Summary
Speekselklier hypofunction is een frequente gevolg van auto-immune ziekte en straling therapie. Reproduceerbaar evaluatie van speekselklier functie in muismodellen van deze ziekten is een technische uitdaging. Hier wordt een eenvoudige methode voor nauwkeurige en reproduceerbare meting van speeksel productie in muizen beschreven.
Abstract
Patiënten met het syndroom van Sjögren, een auto-immune ziekte die de exocrine klieren, ontsteking van de speekselklier ontwikkelen en speeksel productie is gedaald. Ook is speeksel productie ernstig aangetast in patiënten die radiotherapie voor kanker van het hoofd en de nek. Knaagdier modellen, ontwikkeld om deze klinische omstandigheden, nabootsen vergemakkelijken van een goed begrip van de pathogenese van de ziekte en toestaan voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën. Daarom is de mogelijkheid om nauwkeurig, reproducibly en herhaaldelijk meten speekselklier functie in diermodellen is kritisch. Voortbouwend op de procedures die zijn beschreven in de literatuur, een methode ontwikkeld die aan deze criteria voldoet en werd gebruikt om de functie van de speekselklier bij muizen wordt geëvalueerd. Een bijkomend voordeel van deze nieuwe methode is dat het is gemakkelijk onder de knie, en weinig variatie tussen exploitant heeft. Speekselklier functie wordt geëvalueerd als de hoeveelheid (gewicht of volume) of een percentage (mL/min) speeksel in reactie op pilocarpine stimulatie geproduceerd. De verzamelde speeksel is een goede bron voor de analyses van het gehalte aan andere melkeiwitten, immunoglobulin concentraties en andere biomoleculen.
Introduction
De speekselklieren produceren speeksel in reactie op een verscheidenheid van neurologische en mechanische stimuli1. De prikkels zijn uitgevoerd door het sympathische en parasympathische zenuwstelsel aan de adrenergic en cholinerge receptoren in de klier. Pilocarpine is een cholinerge, para-sympathomimetic agent die voornamelijk op muscarinerge receptoren fungeert. In de speekselklier induceert het de productie van speeksel door te handelen op de muscarinerge acetylcholine receptor M31. Productie van speeksel na toediening van de pilocarpine is een indicator van het vermogen van de speekselklieren te reageren op de stimulatie en wordt vaak gebruikt als een maatregel van speekselklier functie.
Nauwkeurige meting van het speeksel productie is van cruciaal belang in de studie van speekselklier ziekten met inbegrip van Sjögren syndroom2 en straling schade na van hoofd en nek kanker behandeling3. Verschillende methoden zijn ontwikkeld voor het meten van de productie van speeksel in knaagdieren. Deze omvatten directe cannulation van het uitscheidingsmechanisme speeksel buis4, de collectie van speeksel uit de mondholte onder vacuüm5en collectie glazen capillairen6 of een micropipet7,-8, 9. directe cannulation van het speeksel kanaal biedt de meest nauwkeurige en zuiver speeksel. Echter, dit is een technisch uitdagende procedure, en het potentieel voor het veroorzaken van letsel ductaal uitsluit repetitieve speeksel collecties van hetzelfde dier. Het verzamelen van speeksel onder vacuüm kan leiden tot variabele resultaten te wijten aan het drogen van het speeksel uit de buis. Dit verlies is verder overdreven in muizen met verminderde speekselvloed. Glazen capillairen toe de collectie van speeksel voor latere analyses, veranderingen in de viscositeit van het speeksel uitgescheiden in de zieke staat voorkomt echter dat efficiënte vulling van het capillair. Verder kunnen probeert te vegen de mondholte voor het verzamelen van de resterende speeksel leiden tot letsel. De pipet-methode zorgt voor de complete collectie, en voor dezelfde exploitant, het is opmerkelijk consistente tussen experimenten. Om onbekende redenen blijkt deze methode echter aanzienlijke variatie tussen de verschillende exploitanten. Zodat passende vergelijkingen, wordt het daarom noodzakelijk dat dezelfde exploitant alle experimenten gerelateerd aan een specifiek project voert. Duidelijk, vertegenwoordigt dit een groot nadeel voor een laboratorium.
