Summary
Spottkörtel svikt är en frekvent följd av autoimmun sjukdom och strålbehandling. Reproducerbara utvärdering av Saliv-körtel funktion i musmodeller av dessa sjukdomar är en teknisk utmaning. Här beskrivs en enkel metod för exakt och reproducerbar mätning av salivproduktion hos möss.
Abstract
Patienter med Sjögrens syndrom, en autoimmun sjukdom som påverkar de exokrina körtlarna, utveckla Saliv-körtel inflammation och har nedsatt salivproduktion. På samma sätt äventyras allvarligt salivproduktion hos patienter som får strålbehandling för huvud och hals cancer. Gnagare modeller, som utvecklats för att efterlikna dessa kliniska tillstånd, underlätta förståelsen av sjukdomen patogenesen och möjliggör utvecklingen av nya terapeutiska strategier. Därför är förmågan att korrekt reproducibly och upprepade gånger mäta Saliv-körtel funktion i djurmodeller kritisk. Bygger på förfaranden som tidigare beskrivits i litteraturen, utvecklades en metod som uppfyller dessa kriterier och användes för att utvärdera Saliv-körtel funktion hos möss. En ytterligare fördel med denna nya metod är att det är enkelt behärskar, och har lite mellan operatören variant. Saliv-körtel funktion bedöms som mängden (vikt eller volym) eller hastighet (mL/min) av saliv som produceras som svar på pilokarpin stimulering. Den samlade saliven är en bra källa för analyser av proteinhalt, immunglobulin koncentrationer och andra biomolekyler.
Introduction
Spottkörtlarna producerar saliv som svar på en mängd olika neurologiska och mekaniska stimuli1. Stimuli bärs genom det sympatiska och parasympatiska nervsystemet till adrenerga och kolinerga receptorer i körteln. Pilokarpin är en kolinerga, para-sympatomimetiska medel som verkar huvudsakligen på muskarina receptorer. I den saliv-körteln inducerar det produktion av saliv genom att agera på muskarina acetylkolin receptorns M31. Salivproduktion administrering pilokarpin är en indikator på spottkörtlarna förmåga att reagera på stimulans och används ofta som ett mått på Saliv-körtel funktion.
Noggrann mätning av salivproduktion är kritisk i studien av spottkörteln sjukdomar inklusive Sjögrens syndrom2 och strålning skada efter huvud och hals cancer behandling3. Flera olika metoder har utvecklats för att mäta salivproduktion hos gnagare. Dessa inkluderar direkta kanylering av utsöndringar saliv kanal4, insamling av saliv från munhålan under vakuum5och samling med glas kapillärer6 eller en mikropipett7,8, 9. direkta kanylering av saliv kanalen ger de mest exakta och rena saliv. Men detta är ett tekniskt krävande ingrepp och potentialen för duktal skadar utesluter repetitiva saliv samlingar från samma djur. Att samla saliv under vakuum kan leda till varierande resultat på grund av torkning av saliv från röret. Denna förlust är ytterligare överdriven hos möss med minskad salivavsöndring. Glas kapillärer tillåta insamling av saliv för efterföljande analyser, men förändringar i viskositet i saliv utsöndras i sjuka tillstånd förhindrar effektiv fyllning av kapillären. Vidare kan försök att sopa munhålan för att samla in resterande saliv leda till skada. Pipettera metoden möjliggör komplett samling, och för samma operatör, är det anmärkningsvärt konsekvent mellan experiment. Men av okänd anledning visar denna metod betydande variation mellan olika operatörer. Därför, för att möjliggöra lämpliga jämförelser, blir det nödvändigt att samma operatör utför alla de experiment som relaterade till ett visst projekt. Tydligt, utgör detta en stor nackdel för ett laboratorium.
För att övervinna dessa problem, utvecklades ett förfarande att kombinerar metoder för insamling av saliv används för människa och gnagare. Metoden kompress, som beskrivs nedan för att mäta pilokarpin-inducerad saliv volym är enkel, reproducerbara, inte påverkas av operatören, och kan utföras flera gånger på samma djur. Det kan dessutom samla saliv för efterföljande analys av proteiner, immunglobuliner eller andra biomolekyler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet beskrivs nedan godkändes av institutionella djur vård och användning kommittén och följer de etiska riktlinjer som fastställts av National Institutes of Health. Alla data som presenteras i denna rapport genererades med hjälp av honmöss som var 10-12 veckors ålder. Följande stammar av möss användes: C57BL/6, BALB/c, DBA1, 129S och (B6XA/J) F1. Alla möss var inrymt i barriär burar (5 djur per bur) i specifika patogenfria villkor och förutsatt att foder och vatten ad lib.
