Summary
בלוטת הרוק hypofunction הוא תוצאה תכופים של מחלות אוטואימוניות והקרנות. לשחזור הערכה של תפקוד בלוטת הרוק במודלים של העכבר המחלות האלה היא אתגר טכני. . הנה, מתוארת שיטה פשוטה למדידה מדויקת, לשחזור של ייצור רוק בעכברים.
Abstract
חולים עם תסמונת סיוגרן, מחלה אוטואימונית משפיע על בלוטות אקסוקרינית, לפתח דלקת בלוטת הרוק, הפחיתו ייצור רוק. באופן דומה, ייצור רוק נפגעו קשות בחולים שקיבלו טיפול קרינה עבור סרטן הראש והצוואר. מודלים מכרסמים, שפותחה כדי לחקות תנאים קליניים אלה, להקל על הבנת הפתוגנזה המחלה ולאפשר הפיתוח של אסטרטגיות טיפוליות חדשות. לכן, היכולת למדוד באופן מדויק, reproducibly ו שוב ושוב תפקוד בלוטת הרוק במודלים של בעלי חיים הוא קריטי. בונים על הליכים שתואר קודם לכן בספרות, שיטה פותחה עונה על קריטריונים אלה, שימש להערכת תפקוד בלוטת הרוק בעכברים. יתרון נוסף של שיטה חדשה היא כי זה הוא שולט בקלות, יש גרסא חדשה בין המפעיל. תפקוד בלוטת הרוק מוערך את הסכום (משקל או נפח) או קצב (mL/min) של הרוק מיוצר בתגובה לגירוי פילוקרפין. הרוק שנאספו הוא מקור טוב עבור הניתוחים של תכולת החלבון, ריכוזים בנוגדנים מולקולות אחרות.
Introduction
בלוטות הרוק לייצר רוק בתגובה למגוון גירויים נוירולוגית ועל מכניים1. הגירויים מתבצעות דרך מערכת העצבים הסימפתטית, הפארא-סימפתטי לקולטנים adrenergic, שימוש ב בלוטת. פילוקרפין הוא סוכן שימוש, פארא-sympathomimetic, אשר פועלת בעיקר על קולטנים מוסקריניים. בבלוטת הרוק, זה גורם הייצור של רוק על ידי משחק על קולטן מוסקריני M31. ייצור רוק בעקבות פילוקרפין המינהל הוא מחוון ליכולת של בלוטות הרוק להגיב לגירוי, הוא נפוץ כאמצעי של תפקוד בלוטת הרוק.
מדידה מדויקת של ייצור רוק הוא קריטי במחקר של מחלות בלוטת הרוק כולל תסמונת סיוגרן2 ופציעה קרינה בעקבות הראש והצוואר סרטן טיפול3. פותחו מספר שיטות שונות למדידת ייצור רוק בחולדות. אלה כוללות תעלות ישירה של צינור הרוק excretory4, אוסף של רוק בין חלל הפה תחת ואקום5, וכן אוסף באמצעות נימי זכוכית6 או7,micropipette8, 9. ישיר תעלות התעלה הרוק מספק ביותר רוק טהור ומדויקים. עם זאת, זהו תהליך מאתגר מבחינה טכנית, פוטנציאל גרימת חבלה ductal מונע אוספים רוק חוזרות של אותה חיה. איסוף הרוק תחת ואקום יכול להוביל לתוצאות משתנה עקב ייבוש של רוק מהצינור. אובדן זה היא מוגזמת נוספת אצל עכברים עם ריור מופחת. נימים זכוכית לאפשר את האוסף של רוק עבור ניתוחים שלאחר מכן, אולם, שינויי צמיגות של רוק מופרש במדינה נגועים מונע מילוי יעיל נים. יתרה מזאת, הניסיונות לטאטא את חלל הפה כדי לאסוף שאריות הרוק יכול להוביל לפציעה. שיטת pipet מאפשר איסוף מלאה, המפעיל אותו, זה עקביות במידה ניכרת בין ניסויים. עם זאת, מסיבות לא ידועות, שיטה זו מציגה וריאציה משמעותי בין מפעילי שונים. לכן, כדי לאפשר השוואות המתאים, הוא הופך להיות הכרחי שבו המפעיל אותו מבצע את כל הניסויים הקשורים לפרוייקט ספציפי. ברור, זה מייצג חיסרון מרכזי עבור מעבדה.
