lymphknoten bei Rindern und Bisons

Figure 3
Abbildung 3 . Lymphknoten des bovinen Kopf- und halskrebs. (A) Diese Karikatur zeigt ausgewählte Lymphknoten von Kopf und Hals von Bos Taurus. (B) zeigt dieses Bild die Parotis Lymphknoten im Querschnitt (links) im Vergleich zu der Parotis Speicheldrüse im Querschnitt (rechts). Beachten Sie den Unterschied zwischen den beiden Gewebetypen in Texturen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

  1. Isolierung der prescapular Lymphknoten bei Rindern und Bisons
    1. Einschläfern des Tieres (Rind oder Bison jeden Alters, je nach Bedarf für das Experiment) basierend auf dem lokalen IACUC-Protokoll. Bestätigen Sie den Tod durch Methoden, die speziell in der institutionellen IACUC Protokoll, einschließlich den Mangel an einem Herzschlag, das Fehlen der Atmung und das Fehlen der Hornhaut Reflex beschrieben. Bewegen Sie das Tier auf den Boden der Autopsie.
      Hinweis: Es gibt verschiedene Methoden der humane Euthanasie in der Laborpraxis von großen Tieren verwendet. Die intravenöse Gabe von Natrium Pentobarbital und Phenytoin-Natrium-Lösung ist jedoch die am häufigsten genehmigt und Form genutzt. Beachten Sie die AVMA Richtlinien für die Euthanasie von Tieren. 19
      Achtung: Befolgen Sie alle relevanten Biosafety-Protokolle für eine Autopsie an der Gasthochschule, einschließlich der Richtlinien für die sichere Entsorgung von Kleie in einem pannensicheren Container und die Dekontamination von wiederverwendbaren Metall Messer und Zangen. Dieses Protokoll generiert Sharps Abfälle aus der Verwendung von Einweg-Skalpelle. Tragen Sie persönlichen Schutzausrüstung, wie durch die institutionellen Richtlinien, einschließlich Overalls, Stiefel, Handschuhe und Augenschutz vorgeschrieben.
    2. 3 Teilnehmer an der tierischen Geweben arbeiten zu identifizieren.
      Hinweis: Hier Sezierer 1 wird sein verantwortlich für die groß angelegte Schneiden der gewünschten tierischen Gewebe, Sezierer 2 wird der Lymphknoten von den tierischen Sektionen zu erholen und Sezierer 3 funktioniert an einem separaten Tisch, Abschnitte von jeder Lymphknoten zu isolieren und zu Röhren mit einem Konservierungsmittel Lösung übertragen.
    3. Beginnen Sie, indem man das Tier im seitlichen liegen.
    4. Erweitern Sie die Schulter durch Verschieben der vorderen Gliedmaßen zurück auf die Ebene des Knies (Carpus); Diese Bewegung wird die Schulter zurück zu bringen und ermöglichen ein leichter Abtasten der Lymphknoten. Das Gefühl für das Vorhandensein des Lymphknotens "Klumpen".
      Hinweis: Bei Erkrankungen, Lymphadenopathie möglicherweise vorhanden, was erleichtert die Identifizierung der Lymphknoten, aber dieser Prozess kann auch Auswirkungen auf die Konsistenz, die Zusammensetzung und die Architektur des Lymphknotens.
    5. Verwenden Sie sobald diese gefunden ist, und mit der Schulter noch erweitert, ein Skalpell oder Autopsie Messer um ein Hautschnitt entlang der Kontur der Schulter.
      Hinweis: Beschränken Sie die Größe des Schnittes, nicht, auch wenn die Lymphknoten liegt über Abtasten wurde. Ein größeren Schnitt ermöglicht leichteren Zugriff auf tiefer gelegene Gewebe und erleichtert die Sezierer der Exzision des Lymphknotens.
    6. Mit einer Zange, ziehen Sie die Haut um den Punkt der Schulter und Nacken Muskulatur.
      Hinweis: Die prescapular Lymphknoten findet oft im subkutanen Fett, vor allem bei overconditioned Tieren.
    7. Wieder einmal ertasten Sie die Position des Lymphknotens (Abb. 3A).
      Hinweis: Anders als das subkutane Fett hält die Lymphknoten seine Form beim getastet. Darüber hinaus sind Lymphknoten nicht zusammenhängend mit einer umgebenden Gewebe, wie sie von einer dünnen fibrösen Kapsel eingeschlossen sind.
    8. Nach dem Auffinden der prescapular Lymphknoten, sorgfältig das subkutane Fett, mit einem Skalpell und Pinzette, sezieren Sie und isolieren Sie den Lymphknoten.
      1. Suchen Sie nach das Vorhandensein von einer dünnen fibrösen Kapsel, wie in Abbildung 1 b, um die Lymphknoten und Fettgewebe unterscheiden; Lymphknoten sind nicht zusammenhängend mit einer umgebenden Gewebe.
    9. Übertragen Sie die Lymphknoten an den Lymphknoten Dissektion Tisch, mit einem Plastikbehälter für die Gewebe-Übertragung für weiter Schnitt.
      Hinweis: Die Darstellung dieser Lymphknoten im Bison ist ähnlich. Das zugehörige Video zeigt das Erscheinungsbild des prescapular Lymphknotens als seziert aus der rechten Schulter von einem amerikanischen Bison.
  2. Isolierung der Parotis Lymphknoten bei Rindern und Bisons
    1. Beginnen Sie, indem man das Tier im seitlichen liegen auf dem Boden der Autopsie. Suchen Sie das Kiefergelenk (TMJ).
      1. Wenn dies schwer zu lokalisieren ist, bewegen Sie den Unterkiefer langsam und bestimmen Sie den Speicherort, an dem der Unterkiefer mit dem Schädel verbunden; Dies ist das TMJ.
    2. Machen Sie einen Einschnitt in die Haut mit einem Skalpell oder Autopsie Messer sorgfältig werden. Starten des Schnittes auf das Gelenk dorsal und ventral/vertikal entlang der Jawline zu verlängern.
    3. Sezieren Sie die Haut entfernt, um das subkutane Gewebe sichtbar zu machen. Der Parotis Speicheldrüse ist erstens wegen seiner großen Größe, gelappt Oberflächenaussehen und rote Färbung sichtbar.
    4. Pinzette und Skalpell, bewegen Sie mit Hilfe der Parotis Speicheldrüse beiseite, der Parotis Lymphknoten sitzen nur kranial und medial der Speicheldrüse (Abbildung 3A) zu finden. Prüfen Sie die Parotis Lymphknoten Gewebe für Textur vor der Weiterverarbeitung.
      Hinweis: Lymphknoten des Gesichts (Parotis und mandibulären) sind mit Speicheldrüsen, die die Lymphknoten Isolation verwirren können. Im Vergleich zu den Lymphknoten Speicheldrüsen sind wesentlich größer und haben eine lappenden Oberflächenaussehen. Darüber hinaus auf Schnittfläche, Speicheldrüsen sind homogen in der Natur und weisen nicht auf die klassische kortikalen und medulläre architektonische Muster der Lymphknoten (Abb. 3 b).
    5. Verbrauchssteuern der Drüse mit einem Skalpell. Übertragen sie die Lymphknoten Dissektion Tabelle, mit einem Plastikbehälter für die Gewebe-Übertragung für weiter schneiden.
  3. Isolierung der Supramammary Lymphknoten bei weiblichen Rindern und Bisons
    1. Legen Sie das Tier im seitlichen liegen.
    2. Das Hinterbein zu entlarven die inguinalen Region und suchen das Euter zu erheben.
      Hinweis: Bei einem gesunden, nicht-stillende Tier kann Abtasten der diese Lymphknoten nicht möglich. In einer laktierenden Tieren möglicherweise diese Lymphknoten spürbar an der Caudale Grenze der Basis des Euters.
    3. Mit einem Skalpell, einen Einschnitt machen Sie nur dorsal zum Euter, entlang der Oberschenkel, die Supramammary Drüsen verfügbar zu machen.
    4. Sezieren Sie das subkutane Gewebe zu und finden Sie die Supramammary Lymphknoten, eingebettet in einer dünnen Schicht des subkutanen Fettgewebes. Wenn nicht visuell unterscheidbar, ertasten Sie das exponierte Gewebe auf das Vorhandensein einer festen Struktur innerhalb des subkutanen Fettgewebes.
    5. Mit Pinzette und Skalpell, sorgfältig aus den Lymphknoten aus dem Fett zu sezieren. Übertragen sie die Lymphknoten Dissektion Tabelle, mit einem Plastikbehälter für die Gewebe-Übertragung für weiter schneiden.