1. beredning
- För att förbereda en stamlösning av pilokarpin hydroklorid, väger 10 mg av föreningen och lös upp det i 1.776 mL steril isoton koksaltlösning genom vortexa, att ge en stamlösning 5,63 mg/ml. Det finns ingen anledning att sterilisera denna lösning. Men om du vill filtrera den genom ett 0,2 µM filter. Lagra denna stamlösning i flera alikvoter i-80 oC frys i upp till 3 månader. Varje fryst lager är för engångsbruk. När tinas, inte frysas pilokarpin lösningen.
- Ta 0,6 mL microfuge rör och noggrant punch ett litet hål i botten av varje tub med en uppvärmd 18 gauge nål. Ställa in dessa rör i 2 mL rör. Rören måste inte vara steril.
- Använda en skarp, sterila rakblad, skär cylindriska absorberande kompresser i bitar ca 2 cm i längd. Skär varje 2 cm bit diagonalt för att ge 2 konisk formade kompresser. Placera en kompress i varje 0,6 mL microfuge rören.
- Väg den 0,6 mL mikrofugrör med torra pinnen.
- Överföra mössen studeras in i en ny ren bur med vattenflaskor. Hålla mössen utan mat i minst 2 h före starten av saliv återvinningsstation så att matrester från att förorena saliv samlas in.
Obs: Det är inte nödvändigt att hålla 1 mus per bur för detta förfarande. Dock beror antalet möss som placeras i varje bur på specifika institutionens regler och bestämmelser för användning av djur. - Strax före slutet av 2 h, förbereda pilokarpin arbetslösning (0.0563 mg/mL) genom att späda ut stamlösning 100 x i steril koksaltlösning. Det är inte nödvändigt att ytterligare filter sterilisera denna lösning. Håll alltid pilokarpin arbetslösning på is.
Obs: Tabell 1 ger mängden pilokarpin injiceras för en rad mus kroppsvikter att ge en sista dos 0,375 mg/kg kroppsvikt.
2. förfarande
- Väga varje mus och bestämma dosen bedövningsmedel mix för varje mus med hjälp av tabell 1. Injicera den första musen med lämplig volym av bedövningsmedel mixen av intraperitoneal rutten. Ställ in timern för 2 min (de flesta mus stammar testas i detta protokoll gå för att sova av 2 min). Se till att musen är ordentligt bedövas av brist på promenader när den placeras på en plan yta. Om musen fortfarande gå, vänta på ytterligare 2 min innan du fortsätter till nästa steg. Applicera en droppe av smörjmedel oftalmologiska salva i båda ögonen att förhindra uttorkning.
Obs: I tabell 1, dosen bedövningsmedel mix är 0,007 mL/g kroppsvikt. Det optimala intervallet för denna procedur är 0,006 till 0,008 mL/g kroppsvikt. Men efter 4 min, om musen fortfarande promenader eller uppvisar ryckiga rörelser, samråda med den institutionella veterinären för att på lämpligt sätt öka dosen av bedövningsmedlet. - Bestämma dosen av pilokarpin för musen med hjälp av tabell 1 och injicera lämpligt belopp av intraperitoneal rutt. Ställ in timern för 2 min och in musen i 50 mL fasthållning röret tills huvud och öron sticka ur skär slutet. Placera röret i 45 graders vinkel, med huvudet nedåt, och den ventrala ytan vänd uppåt. Tejpa röret till förfarandet styrelsen att hålla den från att flytta.
Obs: Tabell 1 ger dosering för möss mer än 17 g, eftersom detta förfarande inte har varit försökt på möss som väger under 17 g. - I slutet av 2 min, försiktigt infoga ett stängt par micro dissekera tången i munnen och lyft den lägre käken uppåt för att öppna munnen. Tryck tången 1-2 mm längre in i munnen, att se till att tungan är sett vilar på den övre armen av tången. Med ett annat par fina pincett, håll före vägde torra pinnen nära dess konisk spets.
- Skjut försiktigt koniska spetsen på pinnen i munnen. Återkalla tången medan spetsen på pinnen i munhålan.
