Summary
Ipofunzione della ghiandola salivaria è una frequente conseguenza di autoimmune malattia e radioterapia. Riproducibile valutazione della funzione della ghiandola salivaria in modelli murini di queste malattie è una sfida tecnica. Qui, è descritto un metodo semplice per la misurazione accurata e riproducibile della produzione di saliva nei topi.
Abstract
I pazienti con la sindrome di Sjögren, una malattia autoimmune che interessa le ghiandole esocrine, sviluppano l'infiammazione della ghiandola salivaria e hanno ridotto la produzione di saliva. Analogamente, la produzione di saliva è gravemente compromesso in pazienti che ricevono radioterapia per i tumori testa e collo. Modelli del roditore, sviluppati per simulare queste condizioni cliniche, facilitano la comprensione della patogenesi della malattia e consentono lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche. Pertanto, la capacità di accurata, riproducibile e ripetutamente misurare la funzione della ghiandola salivaria in modelli animali è fondamentale. Sulla base di procedure precedentemente descritte in letteratura, è stato sviluppato un metodo che soddisfa questi criteri ed è stato usato per valutare la funzione della ghiandola salivaria in topi. Un ulteriore vantaggio di questo nuovo metodo è che è facilmente imparato e ha poca variazione inter-operatore. Funzione della ghiandola salivaria è valutata come la quantità (peso o volume) o velocità (mL/min) di saliva prodotta in risposta alla stimolazione di pilocarpina. La saliva raccolta è una buona fonte per le analisi del contenuto proteico, le concentrazioni nell'immunoglobulina e altre biomolecole.
Introduction
Le ghiandole salivari producono la saliva in risposta ad una varietà di stimoli neurologici e meccaniche1. Gli stimoli sono trasportati attraverso il sistema nervoso simpatico e parasimpatico ai recettori adrenergici e colinergici nella ghiandola. Pilocarpina è un agente colinergico, para-simpaticomimetici che agisce prevalentemente sui recettori muscarinici. Nella ghiandola salivaria, induce la produzione di saliva, agendo sui recettori muscarinici M31. Produzione di saliva dopo somministrazione di Pilocarpina è un indicatore della capacità di rispondere alla stimolazione delle ghiandole salivarie ed è comunemente usata come misura della funzione della ghiandola salivaria.
Misurazione precisa della produzione di saliva è fondamentale nello studio delle malattie della ghiandola salivare, tra cui la sindrome di Sjögren2 e ferita di radiazione che segue la testa e del collo cancro trattamento3. Diversi metodi sono stati sviluppati per misurare la produzione di saliva nei roditori. Questi includono diretto inserimento di una canula del dotto escretore salivario4, la raccolta di saliva dalla cavità orale sotto vuoto5e insieme utilizzando vetro capillari6 o una micropipetta7,8, 9. dirigere l'incannulamento del dotto salivare fornisce saliva più accurata e pura. Tuttavia, questa è una procedura tecnicamente impegnativa e il potenziale per causare lesioni ductal preclude collezioni ripetitivo saliva dall'animale stesso. Raccolta della saliva sotto vuoto può portare a risultati variabili dovuto essiccamento della saliva dal tubo. Questa perdita è esagerata ulteriormente in topi con ridotta salivazione. Tubi capillari in vetro permettono la raccolta di saliva per analisi successive, tuttavia, cambiamenti nella viscosità della saliva secreta nello stato malato previene efficiente riempimento del capillare. Inoltre, tentativi di spazzare la cavità orale per raccogliere i residui della saliva possono provocare lesioni. Il metodo di dispensare consente per la collezione completa, e per lo stesso operatore, è notevolmente coerente tra esperimenti. Tuttavia, per ragioni sconosciute, questo metodo Mostra una variazione significativa tra operatori diversi. Pertanto, per consentire paragoni adeguati, diventa imperativo che l'operatore stesso esegue tutti gli esperimenti relazionati a un progetto specifico. Chiaramente, questo rappresenta un grande svantaggio per un laboratorio.
Per superare questi problemi, è stata sviluppata una procedura che combina saliva raccolta metodi usati per gli esseri umani e roditori. Il metodo tampone, descritto di seguito per misurare il volume di saliva indotti da pilocarpina è semplice, riproducibile, non influenzato da parte dell'operatore e può essere eseguito più volte nello stesso animale. Inoltre, permette la raccolta di saliva per successive analisi di proteine, immunoglobuline o altre biomolecole.