3. Schneiden und Lagerung von Lymphknoten

  1. Übergeben Sie die isolierte Lymphknoten aus Sezierer 2 bis 3 auf einem Seziertisch angrenzend an den wichtigsten Autopsie Raum dissector. Legen Sie jeder Lymphknoten auf einem frischen ein Schneidebrett. Pre-label Schneidebretter in Abschnitten von Lymphknoten, um den Empfang von mehreren Lymphknoten in Folge zu erleichtern. Verwenden Sie für infektiöse Proben Einweg-Schalen.
  2. Mit Pinzette und einem Einweg Skalpell oder Autopsie Messer, einen Abschnitt des Lymphknotens entfernen. Mit einem scharfen Messer, machen Sie einen sagittalen Schnitt zu öffnen, den Lymphknoten.
  3. Untersuchen Sie das Innere des Lymphknotens, vor allem in Proben von infizierten Tieren, auf der Suche nach Asymmetrie, Läsionen, Farbunterschiede usw. Notieren der Beobachtungen.
  4. (Option 1) Kleinen Gewebeschnitte
    1. Verwenden Sie Einweg-Skalpelle, um Stücke von jedem Lymphknoten Verbrauchsteuern, die weniger als 5 mm in der Dicke und jedes Stück zu einem Schlauch mit einer RNA-Erhaltung-Lösung mit einer sauberen Pinzette zu übertragen.
  5. (Option 2) Lymphknoten-Biopsie oder schneiden-Methoden
    Hinweis: Biopsien oder speziellen Methoden, angewandt auf parallele Lymphknoten Abschnitte über verschiedene Knoten und Tiere, bieten Konsistenz der Stichprobe Gewebe für eine Massenanalyse RNA.
    1. Keil-Schnitt Methode
      1. Nach der Prüfung die sagittalen Abschnitts erfassen Zellen über das Profil des Lymphknotens, Verbrauchsteuern einen Kuchen-förmigen Keil aus den Lymphknoten aus der Mitte der äußeren Kapsel. Für einen Knoten 2 cm in der Breite (standard-Größe, siehe Tabelle 1), schneiden Sie ein Keil in die Mitte, die 4 mm in der äußeren Bogenlänge und 5 mm Dicke haben ein nasses Gewicht von ~ 100 mg.
      2. Mit dem Skalpell, den Keil klein geschnitten Sie, nicht dicker als 5 mm und ca. 50-100 mg jeden feuchten Tuch Gewicht.
        Hinweis: aus Gründen der Kohärenz verarbeiten Sie alle Keil Stücke aus einer einzigen Lymphknoten entweder in einem Batch oder in separaten Röhren von RNA bündeln gefolgt um eine repräsentative RNA-Profil aus den Lymphknoten von Interesse bieten.
      3. Legen Sie die Gewebe-Stücke mit der Pinzette in Röhren mit mindestens 10 Bänden der RNA Bewahrung Lösung im Vergleich zu der Menge des Gewebes.
    2. Punch-Biopsie-Methode
      1. Wählen Sie eine Biopsie Stanzwerkzeug, wenn das Ziel ist es, bestimmte Bereiche, wie z. B. spezifische Follikel aus dem Knoten sammeln. Wählen Sie ein Werkzeug konsistent mit der Größe der Stichprobe für die Sammlung gewünscht. Biopsie Stanzwerkzeuge sind in einer Vielzahl von Größen, von 1 bis 8 mm Durchmesser erhältlich.
      2. Suchen Sie visuell der Regionen von Interesse zur Probe in den Lymphknoten.
      3. Verwenden Sie das Stanzwerkzeug Biopsie um zu Verbrauchsteuern die Abschnitte von Interesse, drücken und Drehen des Werkzeuges in das Gewebe um den Kern zu erstellen. Übertragen Sie das Stück Gewebe mit der Pinzette auf ein Rohr mit mindestens 10 Bänden der RNA Bewahrung Lösung. Wenn dicker als 5 mm, verwenden Sie Pinzette und Skalpell, das Gewebe weiter in kleinere Stücke teilen.
  6. Sobald die Proben zur Bewahrung Lösung übertragen wurden (zB., RNALater), transportieren sie zurück ins Labor bei Raumtemperatur.
  7. Speichern Sie die Proben bei 4 ° C über Nacht, um Gewebe eindringen zu ermöglichen.
  8. Am nächsten Tag Gießen Sie die überschüssige Konservierungsmittel RNA-Lösung und speichern Sie die Gewebeproben bei-80 ° C. Entfernen Sie so viel Konservierungsmittel wie möglich vor dem Einfrieren der Proben. Verwenden Sie einen P1000 und/oder P200 Mikropipette Tipp für ein effizientes RNA Konservierungsmittel Lösung entfernen.
    Achtung: Entsorgen Sie dekantiert Erhaltung-Lösung entsprechend, basierend auf den infektiösen Eigenschaften des Erregers sowie die chemischen und umweltbedingte Gefahren der Konservierungsmittel Lösung wie angegeben auf dem Sicherheitsdatenblatt genutzt.
    Hinweis: Die hier bereitgestellten Richtlinien sind für die RNA-Erhaltung-Lösung in der Tabelle der Materialienbeschrieben bereitgestellt. Wenden Sie alternative Konservierung Lösungen mit den Richtlinien des Herstellers.

4. Verarbeitung von RNA Lymphknoten

Achtung: Tragen Sie einen Laborkittel, Handschuhe und richtige Augenschutz für die Bearbeitungsschritte.

Hinweis: Das Phenol basierende Reagenz verwendet hier die Tabelle der Materialien beschrieben ist (und das Protokoll basiert auf den Richtlinien des Herstellers)20. Die Verwendung von alternativen Phenol basierende Reagenzien erfordern eine Änderung des Verfahrens, basierend auf den Empfehlungen des Herstellers für das jeweilige Produkt erworben.