כדי להתגבר על בעיות אלה, הליך פותחה כי משלב רוק אוסף שיטות להשתמש עבור בני אדם ומכרסמים. שיטת ספוגית, המתוארים להלן למדידת נפח פילוקרפין-induced רוק פשוטה, לשחזור, לא השפיעו על ידי המפעיל, ניתן לבצע שוב ושוב על אותה חיה. בנוסף, היא מאפשרת איסוף הרוק עבור ניתוחים עוקבות של חלבונים, immunoglobulins או מולקולות אחרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקול המתואר להלן אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה ועוקבת אחרי ההנחיות מוסרית נוסדה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים. כל הנתונים שהובאו בדו ח זה נוצר על ידי שימוש בעכברים הנשי שהיו בגיל 10-12 שבועות. זני עכברים הבאים שימשו: C57BL/6, BALB/ג, DBA1, 129S ו- F1 (B6XA/J). כל העכברים היו שוכנו בכלובים מכשול (5 חיות לכל כלוב) בתנאים מסוימים ללא הפתוגן וסיפק מזון ומים ad libitum.
1. הכנה
- כדי להכין פתרון מניות של פילוקרפין הידרוכלוריד, שוקלת 10 מ ג של המתחם, להמיס ב 1.776 מ ל תמיסת סטרילית מול מאת vortexing, בכדי לתת מענה מניות של 5.63 מ"ג/מ"ל. יש צורך לעקר את הפתרון הזה. אבל, אם תסנן את זה דרך מסנן 0.2 µM. לאחסן פתרון מניות זה aliquots מרובים במקפיא-80 oC עד 3 חודשים. כל מניה קפוא הוא לשימוש יחיד. ברגע הקרת, לא להקפיא את הפתרון פילוקרפין מחדש..
- קח 0.6 מ"ל microfuge צינורות, בזהירות אגרוף חור קטן בתחתית של כל שפופרת עם מחט אל תדאגי מחוממת. הגדר הצינורות האלה לתוך צינורות 2 מ"ל. הצינורות לא צריך להיות סטרילי.
- בעזרת סכין גילוח חד, סטרילי, לחתוך גליל מטליות סופג לחתיכות בערך 2 ס מ אורך. חותכים כל חלק 2 ס מ באלכסון כדי לתת 2 מטליות בצורת חרוט. הצב ספוגית אחת בכל אחד הצינורות microfuge 0.6 מ"ל.
- שוקלים את הצינור microfuge 0.6 מ"ל המכיל הקיסם יבש.
- העברת העכברים שילמדו לתוך כלוב נקי חדש עם בקבוקי מים. לשמור על העכברים ללא מזון במשך לפחות שעתיים לפני תחילת אוסף רוק כדי למנוע חלקיקי מזון שמזהם את הרוק שנאספו.
הערה: אין צורך לשמור על העכבר 1 לכל כלוב עבור הליך זה. עם זאת, מספר עכברים להציב בכלוב כל תלוי של המוסד הספציפי החוקים והתקנות לשימוש בבעלי חיים. - קצת לפני סוף 2 h, הכן הפתרון פילוקרפין לעבוד (0.0563 mg/mL) על ידי דילול מניות פתרון x 100 בתוך תמיסת מלח סטרילית. זה לא הכרחי כדי מסנן נוסף לעקר את הפתרון הזה. שמור תמיד את הפתרון פילוקרפין עובד על קרח.
הערה: טבלה 1 נותן כמות פילוקרפין כדי להיות מוזרק למגוון רחב של משקולות גוף העכבר כדי לתת מנה הסופי של 0.375 מ"ג/ק"ג משקל גוף.
2. הליך
- שוקל כל עכבר, לקבוע את המינון של המיקס הרדמה עבור כל העכבר באמצעות טבלה 1. להזריק את העכבר הראשון עם נפח מתאים של המיקס הרדמה על ידי תוואי בקרום הבטן. לכוון את הטיימר למשך 2 דקות (רוב זני העכבר במקצועות פרוטוקול זה ללכת לישון על ידי 2 דקות). ודא כי העכבר הוא כראוי ומורדמת באמצעות חוסר הליכה כאשר מניחים על משטח שטוח. אם העכבר עדיין ללכת, לחכות 2 דקות נוספות לפני שתמשיך לשלב הבא. טיפה של משחה אופטלמולוגיות סיכה חלות על שתי העיניים כדי למנוע התייבשות.
