Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Verzameling en verwerking van lymfklieren uit grote dieren RNA p.a.: lymfeklier Transcriptomic Studies van grote diersoorten voorbereiden

doi: 10.3791/57195 Published: May 19, 2018

Summary

Dit protocol biedt een overzicht van de procedures voor de isolatie van RNA voor de profilering van de transcriptomic van de lymfeklier weefsels van grote dieren, met inbegrip van de stappen in de identificatie en de besnijdenis van lymfeklieren van vee en wilde dieren, bemonstering benaderingen te leveren consistentie in meerdere dieren, en overwegingen plus representatieve resultaten voor de post collectie bewaring en verwerking ten behoeve van RNA analyse.

Abstract

Grote dieren (vee en wild) dienen als belangrijk reservoirs van zoönotische pathogenen, met inbegrip van Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonellaen E. coli, en zijn nuttig voor de studie van de pathogenese en/of verspreiding van de bacteriën in natuurlijke gastheren. Met de belangrijkste functie van de lymfklieren in de immuunrespons van de gastheer dienen lymfeklier weefsels als een potentiële bron van RNA voor downstream transcriptomic analyses, teneinde de tijdelijke wijzigingen in genexpressie in cellen in de loop van een infectie. Dit artikel geeft een overzicht van het proces van de lymfeklier collectie, bemonstering van weefsel en downstream RNA verwerking in vee, van runderen (Bos taurus) als een model, met extra voorbeelden van de Amerikaanse bison (Bison bison ). Het protocol bevat informatie over de locatie, identificatie en verwijdering van lymfeklieren van meerdere belangrijke plaatsen in het lichaam. Bovendien wordt een biopsie bemonsteringsmethode gepresenteerd dat voorziet in een consistentie van bemonstering over meerdere dieren. Verscheidene overwegingen voor behoud van de steekproef worden besproken, met inbegrip van de generatie van RNA geschikt voor downstream methodologieën zoals RNA-sequencing en RT-PCR. Vanwege de lange vertragingen die inherent zijn aan grote dierlijke vs. muis tijd cursus studies, worden representatieve resultaten van bison en boviene lymfeklier weefsels voorgesteld om te beschrijven van het tijdsverloop van de degradatie in dit weefseltype, in het kader van een herziening van vorige methodologische werkzaamheden op aantasting van het RNA in andere weefsels. Over het geheel genomen zal dit protocol nuttig aan beide veterinaire onderzoekers beginnen transcriptome projecten op grote dieren monsters en moleculaire biologen geïnteresseerd in het leren van technieken voor in vivo weefsel bemonstering en in vitro verwerking zijn.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

RNA-sequencing analyse van transcriptome lymfklieren biedt de mogelijkheid om het karakteriseren van de immuunrespons van dieren aan een verscheidenheid van pathogenen. Terwijl deze methodologie is gebruikt uitgebreid in muizen, analyses hebben onlangs geweest zich uitbreiden naar grotere zoogdieren1,2. Dieren/grote dierlijke lymfeklieren kan worden gebruikt voor het karakteriseren van host reacties op een infectie, niet alleen voor hun gebruik in het vaccin of genetische studies en voor de identificatie van doelen voor Geneesmiddelenontwikkeling, maar ook als modelsystemen voor menselijke studies op zoönotische ziekten. Bijvoorbeeld in het geval van brucellose (een zoönotische bacteriële ziekte dat effecten een half miljoen mensen over de hele wereld elk jaar), ondanks aanzienlijk hogere kosten, studies in schapen of geiten meer relevant zijn voor de menselijke infectie en menselijk vaccin ontwikkeling dan laboratorium diermodellen. Infectie Muismodellen recapituleren de reticuloendotheliaal systeem infectie maar niet de karakteristieke klinische symptomen3.

In grote dierproeven ten opzichte van dierproeven laboratorium bestaat het proces van weefsel oogsten noodzakelijkerwijs uit een langere vertraging tussen de euthanasie en de weefsel-collectie, die een potentiële uitdaging voor het behoud van kwalitatief hoogwaardige RNA. Intact RNA is essentieel voor de generatie van biologisch relevante transcriptomic gegevens. De generatie van kwalitatief hoogwaardige RNA van weefselmonsters is bijzonder kritisch voor grote dieren pathogen studies uitgevoerd in insluiting faciliteiten. Dergelijke studies zijn inherent moeilijker uit te voeren zoals ze niet alleen goedgekeurde voorzieningen en hoogst opgeleid personeel vereisen, maar ook aanzienlijke financiële kosten, die, afhankelijk van het werk voeren, van tientallen tot honderden duizenden dollars variëren kunnen. Deze soorten studies ook betrekking hebben op een interdisciplinaire samenwerking en multidisciplinaire kennis ten behoeve van hun voltooiing, toe te voegen aan hun complexiteit. Daarom, training op, ontwikkeling van en aanhankelijkheid aan een gestroomlijnd systeem voor de sample collectie en het behoud biedt aanzienlijke voordelen voor downstream moleculaire studies van weefsels van besmette dieren.

De collectie van grotere lymfklieren presenteert extra uitdagingen voor de collectie van weefsel ten opzichte van de vergelijkbare bemonstering van lymfkliertest lymfklieren. De voorbereiding voor de steekproef besnijdenis vereist een basiskennis van de anatomie van de lymfeklier, met inbegrip van de relevante interne structuren. De structuur van een lymfeklier bestaat uit lymfoïde melkklieren omgeven door sinussen gevuld met lymfe. Deze structuren zijn ingesloten in een harde, vezelige capsule. 4 een lymfoïde lobule is de "fundamentele anatomische en functionele eenheid van de lymfeklier" en bestaat uit een diep corticale eenheid, en Wallenberg koorden, follikels en sinussen4 (figuur 1A). B en T-lymfocyten zijn de thuisbasis van de follikels en diep corticale eenheden, respectievelijk. Deze structuren bieden een 3D steiger en faciliteren van de interactie tussen de lymfocyten en antigeen of antigeen presentatie van cellen.

Grove, follikels en diep corticale eenheden kunnen worden geïdentificeerd op het snijvlak geconstateerd als ze een dichtere reticulaire gevlochten bevatten en donkerder dan de sinussen, die bestaan uit een meer delicate reticulaire gevlochten en lichter weergegeven (figuur 1B). Door conventie verwijzen pathologen naar de regio's van de lymfeknopen zoals de oppervlakkige cortex (follikels), de paracortex (diep corticale eenheden) en de medulla (Wallenberg koorden en sinussen). Een nauwkeurig onderzoek van de drie gewesten werd geacht als beste praktijk routine pathologisch onderzoek richtsnoeren voor lymfklieren5. Merk op dat er een aanzienlijke variatie in de consistentie, grootte en kleur van de lymfeknopen, zelfs binnen een enkel dier. Naarmate de dieren ouder, hun lymfklieren zal meestal kleiner en worden steviger dan die van jongere dieren, meestal als gevolg van een toename van hun bindweefsel en een vermindering van de normale lymfoïde structuur6,7.

Figure 1
Figuur 1. Anatomie van de lymfeklier. (A) deze cartoon afbeelding toont de anatomie van de lymfeklier, beeltenis van belangrijke structuren. (B) dit nog beeld toont een boviene lymfeklier gesneden in doorsnede. De relevante structuren/lagen die zichtbaar met het blote oog zijn worden gemarkeerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Afhankelijk van de experimentele vraag zullen verschillende lymfklieren van belang zijn voor het verzamelen en analyseren. Perifere lymfklieren zijn gelegen diep in het onderhuidse weefsel. Bij runderen, perifere of oppervlakkige lymfklieren vaak gebruikt in de klinische en experimentele praktijk omvatten parotide, submandibulaire retrofaryngeale, prescapulares, prefemoral (precrural) en de oppervlakkige inguïnale (uier worden bij vrouwtjes, scrotum bij mannen) () Figuur 2). In tabel 1, worden de eigenschappen van de belangrijkste oppervlakkige lymfklieren, zoals beschreven in de vee-systeem8, schetste. Hieronder worden enkele potentiële lymfeklier collectie plannen voor bacteriële infectieziekten van runderen gepresenteerd als een uitgangspunt voor het onderzoek.

Brucella abortus/Brucella melitensis: standaard necropsies voor B. abortus-besmet vee en B. melitensis-besmette geiten aan het National dier ziekte Center herstellen uier worden, prescapular en oorspeeksellymfklieren lymfeklier weefsel , zowel voor het slijpen voor de bacteriële opsomming alsmede voor de bereiding van het RNA voor de host RNA expressie profilering. B. abortus kunnen regelmatig worden hersteld in elk van deze lymfeklieren in experimenteel geïnfecteerde runderen9. De aanwezigheid van bacteriën in elk van deze typen lymfeklier kan worden opgespoord in B. melitensis-besmet geiten tot ten minste negen maanden na infectie met behulp van de methoden voor RNA gebaseerde uit onze studies (Boggiatto et al., onuitgegeven). Salmonella sp.: de prescapular, subiliac (prefemorale), en de mesenterische lymfklieren zinvol zijn geweest tijdens de profilering van runderkarkassen voor een Salmonella prevalentie10,11,12 en zou van potentieel belang voor transcriptomic studies. E. coli O157:H7: mesenterische lymfklieren (op de middelste dunne darm en distale dunne darm locaties) kunnen de sites van een occasionele herstel van de bacteriën in geïnfecteerde kalveren (maar niet in geïnfecteerde volwassen runderen)13. Leptospirose (Leptospira sp.): een chronische persistentie van de bacteriën is waargenomen in de lymfeknopen aftappen van de melkklier14. Mycobacterium bovis : Bij runderen, zijn de bacteriën herstelde na experimentele infectie van de lymfeknopen mediastinale en tracheobronchial van kalveren15geweest. Bovendien is lymfeklier RNA te onderzoeken dieren talloze reacties op virussen, zoals de varkens reproductieve en respiratoir syndroom virus2gebruikt. Figuur 2 toont de locatie van een subset van deze grote lymfeklieren in het lichaam van vee.

Figure 2
Figuur 2: Cartoon beeltenis van geselecteerde lymfeklier locaties in Bos taurus . De genummerde lymfeklieren zijn geannoteerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

In dit document en de bijbehorende video presenteren wij een protocol voor de isolatie van grote dieren lymfklieren voor RNA studies, ontworpen als informatief voor moleculaire biologen die betrokken zijn bij transcriptomic studies van grote dierlijke infecties. Eerst, wij bieden een overzicht van de isolatie-procedure voor de lymfeknopen, met behulp van bemonstering van weefsels van runderen en bison als voorbeelden. Gekoppeld aan deze demonstratie, zoals weergegeven in de video, is een werkstroom voor een reproduceerbare weefsel bemonstering voor RNA isolatie. Vervolgens beschrijven we belangrijke overwegingen voor de verwerking van een geïnfecteerde lymfe-knooppunt, met een focus op veiligheid, consistentie en kwaliteit van RNA.