  1. Vor dem Zugriff auf die Proben, Pre-aliquoten gekühlt (4 ° C) Phenol basierende Reagenz zur Homogenisierung Röhren (1,5 mL/Rohr), mit Hilfe einer Pipette.
    Achtung: Phenol ist giftig, ätzend, und eine Gefahr für die Gesundheit. Chloroform ist giftig und gesundheitsschädlich. Füllen Sie Verarbeitungsschritte 4.1-4.9 in einem chemischen Abzug, und tragen Sie Handschuhe, um den Kontakt mit den Chemikalien zu vermeiden. In den Vereinigten Staaten ist Chloroform als gefährlicher Abfall; Röhrchen mit gefährlicher Abfälle nach lokalen und institutionellen Richtlinien entsorgen. Prozess-Gewebeproben von mit Krankheitserregern unter den entsprechenden BSL-2, BSL-3 oder BSL-4 Leitlinien infizierten Tieren.
  2. Sobald eine Probe mit einer sauberen Pinzette aus der Mikrozentrifugenröhrchen gelöst werden kann, sofort etwa 50-100 mg des erhaltenen Gewebes zum Übertragen der Homogenisierung Röhrchen mit Phenol-basierte Reagenz
    1. Das Auftauen vor der Zugabe zu Phenol basierende Reagenz zu begrenzen. Verwenden Sie Speicher auf Trockeneis, wenn mehrere Proben aus dem Gefrierfach zur Verarbeitung entfernt werden.
  3. Fest Röhrchen Sie der, legen Sie es auf den Homogenisator und homogenisieren Sie die Probe mit einem Rotor-Stator Gewebe Homogenisator in das Phenol basierende Reagenz zu. Füllen Sie die Verarbeitung bei Raumtemperatur. Wenn abgeschlossen haben, überprüfen Sie für ein trübes Aussehen um sicherzustellen, dass die Probe erfolgreich homogenisiert wurde; das Gewebe sollte in eine trübe Suspension verteilt werden.
    Hinweis: Eine 2 min RNA-Extraktion-Einstellung wird verwendet (die voreingestellte RNA_02_1-Einstellung für den Homogenisator beschrieben in der Tabelle der Materialien; für gefrorenes Gewebe entwickelt). Der Rotor-Stator in diesem Protokoll angegeben (siehe Tabelle der Materialien) ist große gezahnt und angepasst für die Homogenisierung der unterschiedlichsten Gewebearten, einschließlich Fasermaterial. Die RNA_02_01-Einstellung richtet sich speziell an (im Gegensatz zu frisch) eingefroren Gewebe. Wie Lymphknoten Bindegewebe Komponenten haben, empfiehlt sich eine ähnlich optimierten Rotor-Stator-Homogenisator, eine effektive Dissoziation zu erreichen. Das National Institute of Environmental Health Sciences21 Weitere Informationen zur Homogenisierung Empfehlungen zu sehen.
    1. Wenn große Teile des Gewebes nach der Homogenisierung bleiben, wiederholen Sie die Homogenisierung. Um effizient die RNA wiederherzustellen, muss das Gewebe gut getrennt werden.
    2. Verwenden Sie für mehr faserig Lymphknoten Stücke Pinzetten und Scheren Lymphknoten Stück in mehrere kleinere Stücke vor der Übertragung an die Homogenisierung Röhre Pre hacken. Wie in der Einleitung beschrieben, möglicherweise Lymphknoten Gewebe von älteren Tieren mehr faserig.
      Hinweis: Wenn eine dual Analyse der Wirt und Erreger RNA gewünscht wird, kann zusätzliche Behandlung (z. B. Wulst Homogenisierung) notwendig sein für die Erholung der bakteriellen RNA besonders wenn Gram-positive Erreger im Gewebe vorhanden sind.
  4. Sofort entfernen der homogenisierten Probe aus den Rohren und überträgt es auf RNase-freie Mikrozentrifugenröhrchen (2,0 mL Größe) mit einer Mikropipette P1000.
  5. Zentrifugieren Sie die Probe für 5 min bei 12.000 x g bei 4 ° C, jede Probe Ablagerungen zu entfernen. Mit einer P1000 Mikropipette Spitze, übertragen des Überstands zu einem frischen Microcentrifuge Schlauch, das Pellet hinterlässt.
  6. Inkubieren Sie den überstand für 5 min bei Raumtemperatur. Jede Probe zwischen zwei 1.5 Mikrozentrifugenröhrchen aufgeteilt.
  7. Fügen Sie 0,2 mL Chloroform pro 1 mL des Phenol-basierte Reagenz (d.h. 0,3 mL für eine 1,5 mL Probe); invertiere es eigenhändig für 1-2 min, mischen Sie die Phasen, aber tun nicht Wirbel der Probenmaterials. 2 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  8. Zentrifugieren Sie es für 15 min bei 12.000 x g bei 4 ° C.
  9. Entfernen Sie vorsichtig die obere, klaren wässrige Phase mit einer Mikropipette Spitze (P1000 oder P200) bilden die obere Schicht wird ohne Unterbrechung der Interphase oder die rote Phenol-Chloroform-Schicht. Auf einen neuen Microcentrifuge Schlauch übertragen.
  10. Mischen Sie es mit einem gleichen Volumen von 100 % Ethanol; Mischen Sie gründlich, durch das Rohr 4 - 5 mal umdrehen. Die Röhre erscheint oft bewölkt.
  11. Übertragen Sie mit einer Mikropipette Spitze die Flüssigkeit auf eine Silica-basierten kommerziellen Spin Spalte weiter zu reinigen und eluieren RNA, nach dem Hersteller Anweisungen22. Eluieren generierte aus RNA ~ 50 mg des Gewebes in 50-100 µl RNase-freies Wasser.
    Hinweis: Während die Gewinnung von Phenol-basierte Reagenz DNA in die organische Phase für die nachgeschaltete Verwendung von RNA in qRT-PCR und/oder RNA-Sequenzierung Anwendungen entfernt empfiehlt sich eine zusätzliche Behandlung der RNA-Proben mit DNase.
  12. Aliquot der eluierten RNA, Schläuche für den Einsatz in eine Quantifizierung und Qualität Bewertung zu jedem Einfrieren Auftauen der wichtigsten RNA-Probe zu trennen. Übertragen Sie die Rohre bis-80 ° C für die Lagerung.
  13. Bestätigen Sie bei Lymphknoten Proben mit Zoonoseerregern, vor allem bei der BSL-3 Aufhaltestufe infizierten Tieren abgeleitet resultierende RNS-Probe für die Abwesenheit von Krankheitserregern, wenn die Probe zu einem niedrigeren Biosafety Level Containment Bereich verschoben werden für die Qualitätsanalyse, RT-PCR und/oder RNA-Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung.
    Hinweis: Es ist entscheidend für die örtliche Vorschriften zu prüfen und im Falle der CDC (Centers for Disease Control and Prevention) Inaktivierung Leitlinien für die Arbeit mit ausgewählten Agenten, es ist notwendig, alle Inaktivierung Verfahren am lokalen Standort des Forschers zu validieren.
    1. 1/10th Volume jeder eluierten RNA-Probe aus Schritt 4.12 (d.h. 5 µl von 50 µl der Gesamt-RNS) entfernen. Mit einer sterilen Technik, mischen Sie die Probe mit 100 µl Bakterienwachstum Brühe in einen sterilen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Die RNA-Brühe-Gemisch verteilt mit einem sterilen Kunststoff Spreader sind die Oberfläche einer nährbodenplatte.
      Hinweis: Wählen Sie eine Brühe Art und Agar Platte konsistent mit dem Wachstum des Erregers mit denen die Tiere in Frage gestellt wurden.
    2. Inkubieren Sie die Agarplatte unter Bedingungen, die spezifisch für das Wachstum des Erregers mit denen die Tiere in Frage gestellt wurden. Überprüfen Sie für das Fehlen einer wiederhergestellten Bakterien vor dem Entfernen der Proben von BSL-3 Containment.
      Hinweis: Die resultierende eluierten RNA ist nach Quantifizierung und Tests von Integrität, geeignet für downstream-Anwendungen, einschließlich einer RNA-Sequenzierung und RT-PCR-Analyse.
  14. Beurteilen Sie die RNA-Erholung und Reinheit mit einem Spektralphotometer. Zur Beurteilung der RNA-Qualität laden Sie 1-2 µl der eluierten RNA-Probe zu Spektralphotometer für eine Analyse. Nehmen Sie ein Spektrum der Probe im ultravioletten (UV) Bereich.
    1. Aus dem UV-Spektrum aufzunehmen, A260/a280 Verhältnis, A260/a230 Verhältnis und den A-260 -Wert für die Probe (A = Absorption).
    2. Da einsträngige RNA in einer Konzentration von 40 µg/mL eine Extinktion von 1,0 bei 260 hat nm, die RNA-Konzentration (µg/mL) multipliziert die A260 40 für die gereinigten Proben zu berechnen.
  15. Als schnelle Methode zur Beurteilung der Widerstandsfähigkeit gegen RNA degradierten Proben von der weiteren Analyse ausgeschlossen, mischen Sie 2 µl jeder RNA-Probe mit 4 µl 1,5 X formamide Belastung Farbstoff [95 % entionisiertem Formamid, 0,025 % (w/V) Bromophenol blue, 0,025 % (w/V) Xylol Cyanol, 5 mM EDTA (pH 8.0), 0,025 % (w/V) SDS] in 1,5 mL Röhrchen Microcentrifuge23,24.
  16. Erhitzen Sie die Rohre bei 70 ° C für 1 min und übertragen Sie dann die Röhren für 1 min Eis.
  17. Laden Sie die Proben zu einem 1 % Agarose-Gel vorbereitet in 1 X TBE (für eine vollständige Beschreibung der eine native Agarose-Gelelektrophorese für RNA, siehe Rio, Ares Jr., Hannon und Nilsen)24. Trennen der Proben durch standard-Gel-Elektrophorese Methoden und bestätigen Sie die Anwesenheit von 28 s und 18 s ribosomalen RNA-Bands.
  18. Follow-up der Gelelektrophorese mit Quantitative Analysemethoden für die RNA-Integrität-Bestimmung [z.B., einem Bioanalyzer und RIN (RNA-Integrität-Nummer) Analyse] wie beschrieben in die Ergebnisse repräsentativ und Müller, O. Et Al. 25 und Schröder, A. Et Al. 26.

5. alternative Extraktionsmethode von Formalin fixiert, Paraffin-eingebetteten (FFPE) Gewebe

Hinweis: Obwohl FFPE Gewebe Erhaltung nicht die stabilste Methode der Nukleinsäure-Konservierung darstellen, das Protokoll dargestellt ist eine Möglichkeit, einige transcriptional Änderungen zu studieren, wenn andere erhaltene Gewebe nicht verfügbar sind.