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Protocol
Il protocollo descritto di seguito è stato approvato dal comitato di uso e cura degli animali istituzionale e segue gli orientamenti etici stabiliti dal National Institutes of Health. Tutti i dati presentati in questo rapporto sono stati generati utilizzando topi femminili che erano 10-12 settimane di età. Sono stati utilizzati i seguenti ceppi di topi: C57BL/6, BALB/c, DBA1, 129S e F1 (B6XA/J). Tutti i topi sono stati alloggiati in gabbie di barriera (5 animali per gabbia) in condizioni da organismi patogeni specifiche e forniti di mangime e acqua ad libitum.
1. preparazione
- Per preparare una soluzione di cloridrato di pilocarpine, pesare 10 mg del composto e dissolverlo in 1,776 mL di soluzione salina isotonica sterile nel Vortex, per dare una soluzione stock di 5,63 mg/mL. Non c'è nessuna necessità di sterilizzare questa soluzione. Ma se lo si desidera, filtrare attraverso un filtro da 0,2 µM. Conservare questa soluzione madre in diverse aliquote in un congelatore-80 oC per fino a 3 mesi. Ogni azione congelate è per uso singolo. Una volta scongelato, non ricongelare la soluzione pilocarpina.
- Prendere 0,6 mL microfuge tubi e attentamente un pugno un piccolo foro nella parte inferiore di ogni tubo con un ago calibro 18 riscaldato. Impostare questi tubi in provette da 2 mL. I tubi non devono essere sterili.
- Utilizzando una lama di rasoio affilata, sterile, taglio cilindrici tamponcini assorbenti in pezzi di circa 2 cm di lunghezza. Tagliare ogni pezzo di 2 cm in diagonale per dare 2 tamponi a forma conici. Inserire un tampone in ciascuna delle provette microfuge 0,6 mL.
- Pesare il tubo di microfuge 0,6 mL contenente il tampone asciutto.
- Trasferire i topi da studiare in una nuova gabbia pulita con bottiglie d'acqua. Tenere i topi senza cibo per almeno 2 h prima dell'inizio della raccolta della saliva per impedire la contaminazione di saliva raccolta le particelle di cibo.
Nota: Non è necessario mantenere 1 mouse per gabbia per questa procedura. Tuttavia, il numero dei topi collocati in ogni gabbia dipende dell'istituzione specifiche norme e regolamenti per uso animale. - Poco prima della fine di 2 h, preparare la soluzione di lavoro pilocarpina (0,0563 mg/mL) diluendo la soluzione di riserva 100 x in soluzione fisiologica sterile. Non è necessario filtrare ulteriormente sterilizzare questa soluzione. Tenere sempre la soluzione di Pilocarpina lavoro sul ghiaccio.
Nota: La tabella 1 fornisce la quantità di Pilocarpina deve essere iniettato per una gamma di pesi corporei del mouse per dare una dose finale di 0,375 mg/kg di peso corporeo.
2. la procedura
- Pesare ogni mouse e determinare la dose di anestetico mix per ogni mouse utilizzando la tabella 1. Iniettare il primo mouse con il volume appropriato della miscela anestetica per via intraperitoneale. Impostare il timer per 2 min (la maggior parte dei ceppi murini testati in questo protocollo andare a dormire da 2 min). Assicurarsi che il mouse è adeguatamente anestetizzato dalla mancanza di camminare quando appoggiata su una superficie piana. Se il mouse è ancora a piedi, attendere per ulteriori 2 min prima di procedere al passaggio successivo. Applicare una goccia di lubrificante unguento oftalmico in entrambi gli occhi per evitare l'essiccazione.
Nota: Nella tabella 1, la dose della miscela anestetica è peso corporeo 0,007 mL/g. La gamma ottimale per questa procedura è 0,006 a 0,008 mL/g di peso corporeo. Tuttavia, dopo 4 min, se il mouse è ancora a piedi o che esibiscono i movimenti a scatti, consultare il veterinario istituzionale per aumentare opportunamente la dose di anestetico. - Determinare la dose di Pilocarpina per il mouse utilizzando la tabella 1 e iniettare la giusta quantità per via intraperitoneale. Impostare il timer per 2 min e inserire il tubo di guida 50 mL il mouse fino a quando la testa e le orecchie bastone fuori alla fine taglio. Posizionare il tubo ad un angolo di 45 gradi, con la testa in giù e la superficie ventrale rivolta verso l'alto. Nastro il tubo alla scheda procedura per impediscono di muoversi.