De voorbereiding van RNA van het weefsel met een aangezuurde fenol-guanidine isothiocyanaat reagens is gebaseerd op de originele methode van Chomczynski en Sacchi16,17, met een zuivering over silica gebaseerde spin kolommen in aanwezigheid van chaotropic agenten op basis van het oorspronkelijke werk van Vogelstein en Gillespie18. We onderzoeken ook de mogelijkheden voor het herstel van RNA voor transcriptomics van vee lymfklieren geconserveerd door toepassing van alternatieve methoden. Ten slotte onderzoeken we de invloed van de variabele van de tijd op de kwaliteit van de RNA in grote dierlijke necropsies, met inbegrip van een representatieve experiment beeltenis van het effect van een toename van de tijd tussen de euthanasie en de bemonstering op de herstelde RNA-Profiel van bison en boviene lymfklieren. Dit artikel zal nuttig zijn niet alleen voor moleculaire biologen maar ook aan veterinaire onderzoekers vanaf transcriptomic studies zijn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De hier afgebeelde dier necropsie-procedures vallen onder de goedgekeurde IACUC protocollen bij het National dier ziekte Center, Ames, IA Alle experimenten werden uitgevoerd overeenkomstig de goedgekeurde richtsnoeren voor dierlijke zorg en welzijn.

1. pre-planning voordat necropsie

  1. Voordat hij de necropsie, stelt u de volgende materialen voor transport naar de necropsie suite:
    1. 1.5 of 2 mL microcentrifuge buizen gevuld met ~ 1,0 mL van RNA behoud oplossing, in een rek of transport container. Zorg ervoor dat richtlijnen te volgen van de fabrikant voor de verhouding tussen het volume van de oplossing voor behoud aan het volume van het weefsel.
    2. Wegwerp scalpels en schone, gesteriliseerde met autoclaaf pincet: één set voor het ontleden van de huid en een andere set voor het verzamelen van de lymfeklieren (één voor elke lymfeklier, per dier), waardoor een cross-besmetting van de huid en de milieu flora met de lymfeklier weefsels.
    3. 3 punch mm biopsie tools, necropsie messen, een slijpsel container voor de gebruikte scalpels en hulpmiddelen voor biopsie en snijplanken of wegwerp trays voor gebruik in de lymfeklier dissectie.
    4. Gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen, met inbegrip van PPE nodig voor werk op het passende niveau van BSL voor het systeem.
    5. Autoclaaf herbruikbare metalen instrumenten, met inbegrip van de verlostang, in metalen pannen vóór de necropsie, met behulp van het gereedschap/drogeladingvaart instellen.

2. identificatie en monsterneming van lymfklieren in vee en Bison

Figure 3
Figuur 3 . Lymfeklieren van de boviene hoofd en nek. (A) deze cartoon afbeelding toont geselecteerde lymfeknopen van het hoofd en de nek van het Bos taurus. (B) dit beeld toont de oorspeeksellymfklieren lymfeklier in dwarsdoorsnede (links) in vergelijking met de oorspeeksellymfklieren speekselklier in dwarsdoorsnede (rechts). Let op het verschil in structuren tussen de twee weefseltypes (HLA). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

  1. Isolatie van prescapulares lymfklieren in vee en bison
    1. Euthanaseren van het dier (vee of bison van elke leeftijd, al naargelang het experiment) gebaseerd op het lokale protocol van de IACUC. Bevestig de dood door specifiek in het institutionele IACUC protocol, met inbegrip van het ontbreken van een hartslag, het ontbreken van de ademhaling en het ontbreken van een hoornvlies reflex beschreven methoden. Verplaats het dier aan de vloer van de necropsie.
      Opmerking: Er zijn verschillende methoden van humane euthanasie gebruikt in de laboratoriumpraktijk van grote dieren. Intraveneuze toediening van pentobarbital natrium en fenytoïne natriumhydroxide-oplossing is echter de meest algemeen goedgekeurd en formulier gebruikt. Raadpleeg de AVMA richtsnoeren voor de euthanasie van dieren. 19
      Let op: Volg alle relevante bioveiligheid protocollen voor een necropsie aan de gastinstelling, met inbegrip van de richtsnoeren voor de veilige verwijdering van scherpe instrumenten in een punctie-bewijs container, en de decontaminatie van herbruikbare metalen messen en pincet. Dit protocol genereert slijpsel afval van het gebruik van wegwerp scalpels. Draag persoonlijke beschermingsmiddelen zoals gedicteerd door de institutionele richtsnoeren, met inbegrip van laarzen, overalls, handschoenen en oogbescherming.
    2. 3 deelnemers om te werken op de dierlijke weefsels te identificeren.
      Opmerking: Hier, dissector 1 zal worden belast met de grootschalige segmenteren van de gewenste dierlijke weefsels, dissector 2 zal het herstellen van de lymfklieren van de verschillende dierlijke delen, en dissector 3 zal werken op een afzonderlijke tabel te isoleren van de secties van elk lymfeklier en overbrengen naar de buizen met een conserveermiddel oplossing.
    3. Beginnen door het plaatsen van het dier in de laterale ligcomfort.
    4. De schouder uit te breiden door het bewegen van de voorste ledematen terug op het niveau van de knie (carpus); deze resolutie zal de schouder terug te brengen en zorgen voor een makkelijker palpatie van de lymfeklier. Gevoel voor de aanwezigheid van de lymfeklier "vast".
      Opmerking: Tijdens ziekte voorwaarden, lymfadenopathie aanwezig kan zijn, waardoor de identificatie van lymfklieren gemakkelijker, maar dit proces kan ook invloed hebben op de consistentie, samenstelling en architectuur van de lymfeklier.
    5. Zodra gevonden, en met de schouder nog uitgebreid, gebruik een scalpel of necropsie mes om een huid incisie langs de omtrek van de schouder.
      Opmerking: Niet beperken de grootte van de incisie, zelfs als de lymfeklier gelegen via palpatie is. Een grotere incisie biedt gemakkelijker toegang tot diepere weefsels en vergemakkelijkt voor de dissector van de besnijdenis van de lymfeklier.
    6. Met behulp van een paar pincet, trekken de huid om te onthullen van het punt van de schouder en nek spieren.
      Opmerking: De prescapulares lymfeklier is vaak gevonden in onderhuids vet, met name in overconditioned dieren.
    7. Nogmaals, palperen de locatie van de lymfeklier (figuur 3A).
      Opmerking: In tegenstelling tot het onderhuidse vet, de lymfeklier houdt zijn vorm wanneer gepalpeerd. Lymfeklieren zijn bovendien niet aaneengesloten waren met de omringende weefsel, zoals ze worden omsloten door een dunne vezelig capsule.
    8. Na het lokaliseren van de prescapulares lymfeklier, zorgvuldig uit het subcutane vet, met behulp van een scalpel en pincet, ontleden en isoleren van de lymfeklier.
      1. Kijk voor de aanwezigheid van een thin cellulosehoudende capsule, als afgebeeld in figuur 1B, om deze te onderscheiden van de lymfeklier en adipeus weefsel; lymfeklieren zijn niet aaneengesloten waren met de omringende weefsel.
    9. De lymfeklier overbrengen in de lymfeklier dissectie tabel, met behulp van een kunststof dienblad voor de overdracht van weefsel, voor verdere segmenteren.
      Opmerking: Het uiterlijk van deze lymfeklieren in bison is vergelijkbaar. De bijbehorende video toont het uiterlijk van de prescapulares lymfeklier als ontleed uit de rechterschouder van een Amerikaanse bizon.
  2. Isolatie van de oorspeeksellymfklieren lymfklieren in vee en bison
    1. Beginnen door het plaatsen van het dier in de laterale lighouding op de verdieping van de necropsie. Zoek het kaakgewricht (TMJ)-gewricht.
      1. Als dit moeilijk is te vinden, de onderkaak langzaam en bepalen van de locatie waarop de onderkaak met de schedel hecht; Dit is de TMJ.
    2. Met behulp van een scalpel of necropsie mes, zorgvuldig Maak een incisie in de huid. Start de incisie dorsale op het gewricht en breiden het ventrally/verticaal langs de kaaklijn.
    3. Het ontleden van de huid weg te onthullen het subcutane weefsel. De oorspeeksellymfklieren speekselklier zal eerst zichtbaar zijn als gevolg van zijn groot lobulated oppervlak verschijning, en rode kleuring.
    4. Met behulp van Tang en een scalpel, verplaatsen de oorspeeksellymfklieren speekselklier opzij te vinden de oorspeeksellymfklieren lymfeklier zit gewoon craniale en mediale naar de speekselklier (figuur 3A). Het onderzoeken van het weefsel van de oorspeeksellymfklieren lymfeklieren voor textuur vóór verdere verwerking.
      Opmerking: lymfeklieren van het gelaat (oorspeeksellymfklieren en submandibulaire) worden geassocieerd met de speekselklieren, die het isolement van de lymfeklier verwarren kunnen. In vergelijking met de lymfeknopen, speekselklieren zijn veel groter en hebben een lobulated oppervlak uitstraling. Bovendien, op het snijvlak, speekselklieren homogeen in de natuur en geen vertonen de klassieke corticale en Wallenberg architecturale patroon van lymfklieren (figuur 3B).
    5. Accijnzen de klier met een scalpel. Overbrengen naar de lymfeklier dissectie tabel, met behulp van een kunststof dienblad voor de overdracht van weefsel, voor verdere segmenteren.
  3. Isolatie van lymfklieren in vrouwelijke runderen en bison
    1. Plaats het dier in de laterale ligcomfort.
    2. Verhoog de achterpoot om de inguïnale regio bloot en zoek de uier.
      Opmerking: In een gezonde, niet-zogende dier, palpatie van deze lymfeklieren niet mogelijk. In een zogende dier, kan deze lymfeklieren zijn voelbaar aan de caudal grens van de basis van de uier.
    3. Met behulp van een scalpel, maken een insnijding net dorsale de uier, loopt langs het bovenbeen, de klieren van de uier worden bloot te stellen.
    4. Ontleden van het subcutane weefsel en vinden de lymfeklier van de uier worden ingebed in een dunne laag van onderhuids vet. Als niet visueel te onderscheiden, palperen het blootgestelde weefsel voor de aanwezigheid van een stevige structuur binnen het subcutane vet.
    5. Zorgvuldig uit de lymfeklier van het vet met behulp van Tang en een scalpel, ontleden. Overbrengen naar de lymfeklier dissectie tabel, met behulp van een kunststof dienblad voor de overdracht van weefsel, voor verdere segmenteren.