  1. Bereiten Sie Formalin Reagenzien für den Erhalt von Gewebe durch den Verzicht auf Formalin in Kunststoffbehältern. Gewebe sollte bzw. in Formalin mit einem Verhältnis von 20:1 Formalin: Gewebe Volumen/Gewicht, beibehalten werden.
    Achtung: Formalin ist ein bekanntes menschliches karzinogen und obwohl nicht akut toxisch, chronischer Exposition (in der Regel durch eingeatmete Dämpfe) kann eine erhebliche Gesundheitsgefahr darstellen. Ausreichende Belüftung und PPE (d.h. die Verwendung von Nitril-Handschuhe, innerhalb von 15 Minuten nach der ersten Exposition geändert werden) sind erforderlich, um die gesundheitlichen Risiken zu minimieren. Beziehen sich auf die OSHA Formaldehyd Standard (29 CFR 1910.1048) für weitere Informationen zur Belichtung Überwachung und Risikobewertung.
    Hinweis: Mit zu wenig Formalin kann die Fähigkeit des Gewebes, vollständig erhalten werden, wenn in Konservierungsmittel untergetaucht auswirken.
  2. Nach der Isolierung des Gewebes von Interesse sorgfältig Trimmen des Gewebes auf weniger als 5 mm Dicke.
    1. Tauchen Sie mit Pinzette, sorgfältig getrimmte Gewebe in Formalin, Spritzer zu minimieren.
      Hinweis: Das Gewebe sollte vollständig in Formalin, um eine komplette Fixierung ermöglichen getaucht werden. Es ist wichtig, dass alle Flächen des Gewebes mit Formalin vollständig bedeckt sind.
  3. Sobald das Gewebe in Formalin getaucht wurde, ermöglichen Sie die Gewebe Fixierung für mindestens 24 Stunden bei Raumtemperatur erfolgen.
    Hinweis: Formalin Gewebe dringt langsam, mit einer Rate von 1 mm pro Stunde von allen Oberflächen27,28. Daher halten die Dicke der Gewebeschnitte auf weniger als 5 mm Ergebnisse in eine schnelle Fixierung des gesamten Gewebes.
  4. Übertragen Sie nach der Fixierung der Gewebe auf eine entsprechende Reagenz für die Einbettung von Paraffin.
    Hinweis: zum Beispiel waren das Gewebe untersucht in dieser Handschrift zu 70 % Ethanol vor der Einbettung übertragen.
  5. Des Gewebes in Paraffin einbetten. 29
  6. Abschnitt des Gewebes bis 10-80 µm Dicke (Einsatz 10-20 µm MiRNA ist auf Wunsch extrahiert werden)29.
  7. Mit Skalpell und Pinzette, entfernen Sie eine 40 mg Gewebe Stück von jeder Probe verarbeitet werden und legen Sie sie in ein steriles, Nuklease-free Microfuge Rohr.
  8. Nutzen Sie eine kommerzielle Set für 4.wenn und Nukleinsäure-Recovery von Proteinkinase Gewebeproben RNA aus den erhaltenen Proben zu extrahieren.
    Hinweis: Das Kit verwiesen in der Tabelle der Materialien nutzt Xylol und Ethanol wäscht entfernen Paraffin, einem Behandlungsschritt Protease und Glasfaser Filter, RNA zu reinigen.

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Representative Results

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Die Nutzung der in diesem Artikel (Schritte 1 bis 4 des Protokolls) vorgestellten Überlegungen helfen bei der Beitreibung von RNA aus großen Tier Proben, die für eine nachgeschaltete Analyse in Host genexpressionsstudien geeignet ist. Die RNA-Qualität für downstream-Anwendungen wird durch mehrere standard-Maßnahmen beurteilt. Spektrophotometrie A260/a280 Verhältnis liefert ein Maß für die Protein-Verschmutzung und A260/a230 Verhältnis stellt ein weiteres Mittel zur Reinheit-Bewertung, die chemische Verunreinigungen wie Phenol erkennen wird. In jedem Fall Verhältnisse der ~ 2.0 sind ein Beweis für qualitativ hochwertige RNA, und verminderte Verhältnisse sind Hinweise auf Verunreinigungen. Wichtig ist, diese Verhältnisse bieten keine Informationen über RNA-Abbau, die qualitativ bewertet werden kann (Schritte 4.15-4.17) und quantitativ (4.18, Schritt, wie z. B. durch eine RNA Integrität Nummer oder RIN score).

Es ist wichtig zu beachten, dass das erwartete Qualitätsniveau der RNA von Lymphknoten Gewebeschnitte erholt, im Durchschnitt, niedriger als bei RNA bovine Leukozyten Proben erholt. In einer umfassenden Reihe von RNA-Extraktion aus Rindergewebe und Zelllinien finden Fleige und Pfaffl30 , dass die durchschnittliche RIN (RNA Integrität Zahlen gemessen auf einem Bioanalyzer) variieren zwischen < 5 für Jejunum und Pansen Gewebe und > 9 für die weißen Blutkörperchen Zellen und Corpus Luteum, mit Lymphknoten RIN Scores fallen in der Mitte bei einem Durchschnitt von 6,9. In der Regel Fleige und Pfaffl30 beachten Sie, dass feste Geweben RIN Partituren von 6-8, und das Gewebe mit höheren Konzentrationen von Bindegewebe produzieren weisen eine höhere mittlere Verschlechterung. Die Dichte des Bindegewebes in den Lymphknoten, sowie der inneren Ebene von RNases in diesem Gewebetyp kann verantwortlich sein für die Unfähigkeit, konsequent Recover RNA mit RIN > 9 von Lymphknoten punktet.

Ein Beispiel für ein Bioanalyzer Profil für die RNA erholte sich von einem Bison Supramammary Lymphknoten mit der hier vorgestellten Methodik wird jedoch in Abbildung 4Azeigt die Erholung der RNA mit einem RIN-Score von 8,6 (vor allem intakt und geeignete angezeigt. für im Wesentlichen alle downstream-Anwendungen). Aus diesem Verfahren erzeugten RNA wurde verwendet, um erfolgreich Bibliotheken für den Einsatz in RNA-Sequenzierung zu erzeugen; Dieses Protokoll ermöglicht die regelmäßige Isolierung der RNA-Proben von Bisons und Rinder Lymphknoten mit RIN Werte > 8 (und oft > 9). Für ein Muster-Set von acht extrahierten RNA-Proben das Verhältnis der durchschnittlichen Absorption bei 260 nm/280 nm war 2.1 und bei 260 nm/230 nm war 2.1 Angabe eine eiweißarme Kontamination und eine geringe Belastung mit Chemikalien wie Phenol, beziehungsweise. Die durchschnittliche Nukleinsäure-Rückgewinnung aus jeder Extraktion war 97 ± 10 µg pro ~ 100 mg oder einer Ausbeute von ~ 1 µg RNA/mg von Lymphknoten Gewebe.

Figure 4
Abbildung 4 . Repräsentativen Qualität Spuren, RNS-Qualität von Extraktion Methoden darstellen. (A) dieses Panel zeigt eine Gesamt-RNS Spur von qualitativ hochwertigen RNA aus einem Bison Lymphknoten erzeugt mithilfe des Verfahrens in diesem Manuskript vorgestellt. (B) dieses Panel zeigt eine Spur einer bovinen FFPE-Probe ausgewählt aus Tabelle 4, Darstellung sehr degradierten RNA. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. 

Aufgrund die Herausforderungen verbunden mit der schnellen Isolierung von Geweben aus großen Kadaver, vor allem bei Probenahme von Tierarten, die Auswirkungen der Zeitverzögerung zwischen der Euthanasie und die Platzierung der Gewebe-Stücke in einer RNA-Erhaltung potenzielle Gefahr in der Analyse ist die Lösung. Die Informationen in der Literatur über die Stabilität der RNA in Lymphknoten Gewebe, insbesondere beschränkt. Um Informationen über die zulässigen Parameter für Gewebe-Kollektion zu bieten, ist die Stabilität der RNA in Bison Lymphknoten nach Euthanasie zeichnete.