- Förstå den bredare änden av pinnen sträcker sig utanför munnen och rotera den så att den maximala arealen av kontakt med munnen. Hålla pinnen i den här positionen i 15 min.
Obs: Detta säkerställer att pinnen kvar i munnen under hela samlingen. Observera att konformade spetsen på pinnen fungerar som en veke och den breda delen av pinnen förblir utanför munnen. - I slutet av 15 min, försiktigt rotera pinnen för att samla in någon saliv som inte har absorberats och placera våta pinnen i 0,6 mL mikrofugrör. Nära röret och sätta den i 2 mL röret placeras på is.
Obs: Vid denna tid, munslemhinnan visas helt torr. Musen kan nu flyttas tillbaka till sin bur för återhämtning från anestesi. - Flytta musen i buren. Placera fuktade mat pellets i buren efter saliv samling att hjälpa snabbare rehydrering.
Obs: Möss vakna upp inom 10 min efter slutet av samlingen. Subkutan injektion av 0,2 mL före värmde isoton koksaltlösning ges också att påskynda återhämtning. - Gå vidare till nästa musen. Alla möss bör övervakas tills de har återhämtat sig helt och är ambulatory.
3. mätningar
- I slutet av alla samlingar, väga 0,6 mL tuberna med våta pinnen. Beräkna skillnaden mellan våtvikt och torr vikt att få vikten på saliv som produceras. Placera 0,6 mL röret med saliv tillbaka i 2 mL röret.
- Skär av locken av 2 ml rör. Sedan Centrifugera 2 mL tuberna för 2 min vid 7500 x g, vid 4oC i en mikro centrifug återställa saliv. Mäta volymen av saliv som erhålls med hjälp av en mikropipett.
- Uttryck resultatet som saliv vikt (mg)10 över 15 min eller som en kvot av saliv vikt (mg) / mus kroppsvikt (g).
Obs: Om mängden saliv som utvinns ur pinnen har mätts, redovisa resultaten som volymen av saliv återhämtat sig (mL) eller förhållandet mellan saliv volym (mL) / mus kroppsvikt (g).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I experimentella mus modellsystem används förmågan att producera saliv som svar på pilokarpin stimulering som en indikator på Saliv-körtel funktion. Salivproduktion mättes i 11 veckor gamla C57BL/6 honmöss av metoden kompress. I figur 1Auttrycks resultaten som mängden saliv (mg) som samlats in efter ökande doser av pilokarpin. Vid dosen 1 mg/kg kroppsvikt började några av möss uppvisar nöd (ofrivilliga skakningar och frossa). Högre doser av pilokarpin, utöver 1 mg/kg kroppsvikt testades därför inte i denna studie. I figur 1Brepresenteras resultaten som förhållandet mellan saliv vikt (mg) till musen kroppsvikt (g). Dessa uppgifter visar sammantaget en god dos-respons-samband mellan pilokarpin belopp och saliv produktion. Mängden saliv som återhämtat sig från pinnen mättes också. Som visas i figur 1 c, finns det en betydande överensstämmelse mellan saliv vikt och volym där 1 mg av saliv motsvarar 0,001 mL.
De resultat som erhålls med metoden provstickan är liknande dem som erhållits med pipett samling metod. Figur 2A visar att genomsnittliga mängden saliv som samlats in av pinnen metoden och metoden Pipettera är mycket lik och skillnaderna är statistiskt inte betydande. Figur 2B Visar att metoden pinnen inte påverkar uppskattning av biomolekyler i saliv , 2 C och 2D . I själva verket jämfört med metoden Pipettera metoden pinnen visade en övergripande högre trend i de genomsnittliga nivåerna av saliv totalprotein (figur 2 c), saliv lysozym verksamhet (figur 2D) och saliv IgA (figur 2E). Dessa skillnader var dock inte statistiskt signifikant.