Nota: La tabella 1 fornisce il dosaggio per topi più di 17 g, come questa procedura non è stata tentata su topi pesatura sotto 17 g. - Alla fine di 2 min, delicatamente inserire un paio di micro forcipe di dissezione in bocca chiusi e sollevare la mascella inferiore verso l'alto per aprire la bocca. Spingere il forcipe 1-2mm ulteriormente nella bocca, assicurandosi che la linguetta è visto che riposa sul braccio superiore della pinza. Con un altro paio di una pinzetta, tenere il tampone asciutto pre-pesato vicino alla sua punta conica.
- Far scorrere delicatamente la punta conica del tampone in bocca. Ritirare il forcipe, lasciando la punta del tampone nella cavità orale.
- Afferrare l'estremità più larga del tampone che si estende di fuori della bocca e ruotarlo per consentire la massima superficie di contatto con la bocca. Tenere il tampone in questa posizione per 15 min.
Nota: Questo assicura che il tampone rimane in bocca per tutta la durata della raccolta. Nota che la punta conica del tampone funge da uno stoppino e la parte più ampia del tampone rimane fuori della bocca. - Alla fine di 15 min, delicatamente ruotare il tampone per raccogliere qualsiasi saliva che non è stata assorbita e inserire il tampone bagnato nel tubo microfuge 0,6 mL. Tappare la provetta e impostarlo nel tubo 2ml posizionato su ghiaccio.
Nota: In questo momento, la mucosa orale apparirà completamente asciutto. Il mouse può ora essere spostato indietro nella sua gabbia per il recupero dall'anestesia. - Trasferire il mouse nella gabbia. Posto inumidito pellet cibo nella gabbia dopo il prelievo della saliva per aiutare più veloce reidratazione.
Nota: I topi si sveglia entro 10 min dopo la fine della raccolta. L'iniezione sottocutanea di 0,2 mL di soluzione salina isotonica pre-riscaldato può anche essere somministrato per accelerare il recupero. - Procedere al prossimo mouse. Tutti i topi devono essere monitorati fino a quando completamente hanno recuperato e sono ambulatoria.
3. misurazioni
- Alla fine di tutte le collezioni, pesare i tubi di 0,6 mL con il tampone bagnato. Calcolare la differenza tra il peso bagnato e il peso a secco per ottenere il peso della saliva prodotta. Posizionare il tubo di 0,6 mL con la saliva nuovamente dentro il tubo di 2 mL.
- Tagliare i tappi delle provette 2 ml. Quindi, centrifugare le provette 2 mL per 2 min a 7500 x g, a 4oC in una centrifuga micro per recuperare la saliva. Misurare il volume di saliva ottenuto utilizzando una micropipetta.
- Esprimere i risultati come saliva peso (mg)10 oltre 15 min o come un rapporto tra peso saliva (mg) / mouse peso corporeo (g).
Nota: Se il volume di saliva estratta fuori il tampone è stato misurato, esprimere i risultati come il volume di saliva recuperato (mL) o il rapporto di saliva volume (mL) / mouse peso corporeo (g).
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Representative Results
Nei sistemi modello sperimentale del topo, la capacità di produrre saliva in risposta alla stimolazione di Pilocarpina è usata come un indicatore della funzione della ghiandola salivaria. La produzione di saliva è stata misurata in 11-settimana-vecchi topi femminili C57BL/6 il metodo tampone. In Figura 1A, i risultati sono espressi come la quantità di saliva (mg) raccolta seguendo le dosi aumentanti di pilocarpina. Alla dose di 1 mg/kg di peso corporeo, alcuni dei topi iniziato a esporre afflizione (agitazione e brividi involontari). Quindi le dosi elevate di pilocarpina, oltre 1 mg/kg di peso corporeo non sono state testate in questo studio. In Figura 1B, i risultati vengono rappresentati come il rapporto tra peso saliva (mg) per il peso del corpo del mouse (g). Collettivamente, questi dati mostrano una relazione di risposta buona dose tra la produzione di quantità e saliva di pilocarpina. Inoltre è stato misurato il volume di recuperato dal tampone di saliva. Come illustrato nella Figura 1, c'è una notevole concordanza tra saliva peso e volume cui 1mg di saliva è uguale a 0,001 mL.