Om te overwinnen van deze problemen, werd een procedure uitgewerkt dat combineert speeksel vergaringsmethoden voor mens en knaagdieren gebruikt. De swab-methode, beschreven hieronder voor het meten van speeksel pilocarpine-geïnduceerde volume is eenvoudig, reproduceerbaar is, niet beïnvloed door de exploitant, en herhaaldelijk kan worden uitgevoerd in hetzelfde dier. Verder staat het verzamelen van het speeksel voor latere analyses van eiwitten, immunoglobulinen, of andere biomoleculen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het protocol hieronder beschreven werd goedgekeurd door het institutionele Animal Care en gebruik Comité en volgt de ethische richtsnoeren die zijn vastgelegd door de National Institutes of Health. Alle gegevens die in dit verslag werden gegenereerd met behulp van vrouwelijke muizen die 10-12 weken oud waren. De volgende muizenstammen werden gebruikt: C57BL/6, BALB/c, DBA1, 129S en (B6XA/J) F1. Alle muizen waren gehuisvest in barrière kooien (5 dieren per kooi) in de voorwaarden van specifieke pathogenen vrije en voeder en water ad libitum verstrekt.
1. voorbereiding
- Ter voorbereiding van een stamoplossing van pilocarpine hydrochloride, Weeg 10 mg van de stof en het ontbinden in 1.776 mL steriele isotonische zoutoplossing door vortexing, om een stamoplossing van 5.63 mg/mL. Er is geen behoefte om deze oplossing te steriliseren. Maar indien gewenst, filtreer het door een 0,2 µM filter. Bewaar deze voorraadoplossing in meerdere porties in een vriezer-80 oC voor maximaal 3 maanden. Elke bevroren voorraad is voor eenmalig gebruik. Eenmaal ontdooid, niet de oplossing pilocarpine refreeze.
- Neem 0,6 mL microfuge buizen en zorgvuldig punch een klein gaatje in de onderkant van elke buis met een verwarmde naald 18-gauge. Zet deze buizen in 2 mL tubes. De buizen moeten niet steriel.
- Met behulp van een scherpe, steriele scheermesje, cilindrische absorberend swabs snij in stukken ongeveer 2 cm in lengte. Knip elke stukje van 2 cm diagonaal om 2 conisch gevormde swabs. Plaats een doekje in elk van de 0,6 mL microfuge buizen.
- Weeg de 0,6 mL microfuge buis met het droge staafje.
- Overdracht van de muizen worden bestudeerd in een nieuwe schone kooi met flessen water. Houd de muizen zonder voedsel voor ten minste 2 uur voor de aanvang van speeksel collectie om te voorkomen dat voedseldeeltjes verontreiniging van het speeksel verzameld.
Opmerking: Het is niet nodig om te houden van 1 muis per kooi voor deze procedure. Echter, het aantal muizen in elke kooi geplaatst is afhankelijk van de instelling van de specifieke regels en voorschriften voor dierlijk gebruik. - Vlak voor het einde van 2 h, bereiden de werkoplossing pilocarpine (0.0563 mg/mL) door verdunning van de stockoplossing 100 x in een steriele zoutoplossing. Het is niet nodig om verdere filter steriliseren van deze oplossing. Houd altijd de werkoplossing pilocarpine op ijs.
Opmerking: Tabel 1 geeft de hoeveelheid pilocarpine ingespoten brandstof voor een scala van muis lichaam gewichten te geven een laatste dosis van 0.375 mg/kg lichaamsgewicht.
2. de procedure
- Weeg elke muis en bepalen van de dosering van de verdoving mix voor elke muis met behulp van tabel 1. Injecteer de eerste muis met het juiste volume van de verdoving mix door de intraperitoneaal route. Instellen van de timer voor 2 min (meeste muis stammen getest in dit protocol gaan slapen door 2 min). Zorg ervoor dat de muis is goed verdoofd door gebrek lopen wanneer geplaatst op een plat oppervlak. Als de muis nog steeds loopt, wachten op extra 2 min voordat u verdergaat met de volgende stap. Een daling van smeermiddel ophthalmic zalf toepassen op beide ogen om te voorkomen dat het drogen.