הערה: טבלה 1, המינון של המיקס הרדמה היא 0.007 mL/גרם משקל. הטווח האופטימלי עבור הליך זה הוא במשקל הגוף כדי 0.006 0.008 מ ל/g. עם זאת, לאחר 4 דקות, אם העכבר עדיין הליכה או מציג תנועות קופצניות, התייעץ עם הוטרינר מוסדי עבור כראוי להגדיל את המינון של ההרדמה. - לקבוע את המינון של פילוקרפין אחר העכבר באמצעות טבלה 1 ולהזריק את הכמות המתאימה דרך בקרום הבטן. את הטיימר למשך 2 דקות ולהוסיף את העכבר לתוך הצינור restrainer 50 מ ל עד בראש ובאוזניים להישאר מחוץ הסוף לחתוך. הניחו את השפופרת בזווית של 45 מעלות, עם הראש למטה, ואת (גחוני) פונה כלפי מעלה. קלטת את הצינור ללוח הליך כדי למנוע את העברת.
הערה: טבלה 1 מספק המינון עבור עכברים יותר מ- 17 גרם, כמו בהליך זה ניסה לא על עכברים שקילה מתחת 17 גרם. - בסוף 2 דקות, בעדינות להוסיף זוג מיקרו לנתח מלקחיים לתוך הפה סגור והרם את הלסת התחתונה כלפי מעלה כדי לפתוח את הפה. לדחוף את המלקחיים 1-2 מ מ נוספים לתוך הפה, מוודא כי הלשון נתפסת נח על הזרוע העליונה של המלקחיים. עם עוד זוג מלקחיים בסדר, להחזיק הקיסם יבש מראש שנשקל קרוב את קצהו חרוט.
- החלק בעדינות את קצה הדגימה חרוט לתוך הפה. תיסוג המלקחיים ולהשאיר את קצה הדגימה בחלל הפה.
- לאחוז בקצה רחב יותר של הדגימה הארכת מחוץ הפה וסובב אותו כדי לאפשר מקסימום שטח המגע עם הפה. שמור את הספוגית בתנוחה זו למשך 15 דקות.
הערה: פעולה זו מבטיחה כי הדגימה נשאר בפה למשך כל האוסף. שימו לב כי קצה הדגימה חרוט משמש הפתיל, החלק הרחב של הדגימה, נותר מחוץ לפה. - בסוף 15 דקות, בעדינות לסובב הדגימה כדי לאסוף את כל רוק זה לא נספג ולמקם את הספוגית לחה בצינור microfuge 0.6 מ"ל. לסגור את הצינור ולהגדיר אותו בצינור 2 מ"ל על קרח.
הערה: בשלב זה, הרירית האוראלית יופיעו יבש לחלוטין. העכבר עכשיו ניתן להעביר בחזרה לכלוב שלו ההתאוששות מן ההרדמה. - להעביר את העכבר בתוך הכלוב. המקום לחלח באוכל שלהן בכלוב אחרי אוסף רוק כדי לסייע מהיר התייבשות.
הערה: העכברים להתעורר בתוך 10 דקות לאחר הסיום של האוסף. הזרקה תת עורית של 0.2 מ"ל תמיסת מלח מול ומחוממת מראש יכול להינתן גם כדי להאיץ את ההחלמה. - להמשיך העכבר הבאה. כל העכברים צריכים להיות במעקב עד הם התאוששו לגמרי, הן פעולות כירורגיות.
3. מדידות
- בסוף כל האוספים, לשקול את צינורות 0.6 מ"ל עם הדגימה רטוב. חישוב ההפרש בין משקל רטוב משקל יבש כדי לקבל את המשקל של הרוק מיוצר. מקם את הצינור 0.6 מ"ל עם הרוק בחזרה לתוך הצינור 2-mL.
- חתוך את הפקקים של הצינורות 2 מ"ל. לאחר מכן, centrifuge את צינורות 2 מ"ל למשך 2 דקות ב g 7500 x, ב 4oC ומפרידה מיקרו לשחזר את הרוק. למדוד את עוצמת הקול של הרוק תוך שימוש micropipette.
- לבטא את התוצאות כמו רוק משקל (מ ג)10 מעל 15 דקות או כיחס של רוק משקל (מ ג) / עכבר משקל הגוף (g).