I risultati ottenuti con il metodo tampone sono simili a quelli ottenuti con il metodo di raccolta di pipetta. La Figura 2A Mostra che la quantità media di saliva raccolta dal metodo tampone e il metodo di dispensare è molto simile e le differenze sono statisticamente non significative. Figura 2B 2C e 2D mostrano che il metodo tampone non ha impatto stima di biomolecole nella saliva. Infatti, in confronto con il metodo della pipetta, il metodo tampone ha evidenziato un andamento totale superiore nei livelli medi di proteine salivari totali (Figura 2), attività del lisozima salivare (Figura 2D) e IgA salivario (Figura 2E). Tuttavia, queste differenze erano statisticamente non significative.
Il metodo di raccolta della saliva qui descritto è in grado di rilevare le differenze nella quantità di saliva prodotta da ceppi di topi diversi (Figura 3) e ipofunzione della ghiandola salivaria indotto da condizioni differenti di malattia (Figura 4). Figura 3A Mostra risultati di produzione di saliva di Pilocarpina indotta da 10-12-settimana-vecchi topi femminili C57BL/6, BALB/c, DBA1/J e 129S6. I topi di 129S6 prodotto la quantità minima di saliva rispetto agli altri ceppi. Si deve osservare che le differenze nei pesi corpo di questi topi non erano significativamente differenti (Figura 3B). Successivamente, il metodo tampone è stato utilizzato per rilevare ipofunzione della ghiandola salivaria e due esempi sono mostrati in Figura 4. Figura 4A Mostra un risultato rappresentativo di ipofunzione della ghiandola salivaria indotta dall'attivazione dell'immunità innata che segue l'iniezione del lipopolysaccharide (LPS) (10 µ g/mouse, intraperitonealmente). Topi di controllo sono stati iniettati con salino11. LPS-trattati topi mostrano un calo significativo nella saliva rispetto ai controlli. Il trasferimento passivo di anticorpi che reagiscono con l'antigene di sindrome di Sjögren A/Ro52 induce ipofunzione della ghiandola salivaria, e questo modello simula alcuni aspetti della sindrome di Sjögren9. Come mostrato in Figura 4B, topi iniettati con l'allume adiuvante più anticorpi anti-Ro52 insieme erano significativamente più bassa produzione di saliva, rispetto ai topi non trattati o di topi trattati solo con l'allume.
Il metodo tampone è semplice da implementare e operatore indipendente. La figura 5 Mostra la produzione di saliva da topi C57BL/6 femmina 10-13-settimana-vecchio, in esperimenti effettuati in 6 diversi momenti da 2 operatori diversi. Operatore ho iniziato con solo 2 mesi di esperienza di gestione mentre operatore II aveva 6 mesi di esperienza di gestione preventiva del mouse, ma è stata introdotta soltanto per il metodo di raccolta della saliva per una settimana del mouse. Questi dati sono stati generati in esperimenti condotti da quasi un anno di distanza, utilizzando la dose di Pilocarpina 0,375 mg/kg. I rapporti di saliva ottenuti da entrambi gli operatori mostrano una gamma di letture (1,84 a 5,87). Operatore esperimenti di ho attraversato un periodo di 10 settimane mentre esperimenti di operatore II sono stati effettuati oltre 3 giorni consecutivi quasi un anno più successivamente (Figura 5A). In particolare, i rapporti di saliva ottenuti nel corso del tempo non erano significativamente differenti (p = 0.064; Test di Kruskal-Wallis). Per confrontare ulteriori variazioni inter-operatore, i rapporti di peso saliva al peso corporeo di g da 3 esperimenti per ogni operatore sono stati riuniti e sono mostrati in figura 5B. Rapporti di saliva ottenuti dall'operatore ho (media + SEM; 4,45 + 0,152, n = 38) non siano significativamente diverse da operatore 2 (media + SEM; 4,21 + 0.169; n = 25; p = 0.296 test Mann Whitney).