3. afdelen en opslag van lymfklieren

  1. Passeren de geïsoleerde lymfeklieren van dissector 2 te dissector 3 aan een dissectie tafel grenzend aan de belangrijkste necropsie ruimte. Plaats elke lymfeklier op een verse gedeelte van een snijplank. Label vooraf de snijplanken in secties door lymfeklier, ter vergemakkelijking van de ontvangst van meerdere lymfklieren achter elkaar. Gebruik wegwerp trays voor infectieuze monsters.
  2. Met behulp van Tang en een wegwerp scalpel of necropsie mes, verwijder een sectie van de lymfeklier. Maak met een scherp mes een Sagittaal knippen openstellen van de lymfeklier.
  3. Het interieur van de lymfeklier, met name in specimens van besmette dieren te onderzoeken, op zoek naar asymmetrie, laesies, kleurverschillen, etc. opnemen de opmerkingen.
  4. (Optie 1) Kleine weefselsecties
    1. Gebruik wegwerp scalpels accijnzen stukken van elke lymfeklier die minder dan 5 mm in dikte en elk stuk overbrengen in een buis met een RNA behoud oplossing met schone pincet.
  5. (Optie 2) Lymfeklier biopsie of segmenteren methodologieën
    Opmerking: Biopsieën of vectorafbeeldingsbestanden methoden, wanneer toegepast op parallelle lymfeklier secties over verschillende knooppunten en dieren, bieden consistentie van gesamplede weefsel voor een bulk RNA analyse.
    1. Wig afdelen methode
      1. Na bestudering van de Sagittaal sectie voor het opvangen van cellen in het profiel van de lymfeklier, accijnzen een taart-vormige wig uit de lymfeklier, vanuit het midden naar de buitenste capsule. Voor een knooppunt 2 cm in breedte (standaardformaat; Zie tabel 1), een wig op het centrum dat is 4 mm in de buitenste booglengte gesneden en 5 mm in dikte krijgen een versgewicht van ~ 100 mg.
      2. Met behulp van de scalpel, snijd de wig in kleine stukjes, niet dikker dan 5 mm, en ongeveer 50-100 mg elke in vochtige tissues gewicht.
        Opmerking: Voor consistentie, verwerken alle wig stukken uit een enkele lymfeklier in één batch of in afzonderlijke buizen gevolgd door RNA bundelen om een representatieve RNA-Profiel van de lymfeklier van belang.
      3. Leg de stukjes van weefsel met een tang in buizen met ten minste 10 systeemvolumes van RNA behoud oplossing, in vergelijking met het volume van het weefsel.
    2. Punch biopsie methode
      1. Selecteer een gereedschap van de biopsie punch als het doel is het verzamelen van specifieke secties, zoals specifieke follikels van het knooppunt. Selecteer een gereedschap in overeenstemming met de omvang van de steekproef gewenst voor collectie. Punch biopsie tools zijn beschikbaar in een waaier van formaten, van 1 tot 8 mm in diameter.
      2. Visueel zoeken de regio's van belang zijn voor het monster in de lymfeklier.
      3. Gebruik het gereedschap van de biopsie punch accijnzen van de secties van belang op te drukken en het omdraaien van het werktuig in het weefsel te creëren van de kern. Overbrengen in het stuk weefsel met een tang een buis met ten minste 10 systeemvolumes van RNA behoud oplossing. Als dikker dan 5 mm, gebruik pincet en een scalpel om verder het weefsel in kleinere stukjes te verdelen.
  6. Zodra de monsters zijn overgedragen aan behoud oplossing (bijv., RNALater), vervoer ze terug naar het laboratorium bij kamertemperatuur.
  7. Opslaan van de monsters bij 4 ° C's nachts om weefsel penetratie mogelijk te maken.
  8. De volgende dag giet af de overtollige RNA conserveermiddel oplossing en slaan de weefselmonsters bij-80 ° C. Verwijder zoveel conserveringsmiddel mogelijk voordat de bevriezing van de monsters. Gebruik een P1000 en/of P200 micropipet-tip voor een efficiënte RNA conserveermiddel oplossing verwijderen.
    Let op: Gooi de gedecanteerde behoud-oplossing op de juiste manier, op basis van de besmettelijke eigenschappen van het pathogene agens gebruikt evenals de chemische en milieurisico's van de conserveermiddel oplossing zoals opgegeven op het veiligheidsinformatieblad.
    Opmerking: De hier gegeven richtlijnen zijn verstrekt voor de RNA behoud oplossing beschreven in de Tabel van materialen. Raadpleeg de fabrikant richtsnoeren als met behulp van alternatieve behoud oplossingen.

4. verwerking van RNA lymfklieren

Let op: Draag een laboratoriumjas, handschoenen en goede eye protection voor de verwerking stappen.

Opmerking: De fenol gebaseerde reagens gebruikt hier wordt beschreven in de Tabel van de materialen (en het protocol is gebaseerd op de richtlijnen van de fabrikant)20. Het gebruik van alternatieve fenol gebaseerde reagentia kan vergen een wijziging van de procedure, op basis van de aanbevelingen van de fabrikant voor het specifieke product gekocht.

  1. Voordat het toegang tot van de monsters, pre aliquot het gekoeld (4 ° C) fenol gebaseerde reagens homogenisering buizen (1,5 mL/buis), met behulp van een precisiepipet.
    Let op: Fenol is giftig, bijtend en een gevaar voor de gezondheid. Chloroform is giftig en een gevaar voor de gezondheid. Stappen verwerking 4.1-4.9 in een chemische zuurkast en draag handschoenen om te voorkomen dat elk contact met de chemicaliën. In de Verenigde Staten is chloroform een gevaarlijke afvalstoffen; beschikken over buizen met gevaarlijke afvalstoffen volgens lokale en institutionele richtsnoeren. Proces weefselmonsters van met ziekteverwekkers onder de overeenkomstige BSL-2, BSL-3 of BSL-4 richtsnoeren besmette dieren.
  2. Zodra een monster kan worden losgemaakt van de microcentrifuge-buizen met schone pincet, onmiddellijk overdracht ongeveer 50-100 mg van het bewaarde weefsel aan de homogenisering buis met het reagens op basis van fenol.
    1. Beperken het ontdooien voordat de toevoeging aan het reagens op basis van fenol. Opslag op droog ijs gebruiken wanneer meerdere monsters uit de vriezer voor verwerking worden verwijderd.
  3. Strak cap van de buis, plaats het op de homogenizer, en meng het monster met een rotor-stator weefsel homogenizer in het reagens op basis van fenol. Voltooi de verwerking bij kamertemperatuur. Wanneer voltooid, Controleer voor een bewolkte verschijning om ervoor te zorgen dat het monster was succesvol gehomogeniseerd; het weefsel moet worden verspreid in een bewolkt schorsing.
    Opmerking: De instelling van een 2 min RNA extractie wordt gebruikt (de voorgeprogrammeerde instelling van de RNA_02_1 voor de homogenizer beschreven in de Tabel van materialen, ontworpen voor bevroren weefsels). De rotor-stator opgegeven in dit protocol (Zie de Tabel van materialen) is groot-toothed en aangepast voor de homogenisering van allerlei weefselsoorten, met inbegrip van vezelig materiaal. De instelling van de RNA_02_01 is ontworpen specifiek voor bevroren (in tegenstelling tot vers) weefsels. Zoals lymfklieren vezelig bindweefsel componenten hebben wordt een evenzo geoptimaliseerde rotor-stator homogenizer aanbevolen om een effectieve dissociatie. Zie de National Institute of Environmental Health Sciences21 voor meer informatie over homogenisering aanbevelingen.
    1. Als grote brokken van weefsel na de homogenisering blijven, herhaalt u de procedure homogenisering. Om efficiënt herstellen het RNA, moet het weefsel goed worden losgekoppeld.
    2. Gebruik voor meer vezelige lymfeklier stukken, Tang en schaar te hakken vooraf de lymfeklier stuk in verschillende kleinere stukken vóór de overdracht aan de homogenisering buis. Zoals in de inleiding is beschreven, is er mogelijk lymfeklier weefsels van oudere dieren meer vezelige.
      Opmerking: Indien een dubbele analyse van de gastheer en ziekteverwekker RNA is gewenst, aanvullende behandeling (zoals kraal homogenisering) kan nodig zijn voor het herstel van het bacteriële RNA, vooral als de gram-positieve ziekteverwekkers zijn aanwezig in de weefsels.
  4. Onmiddellijk verwijderen van het gehomogeniseerde monster uit de tubes en het overbrengen naar RNase-vrije microcentrifuge buizen (2,0 mL in grootte) met een micropipet P1000.
  5. Centrifugeer het monster gedurende 5 minuten bij 12.000 x g bij 4 ° C tot het verwijderen van het puin van een steekproef. Gebruik een P1000 micropipet tip, overbrengen in het supernatant een verse microcentrifuge buis, de pellet achterlatend.
  6. De bovendrijvende vloeistof gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur incuberen. Splitsen van elk monster tussen twee 1,5 microcentrifuge buizen.
  7. Voeg 0,2 mL chloroform per 1 mL van het reagens op basis van fenol (d.w.z., 0.3 mL voor het monster van een 1,5 mL); omkeren het met de hand voor 1-2 min naar de fasen te mengen, maar niet niet vortex het monster. Incubeer het gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
  8. Centrifugeer het gedurende 15 minuten staan bij 12.000 x g bij 4 ° C.
  9. Verwijder voorzichtig de bovenste, heldere waterige fase met een micropipet tip (P1000 of P200) die de bovenste laag, zonder het verstoren van de interfase of de rode fenol-chloroformlaag zal vormen. Overbrengen naar een nieuwe microcentrifuge buis.
  10. Meng het met een gelijk volume van 100% ethanol; Meng het door het omkeren van de buis 4 - 5 keer. De buis verschijnt vaak bewolkt.
  11. Met een tip van micropipet, door de vloeistof te overbrengen in een commerciële spin silica gebaseerde kolom, verder te zuiveren en elueer de RNA, na22instructies van de fabrikant. Elueer de RNA gegenereerd op basis van ~ 50 mg van weefsel in 50-100 µl RNase-gratis water.
    Opmerking: Hoewel de extractie van fenol gebaseerde reagens DNA in de organische fase, voor het stroomafwaarts gebruik van RNA in qRT-PCR en/of RNA-sequencing toepassingen verwijdert, een aanvullende behandeling van RNA monsters met DNase wordt aanbevolen.
  12. Aliquot eluted RNA te scheiden van buizen voor gebruik in een kwantificering en kwaliteit beoordeling, om eventuele bevriezen-ontdooien van het belangrijkste RNA-monster. Overdracht van de buizen tot-80 ° C voor opslag.
  13. In het geval van lymfeklier monsters afkomstig zijn van dieren die besmet zijn met zoönotische pathogenen, vooral bij het beheersingsniveau BSL-3 valideren de resulterende RNA monster voor de afwezigheid van ziekteverwekkers als het monster zal worden verplaatst naar een lager niveau insluiting gebied van bioveiligheid voor de analyse van de kwaliteit, RT-PCR, en/of RNA-sequencing bibliotheek voorbereiding.
    Opmerking: Het is essentieel dat lokale regelgeving, en in het geval van de CDC (Centers for Disease Control and Prevention) inactivatie richtsnoeren voor werk met select agenten, het is noodzakelijk voor het valideren van alle inactivatie procedures op de lokale site van de onderzoeker.
    1. 1/10th volume van elk eluted RNA monster uit stap 4.12 (dat wil zeggen, 5 µl van 50 µl van het totale RNA) te verwijderen. Met behulp van een steriele techniek, meng het monster met 100 µl van bacteriële groei Bouillon in een steriele 1,5 mL microcentrifuge buis. Met behulp van een steriele kunststof strooier, verspreid het RNA-Bouillon-mengsel over het oppervlak van een agarplaat.
      Opmerking: Selecteer een bouillon type en agar plaat consistent is met de groei van het pathogene agens waarmee de dieren werden uitgedaagd.
    2. Incubeer de agarplaat onder omstandigheden die specifiek zijn voor de groei van het pathogene agens waarmee de dieren werden uitgedaagd. Het ontbreken van herstelde bacteriën controleren voordat het verwijderen van de monsters van de insluiting van BSL-3.
      Opmerking: De resulterende eluted RNA, na kwantificering en proeven van integriteit, is geschikt voor downstream toepassingen, waaronder een RNA-sequencing en RT-PCR analyse.
  14. Het beoordelen van de RNA herstel en zuiverheid met behulp van een spectrofotometer. Laden om te beoordelen van de kwaliteit van RNA, 1-2 µl van het eluted monster van het RNA tot de spectrofotometer voor een analyse. Het opnemen van een spectrum van het monster in het ultraviolette (UV) bereik.
    1. Van het UV-spectrum, het opnemen van de A260/A280 verhouding, de verhouding tussen de A260/A230 en de A260 waarde voor het monster (A = absorptie).
    2. Als single-stranded RNA bij een concentratie van 40 µg/mL een extinctie van 1.0 op 260 heeft nm, bereken de concentratie van de RNA (µg/mL) vermenigvuldigd met de A260 x 40 voor de gezuiverde monsters.
  15. Als een snelle methode voor de beoordeling van RNA betrouwbaarheid, om aangetaste monsters uitsluiten van verdere analyse, Meng 2 µl van elk monster RNA met 4 µl van 1,5 x formamide laden kleurstof [95% gedeïoniseerd formamide, 0,025% (m/v) bromophenol blauw, 0,025% (m/v) xyleen cyanol, 5 mM EDTA (pH 8.0), 0,025% (m/v) SDS] in 1,5 mL tubes microcentrifuge23,24.
  16. Verhit de buizen bij 70 ° C gedurende 1 minuut, en breng de buizen aan ijs voor 1 min.
  17. Laden van de monsters naar een 1% agarose gel bereid in 1 x TBE (Zie voor een volledige beschrijving van een inheemse agarose gelelektroforese voor RNA, Rio, Ares Jr., Hannon en Nilsen)24. Scheiden van de monsters door standaard gel elektroforese methoden en de aanwezigheid van 28 en 18S ribosomaal RNA bands bevestigen.
  18. Follow-up van de Elektroforese van het gel met kwantitatieve analysemethoden voor de bepaling van RNA integriteit [bv, een Bioanalyzer en RIN (RNA Integrity nummer) analyse], zoals beschreven in de Resultaten van de vertegenwoordiger en Mueller, O. et al. 25 en Schroeder, A. et al. 26.