הערה: אם יש כבר למדוד הנפח של רוק חולצו מתוך הדגימה, לבטא את התוצאות כמות הרוק התאושש (mL) או היחס בין נפח רוק (mL) / עכבר משקל הגוף (g).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במערכות דגם ניסיוני העכבר, היכולת לייצר רוק בתגובה לגירוי פילוקרפין משמש כמחוון של תפקוד בלוטת הרוק. ייצור רוק נמדדה בעכברים נקבה בת 11 בשבוע C57BL/6 בשיטת ספוגית. ב- איור 1A, התוצאות מבוטא את כמות הרוק (מ ג) שנאספו בעקבות הגדלת מינון של פילוקרפין. במינון של 1 מ"ג/ק"ג משקל גוף, חלק העכברים התחיל מפגין מצוקה (באופן לא רצוני רועד רועד). ומכאן מינונים גבוהים יותר של פילוקרפין, מעבר 1 מ"ג/ק"ג משקל גוף לא נבדקו במחקר זה. ב- איור 1B, התוצאות מיוצגים כיחס בין רוק משקל (מ ג) למשקל הגוף העכבר (g). באופן קולקטיבי, נתונים אלה מראים קשר תגובה מינון גבוה בין ייצור כמות ורוק פילוקרפין. הנפח של רוק התאוששה הדגימה נמדדה גם. כפי שמוצג באיור 1C, יש הקונקורדנציה משמעותי בין רוק ונפח איפה 1 מ ג של רוק שווה ל- 0.001 mL.
התוצאות המתקבלות באמצעות שיטת ספוגית דומים לאלו שהושגו באמצעות שיטת איסוף פיפטה. איור 2A מראה כמות הרוק שנאספו על ידי שיטת ספוגית ושיטת pipet רשע דומה מאוד ההבדלים אינם סטטיסטית משמעותית. איור 2B 2 ג ו- 2D מראים כי השיטה ספוגית לא משפיעים שערוך של מולקולות ברוק. למעשה, לעומת שיטת pipet, השיטה ספוגית הראה על המגמה הכללית גבוהה יותר של רמות אכזרי של חלבון הרוק הכולל (איור 2C), פעילות ליזוזים הרוק (איור דו-ממדי) איגה הרוק (איור 2E). עם זאת, הבדלים אלה מבחינה סטטיסטית לא היו משמעותיים.
אוסף רוק השיטה המתוארת כאן הוא יכול לזהות את ההבדלים בין הרוק מיוצר על ידי העכבר שונים זנים (איור 3), בלוטת הרוק hypofunction המושרה על ידי תנאים מחלות שונות (איור 4). איור 3A מציג תוצאות של ייצור רוק פילוקרפין המושרה עכברים C57BL/6, BALB/ג, DBA1/J ו- 129S6 נשים 10-12-בת שבוע. העכברים 129S6 המיוצר הסכום הנמוך ביותר של הרוק לעומת זנים אחרים. יצוין, כי ההבדלים משקלי גוף אלו עכברים היו לא שונה באופן משמעותי (איור 3B). בשלב הבא, השיטה ספוגית שימש כדי לזהות בלוטת הרוק hypofunction, שתי דוגמאות מוצגות באיור4. איור 4A מראה תוצאה נציג של בלוטת הרוק hypofunction המושרה על ידי הפעלת מולדת חסינות לאחר ההזרקה של ליפופוליסכריד (LPS) (µg 10/עכבר, intraperitoneally). בקרת עכברים הוזרקו מלוחים11. עכברים שטופלו LPS מראים ירידה משמעותית רוק לעומת שולט. העברה פסיבית של נוגדנים תגובתי עם תסמונת אנטיגן סיוגרן A/Ro52 גורם בלוטת הרוק hypofunction, מודל זה מחקה היבטים מסוימים של תסמונת סיוגרן9. כפי שמוצג באיור 4B, עכברים הזריק אדג'וונט אלום פלוס נוגדנים anti-Ro52 ביחד היה ייצור רוק נמוך באופן משמעותי בהשוואה לעכברים שלא טופלו או עכברים שטופלו רק אלום.
השיטה ספוגית היא פשוט ליישם מפעיל עצמאי. איור 5 מציג ייצור הרוק הנשי 10-13-בת שבוע עכברים C57BL/6, בנסויים שנערכו בנקודות זמן שונות 6 באמצעות אופרטורים שונים 2. אופרטור התחלתי עם רק 2 חודשים של העכבר טיפול ניסיון בעוד המפעיל השני היה 6 חודשים של העכבר מוקדמת טיפול ניסיון, אבל הוצג רק לשיטת אוסף רוק למשך שבוע. נתונים אלה נוצרו בניסויים ביצעו כמעט שנה בנפרד, שימוש במינון פילוקרפין 0.375 מ"ג/ק"ג. היחס רוק מתקבל על ידי שני אופרטורים להציג טווח של קריאות (1.84 כדי 5.87). אופרטור של הניסויים המורחב תקופה של 10 שבועות בזמן הניסויים של המפעיל השני בוצעו מעל 3 ימים רצופים כמעט שנה לאחר מכן (איור 5A). ראוי לציין, היחס רוק שהושג לאורך זמן לא היו שונים באופן משמעותי (p = 0.064; מבחן Kruskal-Wallis). כדי עוד יותר להשוות בין המפעיל הספציפיים, היחס של רוק משקל לכל גרם משקל של ניסויים 3 עבור כל אופרטור היו איחדו, מוצגות באיור איור 5B. רוק יחסי שהושג על-ידי המפעיל (ממוצע + SEM; 4.45 + 0.152, n = 38) אינם שונים באופן משמעותי מפעיל 2 (ממוצע + SEM; 4.21 + 0.169; n = 25; p = 0.296 על ידי מבחן מאן ויטני).
