Summary
Tükürük bezi hypofunction otoimmün hastalığı ve radyasyon terapisi sık bir sonucudur. Bu hastalıkların fare modellerinde Tükürük bezi ile tekrarlanabilir değerlendirilmesi teknik bir sorundur. Burada, tükürük üretim farelerde doğru ve tekrarlanabilir ölçüm için basit bir yöntem açıklanmıştır.
Abstract
Sjoegren Sendromu, ekzokrin bezleri etkileyen otoimmün bir hastalığı olan hastalarda Tükürük bezi iltihabı geliştirmek ve tükürük üretimi azalttı. Benzer şekilde, tükürük üretim ciddi baş ve boyun kanserlerinin için radyasyon tedavisi alan hastalarda güvenilir değil. Kemirgen modelleri, bu klinik durumlar ve taklit etmek için geliştirilen hastalık patogenezinde anlamayı kolaylaştırmak ve yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için izin verir. Bu nedenle, doğru tekrarlanarak ve art arda Tükürük bezi işlevi hayvan modellerinde ölçmek için kritik yeteneğidir. Literatürde daha önce açıklanan yordamları hakkında oluşturmak, bu kriterleri karşılayan ve tükürük bezi işlevi farelerde değerlendirmek için kullanılan bir yöntem geliştirilmiştir. Ek bir avantaj bu yeni yöntemin bu kolayca hakim ve küçük arası operatör varyasyon vardır olduğunu. Tükürük bezi işlevi miktar (ağırlık veya hacim) veya tükürük Pilokarpin stimülasyon üretti oranını (mL/dk) olarak değerlendirilir. Toplanan tükürük analizleri protein içeriği, immünglobulin konsantrasyonları ve diğer biomolecules için iyi bir kaynaktır.
Introduction
Tükürük bezlerinin tükürük yanıt olarak nörolojik ve mekanik uyaranlara1çeşitli üretmek. Uyaranlara için bezi adrenergic ve kolinerjik reseptörler sempatik ve parasempatik sinir sistemi aracılığıyla taşınır. Pilokarpin muscarinic reseptörleri üzerinde ağırlıklı olarak davranır kolinerjik, para sempatomimetik bir ajandır. Tükürük bezi bu muscarinic asetilkolin reseptörü M31üzerinde hareket ederek tükürük üretimini neden olmaktadır. Tükürük üretim Pilokarpin yönetim takip tükürük bezleri uyarmaya tepki yeteneğini bir göstergesidir ve tükürük bezi işlevi bir ölçüsü olarak yaygın olarak kullanılır.
Tükürük üretim doğru ölçüm Tükürük bezi hastalıkları Sjoegren Sendromu2 ve baş ve boyun kanser tedavi3takip radyasyon hasarı da dahil olmak üzere çalışma odasında önemlidir. Tükürük üretim Rodents ölçmek için birkaç farklı yöntem geliştirilmiştir. Bunlar doğrudan cannulation boşaltım tükürük kanal4, tükürük ağız boşluğu altında vakum5üzerinden topluluğu ve cam kılcal6 veya bir micropipette7,8, kullanarak toplama içerir 9. cannulation tükürük kanalının en doğru ve saf tükürük sağlar doğrudan. Ancak, bu teknik olarak zor bir işlemdir ve tekrarlayan tükürük koleksiyonları aynı hayvan duktal yaralanma neden için potansiyel engellemektedir. Vakum altında tükürük toplama tükürük tüp kurutma nedeniyle değişken sonuçları yol açabilir. Bu kaybı daha da indirimli salya ile farelerde abartılı olduğunu. Cam kılcal damarlar koleksiyonunu tükürük daha sonraki analizler için izin verir, ancak, viskozite hastalıklı durumda salgılanan tükürük değişimler kılcal verimli dolgu engeller. Ayrıca, artık tükürük toplamak için ağız boşluğu süpürme girişimlerini yaralanmalara yol açabilir. Damlalıklı yöntemi için tam toplama sağlar ve aynı işleci için deneyler arasında son derece tutarlı. Ancak, bilinmeyen nedenlerden dolayı bu yöntem farklı operatörler arasında önemli değişimleri gösterir. Bu nedenle, uygun karşılaştırma izin vermek için bu aynı işleç belirli bir projeyle ilgili tüm deneylerin gerçekleştirir şart olur. Açıkçası, bu bir laboratuvar için büyük bir dezavantaj temsil eder.