5. alternatieve extractiemethode van formaline-vaste, paraffine-ingebedde (FFPE) weefsels

Opmerking: Hoewel FFPE weefsel behoud niet de meest robuuste wijze van preservatie van nucleic zuur vertegenwoordigt, kan het protocol hieronder zijn een manier om te studeren van sommige transcriptionele veranderingen wanneer andere bewaarde weefsels niet beschikbaar zijn.

  1. Formaline reagentia voorbereiden op het behoud van weefsel door verstrekking van formaline in plastic bakjes. Weefsels moeten worden bewaard in formaline met een verhouding van 20:1 formaline: weefsel volume/gewicht, respectievelijk.
    Let op: Formaline is een bekend menselijk carcinogeen en hoewel niet acuut toxisch, chronische blootstelling (meestal door middel van geïnhaleerde rook) kan vertegenwoordigen een aanzienlijk gezondheidsrisico. Goede ventilatie en PPE (dat wil zeggen, het gebruik van nitril handschoenen, worden gewijzigd binnen 15 min na de eerste blootstelling) moeten de gezondheidsrisico's te minimaliseren. Verwijzen naar de OSHA Formaldehyde Standard (29 CFR 1910.1048) voor meer informatie over controle en risico evaluatie van de blootstelling.
    Opmerking: Gebruik van te weinig formaline kan invloed hebben op het vermogen van het weefsel te worden volledig behouden wanneer ondergedompeld in conserveermiddel.
  2. Snijd na het isolement van het weefsel van belang, zorgvuldig het weefsel tot minder dan 5 mm in dikte.
    1. Het schoongemaakte weefsel met pincet, zorgvuldig worden dompelen in formaline te minimaliseren elke spatten.
      Opmerking: De weefsels moeten volledig worden ondergedompeld in formaline te voorzien in een volledige vastlegging. Het is van cruciaal belang dat alle oppervlakken van het weefsel volledig zijn bedekt met formaline.
  3. Zodra de weefsels hebben is ondergedompeld in formaline, toestaan voor de fixatie van het weefsel optreden gedurende ten minste 24 uur bij kamertemperatuur.
    Opmerking: Formaline doordringt weefsels langzaam, met een snelheid van 1 mm per uur van alle oppervlakken27,28. Daarom houden de dikte van de weefselsecties tot minder dan 5 mm resultaten in een snelle vastlegging van het hele weefsel.
  4. Na de fixatie door de weefsels te overbrengen in een geschikt reagens voor het insluiten van de paraffine.
    Opmerking: bijvoorbeeld de weefsels in dit manuscript onderzocht werden overgedragen aan 70% ethanol voorafgaand aan het insluiten.
  5. Het weefsel inbedden in paraffine. 29
  6. Afdeling van het weefsel tot 10-80 µm in dikte (gebruik 10-20 µm desgewenst miRNA is moet worden geëxtraheerd)29.
  7. Een stuk van 40 mg weefsel van elk monster te worden verwerkt en leg deze in een steriele, nuclease-gratis microfuge buis scalpel en pincet gebruikt, verwijderen.
  8. Gebruik maken van een commerciële kit ontworpen voor deparaffinization en nucleïnezuur herstel van FFPE weefselsteekproeven RNA om uit te halen de bewaarde monsters.
    Opmerking: De kit waarnaar wordt verwezen in de Tabel van de materialen maakt gebruik van xyleen en ethanol wast paraffine, een stap van de behandeling protease en een glasvezel filter voor het zuiveren van RNA verwijderen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Het gebruik van de overwegingen die in dit artikel (stappen 1-4 van het protocol) gepresenteerd zal helpen bij het herstel van RNA van grote dieren monsters die geschikt is voor een stroomafwaartse analyse in host gen expressie studies. De kwaliteit van de RNA voor downstream toepassingen wordt beoordeeld door meerdere standaard maatregelen. Spectrofotometrie, de verhouding tussen de A260/A280 biedt een zekere mate van besmetting van het eiwit en de A260/A230 verhouding biedt een ander middel van zuiverheid beoordeling dat chemische contaminanten zoals fenol detecteert. In elk geval, ratio's van ~ 2.0 zijn het bewijs van kwalitatief hoogwaardige RNA, en verminderde ratio's zijn het bewijs voor besmetting. Nog belangrijker is, deze ratio's bieden niet alle informatie over de aantasting van het RNA, die kwalitatief kan worden beoordeeld (stappen 4.15-4.17) en kwantitatief (stap 4.18, zoals via een RNA integriteit nummer of RIN score).

Het is belangrijk om er rekening mee dat het verwachte kwaliteitsniveau van RNA lymfeklier weefselsecties verhaald, gemiddeld, lager dan voor RNA boviene witte bloedcel monsters worden verhaald. In een uitgebreide reeks van RNA extracties uit weefsels van runderen en cellijnen vinden Fleige en Pfaffl30 dat het gemiddelde RIN (RNA integriteit getallen uitgedrukt op een Bioanalyzer) variëren tussen < 5 voor jejunum en pens weefsel en > 9 voor witte bloed cellen en corpus luteum, met lymfeklier RIN scores die vallen in het midden op een gemiddelde van 6,9. In het algemeen, Fleige en Pfaffl30 opmerking dat solide weefsels produceren RIN scores variërend van 6-8, en dat weefsels met hogere concentraties van bindweefsel vertonen een hogere gemiddelde degradatie. De dichtheid van bindweefsel in de lymfeklier, plus het intrinsieke niveau van RNases in deze weefseltype, kan aansprakelijk voor het onvermogen om consequent recover RNA met RIN > 9 uit lymfklieren scoort.