Für dieses Experiment galt Zeit 0 als die Zeit, die das Tier tot durch das Fehlen eines Herzschlages und das Fehlen einer Hornhaut Reflex ausgesprochen wurde. Der Transport von der Karkasse und der Beginn der Autopsie, nach ~ 15 min. waren vergangen, bevor Sie den Abruf der ersten Lymphknoten Probe (15-20 min war standard in unseren Beobachtungen zur Rückgewinnung von Feld Tiere; Zeit Kurse variiert je nach Standort ). Die Supramammary Lymphknoten identifiziert wurde, und ein kleiner Ausschnitt des Gewebes entfernt und auf Raumtemperatur gehalten wurde. Abschnitte wurden anschließend in ca. 15 min Abständen und auf konservierende RNA übertragen; in der Mitte den zeitlichen Verlauf wurde das Tier für den zweiten Satz von 4 Zeitpunkten in der Serie (Abbildung 5A, geschlossene Kreise, Abbildung 5) eine zweite Stichprobe von Lymphknoten entnommen. RNA wurde parallel mit der oben beschriebenen Methode aus den Lymphknoten entnommen. Dieser 1 h zeigt Experiment, dass die Lymphknoten RNA die Mehrheit seiner Integrität über den zeitlichen Verlauf mit einem nur leichten Rückgang der RIN Partitur bis zum Jahresende den zeitlichen Verlauf (Abbildung 5 b und 5 C) beibehalten. Ebenso RNA aus bovine prescapular und Parotis-Lymphknoten behielt seine Integrität, gemessen an den RIN-Punktzahl über ~ 1 h Zeit Kurse Post Mortem (Abbildung 5; das Tier Informationen in Tabelle 2). Darüber hinaus wurde RNA aus extrahiert Supramammary Lymphknoten Abschnitte, die 8 h nach Tod gesammelt wurden halten ganze Abschnitte in Zellkulturmedien entweder Raumtemperatur oder bei 37 ° C, die Haltezeit in ein Tierkadaver zu simulieren. Ribosomale RNA war selbst nach 8 h hält Zeiten (Abbildung 5).

Figure 5
Abbildung 5 . RNS-Qualität in Bison Lymphknoten Proben gesammelt über Zeit Kurse nach dem Tod. (A) dieses Panel zeigt experimentelle Überblick ein 1 h Zeit Kurs Verfahren. (B, C) Diese Tafeln zeigen eine Untersuchung der RNS-Qualität für Proben, die über eine 1 h Zeit Platz aus einen Supramammary Lymphknoten isoliert von einem amerikanischen Bison. Gel spiegelt RNA-Proben in Formamid denaturiert und getrennt auf einem 1 % nicht Denaturierung Gel. Feld (C) zeigt die Änderungen in RIN Partituren für jede Probe. Die Daten von weiteren Experimenten auf bovine prescapular und Parotis-Lymphknoten werden überlagert, wie angegeben. (D) dieses Panel zeigt ein Beispiel für RNA-Gel, wie beschrieben für das Gel im Bedienfeld "(B), verwendet für Supramammary Lymphknoten Proben nach 8 h Inkubation bei beiden Raumtemperatur (Spur 1) oder bei 37 ° C (Bahn 2) in Zellkulturmedien verarbeitet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Diese repräsentative Ergebnisse stehen im Einklang mit RNA-Stabilität-Ergebnisse für andere Gewebearten und Quellen. Tabelle 3 enthält eine Zusammenfassung der Ergebnisse einer Stichprobe von Veröffentlichungen, die die RNA-Stabilität über Pre Aufbewahrungszeit Kurse untersucht haben. Beachten Sie, dass nur Trends aus RIN Partituren und/oder rRNA gel-Beobachtung (Gesamt-RNS) sind in der Tabelle enthalten, obwohl einige Papiere bieten eine zusätzliche Analyse der mRNA Integrität, wie z. B. durch die Bestimmung der Verhältnisse von 5' vs. 3' Segmente des ausgewählten RNAs (z.B.Fajardy Et Al.) 31. es ist jedoch wichtig zu bedenken, dass längere Zeit zwischen Tod und Probe Erhaltung zu Änderungen in der RNA expressionsprofile führen können, wie gezeigt, zum Beispiel für die plazentaren Gewebes31. Im Vergleich zu stabilen Transkripte, können instabiler RNAs erschöpft sein. Daher ist es wichtig, einen schnellen und optimierte Workflow für die Gewebe-Wiederherstellung zu nutzen, um Verzögerungen zu verringern, sobald das Tier für Autopsie, zur Verfügung steht, um die biologisch gültig RNA-Profile zu erreichen. Es wäre ein Fehler, anzunehmen, dass das Vorhandensein von intakten ribosomaler RNA das Fehlen von Änderungen in das Transkriptom-Profil zeigt. Dennoch empfehlen die repräsentativen Ergebnisse auch mit erhöhten Verarbeitung Zeiten für notwendige große Tier Probenahme, es ist möglich, RNA zu kochen, die für eine Genanalyse Ausdruck von Lymphknoten Proben geeignet ist.

Darüber hinaus wurde die Wirkung der nach dem Auftauen Zeitvariable untersucht; Während dieser Zeit ist die RNA anfällig für Abbau von der Nukleasen im Gewebe vorhanden. Die Qualität der verarbeiteten unter Verwendung dieses Protokolls mit 0 oder 64 min Haltezeit bei Raumtemperatur nach dem Auftauen bei Schritt 4.1 RNA-Proben wurde durch eine RIN-Score gemessen. Dieses Experiment zeigt, dass das Protokoll sehr unempfindlich gegenüber der Tauwetter-Zeit, so dass es robust für die Bearbeitung mehrerer Proben (Abbildung 6A).

Figure 6
Abbildung 6. Zusätzliche Analyse der RNA Qualitätsparameter. (A) dieses Panel zeigt die RNS-Qualität für RNA gereinigt, sofort nach dem Auftauen (0 min) oder nach dem halten seit 64 min bei Raumtemperatur vor der Verarbeitung führt. Die Balken repräsentieren den Durchschnitt von 3 Gewebe Stück für jede Bedingung, ± Standardabweichung. Allen Geweben wurden in einer RNA Konservierungsmittel Lösung vor dem Auftauen, gespeichert, wie im Protokoll beschrieben. (B) dieses Panel zeigt eine Bioanalyzer Spur einer Probe aus einem schlecht homogenisierten Lymphknoten, die große Teile des Bindegewebes enthalten. Die geringe Größe der 28 s und 18 Gipfel, im Vergleich zu den Gipfeln im Bereich von 5 s, ist offensichtlich. Dies kann auch infolge des Abbaus der RNA, auftreten, obwohl die relativ flache Basislinie zwischen den 5 s-Bereich und dem 18-Gipfel Alternativ suggestive der Armen Extraktion ist; Avraham, R. Et Al. sehen 48 weitere Details. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Als Punkt des Vergleiches zur Isolierung von RNA aus Lymphknoten führte eine Studie Rückgewinnung von RNA aus FFPE mesenterialen Lymphknoten Stücke vom Rind. Wie oben beschrieben, wurden die Proben für 1 Woche in Formalin vor das Paraffin einbetten, gefolgt von 4 Monaten Lagerung in Paraffin bei Raumtemperatur fixiert. Die Gewebe wurden in fünf 10 µm Abschnitte geschnitten und mit FFPE Extraktionsverfahren, ca. 62 ng/µL RNA pro Probe (± 14 ng/µL) wurde wiederhergestellt. Die Verhältnisse der Absorption bei 260 nm/280 nm durchschnittlich 1,9, ein Produkt mit niedrigem Protein Verschmutzung, angibt, obwohl die A260/a230 Verhältnisse ungünstig (Tabelle 4 waren). Beachten Sie, dass die RIN-Scores zu beobachten, für diese Proben sehr waren niedrig (< 2), zeigt eine Verschlechterung der RNA-Produkte (Tabelle 4Abbildung 4 b), mit der Beschreibung von Srinivasan Et Al. 45. in Tests mit qPCR, in der Regel kleine Abschnitte der RNA, oder genauer gesagt cDNA (< 200 bp), werden verstärkt. Daher die Verstärkung von kleinen Produkten kann noch von degradierten Proben auftreten und qPCR-Analyse durchgeführt werden kann. Zum Beispiel war es möglich, ein Segment des ribosomalen Proteins S9 (RPS9) verstärken Abschrift aus diesen FFPE erholte sich Proben von qPCR. CT -Werte stimmten über die Proben und durchschnittlich 19,2 ± 1,8. Denken Sie daran, die Einschränkungen, die bei der Verwendung von Proteinkinase vorbereiteten Proben, aber, wie größere Produkte nicht unbedingt vorhanden sind, und der Abbau kann nicht zu einem einheitlichen Preis über alle Proben aufgetreten sind. Daher dieses Material eignet sich für Studien mit vorbehalten, aber erhebliche Einschränkungen sind vorhanden für alle nachgelagerten Anwendungen wie RNA-Sequenzierung.

