Innsamling og behandling av Lymph noder fra store dyr for RNA analyse: forbereder lymfeknute Transcriptomic studier av store dyrearter

Summary

Denne protokollen gir en oversikt over prosedyrer for isolering av RNA for transcriptomic profilering av lymfeknute vev fra store dyr, inkludert trinnene i identifikasjon og excision av lymph noder fra husdyr og dyreliv, prøvetaking metoder å gi konsistens på tvers av flere dyr, og betraktninger pluss representant resultater for post samling bevaring og behandling for RNA analyse.

Abstract

Store dyr (husdyr og dyreliv) tjene som viktig reservoarer zoonotiske patogener, inkludert Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonellaog E. coli, og er nyttige for studiet av patogenesen og/eller spredning av bakterier i naturlige verter. Med funksjonen nøkkel av lymfeknuter i immunforsvaret vert tjene lymfeknute vev som en potensiell kilde til RNA for nedstrøms transcriptomic analyser, for å vurdere timelige endringene i genuttrykk i celler i løpet av en infeksjon. Denne artikkelen gir en oversikt over prosessen med lymfeknute innsamling, vev prøvetaking og nedstrøms RNA behandling i husdyr, med storfe (Bos taurus) som modell, med flere eksempler fra den amerikanske bison (Bison bison ). Protokollen inneholder informasjon om plasseringen, identifisering og fjerning av lymph noder fra flere viktige områder i kroppen. I tillegg presenteres en biopsi prøvetaking metodikk som tillater en konsistens av prøvetaking over flere dyr. Flere hensyn for eksempel bevaring diskuteres, inkludert generering av RNA egnet for nedstrøms metoder som RNA-sekvensering og RT PCR. På grunn av de lange forsinkelsene i store dyr vs mus tid kurs studier presenteres representant resultater fra bison og storfe lymfeknute vev for å beskrive time course of nedbrytning i denne vev, i forbindelse med en gjennomgang av tidligere metodologisk arbeid på RNA degradering av andre vev. Samlet vil denne protokollen være nyttig både veterinær forskerne begynner transcriptome prosjekter på store dyr prøver og molekylær biologer interessert i å lære teknikker for i vivo vev prøvetaking og i vitro behandling.

Introduction

RNA-sekvensering analyse av transcriptome av lymfeknuter gir deg mulighet å karakterisere immunrespons av dyr til en rekke patogener. Mens denne metodikken blitt benyttet mye i mus, har analyser nylig blitt utvide til større pattedyr^1,2. Husdyr/store dyr lymfeknuter kan brukes til å karakterisere vert svar til en infeksjon, ikke bare for deres bruk i vaksine eller genetisk mottakelighet studier og identifisering av mål for narkotika utvikling, men også som modellsystemer for menneskelige studier på zoonotiske sykdommer. For eksempel ved brucellose (en zoonotiske bakteriell sykdom som påvirker en halv million mennesker rundt om i verden hvert år), til tross for betydelig økt kostnader, studier i sau eller geiter er mer relevante for menneske-smitte og menneskelige vaksine utvikling enn laboratorium dyremodeller. Musen infeksjon modeller recapitulate reticuloendothelial systemet infeksjonen men ikke karakteristiske klinisk underskriver³_.

I store dyreforsøk i forhold til laboratoriet dyrestudier innebærer prosessen med vev høsting nødvendigvis en lengre forsinkelse mellom euthanasia og samlingen vev, som en potensiell utfordring for bevaring av høy kvalitet RNA. Intakt RNA er viktig for generering av biologisk relevante transcriptomic data. Generasjonen av høy kvalitet fra vevsprøver er spesielt viktig for store dyr patogen studier gjennomført i forvaring fasiliteter. Slike studier er iboende vanskeligere å utføre som de ikke bare krever godkjent fasiliteter og høyt utdannet personell men også gjennomføre betydelige finansielle kostnader, som, avhengig av arbeidet, kan variere fra titalls til hundrevis av dollar. Slike studier også innebære et tverrfaglig samarbeid og tverrfaglig kunnskap for sine ferdigstillelse, legge til kompleksitet. Derfor gir opplæring på, utviklingen av, og overholdelse av et strømlinjeformet system for eksempel innsamling og bevaring betydelige fordeler for nedstrøms molekylære studier av vev fra infiserte dyr.

Samlingen av større lymfeknuter gir ekstra utfordringer for vev samlingen sammenlignet med lignende prøvetaking av murine lymfeknuter. Forberedelse for eksempel excision nødvendiggjør en grunnleggende forståelse av anatomien i lymfeknute, inkludert de relevante interne strukturene. Strukturen i en lymph node består av lymfoide lobules former omgitt av bihulene fylt med lymfe. Disse strukturene er omsluttet av en tøff, fibrøs kapsel. ⁴ en lymfoide lobule er “anatomiske og funksjonelle basisenheten av lymfeknute” og består av hårsekkene, en dyp kortikale enhet, og medullær ledninger og bihulene⁴ (figur 1A). B- og T-lymfocytter er hjem til hårsekkene og dypt kortikale enheter, henholdsvis. Disse strukturene gir en 3D stillaset og gjøre interaksjon mellom lymfocytter og antigen eller antigen presentere celler.