Een voorbeeld van een Bioanalyzer-profiel voor de RNA hersteld van een lymfeklier van de bison uier worden met behulp van de hier voorgestelde methodologie wordt echter weergegeven in figuur 4A, demonstreren van het herstel van RNA met een score van de RIN van 8.6 (voornamelijk intact en geschikt voor in wezen alle downstream-toepassingen). RNA gegenereerd op basis van deze procedure is gebruikt voor het met succes het genereren van bibliotheken voor gebruik in RNA-sequencing; Dit protocol zorgt voor de regelmatige isolatie van RNA monsters van bison en boviene lymfklieren met RIN waarden > 8 (en vaak > 9). Voor een monster set van acht uitgepakte RNA monsters, de gemiddelde Extinctieverhouding op 260 nm/280 nm was 2.1 en 260 nm/230 nm was 2.1, met vermelding van de besmetting van een laag eiwitgehalte en een lage vervuiling met chemische stoffen zoals fenol, respectievelijk. De terugwinning van de gemiddelde nucleïnezuur van elke extractie was 97 ± 10 µg per ~ 100 mg of een rendement van ~ 1 µg RNA/mg van lymfeklier weefsel.

Figure 4
Figuur 4 . Representatieve kwaliteit sporen beeltenis van RNA kwaliteit van extractie methodologieën. (A) dit paneel toont een totale RNA spoor van kwalitatief hoogwaardige RNA gegenereerd op basis van een lymfeklier bison, met behulp van de procedure in dit manuscript gepresenteerd. (B) dit paneel toont een spoor van een boviene FFPE-steekproef geselecteerd van tabel 4, beeltenis zeer gedegradeerde RNA. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. 

Als gevolg van de uitdagingen die zijn gekoppeld aan de snelle isolatie van weefsels van grote karkassen, vooral in het geval van bemonstering van vogelsoorten, de gevolgen van de vertraging tussen de euthanasie en de plaatsing van de stukjes weefsel in een RNA-behoud oplossing is van potentieel belang in de analyse. De informatie in de literatuur over de stabiliteit van RNA in lymfeklier weefsels, in het bijzonder, is beperkt. Daarom, om informatie te verstrekken over acceptabele parameters voor weefsel collectie, de stabiliteit van RNA in bison lymfeklier na euthanasie werd gekenmerkt.

Voor dit experiment, werd tijd 0 beschouwd als de tijd die het dier werd uitgesproken dood door het ontbreken van een hartslag en het ontbreken van een hoornvlies reflex. Na het transport van het karkas en het begin van de necropsie, ~ 15 min had verstreken voor het ophalen van het eerste lymfeklier monster (15-20 min was standaard in onze opmerkingen inzake de invordering van veld dieren; tijdsverloop zal variëren afhankelijk van de locatie ). De lymfeklier van de uier worden werd geïdentificeerd, en een klein deel van het weefsel werd verwijderd en op kamer temperatuur gehouden. Secties werden vervolgens ongeveer 15 min regelmatig genomen en overgedragen aan het RNA conserveermiddel; in het midden van het tijdsverloop, werd een tweede monster van de lymfeklier het dier voor de tweede reeks van 4 keer punten in de reeks (figuur 5A; gesloten cirkels, figuur 5C) opgehaald. RNA is uitgepakt parallel uit de stukken van de lymfeklier met behulp van de hierboven beschreven methode. Deze 1 h experiment blijkt dat de lymfeklier RNA het merendeel van de integriteit in de tijdsverloop, met slechts lichte reducties van de RIN score tegen het einde van het tijdsverloop (figuur 5B en 5 C behouden). Evenzo RNA van boviene prescapulares en de oorspeeksellymfklieren lymfklieren behouden de integriteit zoals gemeten door de RIN score over ~ 1 h tijd cursussen post mortem (figuur 5C; het dier informatie vindt u in tabel 2). Bovendien was RNA geëxtraheerd uit uier worden lymfeklier secties die verzameld werden 8 h na dood, hele secties in cel voedingsbodems bij beide kamertemperatuur of bij 37 ° C te simuleren het bedrijf tijd in een dierlijke karkas te houden. Ribosomaal RNA was waarneembare zelfs na 8u holding tijden (figuur 5D).

Figure 5
Figuur 5 . RNA kwaliteit in bison lymfeklier monsters verzameld over tijd cursussen na dood. (A) dit paneel toont een experimentele overzicht van een 1 uur tijd cursus procedure. (B, C) Deze panelen tonen een onderzoek naar de kwaliteit van de RNA voor monsters die zijn genomen in een 1U-tijdsverloop van een lymfeklier van de uier worden geïsoleerd uit een Amerikaanse bizon. Gel weerspiegelt RNA samples gedenatureerd in formamide en gescheiden op een 1% niet-denaturering gel. Deelvenster (C) ziet u de veranderingen in RIN scores voor elk monster. De gegevens van aanvullende experimenten op boviene prescapulares en de oorspeeksellymfklieren lymfklieren is bedekt zoals aangegeven. (D) dit deelvenster ziet u een voorbeeld van RNA gel, zoals beschreven voor de gel wordt gebruikt in deelvenster (B), voor uier worden lymfeklier monsters verwerkt na 8 uur incubatie bij beide kamertemperatuur (Lane 1) of bij 37 ° C (Lane 2) in cel voedingsbodems. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Deze representatieve bevindingen zijn consistent met RNA stabiliteit resultaten voor andere weefseltypes (HLA) en bronnen. Tabel 3 geeft een samenvatting van de resultaten van een steekproef van gepubliceerde documenten, die hebben onderzocht het RNA stabiliteit over pre behoud tijdsverloop. Opmerking dat enige trends uit RIN scores en/of rRNA gel observatie (totaal RNA) zijn opgenomen in de tabel, hoewel sommige papieren bieden een aanvullende analyse van mRNA integriteit, zoals door middel van de bepaling van de ratio's van 5' vs. 3' segmenten van de geselecteerde RNAs (b.v.Fajardy et al.) 31. het is echter belangrijk om te onthouden dat langere tijden tussen de dood en monster behoud leiden veranderingen in het RNA expressieprofielen tot kunnen, zoals aangetoond, bijvoorbeeld voor de placenta weefsel31. Vergeleken met stabiele afschriften, kunnen meer instabiele RNAs worden uitgeput. Daarom is het belangrijk om gebruik te maken van een snelle en gestroomlijnde workflow voor het herstel van het weefsel teneinde vertraging zodra het dier beschikbaar voor necropsie, is met het oog op de meest biologisch geldig RNA-profielen. Het zou een vergissing zijn om te veronderstellen dat de aanwezigheid van intact ribosomaal RNA de afwezigheid van eventuele wijzigingen in de transcriptoom profiel geeft. De representatieve resultaten suggereren echter dat zelfs met de verhoogde verwerking keer nodig voor grote dieren bemonstering, het mogelijk is om voor te bereiden van RNA die geschikt is voor een gen expressie analyse van monsters van de lymfeklier.

Bovendien, werd de invloed van de variabele tijd na ontdooien onderzocht; gedurende deze tijd is RNA gevoelig voor aantasting van de nucleasen aanwezig in het weefsel. De kwaliteit van de monsters van de RNA verwerkt met behulp van dit protocol met 0 of 64 min van tijd houden bij kamertemperatuur na ontdooien bij stap 4.1 werd gemeten door een score van RIN. Dit experiment toont aan dat het protocol vrij ongevoelig voor de dooi tijd, waardoor het robuust voor de verwerking van meerdere monsters (figuur 6A).

Figure 6
Figuur 6. Aanvullende analyse van RNA kwaliteitsparameters. (A) dit paneel toont de RNA-kwaliteit voor RNA gezuiverd onmiddellijk na het ontdooien (0 min) of resultaten na bedrijf voor 64 min vóór de verwerking op kamertemperatuur. De staven aan het gemiddelde van 3 stuks van het weefsel voor elke voorwaarde, ± de standaarddeviatie. Alle weefsels werden opgeslagen in een RNA conserveermiddel oplossing vóór het ontdooien, zoals beschreven in het protocol. (B) dit paneel toont een spoor van de Bioanalyzer van een steekproef uit een slecht gehomogeniseerde lymfeklier stuk met grote delen van bindweefsel. De geringe omvang van de 28 en 18S pieken, ten opzichte van de pieken in het bereik van de 5S, is duidelijk. Dit kan ook optreden als gevolg van de aantasting van het RNA, hoewel de relatief vlakke basislijn tussen het bereik van de 5S en de 18S piek als alternatief suggestief van arme extractie is; Zie Avraham, R. et al. 48 voor meer informatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Als een punt van vergelijking aan het isolement van RNA van lymfeklieren, werd een proef herstel van RNA van FFPE mesenterische lymfeklieren stukken uit vee uitgevoerd. Zoals hierboven beschreven, werden de monsters vastgesteld voor 1 week in formaline voorafgaand aan de paraffine insluiten, gevolgd door 4 maanden van opslag in paraffine bij kamertemperatuur. De weefsels zijn gesegmenteerd in vijf 10 µm secties, en met behulp van de FFPE-extractiemethode, ongeveer 62 ng/µL van RNA, per monster (± 14 ng/µL) werd teruggevonden. De absorptie ratio's op 260 nm/280 nm gemiddeld 1,9, met vermelding van een product met lage niveaus van proteïne besmetting, hoewel de A260/A230 verhoudingen ongunstige (tabel 4 waren). Merk op dat de scores RIN waargenomen voor deze monsters zeer waren laag (< 2), met vermelding van een degradatie van de RNA-producten (tabel 4Figuur 4B), overeenstemming met de beschrijving van Srinivasan et al. 45. in testen met behulp van qPCR, meestal kleine secties van RNA, of meer in het bijzonder cDNA (< 200 bp), worden versterkt. Daarom, de versterking van kleine producten nog steeds kan optreden van aangetaste monsters en qPCR analyse kan worden uitgevoerd. Bijvoorbeeld, kon een segment van het ribosomal S9-eiwit (RPS9) versterken transcriptie van deze monsters FFPE-hersteld door qPCR. De CT -waarden waren consistent over de monsters en gemiddeld 19,2 ± 1.8. Houd in gedachten de beperkingen die aanwezig zijn bij gebruik van de monsters FFPE-voorbereid, echter, zoals grotere producten niet noodzakelijkerwijs aanwezig zijn en de afbraak kan niet hebben plaatsgevonden op een uniform tarief over alle monsters. Daarom, dit materiaal kan worden gebruikt voor studies met kanttekeningen, maar significante beperkingen zijn aanwezig voor elke downstream toepassingen zoals RNA-sequencing.