איור 1: ייצור רוק תלויה במינון פילוקרפין. C57BL6/J עכברים (נקבות בת 11 בשבוע, 5 לכל קבוצה) הוזרקו מינונים שונים של פילוקרפין (משקל 0.25 מ"ג/ק"ג, 0.5 מ"ג/ק"ג, 1.0 מ"ג/ק"ג גוף), ייצור רוק נמדדה במשך 15 דקות (א) תוצאות מיוצגים כסכום רוק מ ג (זאת אומרת ± SEM). (B) הנתונים מיוצגים כמו רוק רשע יחס (רוק מ"ג לכל גרם משקל העכבר). (ג) רוק של עכברים C57BL/6 נקבה בת 11 בשבוע (n = 5) נאסף ע י שיטת ספוגית. פילוקרפין נעשה שימוש במינון של 0.375 מ"ג/ק"ג משקל גוף. הושארו רטוב נשקלו כדי למדוד את כמות הרוק מיוצר מ ג. הרוק בהושארו נמצאה לאחר מכן על ידי צנטריפוגה ולאחר הכרכים של הרוק התאושש נמדדו. ההסכם משמעותי נתפסת בין המשקל רוק בכרך מ"ג ו רוק µL. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: שיטת ספוגית לא משפיע על הניתוח של מולקולות ברוק. רוק של 2 קבוצות של עכברים C57BL/6 נקבה בת 11 בשבוע, (n = 5 עכברים לכל קבוצה), נאספה בשיטת ספוגית או באמצעות פעולת השירות micropipet. ההבדלים רשע כרכים של רוק (א), כלומר בכמות החלבון (B), מתכוון כמויות של פעילות ליזוזים (C), ואני מתכוון כמויות האיגה בין 2 הקבוצות אינן סטטיסטית משמעותית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: שיטת ספוגית של אוסף רוק מזהה הבדלים בייצור הרוק קו הבסיס על ידי זנים שונים של עכברים. (א) רוק של עכברים (10-12-בת שבוע) נקבה שנאספו במשך 15 דקות באמצעות מנה פילוקרפין של 0.375 מ"ג/ק"ג משקל גוף. (B) משקולות הגוף אומר בין הקבוצות של עכברים לא היו שונים באופן משמעותי. מובהקות סטטיסטית נותחו על ידי Kruskal-איי ווליס מבחן, ואחריו דאן של מבחן השוואות מרובות. P < 0.05 נחשב משמעותי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: שיטת ספוגית מזהה בלוטת הרוק hypofunction. (א) (B6 X A / J) עכברים הנשי F1 הוזרק גם פתרון LPS (0.1 mg/mL, mL 0.1 לכל עכבר, intraperitoneally) או תמיסת מלח, ורוק נמדדה 26 h מאוחר יותר. ניסוי נציג מראה משמעותי (p = 0.0079) ירידה (60%) בייצור הרוק עכברים שטופלו LPS. (B) בלוטת הרוק hypofunction נמדדה במערכת מודל ניסיוני העכבר לתסמונת סיוגרן. המודל העברה פסיבית שפורסמו קודם לכן עבור אינדוקציה של תפקוד הבלוטות היה בשימוש4 עם כמה שינויים. C57BL/6 נקבות עכברים (בן 10-12 שבועות) הוזרקו אדג'וונט אלום. בימים 14 ו- 20 עכברים הוזרקו 0.05 מ של הארנב סרום אנטי-Ro52, ייצור רוק נמדדה אחרי ה 24 הערה משמעותי (p = 0.0003) טיפה (50%) בייצור הרוק עכברים שטופלו סרום אלום ו anti-Ro52. מובהקות סטטיסטית נותחו על ידי Kruskal-איי ווליס מבחן, ואחריו דאן של מבחן השוואות מרובות. P < 0.05 נחשב משמעותי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: השיטה