Opmerking: In tabel 1is de dosis van de verdoving mix 0.007 mL/g lichaamsgewicht. De optimaal bereik voor deze procedure is 0.006 tot 0,008 mL/g lichaamsgewicht. Echter na 4 min., als de muis is nog steeds lopen of schokkerige bewegingen, exposeren consult met de institutionele dierenarts voor het op de juiste manier het verhogen van de dosis van de verdoving. - Bepalen van de dosering van pilocarpine voor de muis met behulp van tabel 1 en injecteren van het passende bedrag door intraperitoneaal route. Instellen van de timer voor 2 min en plaats van de muis in de afdekking tube van 50 mL tot het hoofd en de oren stok uit de gesneden geraken. Plaats de buis in een hoek van 45 graden, met het hoofd naar beneden, en de ventrale oppervlak naar boven gericht. Tape de buis aan het bestuur van de procedure te houden bewegen.
Nota: Tabel 1 verstrekt dosering voor muizen meer dan 17 g, aangezien deze procedure heeft niet geprobeerd bij muizen met een gewicht van minder dan 17 g. - Aan het einde van de 2 min, zachtjes invoegen een gesloten paar micro ontrafeling van pincet in de mond en til de onderkaak naar boven om te openen van de mond. Duw de verlostang 1-2 mm verder in de mond, om ervoor te zorgen dat de tong wordt gezien rusten op de bovenste arm van de verlostang. Met een ander paar van fijne pincet, houden de vooraf gewogen droog doekje dicht bij zijn conisch uiteinde.
- Schuif de conische punt van het staafje voorzichtig in de mond. Trekken de verlostang terwijl het verlaten van het puntje van het staafje in de mondholte.
- Pak het bredere einde van het staafje uit te breiden buiten de mond en draaien zodat de maximale oppervlakte van contact met de mond. Houd het staafje in deze positie gedurende 15 minuten.
Opmerking: Dit zorgt ervoor dat het staafje in de mond voor de duur van de collectie blijft. Merk op dat de conische punt van het staafje als een wick en het bredere gedeelte van het staafje fungeert buiten de mond blijft. - Aan het einde van 15 min, zachtjes draaien van het staafje te verzamelen speeksel dat is niet geabsorbeerd en plaats het natte staafje in de 0,6 mL microfuge buis. Sluit de tube en zet deze in de 2 mL-buis geplaatst op ijs.
Opmerking: Op dit moment, de mondelinge mucosa verschijnt helemaal droog. De muis kan nu worden keerde terug naar zijn kooi voor het herstel van de verdoving. - Overdracht van de muis in de kooi. Plaats bevochtigd voedsel pellets in de kooi na speeksel collectie om te helpen sneller rehydratie.
Opmerking: De muizen wakker binnen 10 minuten na het einde van de collectie. Subcutane injectie van 0,2 mL voorverwarmde isotonische zoutoplossing kan ook worden gegeven aan het versnellen van herstel. - Ga verder met de volgende muis. Alle de muizen moeten worden gecontroleerd, totdat zij volledig zijn hersteld en zijn ambulante.
3. metingen
- Aan het einde van alle collecties, wegen de 0,6 mL buisjes met het natte staafje. Bereken het verschil tussen de versgewicht en het droge gewicht te krijgen van het gewicht van speeksel geproduceerd. Plaats de buis 0,6 mL met speeksel terug in de 2-mL-buis.
- De doppen van de 2 ml tubes afgesneden. Centrifugeer dan de 2 mL tubes voor 2 min bij 7500 x g, op 4oC in een micro-centrifuge om te herstellen van het speeksel. Het meten van de hoeveelheid speeksel verkregen met behulp van een micropipet.
- Geef de resultaten als speeksel gewicht (mg)10 meer dan 15 min of als een verhouding van speeksel gewicht (mg) / mouse lichaamsgewicht (g).