Lymph Node Type Locatie Lengte Breedte Regio's bevloeid door de knooppunten
Prescapular Gewoon medial aan het gewricht van de schouder; ingebed in onderhuids vet en onder een laag spieren 1-10 cm 1,5-2 cm Huid van nek; schouder; en huid, spieren en gewrichten van de onderste borstwervels extremiteit (ref. 8)
Prefemoral (ook wel precrural genoemd) Gewoon dorsale en mediale aan het verstikken, ongeveer 12-15 cm boven de knieschijf 8-10 cm 2.5 cm Huid van de ledemaat bekken, buik en caudal delen van de thorax (ref. 8)
Retrofaryngeale Gevonden in de schouderstreek dorsale naar de farynx 4-5 cm 2-3,5 cm Tong, slijmvliezen van de mondholte, tandvlees, lippen, harde verhemelte, speekselklieren, allermeest naar de spieren van de nek
Parotide Gelegen subcutaan ventrale aan het temporomandibulair gewricht, caudal naar kauwspieren spier (ref. 8) 6-9 cm 2-3 cm Huid, subcutis, allermeest naar de spieren van het hoofd, de spieren van het oog en oor, oogleden, traanklier, de rostraal gedeelte van de neusholte
Submandibulaire (mogelijk heden 1-3) Subcutaan gelegen aan de mediale aspect van de hoek van de onderkaak, die is gekoppeld aan de speekselklieren 3-4 cm 2-3 cm Snuit, lippen, wangen, harde verhemelte, rostraal deel van de neusholte, puntje van de tong, de huid en de spieren van het hoofd (ref. 8)
Uier worden (vrouwelijke oppervlakkige inguïnale, meestal 2 aanwezig) Caudally en dorsally gevonden ten opzichte van de borstklieren 6-10 cm Uier, vulva, vestibule van de vagina, de huid op de mediale en caudal aspecten van de dij, mediale oppervlak van de poot
Scrotale (mannelijke versie van oppervlakkige inguïnale) Hieronder de prepublic pees binnen een laagje vet rond de hals van het scrotum gevonden 3-6 cm Penis, scrotum en voorhuid

Tabel 1. Overzicht van boviene oppervlakkige lymfklieren.

Beschrijving van het dier Locatie in Manuscript Leeftijd Geslacht Gezondheidstoestand
Veiligheidspolitie Bison bison Bison in video--lymfeklier herstel 5-6 yo Vrouw Gezonde
Veiligheidspolitie Bos taurus Runderen in video--lymfeklier herstel 7-8 yo Gecastreerde reu Gezonde
Bison bison voor RNA stabiliteit studie Fig. 5A-C 5-6 yo Vrouw Gezonde
Bos taurus A voor RNA stabiliteit studie Fig. 5C, Fig. 6A 7-8 yo Gecastreerde reu Gezonde
Bos taurus B voor RNA stabiliteit studie Fig. 5C 7-8 yo Gecastreerde reu Gezonde
Bos taurus voor FFPE kwaliteit studie Tabel 4, Fig. 4B 0,5 yo Gecastreerde reu Gezond (controle uit O157:H7 infectie studie)
Merk op dat de methodologie heeft geweest tweedehands voort meerdere aanvullende vee, bison en geit lymfeklier monsters, buiten die hier worden gemarkeerd.
Bovendien, we dezelfde methode gebruikt op lymfeklier verzameld van een 1,5 mo.-oude vrouwelijke kalf.

Tabel 2. Kenmerken van dieren die worden gebruikt in de pilotstudies.

Weefseltype Behoud methode Houden van de voorwaarden Afbraak conclusie Referentie
Boviene obesitas, skelet spieren, lever Snap bevriezing (vloeibare N2) 4 ° C, vacuüm verpakt weefsel Spier RNA stabieler (zelfs uit tot 8 dagen van de opslag); adipeus en lever stabiele vooral aan 24 h. zoals beoordeeld door verschijning van rRNA bands Bahar et al. (2007)32
Menselijke Colón, colorectaal carcinoom RNA behoud oplossing Kamer temp. RIN bewaard voor 2 h., maar subset van genen wijzigingen weergeven in expressie van 0,5-2 h. Yamagishi et al. (2014)33
Muis lever, milt RNA behoud oplossing of module bevriezing (droogijs drijfmest) Binnen de muis karkas (37 ° C) Milt monsters waren stabiel uit tot 1,5 h; lever monsters tentoongesteld eerdere afbraak (24% afname in RIN op 105 min.) Choi et al. (2016)34
Muis lever Geen (gehomogeniseerd vers in guanidinium kaliumthiocyanaat-fenol-chloroform) 25 ° C, 37 ° C Beperkte afbraak uit tot 4 h. bij 25 ° C, maar uitgebreide aantasting bij 37 ° C gedurende 4 h. (zoals waargenomen met behulp van RIN scores). Almeida et al. (2004)35
Menselijke ileum RNA behoud oplossing of module bevriezing 4 ° C, 37 ° C Over het algemeen stabiel op 1,5 h. bij 37 ° C; Stabiele out aan 6 h. bij 4 ° C (zoals waargenomen met behulp van RIN scores).  Merk op dat de auteurs bieden ook een samenvatting van de geselecteerde resources van de stabiliteit van de RNA in tabel S1 die als een extra verwijzing voor degenen die ook geïnteresseerd in de verdere beoordeling van het weefsel RNA integriteit literatuur dienen kan. Lee et al. (2015)36
Menselijke lever Snap bevriezing (vloeibare N2 of tolueen) Kamer temp. Afbraak waargenomen bij 1 h. (tot 0,85 ΔRIN); meer afbraak in kleinere monsters van lever dan in grotere monsters. Kap et al. (2015)37
Menselijke colorectaal carcinoom Snap bevriezing (vloeibare N2/tolueen) 4 ° C Afbraak waargenomen door 1 h.; RIN score van alleen 4.2 na 90 min. van vertraging in de bevriezing van de tijd Hong et al. (2010)38
Menselijke lever RNA behoud oplossing, ook flash bevriezing (vloeistof N2) Kamer temp, 4 ° C Monsters waren stabiel zelfs uit tot 1 overleden op ijs; afbraak waargenomen na 1 overleden op kamer temp. (maar niet na 3 h.; als waargenomen met behulp van RIN scores) Lee et al. (2013)39
Paard obesitas, skeletal muscle Snap bevriezing (vloeibare N2) 13 ° C Auteurs raden beste integriteit voor spier binnen 2 uur was.; obesitas behoud binnen 0,5 h. Aanbevolen door auteurs (zoals waargenomen door rRNA gel verschijning) Morrison et al. (2014)40
Zalm hersenen, nieren, lever, spieren RNA behoud oplossing Kamer temp. Hersenen RNA stabiel op 4-8 h.-, nier- en spier exhbiit sommige afbraak door 8 h. (gel, RIN score beide gebruikt) Seear & Sweeney (2008)41
Konijn bindweefsel (gewrichtsbanden, pezen, kraakbeen) Snap bevriezing (vloeibare N2) 4 ° C, kamer temp. Geen "openlijke" afbraak uit tot 96 h. postmortem, zoals waargenomen door rRNA gel verschijning Martsjoek et al. (1998)42
Rat hersenen, hart, longen en lever Lijkt te worden geëxtraheerd vers Binnen het karkas van de rat gehouden in 20 ° C incubator Hoogste RNA stabiliteit waargenomen in de hersenen (kon waarnemen rRNA bands uit tot 7 dagen postmortem, hoewel afbraak aanwezig was), matige stabiliteit in longen en hart, lage stabiliteit in lever; zoals opgemerkt door rRNA gel verschijning Inoue et al. (2002)43
Menselijke tonsillen, dubbele punt Met en zonder RNA behoud oplossing, vervolgens module-bevroren Kamer temp. (22 ° C), oplossing van 4 ° C RNA behoud, koud zout of ijs (0 ° C) Stabiele aan 16 h. op ijs of in RNA behoud oplossing; lichte achteruitgang op 6 of 16 h. in koude zoutoplossing of RT (gemeten door RIN scores) Micke et al. (2006)44

Tabel 3. Steekproef van eerdere bevindingen op RNA stabiliteit in post mortem weefselsteekproeven. De posten vertegenwoordigen geselecteerde manuscripten uit de literatuur op RNA stabiliteit, met een scala aan weefseltypes (HLA) vertegenwoordigd, met inbegrip van RattenUitrustingen, menselijke biopsie en veterinaire voorbeelden. De methoden voor het behoud, de wijze van opslag pre extractie en een korte samenvatting van de resultaten zijn beschikbaar voor elk van de voorbeelden. Tenzij anders aangegeven, de monsters werden opgeslagen in omstandigheden variërend van ijs tot 37 ° C, gevolgd door de module bevriezen of een infuus met RNA behoud oplossing, na tijd cursus (met andere woorden, stabiliteit was niet wordt gemeten in de aanwezigheid van een RNA behoud oplossing tijdens de incubatie, tenzij aangegeven).

Monster-ID 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Een260/A280 1.96 1.98 1.98 1,91 1.98 1.89 1.89 1,91 1.9 1,84 1,84 1.97
Een260/A230 0.67 0.14 0.19 0.26 0.61 0.69 1.33 0.11 0.21 0.39 0.1 0.44
RIN  1.6 1.1 1.3 1.2 1 1.3 2 1.1 1.2 1 1 1

Tabel 4. Vertegenwoordiger het gevolg is van RNA geïsoleerd van boviene mesenterische lymfklieren, FFPE. De tabel toont de resultaten van Spectrofotometrische en analyses van de kwaliteit van een serie van FFPE runderen lymfeklier monsters verwerkt met behulp van de methode beschreven in dit manuscript. In elk geval weerspiegelen de resultaten sterk aangetaste RNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De meerderheid van de studies van de transcriptomic en de bijbehorende protocollen richten op muis, rat of post-mortemlaesies menselijke specimens. Onderzoeken in vee en wild bieden echter een breed scala van mogelijkheden voor de karakterisering van de immuunrespons tegen ziekten, zowel als toepassing op geneesmiddelen voor diergeneeskundig gebruik en, met betrekking tot de bestrijding van zoönotische ziekten, om de volksgezondheid. Dit protocol verstrekt een overzicht van de belangrijkste overwegingen bij hoge-integriteit RNA extractie uit weefsels van grote dieren, zoals vee, bison, geiten en schapen. De grootte van de dieren, alsmede de voorwaarden voor de sample collectie, maken het herstel een uitgebreidere proces, met een langere verwerkingstijd van het post mortem dan voor muis lymfeklier herstel. Ook noodzaakt de grote omvang van deze lymfeklieren protocollen die herstellen van parallelle monsters van verschillende dieren, alsmede monsters die representatief voor de immunologische/pathologische veranderingen binnen de lymfeklier zijn. De suggesties voor sample collectie in dit protocol invoeren voor de nuttige toepassing van intact RNA alsook wat betreft de representatieve profielen op basis van de segmentering van de lymfeklier.