ספוגית מניבה תוצאות לשחזור לאורך זמן (א) ובין מפעילי (B). השיטה ספוגית מראה תוצאות דומות בין שני אופרטורים בעלי אורכים שונים של העכבר טיפול ניסיון בניסויים שבוצעו על שנה אחת. ייצור רוק בסיסית בעכברים הנשי C57BL/6 (מגיל 10-13 שבועות) נמדדה על ידי כל אופרטור. תוצאות מבוטא משקל של הרוק מיוצר (מ ג/גרם משקל). תאריכים של אוסף רוק בציר ה-x, מוצגות התוצאות של הנתונים שנאספו לאורך זמן (א). כל נקודת נתונים מייצג עכבר אחד, מספר עכברים ניתח כל הזמן מוצג בסוגריים. בסיסית רוק יחסי (ממוצע + SEM) איחדו בין 3 ניסויים מוצגים (B), והם אינם שונים באופן משמעותי בין מפעילי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ייצור רוק הוא תהליך מורכב, מושפע מגורמים רבים. לכן, מדידת תפקוד בלוטת הרוק בחיות מעבדה עשויה להיות אתגר. אתגר נוסף הוא כי מדידות חוזרות של תפקוד בלוטת הרוק אצל אותה חיה נדרשים להקים תחילתה של מחלה או להפגין התאוששות לאחר הטיפול.
השיטה ספוגית שתוארו בדו ח זה פשוטה מבחינה טכנית לבצע עם אפשרויות מרובות כדי לייצג את הנתונים. התוצאות המתקבלות הן לשחזור, עם הבין-מפעיל גרסא חדשה. השיטה יכול לזהות ירידה בייצור הרוק מודלים שונים של תפקוד לקוי של בלוטת הרוק. יתרון משמעותי הוא השימוש של פולימרים אינרטי, סופג מאוד שחזור יעיל של רוק שנאספו, המאפשר מדידה של מולקולות הרוק. יתרון נוסף של שיטה זו הוא שניתן לבצע את הליך בו זמנית בעכברים עד 2 בכל פעם על-ידי מפעיל יחיד. זה באופן משמעותי יעיל יותר חלק מהשיטות האחרות, איפה זה מתבצע בעכבר אחת בכל פעם.
ההשתנות במדידות ייצור רוק היה שונא את כל טכניקות מדידה של הרוק. כדי למזער את השתנות, חשוב לדבוק בקפדנות הפרוטוקול. שלבים קריטיים כוללים: בחירה זמנית של היום צום העכברים ואיסוף רוק, המתאים מינון תרופות להרדמה פילוקרפין (טבלה 1), ואת משקל מדויק הרשומות של דגימות רטובה ויבשה. ניהול זמן זהירות נדרשת כדי להגדיר עד שני עברים בכל פעם עבור אוסף רוק.
כפי שמוצג באיור3, הסכום של הרוק מיוצר על ידי עכברים הוא זן התלויים. לכן, מתאים למתח, גיל ומין עכברים תואמים אמור לשמש כפקדי. טיטור של המינון פילוקרפין, המתח ספציפיים, התנאי ניסיוני בחקירה, מומלץ בחום. למרות מינון גבוה יותר של פילוקרפין מעבר 0.5 מ"ג/ק"ג גורם ייצור מוגבר של רוק, כדי להעריך את הבלוטות hypofunction, מומלץ להשתמש במינון נמוך. דבר זה מאפשר זיהוי הבדלים משניים אפילו בייצור רוק בין חולה ולשלוט עכברים. מינונים של 0.5 מ"ג/ק"ג משקל גוף, 0.375 מ"ג/ק"ג משקל גוף שימשו בהצלחה להפגין בלוטת הרוק hypofunction. עם זאת, יצוין כי מערכות דגם ניסיוני מסוימים עשויים לדרוש תקופות ארוכה או קצרה יותר של אוסף מזה המתואר פרוטוקול זה. זה צריך להיבדק על ידי כל מעבדה.