Lymphknoten-Typ Lage Länge Breite Regionen von Knoten entleert
Prescapular Nur Medial um das Schultergelenk; eingebettet in subkutanes Fett und unter einer Schicht von Muskel 1-10 cm 1,5-2 cm Haut des Halses; Schulter; und Haut, Muskeln und Gelenke der unteren thorakalen Gliedmaßen (Nr. 8)
Thymus (auch precrural genannt) Nur dorsal und medial zu ersticken, ca. 12-15 cm oberhalb der Kniescheibe 8-10 cm 2,5 cm Haut der Becken-Bein, Bauch und kaudalen Teile des Thorax (Nr. 8)
Retropharyngeal Gefunden Sie in der Mittellinie auf den Pharynx dorsal 4-5 cm 2-3,5 cm Zunge, Schleimhäute der Mundhöhle, Zahnfleisch, Lippen, harten Gaumen, Speicheldrüsen, die meisten Muskeln des Halses
Parotis Das Hotel liegt subkutan Ventral, das Kiefergelenk, kaudalen, m. Masseter (Nr. 8) 6-9 cm 2-3 cm Haut, Unterhaut, die meisten Muskeln des Kopfes, Muskeln von Auge und Ohr, Lider, Tränendrüse, rostral Teil der Nasenhöhle
Mandibulären (evtl. 1-3 Gegenwart) Subkutan gelegen auf den medialen Aspekt des Winkels des Unterkiefers, Speicheldrüsen zugeordnet 3-4 cm 2-3 cm Schnauze, Lippen, Wangen, harten Gaumen, rostral Teil der Nasenhöhle, Spitze Zunge, Haut und Muskeln des Kopfes (Nr. 8)
Supramammary (weiblich, die oberflächlichen inguinalen, in der Regel 2 vorhanden) Gefunden Sie kaudal und dorsal im Verhältnis zu den Milchdrüsen 6-10 cm Euter, Vulva, Vestibül der Vagina, Haut auf die medialen und kaudalen Aspekte des Oberschenkels, medialen Fläche des Beines
Scrotal (männliche Version von oberflächlichen inguinalen) Unterhalb der prepublic Sehne innerhalb einer Schicht von Fett um den Hals des Hodensacks gefunden 3-6 cm Vorhaut, Hodensack und penis

Tabelle 1. Übersicht der bovinen oberflächlichen Lymphknoten.

Tierische Beschreibung Lage im Manuskript Alter Sex Gesundheitsstatus
Auf Video aufgenommen Bison bison Bison in Video - Lymphknoten Erholung 5-6 yo Weiblich Gesund
Auf Video aufgenommen Bos taurus Rinder in Video - Lymphknoten Erholung 7. / 8. yo Kastrierte männliche Gesund
Bison Bison für RNA Stabilitätsstudie Abb. 5A-C 5-6 yo Weiblich Gesund
Bos taurus A für RNA Stabilitätsstudie Abb. 5, Abb. 6A 7. / 8. yo Kastrierte männliche Gesund
Bos taurus B für RNA Stabilitätsstudie Abb. 5 7. / 8. yo Kastrierte männliche Gesund
Bos Taurus für Proteinkinase Qualitätsstudie Tabelle 4, Abb. 4 b 0,5 yo Kastrierte männliche Gesund (Kontrolle von O157: H7-Infektion-Studie)
Beachten Sie, dass die Methodik auf mehrere zusätzliche Rinder, Bisons und Ziege Lymphknoten Proben, über diejenigen, die hier hervorgehoben werden.
Darüber hinaus wir auf Lymphknoten entnommen die gleiche Methode verwendet eine 1,5 mo.-altes weibliches Kalb.

Tabelle 2: Merkmale der Versuchstiere in Pilotstudien.

Gewebetyp Bewahrung-Methode Bedingungen halten Abbau-Fazit Referenz
Bovine adipös, skelettartigen Muskel, Leber Snap, Einfrieren (flüssige N2) 4 ° C, Vakuum verpackt Gewebe Muskel RNA stabiler (sogar auf 8 Tagen Lagerung); Fettgewebe und Leber stabil hauptsächlich bis 24 Uhr wie Aussehen der rRNA Bands bewertet Bahar Et Al. (2007)32
Menschlichen Dickdarm, Darmkrebs RNA-Erhaltung-Lösung Raumtemp. RIN für 2 h. gespeichert, aber Teil der Gene zeigen Veränderungen im Ausdruck von 0,5-2 h. Yamagishi Et Al. (2014)33
Maus-Leber, Milz RNA-Erhaltung-Lösung oder Snap Einfrieren (Trockeneis Gülle) Im Inneren der Maus Kadaver (37 ° C) Milz Proben waren stabil, bis 1,5 h; Leber Muster ausgestellt früher Abbau (24 % Abnahme der RIN bei 105 min.) Choi Et Al. (2016)34
Maus-Leber Keiner (Homogenized frisch im Guanidinium-Thiocyanat-Phenol-Chloroform) 25 ° C, 37 ° C Begrenzte Verschlechterung, 4 Std. bei 25 ° C, aber umfangreiche Abbau bei 37 ° C für 4 Std. (wie mit RIN Partituren beobachtet). Almeida Et Al. (2004)35
Menschlichen ileum RNA-Erhaltung-Lösung oder Snap Einfrieren 4 ° C, 37 ° C In der Regel um 1,5 h bei 37 ° C stabil; Stabil aus, um 6 h bei 4 ° C (wie mit RIN Partituren beobachtet).  Beachten Sie, dass die Autoren auch eine Zusammenfassung der ausgewählten RNA-Stabilität-Ressourcen in Tabelle S1, die als zusätzliche Referenz für die weitere Prüfung des Gewebes RNA Integrität Literatur interessiert dienen kann. Lee Et Al. (2015)36
Menschlichen Leber Snap, Einfrieren (flüssig N2 oder Isopentane) Raumtemp. Abbau beobachtet um 1 Uhr (bis 0,85 ΔRIN); Weitere Verschlechterung in kleineren Proben der Leber als in größeren Proben. Kap Et Al. (2015)37
Menschlichen colorectal Krebs Snap, Einfrieren (flüssigen N2/Isopentane) 4 ° C Abbau von 1 h beobachtet.; RIN Score von nur 4,2 nach 90 min. Verzögerung bei frostigen Zeit Hong Et Al. (2010)38
Menschlichen Leber RNA Bewahrung Lösung, auch Flash-Einfrieren (Flüssigkeit N2) Raumtemp, 4 ° C Proben wurden stabile sogar heraus auf 1 d. auf Eis; Abbau beobachtet nach 1 d. bei Raumtemp. (aber nicht nach 3 Uhr; als beobachtet mit RIN Partituren) Lee Et Al. (2013)39
Pferd adipös, skelettartigen Muskel Snap, Einfrieren (flüssige N2) 13 ° C Autoren empfehlen, dass beste Integrität für Muskel innerhalb von 2 h war.; adipöse Erhaltung innerhalb 0,5 h empfohlen von Autoren (wie rRNA Gel aussehen beobachtet). Morrison Et Al. (2014)40
Lachs-Gehirn, Niere, Leber, Muskeln RNA-Erhaltung-Lösung Raumtemp. Gehirn RNA stabil, 4-8 h, Nieren und Muskeln Exhbiit eine Verschlechterung von 8 h (Gel, RIN Punktzahl beide verwendet). Seear & Sweeney (2008)41
Kaninchen-Bindegewebe (Bänder, Sehnen, Knorpel) Snap, Einfrieren (flüssige N2) 4 ° C Raumtemp. Keine "offene" Degradation, bis 96 h Post-mortem, wie rRNA Gel aussehen beobachtet. Martschuk Et Al. (1998)42
Rattengehirn, Lunge, Herz, Leber Erscheint frisch extrahiert werden Im Inneren der Ratte Kadaver statt in 20 ° C Inkubator Höchsten RNA-Stabilität im Gehirn (konnte rRNA Bands aus bis zu 7 Tagen Post-mortem, beobachten, obwohl Abbau anwesend war), moderate Stabilität in Lunge und Herz, geringe Stabilität in Leber beobachtet; wie rRNA Gel aussehen beobachtet Inoue Et Al. (2002)43
Menschlichen Tonsillen, Doppelpunkt Mit und ohne RNA Bewahrung Lösung dann Snap-gefroren Raumtemp. (22 ° C), 4 ° C RNA Bewahrung Lösung, kalten Kochsalzlösung oder Eis (0 ° C) Stabile bis 16 Uhr auf dem Eis oder in RNA Bewahrung Lösung; leichte Verschlechterung um 6 oder 16 h in kalten Kochsalzlösung oder bei RT (gemessen von RIN Partituren) Micke Et Al. (2006)44