Als een demonstratie van het belang van een gestandaardiseerde bemonsteringsstrategie en protocol, zoals hier gepresenteerd ondervraagde we 25 papers uit de database PubMed Central, die de transcriptomes vee lymfklieren gekenmerkt. Één papier aangegeven de verwerking van een grote lymfeklier sectie in één keer, één specifieke laser vangt microdissection methoden besproken, een noemde dat een "representatief" werd bijeengezocht uit de lymfeklier, en slechts één papier46 aangegeven dat het stuk van de lymfeklier verzameld (10 mm3 in grootte) omvatte zowel de cortex en de medulla regio's. Terwijl andere papieren opgemerkt dat kleine steekproeven (over het algemeen 30-100 mg) voor RNA analyse werden verwerkt, vermeldde 84% van de papieren niet een bemonsteringsstrategie voor het verzamelen van deze stukken weefsel. Als RNA-sequencing is nog steeds relatief duur, de analyse van meerdere secties per lymfeklier is waarschijnlijk niet financieel levensvatbaar is in de meeste gevallen, vooral omdat biologische monsters meestal voor statistische analyse prioriteit hebben. Door het verzamelen van een steekproef over een wig van een sagittally verdeelde lymfeklier, wordt RNA van lymfeklier regio's rijk aan verschillende soorten immuuncellen vastgelegd in alle monsters. Dit protocol kan daarom dienen als referentie voor een gedocumenteerd en reproduceerbare bemonsteringsstrategie voor lymfeklier transcriptomics.

In de voorbereiding van RNA van weefsels zijn er meerdere belangrijke stappen voor de procedurele besluitvorming. Eerst, de methodologische literatuur is gemengd in termen van het gebruik van behoud oplossingen vs. het gebruik van flash-bevroren weefsel monsters (en latere koude temperatuur slijpen). Vooral in het geval van grote dierlijke necropsies zijn er meerdere potentiële procedurele voordelen aan het gebruik van een oplossing van behoud, dat deel uitmaakt van dit protocol. Ten eerste kunnen weefselmonsters worden opgeslagen tijdens de necropsie in behoud oplossing zonder de noodzaak om de buizen onmiddellijk overbrengen in vloeibare stikstof. Ten tweede, het gebruik van een oplossing voor behoud biedt extra bescherming vóór monster verwerking voor RNA extractie, vooral als het monster geheel of gedeeltelijk kort voordat homogenisering ontdooit. De resultaten in figuur 6A wijzen erop dat dit beschermend effect zich tot lymfeklier weefsel uitstrekt. Flash-bevroren monsters moeten daarentegen worden gehandhaafd in de bevroren toestand tot het moment van homogenisering in een buffer van fenol-bevattende. Tot slot voor veld necropsies van grote dieren, waar de vloeibare stikstof niet beschikbaar is, kunnen monsters worden opgeslagen in behoud oplossing totdat ze kunnen worden teruggebracht naar het lab.

Extra voordelen van de moleculaire componenten van de procedure die hier gepresenteerd zijn de aanwezigheid van fenol tijdens de verwerking van het oorspronkelijke weefsel, die als een desinfecterend middel tijdens het genereren van aërosolen van homogenisering voor monsters van fungeert geïnfecteerde dieren, en het gebruik van de spin kolom procedure residuele fenol en guanidine isothiocyanaat verwijderd met het monster. De representatieve resultaten tonen aan dat de procedure hoogwaardige RNA genereert zoals beoordeeld door een260/A280 en een260/A230 ratio's, gel elektroforese, en RIN scores, en is robuust in het gezicht van tijd cursus uitdagingen van vee en wild bemonstering. De koppeling van weefsel behoud (bijvoorbeeldin RNALater), homogenisering in fenol gebaseerde reagentia (bijvoorbeeldTRIzol) en silica kolom zuivering is met succes gebruikt in de literatuur naar profiel gen expressiepatronen in schapen abomasal lymfklieren besmet met gastro-intestinale nematoden46 en in de lymfeklieren van de runderen besmet met een herpesvirus47, met RIN scores groter is dan 8 en groter dan 7 in verschillende alle steekproeven, respectievelijk.

In het geval van een resulterende RNA met onaanvaardbaar RIN scores voor downstream-analyse, de volgende variabelen, die standaard voor RNA verwerking, moeten worden beoordeeld: het totale verwerking tijd post-mortem, de toestand van de weefsels, de verwerking/vertraging na ontdooien, de techniek tijdens de extractie van RNA, en de behandeling van de na extractie van RNA. De totale tijd post mortem verwerking moet vooral in het geval van weefsels die dieren dood aangetroffen, in tegenstelling tot dieren euthanized verhaald worden beoordeeld. Zoals hierboven beschreven, RNA is relatief stabiel in lymfeknopen, maar lange vertragingen in de verwerking kunnen leiden tot afbraak, vooral voor unstable afschriften. Een variabele tijd storende kon aanwezig als monsters worden vergeleken tussen karkassen die zijn gebleven in het veld voor uiteenlopende hoeveelheden tijd zijn. De conditie van het weefsel moet worden beoordeeld, omdat de afbraak van weefsel integriteit, als gevolg van pathologische veranderingen geassocieerd met infectie, de stabiliteit van het RNA kan verminderen. Bijvoorbeeld lagere RNA kwaliteit is waargenomen in de placentome van Brucella-besmette dieren na abortus (Boggiatto et al., afkomstig). De verwerking vertraging/na dooi wordt verzacht door het gebruik van behoud oplossingen, zoals beschreven in dit protocol. Er zeker van zijn dat de dikte van het weefsel stukken laag genoeg is om een goede en snelle penetratie van de conserveermiddel oplossing in het weefsel (< 5 mm dikte met behulp van het conserveringsmiddel vermeld in de Tabel van de materialen). Tijdens de extractie van RNA, de buffers mag RNase-vrij en contact met handschoenen en andere besmette onderdelen (RNases op de huid aanwezig zijn) moeten worden vermeden. Voor het slijpen van de lymfeklier weefsel, de grootste bron van potentiële RNases zal zijn in het weefsel zelf, maar het is gunstig voor het verminderen van de invoering van contaminanten in alle stadia van de procedure. Voor het afhandelen van de na extractie van RNA, zoals beschreven in het protocol, aliquot RNA samples in buizen vóór het invriezen en opslag bij-80 ° C, te elimineren de noodzaak te bevriezen-ontdooien de monsters voor een kwalitatieve en kwantitatieve analyse.

Lage rendementen in de procedure, behalve als gevolg van de afbraak van RNA monsters, kan als gevolg van een inefficiënt homogenisering van de lymfeklier weefsel bij stap 4.3 in het protocol. Opmerking dat de incubatie in een RNA behoud oplossing kan veranderen de textuur van het weefsel (verhoging van stevigheid), hoewel de meeste lymfeklier weefsels losgekoppeld effectief in pilot loopt met de grote toothed rotor-stator dissociator die hier worden beschreven. Zoals opgemerkt in stap 4.3.1, de homogenisering in fenol gebaseerde reagens moet worden herhaald als de dissociatie onvolledig is. Mortier en stamper slijpen, is gevolgd door een resuspensie van het gemalen monster in een reagens op basis van fenol een ander alternatief voor laboratoria zonder toegang tot een homogenizer met deze specificaties. Een homogenisering in wegwerp buizen kampt echter meerdere potentiële voordelen ten opzichte van het slijpen van bevroren weefsel in een mortier en een stamper, met inbegrip van een meer haalbaar en kortere workflow voor de verwerking van meerdere monsters, een gebrek aan monster verlies wanneer slijpen , geen opruimen, en geen potentiële contact met aangedreven monsters, in het geval van weefsels van besmette dieren.

Avraham et al. 48 beschrijven dat een grote 5S RNA piek in het eindproduct van RNA, gecombineerd met een lage herstel van 28 en 18S ribosomaal RNAs, een teken van een onvolledige lysis van de cellen (die op zijn beurt voor lymfeklier verwerking, kan worden als gevolg van een onvolledige dissociatie van het tiss kan zijn UE). Figuur 6B biedt een voorbeeld van een RNA-profiel gegenereerd op basis van een stuk van boviene oorspeeksellymfklieren lymfeklier die was zeer hoog in bindweefsel en deed niet effectief homogeniseren. RNA opbrengst moeten worden berekend en kan worden gecontroleerd in verschillende steekproeven in een set om te bevestigen dat soortgelijke terugvorderingen worden verkregen per mg van weefsel, en monsters voor directe vergelijking door RNA-sequentiebepaling moeten worden verwerkt in een batch, met behulp van de dezelfde homogenisering p.a. strategie voor alle monsters. Merk op dat de wig bemonstering aanpak ook helpt bij het vermijden van een verzameling van een monster dat is uitsluitend een regio van uitgebreide bindweefsel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen conflicten van belang om te vermelden. Alle onderzoek is gefinancierd met intramurale middelen uit de U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service. Alle verwijzingen naar specifieke producten worden geleverd met het oog op experimentele reproduceerbaarheid en vertegenwoordigen goedkeuring van deze producten niet door de federale overheid.