מגבלה של שיטה זו, רוב שיטות מדידה רוק הוא בצורך בהרדמה. הדו ח באמצעות שיטת ואקום אינו כולל את השימוש הרדמה5. עם זאת, היעדר הרדמה גורם רמות משתנות של חרדה בעכברים. הם נוטים המאבק ולנשוך את הצנרור, זה בתורו, יכול להשפיע על יעילות פלט ואוסף רוק. איזופלוריין הרדמה אצל חולדות גורם הייצור12רוק פילוקרפין המושרה פתע. לעומת זאת, קטמין מגביר הפרשות הסמפונות, הרוק באמצעות גירוי אוהד13. אנחנו ואחרים השתמשו בהצלחה של קטמין, חריגות השירותים הווטרינריים תערובת כחומר הרדמה למדידת פילוקרפין המושרה רוק ייצור4,7,8,9. הטווח המומלץ עבור ניתוח בהרדמה הוא 100-200 מ"ג/ק"ג של קטמין ו- 5-16 מ"ג/ק"ג של חריגות השירותים הווטרינריים14. המינון של 0.006-0.008 מ ל/גרם משקל בשימוש בשיטה זו (מקביל 60-80 מ"ג/ק"ג של קטמין ו- 6-8 מ"ג/ק"ג של חריגות השירותים הווטרינריים) נופל על הקצה התחתון של הטווח המומלץ, מספיקה למתן רמה אחידה של קיבעון ללא הרדמה עמוקה .
השיטה ספוגית הוקמה כחלופה לשיטה micropipet בשימוש שגרתי. החיסרון העיקרי של שיטת pipet היה ההשתנות הגבוהה בין המפעיל לבין הצורך לאסוף רוק עכבר אחד בכל פעם. השיטה ספוגית מטפל בשתי בעיות אלה. היתרונות כוללים הגבלה של מספר בעלי חיים הדרושים כדי להשיג כוח ניתוחים סטטיסטיים, התייעלות. ספוגיות כותנה בהחלפה עם פולימר אינרטי מטליות מציעים אפשרות טובה יותר מאז ספוגיות כותנה ידועים לפגיעה כימות של מולקולות פעילים ביולוגית-15.
לאור הפשטות של השיטה ספוגית, שלה הפארמצבטית גבוהה בין אנשים שונים, יש לקוות כי השיטה ספוגית יקל יותר השוואות של דגמי העכבר בין חוקרים במעבדות שונות ומוסדות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.
Acknowledgments
המחקר נתמך על ידי מענק של מכוני הבריאות הלאומיים, הלאומית המכון של שיניים ומחקר ואסטתיים (DE025030).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals for saliva collection | |||
| Pilocarpine hydrochloride | Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA | B21410 | Dilute in sterile isotonic saline. Store single use aliquots of 100X stock at -80oC |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia Mix solution | Mix 1 mL ketamine hydrochloride + 0.5 mL xylazine + 8.5 mL sterile isotonic saline in a sterile vial. Can be used for 3 months. | ||
| Zetamine (Ketamine hydrochloride) | Vet One, Boise, Idaho, USA | C3N VT1 | Stock is 100 mg/mL |
| Anased (Xylazine) | Med-Vet International, Mettawa, IL, USA | RXANASED-20 | Stock is 20 mg/mL |
| Isotonic sterile saline | Vet One, Boise, Idaho, USA | 501032 | Used as diluent |
| Artificial tears (lubricant ophthalmic ointment) | Henry Schien, Dublin, OH, USA | 48272 | Used to prevent eyes from drying during the procedure |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials for saliva collection | |||
| SalivaBio Children's swab | Salimetrics, LLC Carlsbad, CA, USA | N/A | Individually wrapped swabs |
| 50 mL polypropylene tubes | VWR, Radnor, PA, USA | 89004-364 | Cut off the bottom 1 cm of the tube. Make sure that the cut edge is smooth. |
| Microcentrifuge tubes 0.6 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-290 | Make holes in the bottom of tube with heated 18 gauge needles |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-298 | |
| Insulin Syringes with permanently attached needles | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 324702 | |
| 18 gauge regular bevel needles | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 305195 | |
| Sterile scalpel blade #11 | Integra York Inc PA, USA | 4-311 | |
| Microdissecting forceps | Roboz, Gaithersburg, MD, USA | RS-5139 | Serrated angular 0.8 mm tip, 4" length |
| Label tape | Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA | sc-224487 | |
| 3 channel timer | Amazon.com, Seattle, WA, USA | B06W2KCYVN | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo, Columbus OH, USA | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals/ reagents for inducing salivary dysfunction | |||
| LPS | Invivogen, San Deigo, CA, USA | tlrl-b5lps | Dissolve in endotoxin free water, and store stock solution at 5 mg/mL . dilute in sterile HBSS 100 ug/mL - inject 100 uL/ moue ip |
| Imject Alum adjuvant | Thermo Scientific | 77161 | Dilute 1:1 in sterile saline. Inject intraperitoneally 0.1 mL/mouse |
| Rabbit anti-Ro52 antiserum | Generated in lab | Immunization of rabbits with recombinant mouse Ro52 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals/ Kits for saliva analyses | |||
| Salivary lysozyme estimation | |||
| EnzChek Lysozyme Assay Kit | Molecular Probes, Eugene, OR, USA | E-22013 | Used as per manufacturer's instructions |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salivary IgA estimation by sandwich ELISA | |||
| Mouse IgA | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 0106-01 | Standards for sandwich ELISA - range 30 ng/mL to 0.5 ng/mL |
| Goat anti- mouse IgA unlabeled | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-01 | Coat at 1 ug/mL in bicarbonate buffer |
| Goat anti- mouse IgA HRP | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-05 | Detection antibody used at 1:4000 dilution |
| TMB substrate | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 555214 | Used as per manufacturer's instructions |
| Immulon 4HBX Microtiter 96 well plates | Thermo Scientific, Rochester, NY, USA | 3855 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salivary protein estimation | |||
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | BioRad, Hercules, CA, USA | 5000006 | For protein estimation as per manufacturer's instructions |
References
- Proctor, G. B.