Tabelle 3. Probe der bisherigen Erkenntnisse zur RNA-Stabilität in Post-Mortem Gewebeproben. Die Einträge stellen ausgewählte Manuskripte aus der Literatur über RNA-Stabilität, mit einer Reihe von Gewebetypen vertreten, darunter Murine, menschliche Biopsie und tierärztliche Beispiele. Die Methoden für die Erhaltung, die Art der Lagerung vor Extraktion und eine kurze Zusammenfassung der Ergebnisse sind für jedes Beispiel bereitgestellt. Sofern nicht anders angegeben, wurden die Proben bei Bedingungen von Eis bis 37 ° C, gefolgt von Snap Einfrieren oder eine Infusion mit RNA Bewahrung Lösung, Post-Zeit Kurs gelagert (in anderen Worten, Stabilität wurde nicht gemessen in Anwesenheit einer RNA Bewahrung Lösung während der Inkubation, sofern nicht angegeben).

Proben-ID 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Ein260/a280 1.96 1,98 1,98 1.91 1,98 1,89 1,89 1.91 1.9 1,84 1,84 1.97
Ein260/a230 0,67 0,14 0,19 0.26 0,61 0.69 1.33 0,11 0.21 0,39 0.1 0,44
RIN  1.6 1.1 1.3 1.2 1 1.3 2 1.1 1.2 1 1 1

Tabelle 4. Vertreter ergibt sich aus RNA isoliert von Rindern FFPE mesenterialen Lymphknoten. Die Tabelle zeigt die Ergebnisse von spektralfotometrische und Qualitätsanalysen aus einer Reihe von Proteinkinase bovine Lymphknoten Proben mit in diesem Manuskript beschriebene Methode verarbeitet. In jedem Fall reflektieren die Ergebnisse stark degradierten RNA.

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Discussion

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Die Mehrheit der transkriptomischen Studien und die dazugehörigen Protokolle auf Maus, Ratte oder Post-Mortem Humanproben konzentrieren. Jedoch bieten Untersuchungen in Vieh und Wildtiere eine breite Palette von Möglichkeiten für die Charakterisierung der Immunantwort gegen Krankheiten, sowohl als für Veterinärmedizin und in Bezug auf zoonotische Krankheiten, für die menschliche Gesundheit. Dieses Protokoll zur Verfügung gestellt, einer Übersicht der wichtigsten Überlegungen für hoher Integrität RNA-Extraktion aus Geweben aus große Tiere wie Rinder, Bison, Ziegen und Schafe. Die Größe der Tiere sowie die Bedingungen für die Probenentnahme, machen der Erholung einen umfangreicheren Prozess, mit Post-Mortem-Verarbeitung länger als für die Maus Lymphknoten Wiederherstellung. Ebenso erfordert die Größe dieser Lymphknoten Protokolle, die parallele Proben von verschiedenen Tieren sowie Muster, die repräsentativ für die immunologische/pathologischen Veränderungen in den Lymphknoten zu erholen. Die Vorschläge für die Entnahme von Proben in diesem Protokoll sorgen für die Wiederherstellung der intakten RNA als auch für repräsentative profile basierend auf den Schnitt des Lymphknotens.

Als ein Beweis für die Bedeutung eines standardisierten Probenahmestrategie und Protokoll wie hier vorgestellt, befragten wir 25 Papiere aus der PubMed Central-Datenbank, die das Transkriptom Vieh Lymphknoten gekennzeichnet. Ein Papier angegeben die Verarbeitung einer großen Lymphknoten-Sektion zu einer Zeit, einer bestimmten Laser Mikrodissektion Erfassungsmethoden diskutiert, man erwähnt, dass eine "repräsentative Stichprobe" aus den Lymphknoten erfasst wurden und nur ein Papier46 angegeben Das Stück von Lymphknoten (10 mm3 in der Größe) gesammelt enthalten Cortex und Medulla Regionen. Während andere Papiere festgestellt, dass kleine Proben (in der Regel 30-100 mg) für RNA Analyse verarbeitet wurden, erwähnt 84 % der Papiere kein Stichprobenverfahren für die Sammlung dieser Gewebe Stücke. Als RNA-Sequenzierung ist immer noch relativ teuer, die Analyse von mehreren Sektionen pro Lymphknoten ist unwahrscheinlich, dass in den meisten Fällen finanziell tragfähig sein, zumal replizieren biologische Proben in der Regel für die statistische Analyse priorisiert werden. Durch die Entnahme einer Probe über einen Keil sagittal geschnitten Lymphknotens, wird RNA aus Lymphknoten-Regionen, die reich an verschiedenen Arten von Immunzellen in allen Proben erfasst. Dieses Protokoll dient daher als Referenz für eine dokumentierte und reproduzierbare Probenahmestrategie für Lymphknoten Transkriptom.

Bei der Vorbereitung von RNA aus Gewebe gibt es mehrere wichtige Schritte für verfahrensrechtliche Entscheidungen. Zunächst wird die methodische Literatur in Bezug auf die Verwendung von Erhaltung Lösungen gegen die Verwendung von Blitz eingefroren Gewebe Proben (und anschließende kalte Temperatur Schleifen) gemischt. Besonders bei großen Tieren Autopsien gibt es mehrere mögliche verfahrenstechnischen Vorteile der Verwendung einer Bewahrung Lösung, wie in diesem Protokoll aufgenommen. Erstens können Gewebeproben während der Autopsie in Bewahrung Lösung ohne die Notwendigkeit, die Rohre zu flüssigem Stickstoff Sofortüberweisung gespeichert werden. Zweitens bietet die Verwendung einer Bewahrung Lösung zusätzlichen Schutz vor Probenverarbeitung für RNA-Extraktion, insbesondere dann, wenn die Probe teilweise oder kurz vor der Homogenisierung auftaut. Die Ergebnisse in Abbildung 6A zeigen, dass diese schützende Wirkung erstreckt sich auf Lymphknoten Gewebe. Im Gegensatz dazu Blitz eingefroren Proben im gefrorenen Zustand bis zum Moment der Homogenisierung in einem Phenol-haltigen Puffer einzuhalten. Zu guter Letzt können für Feld Autopsien von großen Tieren, wo die flüssiger Stickstoff nicht sogleich verfügbar ist, Proben in Bewahrung Lösung gelagert werden, bis sie ins Labor zurückgegeben werden können.

Weitere Vorteile der molekularen Komponenten der hier vorgestellten Verfahren sind das Vorhandensein von Phenol während der anfänglichen Gewebe Verarbeitung, dient als Desinfektionsmittel im Aerosol erzeugende Prozess der Homogenisierung für Proben aus infizierte Tiere und Spin Spalte Verfahren, passives Phenol und Guanidin erfolgt aus der Probe zu entfernen. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass das Verfahren qualitativ hochwertige RNA erzeugt wie ein260/a280 und eine260/a230 Kennzahlen bewertet, gel-Elektrophorese und RIN Partituren und ist robust gegen Zeit Kurs Herausforderungen Vieh und Wildtiere Probenahme. Die Paarung von Gewebe (z.B.in RNALater), Erhaltung Homogenisierung in Phenol basierende Reagenzien (z. B.TRIzol) und Kieselsäure Spalte Reinigung ist erfolgreich in der Literatur zur Profil-gen Expressionsmuster in Schafe verwendet worden abomasal Lymphknoten infiziert mit Magen-Darm-Nematoden46 und in den Lymphknoten Rinder infiziert bzw. mit einem Herpesvirus47mit RIN Scores größer als 8 und größer als 7 über alle Proben.