Den saliv insamlingsmetod som beskrivs här är kunna upptäcka skillnader i mängden saliv som produceras av olika mus stammar (figur 3) och Saliv-körtel svikt induceras av olika sjukdomstillstånd (figur 4). Figur 3A visar resultaten av pilokarpin inducerad salivproduktion från C57BL/6, BALB/c, DBA1/J och 129S6 10-12-vecka-gammal honmöss. 129S6 möss produceras det lägsta beloppet av saliv jämfört med andra stammar. Det bör noteras att skillnaderna i kroppsvikter av dessa möss inte var signifikant (figur 3B). Nästa, provstickan metoden användes för att upptäcka spottkörtel svikt och två exempel visas i figur 4. Figur 4A visar ett representativt resultat av spottkörtel svikt induceras av aktivering av medfödd immunitet efter injektion av lipopolysackarid (LPS) (10 µg/mus, intraperitonealt). Kontroll möss injicerades med saltlösning11. LPS-behandlade möss visar en betydande nedgång i saliv jämfört med kontroller. Passiv överföring av antikroppar som är reaktiva med Sjögrens syndrom antigen A/Ro52 inducerar spottkörtel svikt, och denna modell härmar vissa aspekter av Sjögrens syndrom9. Som visas i figur 4B, möss injiceras med adjuvant Alun plus anti-Ro52 antikroppar hade tillsammans betydligt lägre salivproduktion jämfört med obehandlade möss eller möss behandlas endast med Alun.
Provstickan metoden är enkel att implementera och operatör oberoende. Figur 5 visar salivproduktion från 10-13-vecka-gammal kvinnlig C57BL/6 möss, i experiment utförs på 6 olika tidpunkter av 2 olika operatörer. När jag började med bara 2 månader av mus hantering erfarenhet medan operatören II hade 6 månader av tidigare mus hantering erfarenhet, men infördes endast till metoden saliv samling för en vecka. Dessa data har genererats i experiment genomförs nästan ett år isär, med pilokarpin dos 0,375 mg/kg. De saliv-tal som fås av båda aktörer visar en rad avläsningar (1,84 till 5,87). Operatören i's experiment spännde över en period av 10 veckor medan operatören II: s experiment utfördes över 3 dagar nästan ett år senare (figur 5A). Särskilt, de saliv-tal som fås över tid inte var signifikant (p = 0,064; Kruskal-Wallis test). För att ytterligare jämföra mellan operatören variationer, nyckeltalen saliv vikt per g kroppsvikt från 3 experiment för varje aktör var poolade och visas i figur 5B. Saliv nyckeltal som erhållits av person jag (medelvärde + SEM; 4,45 + 0,152, n = 38) skiljer sig inte avsevärt från operatör 2 (medelvärde + SEM; 4,21 + 0.169; n = 25; p = 0.296 av Mann-Whitney test).
Figur 1: saliv produktionen är beroende av pilokarpin dos. C57BL6/J möss (11 veckor gamla kvinnor, 5 per grupp) injicerades med olika doser av pilokarpin (0,25 mg, 0,5 mg/kg och 1,0 mg/kg kroppsvikt) och salivproduktion mättes för 15 min. (A) resultat är representerade som mg saliv belopp (medelvärde ± SEM). (B) Data representeras genomsnittliga saliv baserat (mg saliv per g mus kroppsvikt). (C) saliv från 11 veckor gamla kvinnliga C57BL/6 möss (n = 5) samlades in av metoden kompress. Pilokarpin användes vid en dos 0,375 mg/kg kroppsvikt. De våta kompresser vägdes för att mäta mängden saliv som produceras i mg. Saliv i svabbarna återfanns sedan genom centrifugering, och volymerna av återvunna saliv mättes. Betydande avtalet ses mellan saliv vikten i mg och saliv volym i µL. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: metoden provstickan påverkar inte analysen av biomolekyler i saliven. Saliv från 2 grupper av 11 veckor gamla kvinnliga C57BL/6 möss, (n = 5 möss per grupp), samlades in av metoden kompress eller av metoden micropipet. Skillnader i genomsnittliga volymer av saliv (A), genomsnittlig mängder protein (B), betyda mängder lysozym verksamhet (C), och menar mängder IgA mellan de 2 grupperna är statistiskt inte signifikanta. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: metoden pinnen i saliv samling upptäcker skillnader i base line salivproduktion av olika stammar av möss. (A) saliv från honmöss (10-12-vecka-gammal) samlades för 15 min med hjälp av en pilokarpin dos 0,375 mg/kg kroppsvikt. (B) de genomsnittliga kroppsvikter mellan grupperna av möss var inte signifikant. Statistisk signifikans analyserades genom den Kruskal-Wallis test, följt av Dunn's flera jämförelser test. En p < 0.05 ansågs betydande. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: pinnen metod upptäcker spottkörtel svikt. (A) (B6 X A / J) F1 kvinnliga möss injicerades med antingen LPS-lösning (0,1 mg/mL, 0,1 mL per mus, intraperitonealt) eller saltlösning och saliv mättes 26 h senare. En representativ experiment visar en signifikant (p = 0.0079) droppe (60%) i salivproduktion hos möss behandlades med LPS. (B) spottkörtel svikt mättes i en experimentell mus modellsystem för Sjögrens syndrom. Tidigare publicerade passiv överföring modellen för induktion av glandular dysfunktion var begagnad4 med några ändringar. Kvinnliga C57BL/6 möss (10-12 veckor gamla) injicerades med Alun adjuvant. Dagar 14 och 20 möss injicerades med 0,05 mL kanin anti-Ro52 serum och salivproduktion mättes efter 24 h. Observera en signifikant (p = 0.0003) droppe (50%) i salivproduktion hos möss behandlades med Alun och anti-Ro52 serum. Statistisk signifikans analyserades genom den Kruskal-Wallis test, följt av Dunn's flera jämförelser test. En p < 0.05 ansågs betydande. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: metoden pinnen ger reproducerbara resultat över tid (A) och mellan operatörer (B). Metoden Svabb visar jämförbara resultat mellan två aktörer med olika längder av mus hantering erfarenhet i experiment som genomförs under ett år. Baslinjen salivproduktion i C57BL/6 honmöss (10-13 veckors ålder) mättes av varje aktör. Resultaten uttrycks som vikt av saliv som produceras (mg/g kroppsvikt). Datum för saliv samling finns på x-axeln och resultaten från data samlas in över tid visas (A). Varje datapunkt representerar en mus, och antalet möss analyseras varje gång visas inom parentes. Baslinjen saliv nyckeltal (medelvärde + SEM) poolade från 3 experiment visas (B), och skiljer sig inte signifikant mellan operatörer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Salivproduktion är en komplex process och påverkas av många faktorer. Därför kan mäta Saliv-körtel funktion hos försöksdjur vara en utmaning. Ytterligare en utmaning är att upprepade mätningar av Saliv-körtel funktion på samma djur är skyldiga att upprätta sjukdomsutbrott eller demonstrera återhämtning efter behandling.
Den provstickan metod som beskrivs i denna rapport är tekniskt enkel att utföra med flera alternativ för att representera data. Resultaten är reproducerbara, med lite mellan operatören variant. Metoden kan upptäcka en minskning i salivproduktion i olika modeller av Saliv-körtel dysfunktion. En betydande fördel är användningen av inert, högabsorberande polymerer och effektiv återvinning av saliv samlas in, att tillåta mätning av saliv biomolekyler. En annan fördel med denna metod är att det är möjligt att genomföra proceduren samtidigt i upp till 2 möss i taget genom en enda operatör. Detta är betydligt effektivare än några av de andra metoderna, där det utförs i en enda mus i taget.
Variabiliteten i saliv produktion mätningar har varit bane av alla saliv mätteknik. För att minimera variabiliteten, är det viktigt att strikt följa protokollet. Kritiska steg inkluderar: att välja samma tid på dagen för fasta möss och samla saliv, lämplig dosering av bedövningsmedel och pilokarpin (tabell 1) och korrekt vikt poster av torra och våta kompresser. Försiktig tid förvaltning krävs att ställa upp till 2 möss vid en tidpunkt för insamling av saliv.
I figur 3visas mängden saliv som produceras av möss är stam beroende. Således är lämpligt stam, ålder och kön som matchade möss bör användas som kontroller. Titrering av pilokarpin doseringen, den särskilda stammen och experimentella skick utreds, rekommenderas starkt. Även om en högre dos av pilokarpin bortom 0,5 mg/kg inducerar ökad produktion av saliv, att utvärdera glandular svikt, är det rekommenderat att använda en lägre dos. Detta möjliggör identifiering av även mindre skillnader i saliv produktionen mellan de sjuka och kontrollera möss. Doser på 0,5 mg/kg kroppsvikt och 0,375 mg/kg kroppsvikt har använts framgångsrikt att demonstrera spottkörtel svikt. Det bör dock noteras att vissa experimentellt modellsystem kan kräva kortare eller längre perioder av samling än som beskrivs i detta protokoll. Detta bör testas av varje laboratorium.