Bu sorunları aşmak için bir yordam birleştiren tükürük toplama yöntemleri insanlar ve kemirgen için kullanılan geliştirilmiştir. Tükürük Pilokarpin kaynaklı cilt ölçmek için aşağıda açıklanan çubukla yöntemi, operatör tarafından akıttıkları basit, tekrarlanabilir ve tekrar tekrar aynı hayvan gerçekleştirilebilir. Ayrıca, proteinler, immünglobulin veya diğer biomolecules daha sonraki analizler için tükürük toplama sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aşağıda açıklanan protokol kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından kabul edildi ve ulusal sağlık Enstitüleri tarafından kurulan etik kuralları izler. Bu raporda sunulan tüm veri 10-12 hafta-in yaş vardı kadın fare kullanarak oluşturulan. Fareler aşağıdaki suşları kullanılmıştır: C57BL/6, BALB/c, DBA1, 129S ve (B6XA/J) F1. Bütün fareler bariyer kafeslerde (kafes başına 5 hayvanlar) patojen-Alerjik spesifik koşullar içerisinde yer alan ve yem ve su ad libitum sağlanan.
1. hazırlık
- Pilokarpin hidroklorür stok çözeltisi hazırlamak için bahçedeki 10 mg tartmak ve 1.776 mL steril izotonik salin 5.63 mg/mL stok çözeltisi vermek vortexing tarafından çözülür. Bu çözüm sterilize etmek için gerek yoktur. Ancak istenirse, 0.2 µM filtreden filtre. Bu hisse senedi çözüm birden çok aliquots bir-80 oC dondurucuda 3 aya kadar saklayın. Donmuş her hissenin tek kullanıma yöneliktir. Bir kez çözdürülen Pilokarpin çözüm refreeze değil.
- Microfuge tüpler 0.6 mL al ve dikkatlice ısıtmalı bir 18'lik iğne ile her tüpün dibinde küçük bir delik yumruk. Bu tüpler 2 mL tüpler içine ayarlayın. Tüpler steril olması gerekmez.
- Keskin, steril jilet kullanarak, silindirik emici bezlerden yaklaşık 2 cm uzunluğunda parçalara kesilmiş. Çapraz olarak 2 konik şekilli temizleme bezi vermek için her 2 cm parça kesti. Bir çubukla her 0.6 mL microfuge tüpler içinde yerleştirin.
- Kuru Pamuklu çubuk içeren 0.6 mL microfuge tüp tartın.
- Fareler belirlenmesi için su şişeleri ile yeni bir temiz kafes içine aktarın. Toplanan tükürük kirletici gıda parçacıkları önlemek için tükürük toplama başlamadan önce fareler yemeden en az 2 h tutun.
Not: Bu yordam için kafes başına 1 fare tutmak gerekli değildir. Ancak, belirli kurum ve kuralları hayvan kullanmak için fare her kafese yerleştirilen sayısını bağlıdır. - 2 h sonundan önce çalışan Pilokarpin çözüm (0.0563 mg/mL) steril serum fizyolojik içinde hisse senedi çözüm 100 x sulandrarak hazırlayın. Daha fazla filtre uygulamak için gerekli değildir bu çözüm sterilize. Her zaman çalışan Pilokarpin çözüm buz üzerinde tutun.
Not: Tablo 1 fare vücut ağırlıkları son doz 0.375 mg/kg vücut ağırlığı vermek için bir dizi için enjekte edilir Pilokarpin miktarını verir.
2. yordam
- Her fare tartmak ve anestezik karıştırmak için her fare kullanarak Tablo 1doz belirlemek. Birinci fare mayi yoldan anestezik mix uygun hacmi ile enjekte et. 2 (Bu protokol için test çoğu fare suşları tarafından 2 dk uyu) dk. fırının saatini kurdu. Fare düzgün olmaması düz bir yüzeye yerleştirildiğinde yürüme anestezi emin olun. Fare hala yürüyor, bir sonraki adıma devam etmeden önce ek 2 dk bekleyin. Bir damla yağ oftalmik merhem kurutma önlemek için her iki gözde uygulama.
Not: Tablo 1' de, anestezik mix doz 0,007 mL/gr vücut ağırlığında olduğunu. Bu yordam için optimum menzili 0.006 0.008 mL/g vücut ağırlığı var. Ancak, sonra 4 fare hala yürüme ya sarsıntılı hareketler sergileyen min, konsültasyon ile uygun anesteziyle dozunun artırılması için kurumsal hayvan hastalıklarıyla ilgili. - Tablo 1 kullanarak fare Pilokarpin doz belirlemek ve mayi yoldan uygun miktarda enjekte. 2 min için zamanlayıcı ayarlamak ve baş ve kulaklar kesim sonunda dışarı sopa kadar fareyi 50 mL restrainer tüp içine sokun. Tüp ile baş aşağı, 45 derecelik bir açıyla ve ventral yüzeyde yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Yordamı kurulu hareket etmesini engellemek için tüp teyp.
Not: Bu yordam 17 g ağırlığında fareler üzerinde çalışılmıştır değil gibi Tablo 1 doz 17 g, daha fareler için sağlar. - 2 dk sonunda, yavaşça ağzına forseps dissekan mikro kapalı bir çift eklemek ve yukarı doğru ağız açmak için alt çene kaldırın. Forseps 1-2 mm daha fazla dil forseps üst kol dinlenme görülür emin ağız, içine itin. Bir çift daha iyi Forseps ile önceden ağırlığını kuru bez konik ucu yakın tutun.
- Yavaşça çubukla konik ucunu ağzına kaydırın. Forseps ağız boşluğunda Pamuklu çubuk ucu bırakarak geri alıyorum.
- Daha geniş ağız dışında uzanan çubukla sonuna kavramak ve maksimum alan kişinin ağzı ile izin vermek için döndürün. Pamuklu çubuk 15 dakika bu pozisyonda tutun.
Not: Bu çubukla koleksiyon süresince ağızda kalmasını sağlar. Pamuklu çubuk konik ucunu bir fitil ve pamuklu çubuk daha geniş kısmı gibi davranan Not ağız dışında kalır. - 15 dk sonunda, nazikçe değil absorbe olmuştur herhangi bir tükürük toplamak için çubukla döndürmek ve ıslak bez 0.6 mL microfuge tüpte yerleştirin. Tüp kapatın ve buz üzerinde yerleştirilen 2 mL tüp içinde ayarlayın.
Not: şu anda, oral mukoza tamamen kuru görünür. Fare şimdi geri onun kafes anestezi kurtarma için taşınabilir. - Fare içinde belgili tanımlık kafes aktarın. Yer içinde belgili tanımlık kafes gıda granül daha hızlı rehidrasyon yardımcı olmak için tükürük toplandıktan sonra nemlendirilmiş.
Not: Fareler içinde 10 dk sonra sonuna uyan. 0.2 mL Önceden ısıtılmış izotonik salin Subkutan Enjeksiyon kurtarma hızlandırmak için verilebilir. - Sonraki fare için devam edin. Tüm onlar tamamen iyileşti kadar fareyi takip edilmelidir ve Ambulatuvar vardır.
3. ölçümleri
- Tüm koleksiyonlar sonunda 0.6 mL tüpler ıslak bez ile tartın. Islak ağırlık ve üretilen tükürük kilo almak için Kuru ağırlık farkı hesaplar. Tükürük ile 0.6 mL tüp 2 mL tüp içine yerleştirin.
- 2 ml tüpler kapaklar kapalı kesti. Sonra 2 mL tüpler için tükürük kurtarmak için mikro santrifüj 4oC'de 7500 x g, 2 dk santrifüj kapasitesi. Bir micropipette kullanılarak elde tükürük hacmi ölçmek.
- Tükürük ağırlığı (mg)10 15 dk ya da tükürük ağırlığı (mg) oranında olarak sonuçları hızlı / vücut ağırlığı (g) fare.
Not: ölçülen çubukla dışına çıkarılan tükürük hacmi Eğer sonuçları tükürük (mL) kurtarılan birim veya tükürük hacmi (mL) oranı ifade / fare vücut ağırlığı (g).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deneysel fare modeli sistemlerinde yeteneği tükürük Pilokarpin stimülasyon yanıt üretmek için Tükürük bezi işlevi bir göstergesi olarak kullanılır. Tükürük üretim 11-hafta-yaşlı C57BL/6 dişi farelerde çubukla yöntemi tarafından ölçüldü. Şekil 1A', sonuçları tükürük (mg) artan doz Pilokarpin takip toplanan tutar ifade edilir. Doz 1 mg/kg vücut ağırlığı bazı fareler (istemsiz sallayarak ve titreyerek) sıkıntı sergilenmesi başladı. Bu nedenle daha yüksek doz Pilokarpin, 1 mg/kg vücut ağırlığı ötesinde bu çalışmada test değil. Şekil 1Badımında, sonucunu fare vücut ağırlığı (g) tükürük ağırlığı (mg) oranı olarak temsil edilir. Toplu olarak, bu veri Pilokarpin tutar ve tükürük üretimi arasındaki iyi doz yanıt ilişkiyi göstermek. Pamuklu çubuk kurtarıldı tükürük hacmi de ölçülmüştür. Şekil 1 ciçinde gösterildiği gibi tükürük ağırlık ve hacim burada aynıdır tükürük 1 mg 0,001 mL arasında önemli bir uyumluluk vardır.
Pamuklu çubuk yöntemi ile elde edilen sonuçlar pipet toplama yöntemi ile elde edilen benzer. Şekil 2A çubukla yöntemi ve damlalıklı yöntemi tarafından toplanan tükürük ortalama miktarı çok benzer ve farklılıklar istatistiksel olarak önemli değildir gösterir. Şekil 2B Göstermek , 2 C ve 2D çubukla yöntemi biomolecules tükürük içinde tahmini etkisi olmadı. Aslında, damlalıklı yöntemi ile karşılaştırıldığında, pamuklu çubuk yöntemi ortalama düzeyde toplam tükürük protein (şekil 2C), tükürük lizozim etkinlik (2D rakam) ve tükürük IgA (2E rakam) genel olarak daha yüksek bir eğilim gösterdi. Ancak, bu farklılıkların önemli istatistiksel olarak değil.
Burada açıklanan tükürük toplama yöntemi farklı fare suşları (şekil 3) tarafından üretilen tükürük ve farklı hastalık koşulları (şekil 4) tarafından indüklenen Tükürük bezi hypofunction miktarı farklılıkları tespit edebilmektedir. Şekil 3A 10-12-hafta-yaşlı kadın C57BL/6, BALB/c, DBA1/J ve 129S6 fareler indüklenen Pilokarpin tükürük üretim sonuçlarını gösterir. 129S6 fareler karşılaştırıldığında diğer suşların tükürük en düşük miktarda üretilen. Bu fareler vücut ağırlıkları farklılıkları önemli ölçüde farklı (3B rakam) olmadığını belirtmek gerekir. Ardından, çubukla yöntemi Tükürük bezi hypofunction algılamak için kullanılan ve iki örnek şekil 4' te gösterilmiştir. Şekil 4A temsilcisi sonucu Tükürük bezi hypofunction doğuştan gelen bağışıklık lipopolysaccharide (LPS) enjeksiyon takip etkinleştirme tarafından indüklenen gösterir (10 µg/fare, intraperitoneally). Kontrol fare ile serum fizyolojik11enjekte edildi. Fareler LPS tedavi tükürük kontrollere göre önemli bir düşüş gösterir. Pasif transfer Antikor Reaktif Sjoegren Sendromu antijen A/Ro52 Tükürük bezi hypofunction neden olmaktadır ve bu model Sjoegren Sendromu9bazı yönlerini taklit eder. Şekil 4B' de gösterildiği gibi fare adjuvan şap ile enjekte artı anti-Ro52 antikorlar birlikte tedavi edilmezse farelere göre daha düşük tükürük üretim vardı ya da fareler sadece şap ile tedavi.
Çubukla, Uygula ve operatör bağımsız basit bir yöntemdir. Şekil 5 10-13-hafta-yaşlı kadın C57BL/6 fare, 6 farklı zaman noktalarda 2 farklı operatörleri tarafından gerçekleştirilen deneylerde tükürük üretim gösterir. Operatör operatör II 6 ay önceki fare deneyim işleme vardı, ama sadece tükürük toplama yöntemi için bir hafta boyunca kullanılmaya başlanan deneyim işleme fare sadece 2 ay ile başladı. Bu veriler 0.375 mg/kg doz Pilokarpin kullanarak neredeyse bir yıl arayla, yapılan deneylerde üretildi. Her iki operatörleri tarafından elde edilen tükürük oranlarını okuma (1,84 5.87) bir dizi gösteren. 3 gün üst üste hemen hemen bir yıl sonra (şekil 5A) işleç II deneyler yapılmıştır iken operatör ben'ın deneyler 10 haftalık bir dönem boyunca yayılmış. Özellikle, zaman içinde elde tükürük oranları önemli ölçüde farklı değildi (p = 0.064; Kruskal-Wallis test). Daha fazla arası operatör varyasyonları karşılaştırmak için g vücut ağırlığı her işleç için 3 deneyler üzerinden başına tükürük ağırlık oranları havuza alınmış ve şekil 5Biçinde gösterilir. Tükürük oranları elde edilen operatör tarafından ben (ortalama + SEM; 4,45 + 0.152, n = 38) operatör 2 farklı olmamasını (ortalama + SEM; 4.21 + 0,169; n = 25; p 0.296 = Mann Whitney test tarafından).
Şekil 1: tükürük üretim Pilokarpin doz bağımlı. C57BL6/J fareler (11-hafta-yaşlı kadın, grup başına 5) farklı doz Pilokarpin (0.25 mg/kg, 0.5 mg/kg ve 1.0 mg/kg vücut ağırlığı) enjekte ve tükürük üretimi 15 dk. (A) ölçülen sonuçlar mg tükürük miktarı (ortalama ± SEM) gösterilir. (B) veri ortalama tükürük oranı (g fare vücut ağırlığı başına mg tükürük) olarak gösterilir. (C) tükürük 11-hafta-yaşlı kadın C57BL/6 fare üzerinden (n = 5) Pamuklu çubuk yöntemi ile toplanmıştır. 0.375 mg/kg vücut ağırlığı bir doz Pilokarpin kullanıldı. Islak Temizleme bezi, tükürük mg içinde üretilen miktarı ölçmek için tartıldı. Bezlerden tükürük sonra Santrifüjü tarafından kurtarıldı ve kurtarılan tükürük hacimleri ölçüldü. Önemli anlaşma mg ve tükürük hacmindeki µL. tükürük kilo arasında görülür Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: Pamuklu çubuk yöntemi biomolecules tükürük içinde analizini etkilemez. Tükürük 11-hafta-yaşlı kadın C57BL/6 farelerin 2 gruplardan (n grubu başına 5 fare =), pamuklu çubuk yöntemi veya micropipet yöntemi tarafından toplanan yapıldı. Demek hacimleri tükürük (A), protein (B), ortalama tutarlar farklılıkları lizozim faaliyet (C) tutarların demek ve IgA miktarda 2 grup arasında istatistiksel olarak önemli değildir demek. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: tükürük koleksiyonunun çubukla yöntemini taban çizgisinin tükürük üretim farklılıkları farklı suşları fareler tarafından algılar. (A) tükürük gelen kadın (10-12-hafta-yaşlı) fareler toplanan 15 dakikadır 0.375 mg/kg vücut ağırlığı Pilokarpin doz kullanarak. (B) ortalama vücut ağırlıkları farelerin grupları arasında önemli ölçüde farklı değildi. İstatistiksel anlamlılık analiz Kruskal-Wallis tarafından Dunn tarafından takip testi, birden fazla karşılaştırma testi 's. Bir p < 0,05 olarak önemli kabul. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: Pamuklu çubuk yöntemi algılar Tükürük bezi hypofunction. (A) (B6 X A / J) F1 dişi fareler ya LPS çözüm ile enjekte (0.1 mg/mL, fare, başına 0.1 mL intraperitoneally) ya da serum ve tükürük ölçülen 26 h daha sonra. Temsil edici bir deney önemli bir gösterir (p 0.0079 =) damla (% 60) farelerde tükürük üretiminde LPS ile tedavi. (B) Sjoegren Sendromu için bir deneysel fare modeli sisteminde Tükürük bezi hypofunction ölçülmüştür. Birkaç değişiklik ile kullanılan4 indüksiyon glandüler disfonksiyon için daha önce yayımlanmış Pasif transfer modeliydi. Kadın C57BL/6 fare (10-12 hafta yaşlı) şap adjuvan ile enjekte edildi. Günlerde 14 ve 20 fare ile 0,05 mL tavşan anti-Ro52 serum enjekte edildi ve tükürük üretimi ölçülen 24 h Not ettikten sonra bir önemli (p = 0,0003) damla (% 50) farelerde tükürük üretiminde şap ve anti-Ro52 serum ile tedavi. İstatistiksel anlamlılık analiz Kruskal-Wallis tarafından Dunn tarafından takip testi, birden fazla karşılaştırma testi 's. Bir p < 0,05 olarak önemli kabul. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: Pamuklu çubuk yöntemi zaman içinde (A) ve (B) operatörleri arasındaki tekrarlanabilir sonuçlar verir. Pamuklu çubuk yöntemi ile deneyim bir yıl içinde yapılan deneylerde işleme fare farklı uzunluklarını iki işleç arasında karşılaştırılabilir sonuçlarını gösterir. Temel tükürük üretim C57BL/6 dişi farelerde (10-13 hafta-in yaş) her operatör tarafından ölçüldü. Sonuçları üretilen tükürük (mg/g vücut ağırlığı) ağırlık ifade edilir. Tükürük toplama tarihleri x ekseni üzerinde ve zaman içinde toplanan veri sonuçlarını gösterilen (A). Her bir veri noktasını temsil eden tek bir fare ve fare her zaman analiz sayısı parantez içinde gösterilir. 3 deneylerden havuzlu temel tükürük oranları (ortalama + SEM) (B)gösterilir ve operatörler arasında önemli ölçüde farklı değildir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tükürük üretim karmaşık bir süreçtir ve birçok faktör tarafından etkilenir. Bu nedenle, Tükürük bezi işlevi laboratuvar hayvanlarda ölçme bir meydan okuma olabilir. Tükürük bezi fonksiyonunu kullanabilirsiniz aynı hayvan tekrarlanan ölçüler hastalığın başlangıcı kurmak için veya tedavi aşağıdaki kurtarma göstermek için gerekli olan bir ek mücadeledir.
Bu raporda açıklanan çubukla yöntem teknik olarak verileri göstermek için birden çok seçenek ile gerçekleştirmek basittir. Elde edilen sonuçlar küçük arası operatör varyasyon ile yeniden oluşturulabilir. Yöntem bir azalma Tükürük bezi disfonksiyon farklı modellerde tükürük üretiminde algılayabilir. Önemli bir avantaj etkisiz, yüksek emici polimerler kullanımı ve tükürük biomolecules ölçümü izin toplanan, tükürük verimli kurtarma olduğunu. Bu yöntemin bir diğer avantajı tek bir operatör tarafından bir defada aynı anda en fazla 2 farelerde bu yordamı gerçekleştirmek mümkün olmasıdır. Bu o bir kerede tek bir fare yapılacağı yeri önemli ölçüde daha bazı diğer yöntemlerden daha etkilidir.
Tükürük üretim ölçümleri değişkenlik tüm tükürük ölçüm teknikleri bane olmuştur. Değişkenlik en aza indirmek için kesinlikle iletişim kuralına uygun önemlidir. Kritik adımlar içerir: fareler Oruç ve tükürük toplamak için günün aynı saati seçerek, anestezik ve Pilokarpin (tablo 1) ve kuru ve ıslak temizleme bezi kayıtlarının doğru ağırlık dozaj uygun. Dikkatli zaman yönetimi 2 fareler kadar tükürük koleksiyonu için bir zaman ayarlamak için gereklidir.
Şekil 3' te gösterildiği gibi fareler tarafından üretilen tükürük miktarı zorlanma bağımlı var. Böylece, zorlanma, yaş ve cinsiyet uyumlu fare denetimleri kullanılması gereken uygun. Titrasyon Pilokarpin dozaj belirli zorlanma ve soruşturma altında deneysel durumu için şiddetle tavsiye edilir. Yüksek doz Pilokarpin 0.5 mg/kg ötesinde tükürük salgı hypofunction değerlendirmek için artan üretim neden olmaktadır, ancak daha düşük bir dozda kullanılması önerilir. Bu hastalıklı arasında tükürük üretiminde bile küçük farklılıklar tanımlanması için sağlar ve kontrol fareler. 0.5 mg/kg vücut ağırlığı ve 0.375 mg/kg vücut ağırlığı dozda başarıyla Tükürük bezi hypofunction göstermek için kullanılmıştır. Ancak, bazı deneysel model sistemleri koleksiyonu bu protokol için açıklanan daha kısa veya daha uzun süreler gerektirebilir unutulmamalıdır. Bu her laboratuvar tarafından test edilmelidir.
Bu yöntem ve çoğu tükürük ölçüm yöntemleri sınırlamasından anestezi için ihtiyaç vardır. Vakum yöntemi raporla anestezik5kullanımı dahil değildir. Ancak, anestezi yokluğu anksiyete farelerde çeşitli düzeylerde neden olmaktadır. Onlar mücadele ve tüp ısırık eğilimindedir ve bu sırayla, tükürük çıktı ve toplama verimliliği etkileyebilir. Sıçanlarda Isoflurane anestezi açılan indüklenen Pilokarpin tükürük üretim12neden olmaktadır. Buna ek olarak, ketamin sempatik stimülasyon13arası tükürük ve bronş salgılarını artırır. Biz ve diğerleri ketamin başarılı bir şekilde kullanmış ve tükürük üretim4,7,8,9xylazine karışımı Pilokarpin ölçmek için bir anestezik olarak indüklenen. Önerilen cerrahi anestezi için 100-200 mg/kg ketamin bas ve 5-16 mg/kg xylazine14aralıktır. 0.006 0.008 doz mL/g vücut ağırlığı (60-80 mg/kg ketamin bas ve 6-8 mg/kg xylazine karşılık gelen) Bu yöntemde kullanılan önerilen aralığın alt ucundaki düşer ve derin anestezi olmadan tutuklaması tutarlı bir düzeyde sağlamak için yeterli .
Pamuklu çubuk yöntemi rutin olarak kullanılan micropipet yöntemine alternatif olarak kurulmuştur. Damlalıklı yöntemi büyük dezavantajı yüksek arası operatör değişkenliği ve tükürük bir fare bir anda toplamak için gereken yapıldı. Pamuklu çubuk yöntemi hem bu sorunları giderir. İstatistiksel analizler ve verimlilik artışı güç elde etmek için gerekli hayvan sayısını sınırlama yararları. Pamuk temizleme bezi Nefelometri biyolojik olarak aktif molekülleri15etkisi bilinen bu yana yerine pamuk temizleme bezi etkisiz polimer temizleme bezi ile daha iyi bir seçenek sunuyoruz.
Pamuklu çubuk yöntemi ve farklı bireyler arasında yüksek, tekrarlanabilirlik kolaylığı göz önüne alındığında, bu çubukla yöntemi fare modelleri farklı laboratuar araştırmacılar ve kurumlar arasında daha iyi karşılaştırmalar kolaylaştıracaktır umulmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.
Acknowledgments
Çalışma Ulusal Sağlık enstitüleri, Ulusal Enstitüsü diş ve Fasiyal araştırma (DE025030) bir hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals for saliva collection | |||
| Pilocarpine hydrochloride | Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA | B21410 | Dilute in sterile isotonic saline. Store single use aliquots of 100X stock at -80oC |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia Mix solution | Mix 1 mL ketamine hydrochloride + 0.5 mL xylazine + 8.5 mL sterile isotonic saline in a sterile vial. Can be used for 3 months. | ||
| Zetamine (Ketamine hydrochloride) | Vet One, Boise, Idaho, USA | C3N VT1 | Stock is 100 mg/mL |
| Anased (Xylazine) | Med-Vet International, Mettawa, IL, USA | RXANASED-20 | Stock is 20 mg/mL |
| Isotonic sterile saline | Vet One, Boise, Idaho, USA | 501032 | Used as diluent |
| Artificial tears (lubricant ophthalmic ointment) | Henry Schien, Dublin, OH, USA | 48272 | Used to prevent eyes from drying during the procedure |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials for saliva collection | |||
| SalivaBio Children's swab | Salimetrics, LLC Carlsbad, CA, USA | N/A | Individually wrapped swabs |
| 50 mL polypropylene tubes | VWR, Radnor, PA, USA | 89004-364 | Cut off the bottom 1 cm of the tube. Make sure that the cut edge is smooth. |
| Microcentrifuge tubes 0.6 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-290 | Make holes in the bottom of tube with heated 18 gauge needles |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-298 | |
| Insulin Syringes with permanently attached needles | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 324702 | |
| 18 gauge regular bevel needles | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 305195 | |
| Sterile scalpel blade #11 | Integra York Inc PA, USA | 4-311 | |
| Microdissecting forceps | Roboz, Gaithersburg, MD, USA | RS-5139 | Serrated angular 0.8 mm tip, 4" length |
| Label tape | Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA | sc-224487 | |
| 3 channel timer | Amazon.com, Seattle, WA, USA | B06W2KCYVN | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo, Columbus OH, USA | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals/ reagents for inducing salivary dysfunction | |||
| LPS | Invivogen, San Deigo, CA, USA | tlrl-b5lps | Dissolve in endotoxin free water, and store stock solution at 5 mg/mL . dilute in sterile HBSS 100 ug/mL - inject 100 uL/ moue ip |
| Imject Alum adjuvant | Thermo Scientific | 77161 | Dilute 1:1 in sterile saline. Inject intraperitoneally 0.1 mL/mouse |
| Rabbit anti-Ro52 antiserum | Generated in lab | Immunization of rabbits with recombinant mouse Ro52 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals/ Kits for saliva analyses | |||
| Salivary lysozyme estimation | |||
| EnzChek Lysozyme Assay Kit | Molecular Probes, Eugene, OR, USA | E-22013 | Used as per manufacturer's instructions |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salivary IgA estimation by sandwich ELISA | |||
| Mouse IgA | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 0106-01 | Standards for sandwich ELISA - range 30 ng/mL to 0.5 ng/mL |
| Goat anti- mouse IgA unlabeled | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-01 | Coat at 1 ug/mL in bicarbonate buffer |
| Goat anti- mouse IgA HRP | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-05 | Detection antibody used at 1:4000 dilution |
| TMB substrate | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 555214 | Used as per manufacturer's instructions |
| Immulon 4HBX Microtiter 96 well plates | Thermo Scientific, Rochester, NY, USA | 3855 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salivary protein estimation | |||
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | BioRad, Hercules, CA, USA | 5000006 | For protein estimation as per manufacturer's instructions |
References
- Proctor, G. B. The physiology of salivary secretion. Periodontol 2000. 70 (1), 11-25 (2016).
- Fox, R. I. Sjögren's syndrome. Lancet. 366 (9482), 321-331 (2005).
- Eisbruch, A., Kim, H. M., Terrell, J. E., Marsh, L. H., Dawson, L. A., Ship, J. A. Xerostomia and its predictors following parotid-sparing irradiation of head-and-neck cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 50 (3), 695-704 (2001).
- Marmary, Y., Fox, P. C., Baum, B. J. Fluid secretion rates from mouse and rat parotid glands are markedly different following pilocarpine stimulation. Comp Biochem Physiol A Comp Physiol. 88 (2), 307-310 (1987).
- Lin, A. L., Johnson, D. A., Wu, Y., Wong, G., Ebersole, J. L., Yeh, C. K. Measuring short-term gamma-irradiation effects on mouse salivary gland function using a new saliva collection device. Arch Oral Biol. 46 (11), 1085-1089 (2001).
- Scofield, R. H., Asfa, S., Obeso, D., Jonsson, R., Kurien, B. T. Immunization with short peptides from the 60-kDa Ro antigen recapitulates the serological and pathological findings as well as the salivary gland dysfunction of Sjogren's syndrome. J Immunol. 175 (12), 8409-8414 (2005).
- Deshmukh, U. S., Nandula, S. R., Thimmalapura, P. R., Scindia, Y. M., Bagavant, H. Activation of innate immune responses through Toll-like receptor 3 causes a rapid loss of salivary gland function. J Oral Pathol Med. 38 (1), 42-47 (2009).
- Deshmukh, U. S., Ohyama, Y., Bagavant, H., Guo, X., Gaskin, F., Fu, S. M. Inflammatory stimuli accelerate Sjögren's syndrome-like disease in (NZB x NZW)F1 mice. Arthritis Rheum. 58 (5), 1318-1323 (2008).
- Szczerba, B. M., et al. Interaction between innate immunity and Ro52-induced antibody causes Sjögren's syndrome-like disorder in mice. Ann Rheum Dis. 75 (3), 617-622 (2016).
- Takakura, A., Moreira, T., Laitano, S., De Luca Júnior, L., Renzi, A., Menani, J. Central muscarinic receptors signal pilocarpine-induced salivation. J Dent Res. 82 (12), 993-997 (2003).
- Yao, C., et al. Lipopolysaccharide-induced elevation and secretion of interleukin-1beta in the submandibular gland of male mice. Immunology. 116 (2), 213-222 (2005).
- Knudsen, J., Nauntofte, B., Josipovic, M., Engelholm, S. A., Hyldegaard, O. Effects of isoflurane anesthesia and pilocarpine on rat parotid saliva flow. Radiat Res. 176 (1), 84-88 (2011).
- Kohrs, R., Durieux, M. E. Ketamine: teaching an old drug new tricks. Anesth Analg. 87 (5), 1186-1193 (1998).
- Cold Spring Harbor Protocols. Cold Spring Harb Protoc. , Available from: http://cshprotocols.cshlp.org/ (2006).
- Kozaki, T., Hashiguchi, N., Kaji, Y., Yasukouchi, A., Tochihara, Y. Effects of saliva collection using cotton swab on cortisol enzyme immunoassay. Eur J Appl Physiol. 107 (6), 743-746 (2009).