Figura 1: la produzione di Saliva è dipendente dalla dose di pilocarpina. Topi C57BL6/J (11-settimana-vecchio femmine, 5 per gruppo) sono stati iniettati con differenti dosi di pilocarpina (0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg e 1,0 mg/kg di peso corporeo) e la produzione di saliva è stata misurata per 15 min (A) risultati sono rappresentati come quantità di saliva di mg (media ± SEM). (B) i dati sono rappresentati come rapporto medio della saliva (saliva mg per peso corporeo di g del mouse). (C) Saliva da 11-settimana-vecchi topi femminili C57BL/6 (n = 5) è stato raccolto dal metodo tampone. Pilocarpina è stata utilizzata ad una dose di 0,375 mg/kg di peso corporeo. I tamponi bagnati sono stati pesati per misurare la quantità di saliva prodotta in mg. La saliva nei tamponi quindi è stata recuperata per centrifugazione, e i volumi della saliva recuperato sono stati misurati. L'accordo significativo è visto tra il peso saliva nel volume mg e saliva in µ l. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: il metodo tampone non riguarda l'analisi di biomolecole nella saliva. Saliva da 2 gruppi di 11-settimana-vecchi topi femminili C57BL/6, (n = 5 topi per gruppo), è stato raccolto il metodo tampone oppure dal metodo micropipetta. Le differenze nei volumi di saliva (A), media quantità di proteine (B), significano quantità di attività del lisozima (C) e significano quantità di IgA fra i 2 gruppi sono statisticamente non significativi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: il metodo tampone della saliva raccolta rileva differenze nella linea di base della produzione di saliva da diversi ceppi di topi. (A) Saliva da topi femmine (10-12-week-old) sono stati raccolti per 15 min usando una dose di pilocarpina di 0,375 mg/kg di peso corporeo. (B) i pesi corporeo medio tra i gruppi di topi non erano significativamente differenti. Significatività statistica è stata analizzata da Kruskal-Wallis test, seguito da Dunn di test comparazioni multiple. Una p < 0.05 è stato considerato significativo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: metodo tampone rileva ipofunzione della ghiandola salivaria. (A) (X B6 A / J) topi femminili F1 sono stati iniettati con entrambe le soluzioni LPS (0,1 mg/mL, 0,1 mL per topo, intraperitonealmente) o soluzione fisiologica e la saliva è stata misurata 26 ore più tardi. Un esperimento rappresentanza Mostra un significativo (p = 0.0079) goccia (60%) nella produzione di saliva nei topi trattati con LPS. (B) ipofunzione della ghiandola salivaria è stata misurata in un sistema di modello sperimentale del topo per la sindrome di Sjögren. Il modello di trasferimento passivo precedentemente pubblicati per induzione di disfunzione ghiandolare è stato usato4 con alcune modifiche. Topi femminili C57BL/6 (10-12 settimane) sono stati iniettati con adiuvante di allume. Nei giorni 14 e 20 topi sono stati iniettati con 0,05 mL di siero di coniglio anti-Ro52 e la produzione di saliva è stata misurata dopo 24 h. notare un significativo (p = 0,0003) goccia (50%) nella produzione di saliva nei topi trattati con allume e anti-Ro52 siero. Significatività statistica è stata analizzata da Kruskal-Wallis test, seguito da Dunn di test comparazioni multiple. Una p < 0.05 è stato considerato significativo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: il metodo tampone produce risultati riproducibili nel tempo (A) e tra gli operatori (B). Il metodo tampone Mostra risultati comparabili tra due operatori con diverse lunghezze di esperienza negli esperimenti effettuati in un anno di gestione del mouse. La produzione della saliva basale in topi femminili C57BL/6 (10-13 settimane di età) è stata misurata da ogni operatore. Risultati sono espressi come peso di saliva prodotta (peso corporeo di mg/g). Le date di raccolta della saliva sono sull'asse x e i risultati dai dati raccolti nel corso del tempo sono riportati (A). Ogni punto dati rappresenta un mouse, e il numero di topi analizzati in ogni momento è indicato tra parentesi. Rapporti di saliva basale (media + SEM) riuniti da 3 esperimenti sono mostrati (B)e non siano significativamente diversi tra gli operatori. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La produzione di saliva è un processo complesso ed è influenzata da molti fattori. Di conseguenza, la funzione della ghiandola salivaria in animali da laboratorio di misura può essere una sfida. Un'ulteriore sfida è che le misurazioni ripetute della funzione della ghiandola salivaria nello stesso animale sono necessari per stabilire l'inizio della malattia o per dimostrare il recupero dopo il trattamento.