En begränsning av denna metod, och de flesta saliv mätmetoder är behovet av anestesi. Rapporten med vakuum-metoden omfattar inte användning av bedövningsmedel5. Avsaknad av anestesi inducerar dock varierande nivåer av ångest i möss. De tenderar att kämpa och bita slangen, och som i sin tur kan påverka saliv produktionen och samling effektivitet. Isofluran anestesi hos råttor inducerar en drop-in pilokarpin inducerad saliv produktion12. Däremot ökar ketamin bronkial- och saliv sekret genom sympatisk stimulering13. Vi och andra har framgångsrikt använt ketamin och xylazin blandning som bedövningsmedel för att mäta pilokarpin inducerad saliv produktion4,7,8,9. Rekommenderat intervall för kirurgisk anestesi är 100-200 mg/kg av ketamin och 5-16 mg/kg av xylazin14. Dosen av 0,006-0,008 mL/g kroppsvikt används denna metod (motsvarar 60-80 mg/kg av ketamin och 6-8 mg/kg av xylazin) faller i den nedre änden av rekommenderat intervall och är tillräcklig för att ge en jämn immobilisering utan djup anestesi .
Metoden provstickan etablerades som ett alternativ till metoden rutinmässigt används micropipet. Den stora nackdelen med metoden Pipettera var den höga Inter operator-variabiliteten och behovet av att samla in saliv från en mus i taget. Metoden provstickan löser båda dessa problem. Fördelar inkluderar begränsning av antalet djur som behövs för att uppnå makt i statistiska analyser och ökad effektivitet. Ersätter bomullspinnar med inert polymer kompresser erbjuder ett bättre alternativ eftersom bomull svabb är kända för att påverka kvantitering av biologiskt aktiva molekyler15.
Med tanke på enkelheten i metoden kompress och dess hög reproducerbarhet mellan olika individer, förhoppningen är att metoden pinnen kommer att underlätta bättre jämförelser av musmodeller mellan forskare i olika laboratorier och institutioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter avslöja.
Acknowledgments
Studien har finansierats genom ett bidrag från National Institutes of Health, nationella institutet för tandvård och kraniofaciala forskning (DE025030).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals for saliva collection | |||
| Pilocarpine hydrochloride | Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA | B21410 | Dilute in sterile isotonic saline. Store single use aliquots of 100X stock at -80oC |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia Mix solution | Mix 1 mL ketamine hydrochloride + 0.5 mL xylazine + 8.5 mL sterile isotonic saline in a sterile vial. Can be used for 3 months. | ||
| Zetamine (Ketamine hydrochloride) | Vet One, Boise, Idaho, USA | C3N VT1 | Stock is 100 mg/mL |
| Anased (Xylazine) | Med-Vet International, Mettawa, IL, USA | RXANASED-20 | Stock is 20 mg/mL |
| Isotonic sterile saline | Vet One, Boise, Idaho, USA | 501032 | Used as diluent |
| Artificial tears (lubricant ophthalmic ointment) | Henry Schien, Dublin, OH, USA | 48272 | Used to prevent eyes from drying during the procedure |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials for saliva collection | |||
| SalivaBio Children's swab | Salimetrics, LLC Carlsbad, CA, USA | N/A | Individually wrapped swabs |
| 50 mL polypropylene tubes | VWR, Radnor, PA, USA | 89004-364 | Cut off the bottom 1 cm of the tube. Make sure that the cut edge is smooth. |
| Microcentrifuge tubes 0.6 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-290 | Make holes in the bottom of tube with heated 18 gauge needles |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-298 | |
| Insulin Syringes with permanently attached needles | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 324702 | |
| 18 gauge regular bevel needles | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 305195 | |
| Sterile scalpel blade #11 | Integra York Inc PA, USA | 4-311 | |
| Microdissecting forceps | Roboz, Gaithersburg, MD, USA | RS-5139 | Serrated angular 0.8 mm tip, 4" length |
| Label tape | Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA | sc-224487 | |
| 3 channel timer | Amazon.com, Seattle, WA, USA | B06W2KCYVN | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo, Columbus OH, USA | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals/ reagents for inducing salivary dysfunction | |||
| LPS | Invivogen, San Deigo, CA, USA | tlrl-b5lps | Dissolve in endotoxin free water, and store stock solution at 5 mg/mL . dilute in sterile HBSS 100 ug/mL - inject 100 uL/ moue ip |
| Imject Alum adjuvant | Thermo Scientific | 77161 | Dilute 1:1 in sterile saline. Inject intraperitoneally 0.1 mL/mouse |
| Rabbit anti-Ro52 antiserum | Generated in lab | Immunization of rabbits with recombinant mouse Ro52 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals/ Kits for saliva analyses | |||
| Salivary lysozyme estimation | |||
| EnzChek Lysozyme Assay Kit | Molecular Probes, Eugene, OR, USA | E-22013 | Used as per manufacturer's instructions |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salivary IgA estimation by sandwich ELISA | |||
| Mouse IgA | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 0106-01 | Standards for sandwich ELISA - range 30 ng/mL to 0.5 ng/mL |
| Goat anti- mouse IgA unlabeled | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-01 | Coat at 1 ug/mL in bicarbonate buffer |
| Goat anti- mouse IgA HRP | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-05 | Detection antibody used at 1:4000 dilution |
| TMB substrate | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 555214 | Used as per manufacturer's instructions |
| Immulon 4HBX Microtiter 96 well plates | Thermo Scientific, Rochester, NY, USA | 3855 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salivary protein estimation | |||
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | BioRad, Hercules, CA, USA | 5000006 | For protein estimation as per manufacturer's instructions |
References
- Proctor, G. B.