Opmerking: Als de hoeveelheid speeksel geëxtraheerd uit het staafje is gemeten, Geefderesultaten de hoeveelheid speeksel hersteld (mL) of de verhouding van speeksel volume (mL) / mouse lichaamsgewicht (g).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In de experimentele muis modelsystemen, wordt het vermogen te produceren speeksel in reactie op pilocarpine stimulatie gebruikt als een indicator van speekselklier functie. Speeksel productie werd gemeten in 11-week-oude C57BL/6 vrouwelijke muizen door de swab-methode. In figuur 1A, worden de resultaten uitgedrukt als de hoeveelheid speeksel (mg) verzamelde toenemende doses van pilocarpine na. Bij de dosis van 1 mg/kg lichaamsgewicht begonnen enkele van de muizen tentoonstellen van nood (onvrijwillige schudden en rillen). Daarom zijn hogere doseringen pilocarpine, dan 1 mg/kg lichaamsgewicht niet getest in deze studie. In figuur 1B, worden de resultaten weergegeven als de verhouding van speeksel gewicht (mg) aan het lichaamsgewicht van de muis (g). Collectief, blijkt deze gegevens een goede dosis-respons-relatie tussen pilocarpine bedrag en speeksel productie. De hoeveelheid speeksel hersteld van het staafje werd ook gemeten. Zoals blijkt uit Figuur 1 c, is er een aanzienlijke overeenstemming tussen speeksel gewicht en volume waar 1 mg van speeksel is gelijk aan 0,001 mL.
De resultaten verkregen met de swab-methode zijn vergelijkbaar met die verkregen met de pipetteermethode collectie. Figuur 2A toont dat de gemiddelde hoeveelheid speeksel verzameld door de swab-methode en de methode Pipetteer zeer vergelijkbaar is en de verschillen statistisch niet significant zijn. Figuur 2B Laten zien dat het doekje methode geen voor schatting van biomoleculen in speeksel gevolgen heeft , 2 C en 2D . In feite, in vergelijking met de pipet-methode, de methode wattenstokje toonde een over het algemeen hogere trend in de gemiddelde niveaus van totale speeksel proteïnen (figuur 2C), speeksel lysozym activiteit (figuur 2D) en speeksel IgA (2E figuur). Deze verschillen waren echter statistisch niet significant.
De hier beschreven methode voor de verzameling van speeksel is kundig voor speurder van verschillen in de hoeveelheid speeksel geproduceerd door verschillende muis stammen (Figuur 3) en de speekselklier hypofunction geïnduceerd door verschillende ziekten (Figuur 4). Figuur 3A toont resultaten van pilocarpine geïnduceerde speeksel productie van 10-12-weken oude vrouwelijke C57BL/6, DBA1/J en BALB/c en 129S6 muizen. De 129S6 muizen geproduceerd de laagste hoeveelheid speeksel in vergelijking met de andere stammen. Opgemerkt moet worden dat de verschillen in het gewicht van het lichaam van deze muizen niet significant verschillend (figuur 3B waren). Vervolgens de swab-methode werd gebruikt om te detecteren speekselklier hypofunction en twee voorbeelden worden weergegeven in Figuur 4. Figuur 4A toont een representatief resultaat van speekselklier hypofunction geïnduceerd door de activering van aangeboren immuniteit na injectie van lipopolysaccharide (LPS) (10 µg/muis, intraperitoneally). Controle muizen werden ingespoten met zoute11. LPS-behandelde muizen weergeven een aanzienlijke daling in speeksel in vergelijking met besturingselementen. Passieve overdracht van antistoffen reactief met het Sjögren syndroom antigeen A/Ro52 induceert speekselklier hypofunction en bepaalde aspecten van het Sjögren syndroom9van de Nabootsers van dit model. Zoals blijkt uit figuur 4B, muizen ingespoten met adjuvans aluin plus anti-Ro52 antilichamen samen hadden aanzienlijk lagere productie van speeksel in vergelijking met onbehandelde muizen of muizen alleen met aluin behandeld.
De swab-methode is eenvoudig te implementeren en exploitant onafhankelijk. Figuur 5 toont speeksel productie van 10-13-week-oude vrouwelijke C57BL/6 muizen, in experimenten uitgevoerd op 6 verschillende tijdstippen door 2 verschillende operatoren. Operator ben ik begonnen met slechts 2 maanden van muis ervaring hanteren terwijl Operator II 6 maanden van voorafgaande muis behandeling ervaring had, maar alleen aan de speeksel collectie methode voor één week werd ingevoerd. Deze gegevens werden gegenereerd in experimenten uitgevoerd bijna een jaar uit elkaar, met behulp van pilocarpine dosis van 0.375 mg/kg. De verhoudingen van de speeksel verkregen door beide operatoren Toon een aantal lezingen (1,84 aan 5.87). Exploitant i's experimenten omvatte een periode van 10 weken terwijl Operator II's experimenten werden uitgevoerd van meer dan 3 opeenvolgende dagen bijna een jaar later (figuur 5A). Met name de speeksel-ratio's verkregen na verloop van tijd waren niet significant verschillend (p = 0.064; Kruskal-Wallis test). Als u wilt verder vergelijken tussen exploitant variaties, de ratio's van speeksel gewicht per g lichaamsgewicht uit 3 experimenten voor elke exploitant werden gebundeld en worden weergegeven in figuur 5B. Speeksel ratio's verkregen door Operator I (gemiddelde + SEM; 4.45 + 0,152, n = 38) zijn niet significant verschillend van Operator 2 (gemiddelde + SEM; 4.21 + 0.169; n = 25; p = 0.296 door Mann-Whitney-test).