Il metodo tampone descritto in questo rapporto è tecnicamente semplice da eseguire con diverse opzioni per rappresentare i dati. I risultati ottenuti sono riproducibili, con poca variazione inter-operatore. Il metodo in grado di rilevare una riduzione nella produzione di saliva nei modelli differenti di disfunzione della ghiandola salivaria. Un vantaggio significativo è l'uso di polimeri inerti, altamente assorbente e recupero efficiente della saliva raccolta, consentendo la misurazione di biomolecole salivare. Un altro vantaggio di questo metodo è che è possibile eseguire questa procedura simultaneamente nei topi fino a 2 alla volta da un singolo operatore. Questo è significativamente più efficace rispetto ad alcuni degli altri metodi, dove viene eseguita in un singolo mouse alla volta.
La variabilità nelle misurazioni di produzione di saliva sono stati la rovina di tutte le tecniche di misurazione di saliva. Per ridurre al minimo la variabilità, è importante seguire scrupolosamente il protocollo. Fasi critiche includono: selezionando la stessa ora del giorno per digiuno i topi e la raccolta della saliva, del caso di dosaggio di anestetico e pilocarpina (tabella 1) e accuratamente il peso record di tamponi di asciutti e bagnati. Gestione del tempo attenta è necessaria per impostare fino a 2 topi in un momento per la raccolta della saliva.
Come mostrato nella Figura 3, la quantità di saliva prodotta da topi è ceppo dipendente. Così, del caso ceppo, età e sesso abbinati topi dovrebbero essere utilizzati come controlli. Titolazione del dosaggio pilocarpina, per il ceppo specifico e la condizione sperimentale indagato, è altamente raccomandato. Sebbene una dose maggiore di Pilocarpina oltre 0,5 mg/kg induce aumento della produzione di saliva, di valutare ipofunzione ghiandolare, si consiglia di utilizzare una dose più bassa. Questo permette l'identificazione anche lievi differenze nella produzione di saliva tra il malato e topi di controllo. Dosi di 0,5 mg/kg di peso corporeo e 0,375 mg/kg di peso corporeo sono state utilizzate con successo per dimostrare ipofunzione della ghiandola salivaria. Tuttavia, dovrebbe essere notato che alcuni sistemi di modello sperimentale possono richiedere più o meno lunghi periodi di raccolta rispetto a quanto descritto in questo protocollo. Questo dovrebbe essere testato da ciascun laboratorio.
Una limitazione di questo metodo e la maggior parte dei metodi di misurazione di saliva è la necessità di anestesia. La relazione con il metodo sottovuoto non include l'uso di anestetico5. Tuttavia, l'assenza di anestesia induce diversi livelli di ansia nei topi. Essi tendono a lottare e mordere il tubo, e che a sua volta, può influenzare l'efficienza di produzione e raccolta di saliva. Isoflurano anestesia in ratti induce un drop-in Pilocarpina indotto saliva produzione12. Al contrario, la ketamina aumenta le secrezioni bronchiali e salivari attraverso stimolazione simpatica13. Noi ed altri abbiamo utilizzato con successo la chetamina e xilazina miscela come anestetico per la misurazione di Pilocarpina indotto saliva produzione4,7,8,9. L'intervallo consigliato per l'anestesia chirurgica è 100-200 mg/kg di ketamina e 5-16 mg/kg di xilazina14. La dose di 0,008 0,006 mL/peso corporeo di g utilizzato in questo metodo (corrisponde a 60-80 mg/kg di ketamina e 6-8 mg/kg di xilazina) cade nell'estremità inferiore dell'intervallo consigliato ed è sufficiente per fornire un livello coerente di immobilizzazione senza anestesia profonda .