Acknowledgments

De auteurs wil James Fosse bedanken voor zijn uitstekende werk op alle videografie en video-verwerking; Michael Marti voor zijn uitstekende werk in de generatie van gedigitaliseerde vee beelden; Lilia Walther voor haar hulp bij RNA extractie en Bioanalyzer loopt; Mitch Palmer en Carly Kanipe voor hun nuttige beoordeling en feedback op lymfeklier beelden; verzorging van de dieren en de veterinaire personeel bij de nationale dier ziekte centrum voor al hun harde werk en bijstand met de veehouderij en de voorbereiding voor necropsies.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RNA preservation solution (we used RNALater for all experiments) ThermoFisher AM7020
1.5 ml or 2 ml polypropylene microcentrifuge tubes  Fisher Scientific 05-408-129
Disposable scalpels Daigger Scientific EF7281
Tissue forceps, rat tooth Fisher Scientific 12-460-117 Other tissue forceps available including curved tip, tapered edge, etc. , depends on user preference
3 mm punch biopsy needles Fisher Scientific NC9949469
Sharps container (small and transportable for necropsy) Stericycle 8900SA 1 qt. size shown here
Cutting boards or disposable trays Fisher Scientific 09-002-24A Available in a variety of sizes, depends on user preference
Personal protective equipment Varies with pathogen (gloves, respirator masks, goggles, etc.)
Phenol-based RNA extraction reagent (we used TRIzol Reagent for all experiments) ThermoFisher 15596026
Silica column-based RNA extraction kit (we used the PureLink RNA Mini kit for all experiments) ThermoFisher 12183018A Designed for up to 100 mg tissue
100% Ethanol (200 proof for molecular biology) Sigma-Aldrich E7023
Tissue homogenizer with enclosed homogenization tubes (we used the gentleMACS dissociator for all experiments) Miltenyi Biotec 130-093-235
Agarose (General, for gel electrophoresis) Sigma-Aldrich A9539
1X TBE Fisher Scientific BP24301 Can also make from scratch in the laboratory
Deionized formamide EMD Millipore S4117
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L3771
Bromophenol blue Sigma-Aldrich 114391
Xylene cyanol  Sigma-Aldrich X4126
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) Sigma-Aldrich EDS
UV-Vis Spectrophotometer (we used the NanoDrop Spectrophotometer) ThermoFisher ND-2000
Device for quantitative RNA assessment (we used the Bioanalyzer, with associated components and protocols) Agilent G2939BA
FFPE RNA extraction kit (we used the RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit for Formalin Fixed, Paraffin Embedded Tissue) ThermoFisher AM1975
Plastic spreader (L-shaped spreader) Fisher Scientific 14-665-231 Only needed for sterility testing for samples from infected animals
Necropsy knives Livestock Concepts WI-0009209

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tizioto, P. C., et al. Immunological response to single pathogen challenge with agents of the bovine respiratory disease complex: an RNA-sequence analysis of the bronchial lymph node transcriptome. PLoS One. 10, (6), e0131459 (2015).
  2. Miller, L. C., et al. Analysis of the swine tracheobronchial lymph node transcriptomic response to infection with a Chinese highly pathogenic strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. BMC Veterinary Research. 8, 208 (2012).
  3. Silva, T. M. A., Costa, E. A., Paixao, T. A., Tsolis, R. M., Santos, R. L. Laboratory animal models for brucellosis research. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 518323 (2011).
  4. Willard-Mack, C. L. Normal structure, function, and histology of the lymph nodes. Toxicologic Pathology. 34, 409-424 (2006).
  5. Elmore, S. A. Histopathology of the lymph nodes. Toxicologic Pathology. 34, (5), 425-454 (2006).
  6. Luscieti, P., Hubschmid, T. h, Cottier, H., Hess, M. W., Sobin, L. H. Human lymph node morphology as a function of age and site. Journal of Clinical Pathology. 33, (5), 454-461 (1980).
  7. Hadamitsky, C., et al. Age-dependent histoarchitectural changes in human lymph nodes: an underestimated process with clinical relevance? Journal of Anatomy. 216, (5), 556-562 (2010).
  8. Sisson, S., Grossman, J. D., Getty, R. Sisson and Grossman’s The Anatomy of Domestic Animals, Volume 1. Fifth Edition, W.B. Saunders Company. Philadelphia, PA. (1975).
  9. Olsen, S. C., Johnson, C. Comparison of abortion and infection after experimental challenge of pregnant bison and cattle with Brucella abortus strain 2308. Clinical and Vaccine Immunology. 18, (12), 2075-2078 (2011).
  10. Brichta-Harhay, D. M., et al. Microbiological analysis of bovine lymph nodes for the detection of Salmonella enterica. Journal of Food Protection. 75, (5), 854-858 (2012).
  11. Samuel, J. L., O’Boyle, D. A., Mathers, W. J., Frost, A. J. Isolation of Salmonella from mesenteric lymph nodes of healthy cattle at slaughter. Research in Veterinary Science. 28, (2), 238-241 (1980).
  12. Arthur, T. M., et al. Prevalence and characterization of Salmonella in bovine lymph nodes potentially destined for use in ground beef. Journal of Food Protection. 71, (8), 1685-1688 (2008).
  13. Cray, W. C., Moon, H. W. Experimental infection of calves and adult cattle with Escherichia coli O157:H7. Applied and Environmental Microbiology. 61, (4), 1586-1590 (1995).
  14. Thiermann, A. B. Experimental leptospiral infections in pregnant cattle with organisms of the Hebdomadis serogroup. American Journal of Veterinary Research. 43, (5), 780-784 (1982).
  15. Palmer, M. V., Waters, W. R., Whipple, D. L. Investigation of the transmission of Mycobacterium bovis from deer to cattle through indirect contact. American Journal of Veterinary Research. 65, (11), 1483-1489 (2004).
  16. Chomczynski, P. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA, and proteins from cell and tissue samples. BioTechniques. 15, (3), 532-537 (1993).
  17. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162, (1), 156-159 (1987).
  18. Vogelstein, B., Gillespie, D. Preparative and analytical purification of DNA from agarose. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, (2), 615-619 (1979).
  19. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals. American Veterinary Medical Association. https://www.avma.org/KB/Policies/Pages/Euthanasia-Guidelines.aspx. (2013).
  20. TRIzol Reagent Manual. ThermoFisher Scientific. https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf (2016).
  21. Disruption and Homogenization of Tissue for the Extraction of RNA. National Institute of Environmental Health Sciences . https://www.niehs.nih.gov/research/resources/protocols/extraction/disruption/index.cfm (2014).
  22. PureLink RNA Mini Kit Protocol . Life Technologies. https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/purelink_rna_mini_kit_man.pdf (2012).
  23. RNA Gel-loading Buffer. Cold Spring Harbor Protocols. http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/1/pdb.rec397 (2006).
  24. Rio, D. C., Ares, M. Jr, Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Nondenaturing Agarose Gel Electrophoresis of RNA. Cold Spring Harbor Protocols. (2010).
  25. Mueller, O., et al. A microfluidic system for high-speed reproducible DNA sizing and quantitation. Electrophoresis. 21, (1), 128-134 (2000).
  26. Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, (3), (2006).
  27. Suvarna, K. S., Layton, C., Bancroft, J. D. Bancroft’s Theory and Practice of Histological Techniques. Churchill Livingstone. China. (2012).
  28. Medawar, P. B. The rate of penetration of fixatives. Journal of Microscopy. 61, (1-2), 46-57 (1941).
  29. Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).
  30. Fleige, S., Pfaffl, M. W. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Molecular Aspects of Medicine. 27, 126-139 (2006).
  31. Fajardy, I., et al. Time course analysis of RNA stability in human placenta. BMC Molecular Biology. 10, (21), (2009).
  32. Bahar, B., et al. Long-term stability of RNA in post-mortem bovine skeletal muscle, liver and subcutaneous adipose tissues. BMC Molecular Biology. 8, 108 (2007).
  33. Yamagishi, A., et al. Gene profiling and bioinformatics analyses reveal time course differential gene expression in surgically resected colorectal tissues. Oncology Reports. 31, (4), 1532-1538 (2014).
  34. Choi, S., Ray, H. E., Lai, S. H., Alwood, J. S., Globus, R. K. Preservation of multiple mammalian tissues to maximize science return from ground based and spaceflight experiments. PLoS One. 11, (12), e0167391 (2016).
  35. Almeida, A., Thiery, J. P., Magdelenat, H., Radvanyi, F. Gene expression analysis by real-time reverse transcription polymerase chain reaction: influence of tissue handling. Analytical Biochemistry. 328, (2), 101-108 (2004).
  36. Lee, S. M. L., Schelcher, C., Thasler, R., Schiergens, T. S., Thasler, W. E. Pre-analytical determination of the effect of extended warm or cold ischaemia on RNA stability in the human ileum mucosa. PLoS One. 10, (9), e0138214 (2015).
  37. Kap, M., et al. The influence of tissue procurement procedures on RNA integrity, gene expression, and morphology in porcine and human liver tissue. Biopreservation and Biobanking. 13, (3), 200-206 (2015).
  38. Hong, S. H., et al. Effects of delay in the snap freezing of colorectal cancer tissues on the quality of DNA and RNA. Journal of the Korean Society of Coloproctology. 26, (5), 316-325 (2010).
  39. Lee, S. M., et al. RNA stability in human liver: comparison of different processing times, temperatures and methods. Molecular Biotechnology. 53, (1), 1-8 (2013).
  40. Morrison, P. K., et al. Post-mortem stability of RNA in skeletal muscle and adipose tissue and the tissue-specific expression of myostatin, perilipin and associated factors in the horse. PLoS One. 9, (6), e100810 (2014).
  41. Seear, P. J., Sweeney, G. E. Stability of RNA isolated from post-mortem tissues of Atlantic salmon (Salmo salar L.). Fish Physiology and Biochemistry. 34, (1), 19-24 (2008).
  42. Marchuk, L., Sciore, P., Reno, C., Frank, C. B., Hart, D. A. Postmortem stability of total RNA isolated from rabbit ligament, tendon, and cartilage. Biochimica et Biophysica Acta. 1379, (2), 171-177 (1998).
  43. Inoue, H., Kimura, A., Tuji, T. Degradation profile of mRNA in a dead rat body: basic semi-quantification study. Forensic Science International. 130, (2-3), 127-132 (2002).
  44. Micke, P., et al. Biobanking of fresh frozen tissue: RNA is stable in nonfixed surgical specimens. Laboratory Investigation. 86, (2), 202-211 (2006).
  45. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. The American Journal of Pathology. 161, (6), 1961-1971 (2002).
  46. Ahmed, A. M., et al. Variation in the ovine abomasal lymph node transcriptome between breeds known to differ in resistance to the gastrointestinal nematode. PLoS One. 10, (5), e0124823 (2015).
  47. Russell, G. C., et al. Host gene expression changes in cattle infected with Alcelaphine herpesvirus 1. Virus Research. 169, (1), 246-254 (2012).
  48. Avraham, R., et al. A highly multiplexed and sensitive RNA-seq protocol for simultaneous analysis of host and pathogen transcriptomes. Nature Protocols. 11, 1477-1491 (2016).
Verzameling en verwerking van lymfklieren uit grote dieren RNA p.a.: lymfeklier Transcriptomic Studies van grote diersoorten voorbereiden
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vrentas, C. E., Boggiatto, P. M., Schaut, R. G., Olsen, S. C. Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species. J. Vis. Exp. (135), e57195, doi:10.3791/57195 (2018).More

Vrentas, C. E., Boggiatto, P. M., Schaut, R. G., Olsen, S. C. Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species. J. Vis. Exp. (135), e57195, doi:10.3791/57195 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter