Eine Methode zur Messung der Speicheldrüse Funktion bei Mäusen

Summary

Speicheldrüse Unterfunktion ist eine häufige Folge von Autoimmun-Krankheit und Strahlentherapie. Reproduzierbare Beurteilung der Speicheldrüse Funktion in Mausmodellen dieser Krankheiten ist eine technische Herausforderung. Hier ist eine einfache Methode für die genaue und reproduzierbare Messung der Speichelproduktion bei Mäusen beschrieben.

Abstract

Patienten mit Sjögren Syndrom, eine Autoimmunerkrankung, die Auswirkungen auf die therapeutisches Drüsen, Entzündung der Speicheldrüse zu entwickeln und Speichelproduktion reduziert haben. Ebenso ist Speichelproduktion bei Patienten, die Strahlentherapie bei Kopf-Hals-Tumoren stark beeinträchtigt. Nager-Modelle entwickelt, um diese Krankheitsbilder imitieren ein Verständnis der Pathogenese der Krankheit erleichtern und die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien ermöglichen. Daher ist die Fähigkeit, präzise, reproduzierbar und wiederholt Speicheldrüse Funktion in Tiermodellen messen entscheidend. Aufbauend auf den bisher in der Literatur beschriebenen Verfahren, wurde eine Methode entwickelt, die diese Kriterien erfüllt und wurde verwendet, um die Speicheldrüse Funktion bei Mäusen zu bewerten. Ein weiterer Vorteil dieser neuen Methode ist, dass es problemlos gemeistert und wenig Inter-Operator-Variation hat. Speicheldrüse Funktion wird als die Menge (Gewicht oder Volumen) oder die Rate (mL/min) in Reaktion auf die Pilocarpin Stimulation produziert Speichel ausgewertet. Die gesammelten Speichel ist eine gute Quelle für die Analysen der Eiweißgehalt, Immunglobulin-Konzentrationen und andere Biomoleküle.

Introduction

Die Speicheldrüsen produzieren Speichel in Reaktion auf eine Vielzahl von neurologischen und mechanische Reize¹. Die Reize werden durch die sympathischen und parasympathischen Nervensystem an die adrenergen und cholinergen Rezeptoren in der Drüse durchgeführt. Pilocarpin ist ein cholinergen, Para-Sympathomimetikum, das überwiegend auf Muskarin-Rezeptoren wirkt. In der Speicheldrüse induziert es die Produktion von Speichel durch Einwirkung auf die Muskarin Acetylcholin-Rezeptor M3¹. Speichelproduktion nach Pilocarpin Gabe ist ein Indikator für die Fähigkeit der Speicheldrüsen, auf Reize reagieren und wird allgemein als ein Maß für die Speicheldrüse Funktion verwendet.

Genaue Messung der Speichelproduktion ist entscheidend für das Studium der Speicheldrüse Krankheiten einschließlich Sjögren Syndrom² und Strahlung Verletzung nach Kopf und Nacken Krebs Behandlung³. Verschiedene Methoden wurden entwickelt, um die Speichelproduktion bei Nagetieren zu messen. Dazu gehören direkte Kanülierung der Speicheldrüsen Ausführungsgang⁴, die Sammlung von Speichel aus der Mundhöhle unter Vakuum⁵und Inkasso mit Glas Kapillaren⁶ oder einer Mikropipette^{7,8, 9}. direkte Kanülierung der Speicheldrüsen Rohrleitung bietet am meisten präzise und reine Speichel. Aber dies ist eine technisch anspruchsvolle Verfahren und das Potenzial für Umstehende Duktales schließt sich wiederholende Speichel Sammlungen vom selben Tier. Sammeln von Speichel unter Vakuum führen zu unterschiedliche Ergebnisse durch Trocknung des Speichels aus dem Rohr. Dieser Verlust ist bei Mäusen mit reduzierter Speichelfluss weiter übertrieben. Glaskapillaren erlauben die Sammlung des Speichels für spätere Analysen, Veränderungen in der Viskosität des Speichels abgesondert im kranken Zustand verhindert jedoch, dass effiziente Füllung der Kapillare. Darüber hinaus können Versuche die Mundhöhle residual Speichel sammeln zu fegen zu Verletzungen führen. Pipettieren Methode ermöglicht die komplette Sammlung, und für den gleichen Betreiber ist es bemerkenswert konsistent zwischen Experimente. Aus unbekannten Gründen zeigt diese Methode jedoch erhebliche Unterschiede zwischen verschiedenen Betreibern. Daher um entsprechende Vergleiche zu ermöglichen, ist es zwingend notwendig, dass die gleiche Betreiber alle Experimente, die im Zusammenhang mit einem bestimmten Projekt führt. Natürlich ist dies einen großen Nachteil für ein Labor.

Um diese Probleme zu überwinden, wurde ein Verfahren entwickelt, dass verbindet Speichel Erhebungsmethoden für Menschen und Nagern verwendet. Die unten beschriebene, für Pilocarpin induzierten Speichel Messvolumen Tupfer-Methode ist einfach, reproduzierbar und nicht beeinflusst durch den Betreiber und immer wieder in das gleiche Tier durchgeführt werden kann. Darüber hinaus ermöglicht es den Speichel für spätere Analysen von Proteinen, Immunglobuline oder andere Biomoleküle zu sammeln.

Protocol

Die nachfolgend beschriebene Protokoll von institutionellen Animal Care und Use Committee genehmigt wurde und es folgt die ethischen Leitlinien durch die National Institutes of Health. Alle Daten, die in diesem Bericht vorgestellten entstanden mithilfe von weiblichen Mäusen, die 10-12 Wochen alt waren. Die folgenden Stämme von Mäusen wurden verwendet: C57BL/6, BALB/c, DBA1, 129S und F1 (B6XA/J). Alle Mäuse waren in Barriere Käfigen (5 Tiere pro Käfig) in bestimmten Pathogen-freies Bedingungen untergebracht und Futter und Wasser ad libitum zur Verfügung gestellt.

1. Vorbereitung

1. Zur Vorbereitung einer Stammlösung Pilocarpin Hydrochlorid wiegen Sie 10 mg der Verbindung und durch Vortexen, geben eine Stammlösung von 5,63 mg/mL in 1,776 mL sterile isotonische Kochsalzlösung zu lösen. Es gibt keine Notwendigkeit, diese Lösung zu sterilisieren. Aber wenn gewünscht, durch einen 0,2 µM-Filter filtern. Diese Stammlösung in mehrere Aliquote in einer Gefriertruhe-80 ^oC für bis zu 3 Monate aufbewahren. Jedes gefrorene Lager ist für den einmaligen Gebrauch. Einmal aufgetaut, nicht wieder einfrieren Sie die Pilocarpin-Lösung.
2. Nehmen Sie 0,6 mL Microfuge Röhren und Punsch vorsichtig ein kleines Loch in den Boden des jedes Rohr mit einer beheizten 18-Gauge-Nadel. Diese Rohre in 2 mL Röhrchen gesetzt. Die Rohre müssen nicht steril sein.
3. Mit einer scharfen, sterilen Rasierklinge, zylindrische absorbierenden Tupfer in Stücke ca. 2 cm Länge schneiden. Schneiden Sie jedes 2 cm Stück Diagonal um 2 konisch geformte Abstriche geben. Ein Tupfer in jedes 0,6 mL Microfuge Rohre.
4. Wiegen der 0,6 mL Microfuge Tube mit den trockenen Tupfer.
5. Übertragen Sie die Mäuse in einen neuen sauberen Käfig mit Wasserflaschen untersucht werden. Halten Sie die Mäuse ohne Nahrung für mindestens 2 h vor Beginn der Speichel Sammlung zu verhindern, dass Speisereste verunreinigt den Speichel gesammelt.
   Hinweis: Es ist nicht notwendig, 1 Maus pro Käfig für dieses Verfahren zu halten. Allerdings hängt die Anzahl der Mäuse in jedem Käfig platziert auf die spezifische Einrichtung Regeln und Vorschriften für die Verwendung von Tieren.
6. Kurz vor Ende des 2 h bereiten Sie die Arbeitslösung Pilocarpin (0,0563 mg/mL) durch eine Verdünnung der Stammlösung 100 X in sterile Kochsalzlösung. Es ist nicht notwendig, weitere Filter diese Lösung zu sterilisieren. Halten Sie immer die Arbeitslösung Pilocarpin auf Eis.
   Hinweis: Die Tabelle 1 gibt die Menge an Pilocarpin für verschiedenste Maus Körpergewicht zu geben eine endgültige Dosis von 0,375 mg/kg Körpergewicht gespritzt werden.

(2) Verfahren

1. Jede Maus wiegen und die Dosis des Narkose-Mix für jede Maus mit Tabelle 1zu bestimmen. Die erste Maus mit den entsprechenden Volumen des Narkose-Mix durch die intraperitoneale Route zu injizieren. Stellen Sie den Timer für 2 min (die meisten Mausstämme getestet in diesem Protokoll schlafen gehen von 2 min). Stellen Sie sicher, dass die Maus richtig, durch Mangel an spazieren betäubt ist, als auf einer ebenen Fläche aufgestellt. Wenn die Maus noch zu Fuß unterwegs ist, warten Sie weitere 2 min bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Geben Sie einen Tropfen Gleitmittel ophthalmologischen Salbe auf beiden Augen um Austrocknen zu verhindern.
   Hinweis: In der Tabelle 1ist die Dosis des Narkose-Mix 0,007 mL/g Körpergewicht. Der optimale Bereich für dieses Verfahren ist 0,006 bis 0,008 mL/g Körpergewicht. Doch nach 4 min, wenn die Maus ist noch Fuß oder ruckartige Bewegungen ausstellen mit der institutionellen Tierarzt für angemessene Erhöhung der Dosis des Betäubungsmittels zu konsultieren.
2. Bestimmen Sie die Dosis von Pilocarpin für die Maus mit Tabelle 1 und injizieren Sie die entsprechende Menge durch die intraperitoneale Route. Stellen Sie den Timer für 2 min und legen Sie die Maus in 50 mL Restrainer Rohr, bis der Kopf und die Ohren aus das abgeschnittene Ende kleben. Legen Sie das Rohr in einem Winkel von 45 Grad mit dem Kopf nach unten, und der ventralen Oberfläche nach oben zeigt. Kleben Sie den Schlauch an dem Verfahren-Brett, um es vom bewegen zu halten.
   Anmerkung: Tabelle 1 liefert Dosierung für Mäuse mehr als 17 g, da dieses Verfahren nicht an Mäusen mit einem Gewicht von unter 17 g unternommen wurde.
3. Am Ende 2 min sanft legen Sie ein geschlossenes paar Mikro Zange in den Mund zu zerlegen und heben Sie den Unterkiefer nach oben, um den Mund zu öffnen. Drücken Sie die Zange 1 – 2 mm weiter in den Mund, um sicherzustellen, dass die Zunge ruht auf den oberen Arm der Zange gesehen wird. Halten Sie mit einem anderen paar feine Pinzette die vorgewogene trockenen Tupfer in der Nähe der konische Spitze.
4. Ziehen Sie vorsichtig das konische Ende des Tupfers in den Mund. Zurückziehen der Zange beim Verlassen des Ende des Tupfers in die Mundhöhle.
5. Fassen Sie das breitere Ende des Tupfers außerhalb der Mündung Verlängerung und drehen Sie ihn um die maximale Fläche des Kontaktes mit dem Mund zu ermöglichen. Halten Sie den Tupfer in dieser Position für 15 min.
   Hinweis: Dies stellt sicher, dass die Tupfer für die Dauer der Sammlung im Mund bleibt. Beachten Sie, dass das konische Ende des Tupfers wie ein Docht wirkt und der breitere Teil des Tupfers außerhalb des Mundes bleibt.
6. Am Ende von 15 min sanft Drehen Sie den Tupfer jede Speichel zu sammeln, die nicht aufgenommen worden und den feuchten Tupfer in der 0,6 mL Microfuge Tube. Verschließen Sie das Röhrchen und setzen Sie ihn in der 2 mL Tube auf Eis gelegt.
   Hinweis: Zu diesem Zeitpunkt die Mundschleimhaut vollständig trocken erscheint. Die Maus kann nun wieder in seinem Käfig für die Wiederherstellung aus der Narkose verschoben werden.
7. Übertragen Sie die Maus in den Käfig. Platzieren Sie feuchte Lebensmittel Pellets in den Käfig nach Speichel Sammlung schneller Rehydratation helfen.
   Hinweis: Die Mäuse aufwachen innerhalb von 10 min nach dem Ende der Auflistung. Subkutane Injektion von 0,2 mL vorgewärmten isotonische Kochsalzlösung kann auch gegeben werden, um die Genesung zu beschleunigen.
8. Fahren Sie mit der nächsten Maus. Alles, was die Mäuse sollten überwacht werden, bis sie sich vollständig erholt haben und sind ambulante.

(3) Messungen

1. Am Ende aller Kollektionen wiegen Sie die 0,6 mL Röhrchen mit den feuchten Tupfer. Berechnen Sie die Differenz zwischen dem Frischgewicht und Trockengewicht, das Gewicht der Speichel produziert zu bekommen. Setzen Sie die 0,6 mL-Tube mit Speichel wieder in der 2-mL-Tube.
2. Schneiden Sie die Kappen der 2 ml Röhrchen. Zentrifugieren Sie dann die 2 mL Röhrchen für 2 min bei 7500 X g bei 4oC in ein Mikro Zentrifuge, den Speichel zu erholen. Messen Sie das Volumen der Speichel mit einer Mikropipette erzielt.
3. Express die Ergebnisse als Speichel Gewicht (mg)¹⁰ über 15 min oder als ein Verhältnis von Speichel Gewicht (mg) / Gewicht (g) die Maus.
   Hinweis: Wenn das Volumen des Speichels extrahiert aus den Tupfer gemessen wurde, zum Ausdruck bringen die Ergebnisse als das Volumen des Speichels wiederhergestellt (mL) oder das Verhältnis von Speichel Volumen (mL) / Gewicht (g) Maus.

Representative Results

In der experimentellen Maus-Modellsystemen ist die Fähigkeit, Speichel in Reaktion auf die Pilocarpin Stimulation produzieren als Indikator der Speicheldrüse Funktion verwendet. Speichelproduktion wurde in 11 Wochen alten C57BL/6 weiblichen Mäusen durch die Tupfer-Methode gemessen. Die Ergebnisse sind in Abbildung 1Aals die Menge des Speichels (mg) gesammelten nach zunehmenden Dosen von Pilocarpin ausgedrückt. Bei der Dosis von 1 mg/kg Körpergewicht begannen einige der Mäuse not (unfreiwillige zittern und Frösteln) ausstellen. Höhere Dosen von Pilocarpin, über 1 mg/kg Körpergewicht wurden daher nicht in dieser Studie getestet. In Abbildung 1 bsind die Ergebnisse als das Verhältnis von Speichel Gewicht (mg), die Maus-Körper-Gewicht (g) vertreten. Insgesamt zeigen diese Daten eine gute Dosis-Wirkungs-Beziehung zwischen Pilocarpin Betrag und Speichel Produktion. Das Volumen des Speichels erholte sich von den Tupfer wurde ebenfalls gemessen. Wie in Abbildung 1dargestellt, gibt es eine deutliche Übereinstimmung zwischen Speichel Gewicht und Volumen, wobei 1 mg des Speichels 0,001 mL entspricht.

Die erzielten Ergebnisse mit dem Tupfer-Methode sind ähnlich denen, die mit der Pipette Erfassungsmethode. Abbildung 2A zeigt, dass die durchschnittliche Menge des Speichels gesammelt durch die Tupfer-Methode und die Methode Pipettieren sehr ähnlich ist und die Unterschiede statistisch nicht signifikant sind. Abbildung 2 b 2 C und 2D zeigen, dass die Tupfer-Methode keine auf Schätzung der Biomoleküle im Speichel Auswirkungen. In der Tat zeigte die Tupfer-Methode im Vergleich zu pipettieren Methode, eine insgesamt höhere Tendenz in den mittleren Ebenen der Speicheldrüsen Gesamtprotein (Abbildung 2), Speichel Lysozym-Aktivität (Bild 2D) und Speichel IgA (Abbildung 2E). Diese Unterschiede waren jedoch statistisch nicht signifikant.

Die hier beschriebene Methode zur Sammlung der Speichel ist in der Lage zu erkennen, Unterschiede in der Höhe von Speichel produziert durch verschiedene Mausstämme (Abbildung 3) und Speicheldrüse Unterfunktion induziert durch verschiedene Erkrankungen (Abbildung 4). Abbildung 3A zeigt Ergebnisse von Pilocarpin induzierten Speichelproduktion von 10-12 Wochen alten weiblichen C57BL/6, BALB/c, DBA1/J und 129S6 Mäusen. Die 129S6 Mäuse produziert die niedrigste Menge des Speichels im Vergleich zu den anderen Stämmen. Es sei darauf hingewiesen, dass die Unterschiede in der Körpergewichte dieser Mäuse nicht signifikant unterschiedlich (Abb. 3 b). Als nächstes die Tupfer-Methode wurde verwendet, um die Speicheldrüse Unterfunktion zu erkennen, und zwei Beispiele sind in Abbildung 4dargestellt. Abbildung 4A zeigt ein repräsentatives Ergebnis der Speicheldrüse Unterfunktion induziert durch die Aktivierung der angeborenen Immunität nach Injektion von Lipopolysaccharid (LPS) (10 µg/Maus, intraperitoneal). Kontroll-Mäusen wurden mit Kochsalzlösung¹¹injiziert. LPS-behandelten Mäusen zeigen einen deutlichen Rückgang im Speichel, im Vergleich zu Kontrollen. Passive Übertragung von Antikörpern reaktive mit Sjögren Syndrom Antigen A/Ro52 induziert Speicheldrüse Unterfunktion, und dieses Modell imitiert bestimmte Aspekte des Sjögren Syndrom-⁹. Wie in Abbildung 4 bdargestellt, Mäusen injiziert mit adjuvanten Alaun plus Anti-Ro52 Antikörper zusammen hatten deutlich geringer im Vergleich zu unbehandelten Mäusen Speichelproduktion oder Mäuse behandelt nur mit Alaun.

Die Tupfer-Methode ist einfach zu implementieren und unabhängiger Betreiber. Abbildung 5 zeigt die Speichelproduktion aus 10 13 Wochen alten weiblichen C57BL/6 Mäusen, in den Experimenten von 2 verschiedenen Betreibern zu 6 verschiedenen Zeitpunkten durchgeführt. Operator begann ich mit der Maus Umgang mit Erfahrung, während Betreiber II 6 Monate vorherige Maus Umgang mit Erfahrung hatte, aber nur, um den Speichel Erfassungsmethode für eine Woche eingeführt wurde nur 2 Monate. Diese Daten wurden Experimente durchgeführt, fast ein Jahr auseinander, mit 0,375 mg/kg Pilocarpin Dosis generiert. Die Speichel-Verhältnisse durch die beiden Betreiber zeigen eine Reihe von Lesungen (1,84, 5.87). Operator überspannt iche Experimente einen Zeitraum von 10 Wochen, während mehr als 3 aufeinanderfolgenden Tagen fast ein Jahr später (Abb. 5A) Operator II Experimente durchgeführt wurden. Vor allem die Speichel-Verhältnisse im Laufe der Zeit erhielt unterschieden sich nicht signifikant (p = 0.064; Kruskal-Wallis-Test). Um weitere Inter-Operator Variationen vergleichen, die Verhältnisse von Speichel-Gewicht / g Körpergewicht von 3 Versuche für jeden Bediener wurden zusammengefasst und sind in Abbildung 5 bgezeigt. Speichel-Verhältnisse, die vom Betreiber habe ich erworben (Mittel + SEM; 4,45 + 0.152, n = 38) unterscheiden sich nicht wesentlich von Operator 2 (Mittel + SEM; 4.21 + 0.169; n = 25; p = 0.296 Mann-Whitney-Test).

Abbildung 1: Speichelproduktion ist abhängig von Pilocarpin Dosis. C57BL6/J Mäusen (11 Wochen alten Weibchen, 5 pro Gruppe) wurden mit verschiedenen Dosierungen von Pilocarpin (0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg und 1,0 mg/kg Körpergewicht) injiziert und Speichelproduktion wurde für 15 min. (A) gemessen Ergebnisse als mg Speichel Betrag (Mittelwert ± SEM) dargestellt. (B) Daten sind als Mittelwert Speichel Verhältnis (Speichel mg pro Körpergewicht g Maus) vertreten. (C) Speichel von 11 Wochen alten weiblichen C57BL/6 Mäusen (n = 5) wurde von der Tupfer-Methode gesammelt. Pilocarpin diente bei einer Dosis von 0,375 mg/kg Körpergewicht. Die feuchten Tupfer wurden gewogen, um die Menge des Speichels produziert in mg zu messen. Der Speichel in die Tupfer wurde dann durch Zentrifugation gewonnen, und die Volumen der wiederhergestellten Speichel gemessen. Die bedeutende Abkommen sieht man zwischen den Speichel Gewicht in mg und Speichel Volumen in µL. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: die Tupfer-Methode hat keine Auswirkungen auf die Analyse von Biomolekülen im Speichel. Speichel von 2 Gruppen von 11 Wochen alten weiblichen C57BL/6 Mäusen, (n = 5 Mäusen pro Gruppe), wurden gesammelt, die Tupfer-Methode oder durch die Micropipet-Methode. Die Unterschiede im mittleren Mengen an Speichel (A), mittlere Mengen an Protein (B) Mengen von Lysozym-Aktivität (C) bedeuten, und bedeutet, dass Mengen von IgA zwischen den 2 Gruppen statistisch nicht signifikant sind. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3: die Tupfer Methode der Speichel Kollektion erkennt Unterschiede in der Grundlinie Speichelproduktion durch verschiedene Stämme von Mäusen. (A) Speichel von weiblichen Mäusen (10-12-Wochen alten) sammelten für 15 min mithilfe einer Pilocarpin Dosis von 0,375 mg/kg Körpergewicht. (B) die mittlere Körpergewicht zwischen den Gruppen von Mäusen waren nicht signifikant unterschiedlich. Statistischer Signifikanz wurde analysiert von der Kruskal-Wallis-Test, gefolgt von Dunn ist multiple Vergleiche-Test. Ein p < 0,05 galt als bedeutende. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4: Tupfer Methode erkennt Speicheldrüse Unterfunktion. (A) (B6 X A / J) F1 weibliche Mäusen wurden mit beiden LPS Lösung injiziert (0,1 mg/mL, 0,1 mL pro Maus, intraperitoneal) oder Kochsalzlösung und Speichel 26 h später gemessen wurde. Ein repräsentativere Experiment zeigt eine signifikante (p = 0.0079) (60 %) Rückgang der Speichelproduktion bei Mäusen mit LPS behandelt. (B) Speicheldrüse Unterfunktion wurde in einem experimentellen Maus-Modell-System für Sjögren Syndrom gemessen. Die bisher veröffentlichten Passive Übertragung Modell für die Induktion der glandulären Dysfunktion war verwendeten⁴ mit wenigen Änderungen. Weibliche C57BL/6 Mäusen (10-12 Wochen alt) wurden mit Alaun Adjuvans injiziert. An Tagen 14 und 20 Mäuse wurden mit 0,05 mL Kaninchen Anti-Ro52 Serum injiziert und Speichelproduktion gemessen nach 24 h. beachten Sie eine signifikante (p = 0,0003) (50 %) Rückgang der Speichelproduktion bei Mäusen mit Alaun und Anti-Ro52 Serum behandelt. Statistischer Signifikanz wurde analysiert von der Kruskal-Wallis-Test, gefolgt von Dunn ist multiple Vergleiche-Test. Ein p < 0,05 galt als bedeutende. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 5: die Tupfer-Methode liefert reproduzierbare Ergebnisse im Laufe der Zeit (A) und zwischen den Betreibern (B). Die Tupfer-Methode zeigt vergleichbare Ergebnisse zwischen den beiden Betreibern mit unterschiedlichen Längen der Maus Umgang mit Erfahrung in mehr als einem Jahr durchgeführten Versuche. Grundlinie Speichelproduktion bei weiblichen Mäusen C57BL/6 (10-13 Wochen alt) wurde von jedem Betreiber gemessen. Ergebnis wird als Gewicht der Speichel produziert (mg/g Körpergewicht) ausgedrückt. Termine der Speichel Sammlung sind auf der X-Achse und die Ergebnisse im Laufe der Zeit gesammelten Daten angezeigt (A). Jeder Datenpunkt stellt eine Maus, und die Anzahl der Mäuse, die zu jedem Zeitpunkt analysiert wird in Klammern angezeigt. Grundlinie Speichel Verhältnisse (Mittel + SEM) über 3 Experimente aggregiert werden angezeigt (B)und unterscheiden sich nicht signifikant zwischen den Betreibern. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Speichelproduktion ist ein komplexer Prozess und wird durch viele Faktoren beeinflusst. Daher kann die Messfunktion Speicheldrüse bei Versuchstieren eine Herausforderung sein. Eine zusätzliche Herausforderung ist, dass wiederholte Messungen der Speicheldrüse Funktion im gleichen Tier erforderlich, um den Ausbruch der Krankheit zu etablieren oder zur Erholung nach der Behandlung zeigen.

In diesem Bericht beschriebenen Tupfer-Methode ist technisch einfach mit mehreren Optionen zur Darstellung der Daten durchzuführen. Die Ergebnisse sind reproduzierbar, mit wenig Variation der Inter-Operator. Die Methode kann eine Reduzierung in Speichelproduktion in verschiedenen Modellen der Speicheldrüse Dysfunktion erkennen. Ein wesentlicher Vorteil ist die Verwendung von inert, hoch absorbierenden Polymeren und effiziente Rückgewinnung des Speichels gesammelt, ermöglicht die Messung von Speichel Biomoleküle. Ein weiterer Vorteil dieser Methode ist, dass es möglich ist, dieses Verfahren gleichzeitig in bis zu 2 Mäuse zu einem Zeitpunkt von einem einzigen Betreiber durchführen. Dies ist wesentlich effizienter als einige der anderen Methoden, wo ist es in einem einzigen Mausklick gleichzeitig ausgeführt.

Die Variabilität im Speichel Produktion Messungen wurden der Fluch aller Speichel Messtechniken. Um Schwankungen zu minimieren, ist es wichtig, sich strikt an das Protokoll. Wichtige Schritte umfassen: Auswahl der gleichen Tageszeit zum Fasten die Mäuse und Speichel sammeln, geeignete Dosierung des Betäubungsmittels und Pilocarpin (Tabelle 1) und genaue Gewicht Aufzeichnungen von trockenen und nassen Tupfer. Sorgfältige Zeitmanagement ist erforderlich, um bis zu 2 Mäuse gleichzeitig für Speichel Sammlung festlegen.

Wie in Abbildung 3dargestellt, ist die Menge des Speichels von Mäusen produziert Sorte abhängig. Damit geeignete Sorte, Alter und Geschlecht abgestimmte Mäuse als Steuerelemente verwendet werden soll. Titration von Pilocarpin Dosierung, für die spezifische Belastung und die Versuchsbedingung untersucht, wird dringend empfohlen. Obwohl eine höhere Dosis von Pilocarpin über 0,5 mg/kg vermehrte Produktion von Speichel induziert, auszuwertende glanduläre Unterfunktion empfiehlt es sich, eine niedrigere Dosis zu verwenden. Dies ermöglicht die Identifizierung auch kleine Unterschiede im Speichelproduktion zwischen erkrankten und Mäuse zu kontrollieren. Dosen von 0,5 mg/kg Körpergewicht und 0,375 mg/kg Körpergewicht sind erfolgreich benutzt worden, um Speicheldrüse Unterfunktion zu demonstrieren. Allerdings ist darauf hinzuweisen, dass bestimmte experimenteller Modellsysteme kürzere oder längere Zeit der Sammlung als beschrieben in diesem Protokoll verlangen können. Dies sollte von jedem Labor getestet werden.

Eine Einschränkung dieser Methode, und die meisten Speichel Messmethoden ist die Notwendigkeit für die Anästhesie. Der Bericht mit der Vakuummethode beinhaltet nicht die Verwendung von Narkose⁵. Das Fehlen der Anästhesie induziert jedoch unterschiedliche Niveaus der Angst in den Mäusen. Sie neigen dazu, zu kämpfen und beißen die Schläuche, und das wiederum Speichel Produktion und Sammlung Effizienz beeinflussen. Isofluran-Narkose bei Ratten induziert eine Drop-in Pilocarpin induzierten Speichel Produktion¹². Im Gegensatz dazu erhöht Ketamin Bronchial- und Speichel Sekrete durch sympathische Stimulation¹³. Wir und andere haben erfolgreich das Ketamin eingesetzt und Xylazin Mischung als Narkosemittel zur Messung von Pilocarpin induzierten Speichel Produktion^4,7,8,9. Der empfohlene Bereich für chirurgische Anästhesie ist 100-200 mg/kg Ketamin und Xylazin¹⁴5-16 mg/kg. Die Dosis von 0,006-0,008 mL/g Körpergewicht verwendet in dieser Methode (entspricht 60-80 mg/kg Ketamin und 6-8 mg/kg Xylazin) verliebt sich in das untere Ende des empfohlenen Bereichs und ist ausreichend für die Bereitstellung eines einheitlichen Niveau der Immobilisierung ohne Tiefe Narkose .

Die Tupfer Methode entstand als eine Alternative zu den routinemäßig verwendeten Micropipet-Methode. Der Hauptnachteil der Pipettieren Methode war die hohe Variabilität der Inter-Operator und die Notwendigkeit, Speichel aus einer Maus zu einem Zeitpunkt zu sammeln. Die Tupfer Methode richtet sich beide Probleme. Zu den Vorteilen gehören die Begrenzung der Zahl der Tiere notwendig, um die Macht in statistischen Analysen und höhere Effizienz zu erreichen. Ersetzt Wattestäbchen mit inerten Polymeren Tupfer bieten eine bessere Option, da Wattestäbchen zur Quantifizierung von biologisch aktiven Molekülen¹⁵Auswirkungen bekannt sind.

Angesichts die Einfachheit der Tupfer Methode und ihrer hohen Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Individuen, ist zu hoffen, dass die Tupfer Methode bessere Vergleiche von Mausmodellen zwischen Forschern in verschiedenen Laboratorien und Einrichtungen erleichtern wird.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals for saliva collection
Pilocarpine hydrochloride	Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA	B21410	Dilute in sterile isotonic saline. Store single use aliquots of 100X stock at -80oC
Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia Mix solution			Mix 1 mL ketamine hydrochloride + 0.5 mL xylazine + 8.5 mL sterile isotonic saline in a sterile vial. Can be used for 3 months.
Zetamine (Ketamine hydrochloride)	Vet One, Boise, Idaho, USA	C3N VT1	Stock is 100 mg/mL
Anased (Xylazine)	Med-Vet International, Mettawa, IL, USA	RXANASED-20	Stock is 20 mg/mL
Isotonic sterile saline	Vet One, Boise, Idaho, USA	501032	Used as diluent
Artificial tears (lubricant ophthalmic ointment)	Henry Schien, Dublin, OH, USA	48272	Used to prevent eyes from drying during the procedure
Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials for saliva collection
SalivaBio Children's swab	Salimetrics, LLC Carlsbad, CA, USA	N/A	Individually wrapped swabs
50 mL polypropylene tubes	VWR, Radnor, PA, USA	89004-364	Cut off the bottom 1 cm of the tube. Make sure that the cut edge is smooth.
Microcentrifuge tubes 0.6 mL	VWR, Radnor, PA, USA	87003-290	Make holes in the bottom of tube with heated 18 gauge needles
Microcentrifuge tubes 2 mL	VWR, Radnor, PA, USA	87003-298
Insulin Syringes with permanently attached needles	Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA	324702
18 gauge regular bevel needles	Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA	305195
Sterile scalpel blade #11	Integra York Inc PA, USA	4-311
Microdissecting forceps	Roboz, Gaithersburg, MD, USA	RS-5139	Serrated angular 0.8 mm tip, 4" length
Label tape	Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA	sc-224487
3 channel timer	Amazon.com, Seattle, WA, USA	B06W2KCYVN
Analytical Balance	Mettler Toledo, Columbus OH, USA
Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals/ reagents for inducing salivary dysfunction
LPS	Invivogen, San Deigo, CA, USA	tlrl-b5lps	Dissolve in endotoxin free water, and store stock solution at 5 mg/mL . dilute in sterile HBSS 100 ug/mL - inject 100 uL/ moue ip
Imject Alum adjuvant	Thermo Scientific	77161	Dilute 1:1 in sterile saline. Inject intraperitoneally 0.1 mL/mouse
Rabbit anti-Ro52 antiserum	Generated in lab		Immunization of rabbits with recombinant mouse Ro52
Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals/ Kits for saliva analyses
Salivary lysozyme estimation
EnzChek Lysozyme Assay Kit	Molecular Probes, Eugene, OR, USA	E-22013	Used as per manufacturer's instructions
Name	Company	Catalog Number	Comments
Salivary IgA estimation by sandwich ELISA
Mouse IgA	Southern Biotech, Birmingham, AL, USA	0106-01	Standards for sandwich ELISA - range 30 ng/mL to 0.5 ng/mL
Goat anti- mouse IgA unlabeled	Southern Biotech, Birmingham, AL, USA	1040-01	Coat at 1 ug/mL in bicarbonate buffer
Goat anti- mouse IgA HRP	Southern Biotech, Birmingham, AL, USA	1040-05	Detection antibody used at 1:4000 dilution
TMB substrate	Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA	555214	Used as per manufacturer's instructions
Immulon 4HBX Microtiter 96 well plates	Thermo Scientific, Rochester, NY, USA	3855
Name	Company	Catalog Number	Comments
Salivary protein estimation
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate	BioRad, Hercules, CA, USA	5000006	For protein estimation as per manufacturer's instructions