Grovt, follicles og dypt kortikale enheter kan identifiseres på kutt overflate som de inneholder en tettere reticular meshwork og se mørkere ut enn bihulene, som består av en mer delikat reticular meshwork og virker lysere (figur 1B). Ved konvensjonen se patologer regionene i lymfeknutene overfladisk cortex (follikler), paracortex (dypt kortikale enheter) og medulla (medullær ledninger og bihulene). En skikkelig undersøkelse av alle tre regioner har vært ansett som beste praksis i rutinemessig patologisk undersøkelse retningslinjer for lymfeknuter⁵. Merk at det er en betydelig variasjon i konsistens, størrelsen og fargen på lymfeknuter, selv innenfor en enkelt dyr. Som dyr alder, deres lymfeknuter vil tendere til å redusere størrelsen og blir firmer enn yngre dyr, vanligvis skyldes en økning i connective vev og en reduksjon av normal lymfoide struktur^6,7.

Figur 1. Anatomien til lymfeknute. (A) denne tegneserie bilde viser anatomi av lymfeknute, som viser viktige strukturer. (B) dette fortsatt bildet viser en storfe lymph node kutte tverrsnitt. Relevante strukturer/lag som er synlige for det blotte øye er uthevet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Avhengig av eksperimentelle spørsmålet, vil ulike lymfeknutene være av interesse for innsamling og analyse. Perifer lymph noder er dypt i subkutant vev. I storfe, ytre eller overfladisk lymfeknuter ofte brukt i klinisk og eksperimentell praksis omfatter Parodisk, submandibular, retropharyngeal, prescapular, prefemoral (precrural) og overfladiske lysken (supramammary i kvinner, scrotal hos menn) () Figur 2). I tabell 1, er egenskapene til sentrale overfladisk lymfeknuter, som beskrevet i storfe systemet⁸, beskrevet. Nedenfor presenteres noen potensielle lymfeknute samling planer for bakteriell infeksjonssykdommer av storfe som et utgangspunkt for etterforskningen.

Brucella abortus/Brucella melitensis: Standard necropsies for B. abortus-infisert storfe og B. melitensis-infiserte geiter ved National Animal sykdom Center gjenopprette supramammary, prescapular og parotid lymfeknute vev , både i sliping for bakteriell nummereringen og RNA forberedelse til verten RNA expression profilering. B. abortus kan gjenopprettes regelmessig i hver av disse lymfeknuter i eksperimentelt infiserte storfe⁹_. Tilstedeværelse av bakterier i hver av disse lymfeknute kan påvises i B. melitensis-infisert geiter til minst ni måneder etter smitte ved hjelp av RNA-baserte metoder fra våre studier (Boggiatto et al., upublisert). Salmonella Sp.: prescapular, subiliac (prefemoral), og hvem lymfeknuter vært nyttig under profilering av storfe skrotter til en Salmonella prevalens^10,11,12 og ville være av interesse for transcriptomic studier. E. coli O157: H7: hvem lymfeknuter (på midten tynntarm og distale tynntarmen steder) kan nettstedene til en annen utvinning av bakterier i infiserte kalver (men ikke i infiserte voksen storfe)¹³. Leptospirosis (Leptospira sp.): kronisk utholdenhet av bakterier er observert i lymfeknutene drenering melkekjertlene¹⁴. Mycobacterium bovis : I storfe er bakterier gjenopprettet etter eksperimentelle infeksjon fra mediastinal og tracheobronchial lymfeknutene kalver¹⁵. I tillegg blitt lymfeknute RNA benyttet for å undersøke store dyr vert Svar å virus, som svin reproduktive og åndedretts syndrom virus². Figur 2 viser plasseringen av et delsett av disse store lymfeknuter i storfe kroppen.

Figur 2: Karikaturtegning som viser valgte lymfeknute steder i BIM taurus . Nummererte lymfeknuter er merket. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

I dette papiret og tilhørende video presenterer vi en protokoll for isolering av store dyr lymfeknuter for RNA studier, designet for å være informativ for molekylær biologer involvert i transcriptomic studier av store dyre-infeksjoner. Først, vi gir en oversikt over isolasjon prosedyren for lymfeknutene, bruker utvalg fra storfe og bison vev som eksempler. Sammen med denne demonstrasjon, som vist i videoen, er en arbeidsflyt for en reproduserbar vev prøvetaking RNA isolering. Neste, vi beskriver viktige hensyn for behandling av en infisert lymfeknute, med fokus på sikkerhet og konsekvens RNA kvalitet.