Im Falle einer daraus resultierenden RNA mit inakzeptabel RIN Noten für nachgelagerte Analyse sollte die folgenden Variablen, die für RNA Processing standard sind, bewertet werden: die gesamte Verarbeitung Zeit Post Mortem, den Zustand des Gewebes, die Verarbeitung/Zeitverzögerung nach dem tauen Sie auf, der Technik bei der RNA-Extraktion und die RNA Umgang mit Post-Entnahme. Die gesamte Verarbeitung Zeit Post-Mortem sollte insbesondere bei Gewebe erholt Tiere tot aufgefunden, im Gegensatz zu euthanasierten Tiere beurteilt werden. Wie oben beschrieben, ist die RNA in Lymphknoten relativ stabil, aber lange Verzögerungen in der Bearbeitung führen zu einer Verschlechterung, insbesondere bei instabilen Transkripte. Eine verwirrende Zeitvariable könnte vorhanden sein, wenn Proben zwischen Schlachtkörper verglichen werden, die im Bereich für unterschiedliche Mengen an Zeit geblieben sind. Der Zustand des Gewebes sollte geprüft werden, da der Abbau von Gewebe Integrität durch pathologische Veränderungen im Zusammenhang mit einer Infektion, die RNA-Stabilität reduzieren kann. Z. B. niedriger RNS-Qualität ist in der Placentome von Brucellabeobachtet worden-infizierte Tiere post-Abortion (Boggiatto Et Al., eingereicht). Die Verarbeitung/Zeitverzögerung nach dem Tauwetter wird durch den Einsatz von Erhaltung Lösungen, gemildert, wie in diesem Protokoll beschrieben. Stellen Sie sicher, dass die Dicke der Gewebe Stücke niedrig genug, um eine korrekte und schnelle Durchdringung der Konservierungsmittel-Lösung in das Gewebe (< 5 mm Dicke mit Konservierungsmittel, die in der Tabelle der Materialienerwähnt) zu ermöglichen. Während die RNA-Extraktion sollten die Puffer RNase-freie und Kontakt mit Handschuhen und andere kontaminierte Gegenstände (RNases befinden sich auf der Haut) müssen vermieden werden. Für das Schleifen von Lymphknoten Gewebe, die größte Quelle für mögliche RNases werden im Gewebe selbst, aber es empfiehlt sich, die Einführung von Schadstoffen in allen Phasen des Verfahrens zu reduzieren. Um die Post-RNA-Extraktion, behandeln wie im Protokoll beschrieben, Proben aliquoten die RNA in Röhren vor dem Einfrieren und Lagerung bei-80° C, Frost-Tausalz-Proben für eine qualitative und quantitative Analyse überflüssig.

Niedrige Erträge im Verfahren zusätzlich aus den Abbau von RNA-Proben, kann durch eine ineffiziente Homogenisierung der Lymphknoten Gewebe bei Schritt 4.3 im Protokoll. Beachten Sie, dass die Inkubation in einer RNA-Erhaltung-Lösung die Textur des Gewebes (Erhöhung der Festigkeit), ändern kann, obwohl die meisten Lymphknoten Gewebe effektiv dissoziiert in Nullserien mit dem großen Rotor-Stator Dissociator hier beschriebenen gezahnt. Wie in Schritt 4.3.1 erwähnt, sollte die Homogenisierung in Phenol basierende Reagenz wiederholt, wenn die Dissoziation unvollständig ist. Mörser und Pistill Schleifen, ist gefolgt von Wiederfreisetzung des Boden-Probe in ein Phenol-basierte Reagenz eine weitere Alternative für Labors ohne Zugang zu einem Homogenisator mit diesen Spezifikationen. Allerdings stellt eine Homogenisierung in Einweg-Röhren mehrere potenzielle Vorteile gegenüber dem Schleifen von tiefgefrorenem Gewebe in einem Mörser und Stößel, einschließlich einen mehr Machbaren und kürzere Workflow für die Bearbeitung mehrerer Proben, fehlender Probenverlust beim Schleifen , keine Bereinigung und keine möglichen Kontakt mit angetriebenen Proben bei Geweben von infizierten Tieren.

Avraham Et al. 48 zu beschreiben, dass eine große 5 s RNA Spitze in das Endprodukt RNA, gepaart mit einer geringen Erholung der 28 s und 18 s ribosomalen RNAs, ein Zeichen für eine unvollständige Lyse der Zellen sein kann (das kann wiederum für die Lymphknoten Verarbeitung durch eine unvollständige Dissoziation der tiss UE). Abbildung 6 b bietet ein Beispiel für eine RNA-Profil generiert aus einem Stück Rinder Parotis Lymphknoten, die war sehr hoch, im Bindegewebe und nicht effektiv zu homogenisieren. RNA-Erträge sollte berechnet und über Proben in einem Satz für die Analyse zu bestätigen, dass ähnliche Rückforderungen sich pro mg des Gewebes ergeben und Proben für den direkten Vergleich von RNA-Sequenzierung im Batch, verwenden die gleichen Homogenisierung verarbeitet werden sollten überwacht werden Strategie für alle Proben. Beachten Sie, dass der Keil Stichprobenansatz auch hilft eine Sammlung von einer Stichprobe, die ausschließlich eine Region umfangreiche Bindegewebe ist zu vermeiden.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen. Alle Forschung wird mit intramurale Mittel aus dem US Department of Agriculture, Agricultural Research Service finanziert. Alle Verweise auf bestimmte Produkte werden für die Zwecke der experimentellen Reproduzierbarkeit zur Verfügung gestellt und stellen keine Billigung dieser Produkte durch die Bundesregierung.

Acknowledgments

Die Autoren möchten James Fosse für seine hervorragende Arbeit auf allen Videografie und Videoverarbeitung danken; Michael Marti für seine hervorragende Arbeit bei der Erzeugung von digitalisierten Rinder Bilder; Lilia Walther für ihre Hilfe mit RNA-Extraktion und Bioanalyzer läuft; Mitch Palmer und Carly Kanipe für ihre hilfreiche Bewertung und Feedback auf Lymphknoten Bilder; und die Tierpflege und Tierärzten bei der National Animal Disease Center für all ihre harte Arbeit und Unterstützung bei der Tierhaltung und der Vorbereitung auf Autopsien.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RNA preservation solution (we used RNALater for all experiments) ThermoFisher AM7020
1.5 ml or 2 ml polypropylene microcentrifuge tubes  Fisher Scientific 05-408-129
Disposable scalpels Daigger Scientific EF7281
Tissue forceps, rat tooth Fisher Scientific 12-460-117 Other tissue forceps available including curved tip, tapered edge, etc. , depends on user preference
3 mm punch biopsy needles Fisher Scientific NC9949469
Sharps container (small and transportable for necropsy) Stericycle 8900SA 1 qt. size shown here
Cutting boards or disposable trays Fisher Scientific 09-002-24A Available in a variety of sizes, depends on user preference
Personal protective equipment Varies with pathogen (gloves, respirator masks, goggles, etc.)
Phenol-based RNA extraction reagent (we used TRIzol Reagent for all experiments) ThermoFisher 15596026
Silica column-based RNA extraction kit (we used the PureLink RNA Mini kit for all experiments) ThermoFisher 12183018A Designed for up to 100 mg tissue
100% Ethanol (200 proof for molecular biology) Sigma-Aldrich E7023
Tissue homogenizer with enclosed homogenization tubes (we used the gentleMACS dissociator for all experiments) Miltenyi Biotec 130-093-235
Agarose (General, for gel electrophoresis) Sigma-Aldrich A9539
1X TBE Fisher Scientific BP24301 Can also make from scratch in the laboratory
Deionized formamide EMD Millipore S4117
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L3771
Bromophenol blue Sigma-Aldrich 114391
Xylene cyanol  Sigma-Aldrich X4126
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) Sigma-Aldrich EDS
UV-Vis Spectrophotometer (we used the NanoDrop Spectrophotometer) ThermoFisher ND-2000
Device for quantitative RNA assessment (we used the Bioanalyzer, with associated components and protocols) Agilent G2939BA
FFPE RNA extraction kit (we used the RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit for Formalin Fixed, Paraffin Embedded Tissue) ThermoFisher AM1975
Plastic spreader (L-shaped spreader) Fisher Scientific 14-665-231 Only needed for sterility testing for samples from infected animals
Necropsy knives Livestock Concepts WI-0009209

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Erhebung und Verarbeitung von Lymphknoten von großen Tieren für RNA-Analyse: Vorbereitung auf Lymphknoten Transkriptomischen Studien der großen Tierarten
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Vrentas, C. E., Boggiatto, P. M., Schaut, R. G., Olsen, S. C. Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species. J. Vis. Exp. (135), e57195, doi:10.3791/57195 (2018).More

Vrentas, C. E., Boggiatto, P. M., Schaut, R. G., Olsen, S. C. Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species. J. Vis. Exp. (135), e57195, doi:10.3791/57195 (2018).

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