- Fox, R. I. Sjögren's syndrome. Lancet. 366 (9482), 321-331 (2005).
- Eisbruch, A., Kim, H. M., Terrell, J. E., Marsh, L. H., Dawson, L. A., Ship, J. A. Xerostomia and its predictors following parotid-sparing irradiation of head-and-neck cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 50 (3), 695-704 (2001).
- Marmary, Y., Fox, P. C., Baum, B. J. Fluid secretion rates from mouse and rat parotid glands are markedly different following pilocarpine stimulation. Comp Biochem Physiol A Comp Physiol. 88 (2), 307-310 (1987).
- Lin, A. L., Johnson, D. A., Wu, Y., Wong, G., Ebersole, J. L., Yeh, C. K. Measuring short-term gamma-irradiation effects on mouse salivary gland function using a new saliva collection device. Arch Oral Biol. 46 (11), 1085-1089 (2001).
- Scofield, R. H., Asfa, S., Obeso, D., Jonsson, R., Kurien, B. T. Immunization with short peptides from the 60-kDa Ro antigen recapitulates the serological and pathological findings as well as the salivary gland dysfunction of Sjogren's syndrome. J Immunol. 175 (12), 8409-8414 (2005).
- Deshmukh, U. S., Nandula, S. R., Thimmalapura, P. R., Scindia, Y. M., Bagavant, H. Activation of innate immune responses through Toll-like receptor 3 causes a rapid loss of salivary gland function. J Oral Pathol Med. 38 (1), 42-47 (2009).
- Deshmukh, U. S., Ohyama, Y., Bagavant, H., Guo, X., Gaskin, F., Fu, S. M. Inflammatory stimuli accelerate Sjögren's syndrome-like disease in (NZB x NZW)F1 mice. Arthritis Rheum. 58 (5), 1318-1323 (2008).
- Szczerba, B. M., et al. Interaction between innate immunity and Ro52-induced antibody causes Sjögren's syndrome-like disorder in mice. Ann Rheum Dis. 75 (3), 617-622 (2016).
- Takakura, A., Moreira, T., Laitano, S., De Luca Júnior, L., Renzi, A., Menani, J. Central muscarinic receptors signal pilocarpine-induced salivation. J Dent Res. 82 (12), 993-997 (2003).
- Yao, C., et al. Lipopolysaccharide-induced elevation and secretion of interleukin-1beta in the submandibular gland of male mice. Immunology. 116 (2), 213-222 (2005).
- Knudsen, J., Nauntofte, B., Josipovic, M., Engelholm, S. A., Hyldegaard, O. Effects of isoflurane anesthesia and pilocarpine on rat parotid saliva flow. Radiat Res. 176 (1), 84-88 (2011).
- Kohrs, R., Durieux, M. E. Ketamine: teaching an old drug new tricks. Anesth Analg. 87 (5), 1186-1193 (1998).
- Cold Spring Harbor Protocols. Cold Spring Harb Protoc. , Available from: http://cshprotocols.cshlp.org/ (2006).
- Kozaki, T., Hashiguchi, N., Kaji, Y., Yasukouchi, A., Tochihara, Y. Effects of saliva collection using cotton swab on cortisol enzyme immunoassay. Eur J Appl Physiol. 107 (6), 743-746 (2009).