Figuur 1: speeksel productie is afhankelijk van de dosis pilocarpine. C57BL6/J muizen (11-week-oude vrouwen, 5 per groep) werden ingespoten met verschillende doses van pilocarpine (0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg en 1,0 mg/kg lichaamsgewicht) en speeksel productie voor 15 min. (A) werd gemeten resultaten worden weergegeven als mg speeksel bedrag (gemiddelde ± SEM). (B) gegevens worden weergegeven als de verhouding van de gemiddelde speeksel (mg speeksel per g muis lichaamsgewicht). (C) speeksel van 11 weken oude vrouwelijke C57BL/6 muizen (n = 5) werd verzameld door de swab-methode. Pilocarpine werd gebruikt in een dosis van 0.375 mg/kg lichaamsgewicht. De natte swabs werden gewogen voor het meten van de hoeveelheid speeksel geproduceerd in mg. Het speeksel in de swabs vervolgens door centrifugeren werd teruggevonden, en de volumes van de herstelde speeksel werden gemeten. De belangrijke overeenkomst wordt gezien tussen het gewicht van het speeksel in mg en speeksel volume in µL. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: de swab-methode heeft geen gevolgen voor de analyse van biomoleculen in speeksel. Speeksel uit 2 groepen van 11 weken oude vrouwelijke C57BL/6 muizen, (n = 5 muizen per groep), werd verzameld door de methode doekje of door de micropipet-methode. De verschillen in de gemiddelde hoeveelheid speeksel (A), gemiddelde hoeveelheden eiwit (B), betekent dat bedragen van lysozym activiteit (C), en bedoel bedragen van IgA tussen de 2 groepen zijn statistisch niet significant. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: de swab methode van speeksel collectie verschillen in base line speeksel productie worden ontdekt door verschillende muizenstammen. (A) speeksel van vrouwelijke (10-12-weken oude) muizen werden verzameld gedurende 15 minuten met behulp van een dosis pilocarpine 0.375 mg/kg lichaamsgewicht. (B) de gemiddelde lichaam gewichten tussen de groepen muizen waren niet significant verschillend. Statistische significantie werd geanalyseerd door de Kruskal-Wallis de test, gevolgd door Dunn meerdere vergelijkingen test. Een p < 0.05 werd beschouwd als een belangrijke. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: wattenstokje methode detecteert speekselklier hypofunction. (A) (B6-X A / J) F1 vrouwelijke muizen werden ingespoten met beide LPS-oplossing (0,1 mg/mL, 0,1 mL per muis, intraperitoneally) of zoutoplossing, en speeksel 26 h later werd gemeten. Een representatieve experiment toont een significant (p = 0.0079) (60%) daling van de productie van speeksel in muizen behandeld met LPS. (B) de speekselklier hypofunction werd gemeten in een experimentele muis modelsysteem voor het Sjögren-syndroom. Het model van de eerder gepubliceerde passieve overdracht voor inductie van klierweefsel dysfunctie was gebruikte4 met enkele wijzigingen. Vrouwelijke C57BL/6 muizen (10-12 weken oud) werden ingespoten met aluin adjuvans. Op dagen 14 en 20 muizen werden ingespoten met 0,05 mL konijnenserum anti-Ro52 en speeksel productie werd gemeten na 24 h. Opmerking een significant (p = 0.0003) (50%) daling van de productie van speeksel in muizen behandeld met aluin en anti-Ro52 serum. Statistische significantie werd geanalyseerd door de Kruskal-Wallis de test, gevolgd door Dunn meerdere vergelijkingen test. Een p < 0.05 werd beschouwd als een belangrijke. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: de swab-methode levert reproduceerbare resultaten na verloop van tijd (A) en tussen exploitanten (B). De swab methode toont vergelijkbare resultaten tussen twee exploitanten met verschillende lengtes van muis behandeling ervaring in meer dan een jaar experimenten. Basislijn speeksel productie in C57BL/6 vrouwelijke muizen (10-13 weken oud) werd gemeten door elke exploitant. Resultaten worden uitgedrukt als gewicht van speeksel geproduceerd (mg/g lichaamsgewicht). Datums van speeksel collectie zijn op de x-as en de resultaten van gegevens na verloop van tijd worden weergegeven (A). Elk gegevenspunt vertegenwoordigt één muis, en het aantal muizen geanalyseerd op elk tijdstip wordt weergegeven tussen haakjes. Basislijn speeksel ratio's (gemiddelde + SEM) samengevoegd uit 3 experimenten staan (B), en zijn niet significant verschillend tussen exploitanten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Speeksel productie is een complex proces en wordt beïnvloed door vele factoren. Meten van speekselklier functie in laboratoriumdieren kan dus een uitdaging. Een extra uitdaging is dat herhaalde metingen van speekselklier functie in hetzelfde dier nodig om de eerste verschijnselen van ziekte of om aan te tonen van herstel na de behandeling zijn.