- Fox, R. I. Sjögren's syndrome. Lancet. 366 (9482), 321-331 (2005).
- Eisbruch, A., Kim, H. M., Terrell, J. E., Marsh, L. H., Dawson, L. A., Ship, J. A. Xerostomia and its predictors following parotid-sparing irradiation of head-and-neck cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 50 (3), 695-704 (2001).
- Marmary, Y., Fox, P. C., Baum, B. J. Fluid secretion rates from mouse and rat parotid glands are markedly different following pilocarpine stimulation. Comp Biochem Physiol A Comp Physiol. 88 (2), 307-310 (1987).
- Lin, A. L., Johnson, D. A., Wu, Y., Wong, G., Ebersole, J. L., Yeh, C. K. Measuring short-term gamma-irradiation effects on mouse salivary gland function using a new saliva collection device. Arch Oral Biol. 46 (11), 1085-1089 (2001).
- Scofield, R. H., Asfa, S., Obeso, D., Jonsson, R., Kurien, B. T. Immunization with short peptides from the 60-kDa Ro antigen recapitulates the serological and pathological findings as well as the salivary gland dysfunction of Sjogren's syndrome. J Immunol. 175 (12), 8409-8414 (2005).
- Deshmukh, U. S., Nandula, S. R., Thimmalapura, P. R., Scindia, Y. M., Bagavant, H. Activation of innate immune responses through Toll-like receptor 3 causes a rapid loss of salivary gland function. J Oral Pathol Med. 38 (1), 42-47 (2009).
- Deshmukh, U. S., Ohyama, Y., Bagavant, H., Guo, X., Gaskin, F., Fu, S. M. Inflammatory stimuli accelerate Sjögren's syndrome-like disease in (NZB x NZW)F1 mice. Arthritis Rheum. 58 (5), 1318-1323 (2008).
- Szczerba, B. M., et al. Interaction between innate immunity and Ro52-induced antibody causes Sjögren's syndrome-like disorder in mice. Ann Rheum Dis. 75 (3), 617-622 (2016).
- Takakura, A., Moreira, T., Laitano, S., De Luca Júnior, L., Renzi, A., Menani, J. Central muscarinic receptors signal pilocarpine-induced salivation. J Dent Res. 82 (12), 993-997 (2003).
- Yao, C., et al. Lipopolysaccharide-induced elevation and secretion of interleukin-1beta in the submandibular gland of male mice. Immunology. 116 (2), 213-222 (2005).
- Knudsen, J., Nauntofte, B., Josipovic, M., Engelholm, S. A., Hyldegaard, O. Effects of isoflurane anesthesia and pilocarpine on rat parotid saliva flow. Radiat Res. 176 (1), 84-88 (2011).
- Kohrs, R., Durieux, M. E. Ketamine: teaching an old drug new tricks. Anesth Analg. 87 (5), 1186-1193 (1998).
- Cold Spring Harbor Protocols. Cold Spring Harb Protoc. , Available from: http://cshprotocols.cshlp.org/ (2006).
- Kozaki, T., Hashiguchi, N., Kaji, Y., Yasukouchi, A., Tochihara, Y. Effects of saliva collection using cotton swab on cortisol enzyme immunoassay. Eur J Appl Physiol. 107 (6), 743-746 (2009).