Utarbeidelse av RNA fra vevet med en sur fenol-guanidine isothiocyanate reagens er basert på den opprinnelige metoden Chomczynski og Sacchi^16,17, med en renselse over silisium-baserte spinn kolonner i nærvær av chaotropic agenter basert på det opprinnelige arbeidet i Vogelstein og Gillespie¹⁸. Vi undersøker også muligheten for utvinning av RNA for transcriptomics fra storfe lymfeknuter bevart av alternative metoder. Til slutt, vi utforsker virkningen av variabelen tid på RNA kvaliteten i store dyr necropsies, inkludert en representant eksperiment som viser effekten av en økning i tiden mellom euthanasia og prøvetaking i gjenopprettede RNA profilen fra bison og storfe lymfeknuter. Denne artikkelen vil være nyttig ikke bare til molekylær biologer men også til veterinær forskerne begynner transcriptomic studier.

Protocol

Dyr obduksjon prosedyrene avbildet her dekkes godkjent IACUC protokoller ved National Animal sykdom Center, Ames, IA. Alle eksperimentene ble utført i samsvar med de godkjente retningslinjene for dyr omsorg og velferd. 1. pre-planlegging før obduksjon Før obduksjon, klargjør følgende materialer for transport til obduksjon suite: 1.5 eller 2 mL microcentrifuge rør fylt med ~ 1,0 mL av RNA bevaring løsning, i en rack eller transport beholder. Sørg for å følge produsen…

Representative Results

Bruk av hensyn som presenteres i denne artikkelen (trinn 1-4 av protokollen) vil hjelpe i utvinningen av fra store dyr prøver som passer for en nedstrøms analyse i vert gene expression studier. RNA kvaliteten for nedstrøms programmer vurderes av flere standard tiltak. Spectrophotometry, A260/A280 forholdet gir et mål på protein forurensning og A260/A230 forholdet er en annen renhet vurdering som vil oppdage kjemiske forurensninger som fenol. I hvert tilfelle, prosenter av …

Discussion

Fleste transcriptomic studier og de tilknyttede protokollene som fokuserer på mus, rotte eller evaluering prøver fra mennesker. Men gi undersøkelser i husdyr og ville dyr en rekke muligheter for karakterisering av immun respons på sykdom, både som gjeldende veterinærmedisin og, i forhold til zoonotiske sykdommer, menneskelige offentlig helse. Denne protokollen gitt en disposisjon av nøkkelfaktorer for høy integritet RNA utvinning fra vev fra store dyr, som storfe, bison, geiter og sauer. Størrelsen på dyr, i ti…

Materials

RNA preservation solution (we used RNALater for all experiments)	ThermoFisher	AM7020
1.5 ml or 2 ml polypropylene microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-129
Disposable scalpels	Daigger Scientific	EF7281
Tissue forceps, rat tooth	Fisher Scientific	12-460-117	Other tissue forceps available including curved tip, tapered edge, etc. , depends on user preference
3 mm punch biopsy needles	Fisher Scientific	NC9949469
Sharps container (small and transportable for necropsy)	Stericycle	8900SA	1 qt. size shown here
Cutting boards or disposable trays	Fisher Scientific	09-002-24A	Available in a variety of sizes, depends on user preference
Personal protective equipment			Varies with pathogen (gloves, respirator masks, goggles, etc.)
Phenol-based RNA extraction reagent (we used TRIzol Reagent for all experiments)	ThermoFisher	15596026
Silica column-based RNA extraction kit (we used the PureLink RNA Mini kit for all experiments)	ThermoFisher	12183018A	Designed for up to 100 mg tissue
100% Ethanol (200 proof for molecular biology)	Sigma-Aldrich	E7023
Tissue homogenizer with enclosed homogenization tubes (we used the gentleMACS dissociator for all experiments)	Miltenyi Biotec	130-093-235
Agarose (General, for gel electrophoresis)	Sigma-Aldrich	A9539
1X TBE	Fisher Scientific	BP24301	Can also make from scratch in the laboratory
Deionized formamide	EMD Millipore	S4117
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	L3771
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	114391
Xylene cyanol	Sigma-Aldrich	X4126
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid)	Sigma-Aldrich	EDS
UV-Vis Spectrophotometer (we used the NanoDrop Spectrophotometer)	ThermoFisher	ND-2000
Device for quantitative RNA assessment (we used the Bioanalyzer, with associated components and protocols)	Agilent	G2939BA
FFPE RNA extraction kit (we used the RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit for Formalin Fixed, Paraffin Embedded Tissue)	ThermoFisher	AM1975
Plastic spreader (L-shaped spreader)	Fisher Scientific	14-665-231	Only needed for sterility testing for samples from infected animals
Necropsy knives	Livestock Concepts	WI-0009209