De in dit verslag beschreven methode van doekje is technisch eenvoudig uit te voeren met meerdere opties zodat de gegevens vertegenwoordigen. De resultaten zijn reproduceerbaar is, met weinig variatie tussen exploitant. De methode kan detecteren een vermindering in de productie van speeksel in verschillende modellen van speekselklier dysfunctie. Een belangrijk voordeel is het gebruik van inerte, sterk absorberende polymeren en efficiënt herstel van het speeksel verzameld, zodat de meting van het speeksel biomoleculen. Een ander voordeel van deze methode is dat het mogelijk is voor het uitvoeren van deze procedure gelijktijdig in maximaal 2 muizen tegelijk door een enkele exploitant. Dit is aanzienlijk efficiënter dan sommige van de andere methoden, waar het wordt uitgevoerd in een enkele muis tegelijk.
De variabiliteit in speeksel productie metingen zijn de vloek van alle speeksel meettechnieken. U wilt minimaliseren variabiliteit, is het belangrijk om zich strikt houden aan het protocol. Kritische stappen omvatten: selecteren van hetzelfde moment van de dag voor de muizen vasten en het verzamelen van speeksel, passende dosering van verdoving en pilocarpine (tabel 1), en nauwkeurig gewicht records van droge en natte swabs. Zorgvuldige timemanagement is verplicht te stellen tot 2 muizen tegelijk voor speeksel collectie.
Zoals blijkt uit Figuur 3, is de hoeveelheid speeksel geproduceerd door muizen spanning afhankelijk. Zo nodig stam, leeftijd en geslacht gecompenseerde muizen moeten worden gebruikt als besturingselementen. Titratie van de pilocarpine dosering, voor de specifieke stam en de experimentele conditie onderzocht, wordt sterk aanbevolen. Hoewel een hogere dosis van pilocarpine dan 0,5 mg/kg verhoogde productie van speeksel induceert, om te evalueren van de klieren hypofunction, is het aanbevolen om het gebruik van een lagere dosis. Dit zorgt voor de identificatie van zelfs kleine verschillen in speeksel productie tussen de zieke en controle van muizen. Doses van 0,5 mg/kg lichaamsgewicht en 0.375 mg/kg lichaamsgewicht hebben met succes gebruikt om aan te tonen van de speekselklier hypofunction. Echter, opgemerkt moet worden dat bepaalde experimentele modelsystemen kortere of langere tijd van collectie dan die in dit protocol beschreven kunnen verlangen. Dit moet worden getest door elk laboratorium.