Il metodo tampone nasce come un'alternativa al metodo micropipetta ordinariamente usato. Lo svantaggio principale del metodo pipetta è stata l'elevata variabilità inter-operatore e la necessità di raccogliere saliva da uno mouse alla volta. Il metodo tampone risolve entrambi questi problemi. I vantaggi includono la limitazione del numero di animali necessari per raggiungere il potere in analisi statistiche e maggiore efficienza. Sostituzione tamponi di cotone con tamponi di polimero inerte offrono un'opzione migliore poiché tamponi di cotone sono conosciuti per urtare la quantificazione di molecole biologicamente attive15.
Data la semplicità del metodo tampone e la sua elevata riproducibilità tra diversi individui, si spera che il metodo tampone faciliterà meglio comparazioni di modelli murini tra istituzioni e ricercatori in diversi laboratori.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse a divulgare.
Acknowledgments
Lo studio è stato sostenuto da una sovvenzione dal National Institutes of Health, National Institute of Dental e Craniofacial Research (DE025030).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals for saliva collection | |||
| Pilocarpine hydrochloride | Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA | B21410 | Dilute in sterile isotonic saline. Store single use aliquots of 100X stock at -80oC |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia Mix solution | Mix 1 mL ketamine hydrochloride + 0.5 mL xylazine + 8.5 mL sterile isotonic saline in a sterile vial. Can be used for 3 months. | ||
| Zetamine (Ketamine hydrochloride) | Vet One, Boise, Idaho, USA | C3N VT1 | Stock is 100 mg/mL |
| Anased (Xylazine) | Med-Vet International, Mettawa, IL, USA | RXANASED-20 | Stock is 20 mg/mL |
| Isotonic sterile saline | Vet One, Boise, Idaho, USA | 501032 | Used as diluent |
| Artificial tears (lubricant ophthalmic ointment) | Henry Schien, Dublin, OH, USA | 48272 | Used to prevent eyes from drying during the procedure |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials for saliva collection | |||
| SalivaBio Children's swab | Salimetrics, LLC Carlsbad, CA, USA | N/A | Individually wrapped swabs |
| 50 mL polypropylene tubes | VWR, Radnor, PA, USA | 89004-364 | Cut off the bottom 1 cm of the tube. Make sure that the cut edge is smooth. |
| Microcentrifuge tubes 0.6 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-290 | Make holes in the bottom of tube with heated 18 gauge needles |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-298 | |
| Insulin Syringes with permanently attached needles | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 324702 | |
| 18 gauge regular bevel needles | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 305195 | |
| Sterile scalpel blade #11 | Integra York Inc PA, USA | 4-311 | |
| Microdissecting forceps | Roboz, Gaithersburg, MD, USA | RS-5139 | Serrated angular 0.8 mm tip, 4" length |
| Label tape | Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA | sc-224487 | |
| 3 channel timer | Amazon.com, Seattle, WA, USA | B06W2KCYVN | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo, Columbus OH, USA | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals/ reagents for inducing salivary dysfunction | |||
| LPS | Invivogen, San Deigo, CA, USA | tlrl-b5lps | Dissolve in endotoxin free water, and store stock solution at 5 mg/mL . dilute in sterile HBSS 100 ug/mL - inject 100 uL/ moue ip |
| Imject Alum adjuvant | Thermo Scientific | 77161 | Dilute 1:1 in sterile saline. Inject intraperitoneally 0.1 mL/mouse |
| Rabbit anti-Ro52 antiserum | Generated in lab | Immunization of rabbits with recombinant mouse Ro52 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals/ Kits for saliva analyses | |||
| Salivary lysozyme estimation | |||
| EnzChek Lysozyme Assay Kit | Molecular Probes, Eugene, OR, USA | E-22013 | Used as per manufacturer's instructions |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salivary IgA estimation by sandwich ELISA | |||
| Mouse IgA | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 0106-01 | Standards for sandwich ELISA - range 30 ng/mL to 0.5 ng/mL |
| Goat anti- mouse IgA unlabeled | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-01 | Coat at 1 ug/mL in bicarbonate buffer |
| Goat anti- mouse IgA HRP | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-05 | Detection antibody used at 1:4000 dilution |
| TMB substrate | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 555214 | Used as per manufacturer's instructions |
| Immulon 4HBX Microtiter 96 well plates | Thermo Scientific, Rochester, NY, USA | 3855 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salivary protein estimation | |||
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | BioRad, Hercules, CA, USA | 5000006 | For protein estimation as per manufacturer's instructions |
References
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