Een beperking van deze methode, en de meeste speeksel meetmethoden is de noodzaak voor anesthesie. Het verslag met de vacuüm methode omvat niet het gebruik van verdoving5. Echter, het ontbreken van anesthesie induceert uiteenlopende niveaus van angst bij de muizen. Zij neigen te worstelen en bijten de slang, en die op zijn beurt, speeksel productie en verzameling efficiëntie kan beïnvloeden. Isofluraan anesthesie bij ratten induceert een drop-in pilocarpine geïnduceerde speeksel productie12. Daarentegen verhoogt ketamine afscheidingen van de bronchiale en speeksel en sympathiek stimulatie13. Wij en anderen hebben met succes gebruikt de ketamine en xylazine mengsel als een verdoving voor het meten van pilocarpine geïnduceerde speeksel productie4,7,8,9. Het aanbevolen bereik voor chirurgische anesthesie is 100-200 mg/kg van ketamine en 5-16 mg/kg xylazine14. De dosis van 0.006-0,008 mL/g lichaamsgewicht gebruikt bij deze methode (overeenkomt met 60-80 mg/kg van ketamine en 6-8 mg/kg xylazine) valt in de onderkant van het aanbevolen bereik en is voldoende voor het verstrekken van een consistent niveau van immobilisatie zonder diepe verdoving .
De swab-methode werd opgericht als een alternatief voor de routinematig gebruikte micropipet methode. Het grote nadeel van de methode Pipetteer was de hoge variabiliteit tussen operator en de noodzaak om het verzamelen van speeksel uit één muis tegelijk. De swab-methode behandelt deze beide problemen. De voordelen omvatten de beperking van het aantal dieren die nodig zijn om de macht in de statistische analyses en een verhoogde efficiëntie. Vervangt katoenen wissers met inert polymeer swabs bieden een betere optie omdat katoenen wissers staan bekend om de impact van de kwantificatie van biologisch actieve moleculen15.
Gezien de eenvoud van de methode doekje en haar hoge reproduceerbaarheid tussen verschillende personen, het is te hopen dat de swab-methode beter vergelijkingen van Muismodellen tussen onderzoekers in verschillende laboratoria en instellingen zal vergemakkelijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen conflicten van belang om te vermelden.
Acknowledgments
De studie werd gesteund door een subsidie van de National Institutes of Health, National Institute van tand- en craniofaciale onderzoek (DE025030).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals for saliva collection | |||
| Pilocarpine hydrochloride | Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA | B21410 | Dilute in sterile isotonic saline. Store single use aliquots of 100X stock at -80oC |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia Mix solution | Mix 1 mL ketamine hydrochloride + 0.5 mL xylazine + 8.5 mL sterile isotonic saline in a sterile vial. Can be used for 3 months. | ||
| Zetamine (Ketamine hydrochloride) | Vet One, Boise, Idaho, USA | C3N VT1 | Stock is 100 mg/mL |
| Anased (Xylazine) | Med-Vet International, Mettawa, IL, USA | RXANASED-20 | Stock is 20 mg/mL |
| Isotonic sterile saline | Vet One, Boise, Idaho, USA | 501032 | Used as diluent |
| Artificial tears (lubricant ophthalmic ointment) | Henry Schien, Dublin, OH, USA | 48272 | Used to prevent eyes from drying during the procedure |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials for saliva collection | |||
| SalivaBio Children's swab | Salimetrics, LLC Carlsbad, CA, USA | N/A | Individually wrapped swabs |
| 50 mL polypropylene tubes | VWR, Radnor, PA, USA | 89004-364 | Cut off the bottom 1 cm of the tube. Make sure that the cut edge is smooth. |
| Microcentrifuge tubes 0.6 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-290 | Make holes in the bottom of tube with heated 18 gauge needles |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-298 | |
| Insulin Syringes with permanently attached needles | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 324702 | |
| 18 gauge regular bevel needles | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 305195 | |
| Sterile scalpel blade #11 | Integra York Inc PA, USA | 4-311 | |
| Microdissecting forceps | Roboz, Gaithersburg, MD, USA | RS-5139 | Serrated angular 0.8 mm tip, 4" length |
| Label tape | Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA | sc-224487 | |
| 3 channel timer | Amazon.com, Seattle, WA, USA | B06W2KCYVN | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo, Columbus OH, USA | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals/ reagents for inducing salivary dysfunction | |||
| LPS | Invivogen, San Deigo, CA, USA | tlrl-b5lps | Dissolve in endotoxin free water, and store stock solution at 5 mg/mL . dilute in sterile HBSS 100 ug/mL - inject 100 uL/ moue ip |
| Imject Alum adjuvant | Thermo Scientific | 77161 | Dilute 1:1 in sterile saline. Inject intraperitoneally 0.1 mL/mouse |
| Rabbit anti-Ro52 antiserum | Generated in lab | Immunization of rabbits with recombinant mouse Ro52 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals/ Kits for saliva analyses | |||
| Salivary lysozyme estimation | |||
| EnzChek Lysozyme Assay Kit | Molecular Probes, Eugene, OR, USA | E-22013 | Used as per manufacturer's instructions |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salivary IgA estimation by sandwich ELISA | |||
| Mouse IgA | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 0106-01 | Standards for sandwich ELISA - range 30 ng/mL to 0.5 ng/mL |
| Goat anti- mouse IgA unlabeled | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-01 | Coat at 1 ug/mL in bicarbonate buffer |
| Goat anti- mouse IgA HRP | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-05 | Detection antibody used at 1:4000 dilution |
| TMB substrate | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 555214 | Used as per manufacturer's instructions |
| Immulon 4HBX Microtiter 96 well plates | Thermo Scientific, Rochester, NY, USA | 3855 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salivary protein estimation | |||
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | BioRad, Hercules, CA, USA | 5000006 | For protein estimation as per manufacturer's instructions |
References
- Proctor, G. B.
- Fox, R. I. Sjögren's syndrome. Lancet. 366 (9482), 321-331 (2005).
- Eisbruch, A., Kim, H. M., Terrell, J. E., Marsh, L. H., Dawson, L. A., Ship, J. A. Xerostomia and its predictors following parotid-sparing irradiation of head-and-neck cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 50 (3), 695-704 (2001).
- Marmary, Y., Fox, P. C., Baum, B. J. Fluid secretion rates from mouse and rat parotid glands are markedly different following pilocarpine stimulation. Comp Biochem Physiol A Comp Physiol. 88 (2), 307-310 (1987).
- Lin, A. L., Johnson, D. A., Wu, Y., Wong, G., Ebersole, J. L., Yeh, C. K. Measuring short-term gamma-irradiation effects on mouse salivary gland function using a new saliva collection device. Arch Oral Biol. 46 (11), 1085-1089 (2001).
- Scofield, R. H., Asfa, S., Obeso, D., Jonsson, R., Kurien, B. T. Immunization with short peptides from the 60-kDa Ro antigen recapitulates the serological and pathological findings as well as the salivary gland dysfunction of Sjogren's syndrome. J Immunol. 175 (12), 8409-8414 (2005).
- Deshmukh, U. S., Nandula, S. R., Thimmalapura, P. R., Scindia, Y. M., Bagavant, H. Activation of innate immune responses through Toll-like receptor 3 causes a rapid loss of salivary gland function. J Oral Pathol Med. 38 (1), 42-47 (2009).
- Deshmukh, U. S., Ohyama, Y., Bagavant, H., Guo, X., Gaskin, F., Fu, S. M. Inflammatory stimuli accelerate Sjögren's syndrome-like disease in (NZB x NZW)F1 mice. Arthritis Rheum. 58 (5), 1318-1323 (2008).
- Szczerba, B. M., et al. Interaction between innate immunity and Ro52-induced antibody causes Sjögren's syndrome-like disorder in mice. Ann Rheum Dis. 75 (3), 617-622 (2016).
- Takakura, A., Moreira, T., Laitano, S., De Luca Júnior, L., Renzi, A., Menani, J. Central muscarinic receptors signal pilocarpine-induced salivation. J Dent Res. 82 (12), 993-997 (2003).
- Yao, C., et al. Lipopolysaccharide-induced elevation and secretion of interleukin-1beta in the submandibular gland of male mice. Immunology. 116 (2), 213-222 (2005).
- Knudsen, J., Nauntofte, B., Josipovic, M., Engelholm, S. A., Hyldegaard, O. Effects of isoflurane anesthesia and pilocarpine on rat parotid saliva flow. Radiat Res. 176 (1), 84-88 (2011).
- Kohrs, R., Durieux, M. E. Ketamine: teaching an old drug new tricks. Anesth Analg. 87 (5), 1186-1193 (1998).
- Cold Spring Harbor Protocols. Cold Spring Harb Protoc. , Available from: http://cshprotocols.cshlp.org/ (2006).
- Kozaki, T., Hashiguchi, N., Kaji, Y., Yasukouchi, A., Tochihara, Y. Effects of saliva collection using cotton swab on cortisol enzyme immunoassay. Eur J Appl Physiol. 107 (6), 743-746 (2009).
