Summary
Salivary kjortelen hypofunction er en hyppig konsekvens av autoimmun sykdom og stråling terapi. Reproduserbar evaluering av salivary kjortelen funksjon i musen modeller av disse sykdommene er en teknisk utfordring. Her beskrives en enkel metode for nøyaktig og reproduserbar måling av spytt produksjonen hos mus.
Abstract
Pasienter med Sjögrens syndrom, en autoimmun sykdom som påvirker exocrine kjertler, utvikle salivary kjortelen betennelse og har redusert spytt produksjonen. Tilsvarende er spytt produksjonen sterkt svekket i pasienter som får strålebehandling for hode og nakke kreft. Gnager modeller, utviklet for å etterligne disse klinisk betingelser rette en forståelse av sykdommen patogenesen og tillate utviklingen av nye strategier. Evnen til å nøyaktig reproduserbar og gjentatte ganger måle salivary kjortelen funksjon i dyremodeller er derfor kritisk. Bygge på prosedyrer tidligere beskrevet i litteraturen, ble en metode utviklet som oppfyller disse kriteriene, og ble brukt til å evaluere salivary kjortelen funksjon i mus. En ekstra fordel av denne nye metoden er at det er lett mestrer, og har litt mellom operatører variant. Salivary kjortelen funksjonen evalueres som beløp (vekt eller volum) eller hastigheten (mL/min) av spytt produsert i svar til pilokarpin stimulering. Samlet spytt er en god kilde for analyser proteininnhold, immunglobulin konsentrasjoner og andre biomolecules.
Introduction
Spyttkjertler produsere spytt som svar på en rekke nevrologiske og mekanisk stimuli1. Stimuli er gjennomført sympatisk og parasympatiske nervesystemet til adrenerge og cholinergic receptors i kjertel. Pilokarpin er en cholinergic, para-sympathomimetic agent som virker hovedsakelig på muscarinic reseptorene. I det salivary kjortelen induserer det produksjon av spytt ved å handle på muscarinic acetylcholin reseptor M31. Spytt produksjonen etter pilokarpin administrasjon er en indikator på muligheten av spyttkjertler å svare til stimulering og er ofte brukt som et mål på salivary kjortelen funksjon.
Nøyaktig måling av spytt produksjonen er kritisk i studiet av salivary kjortelen sykdommer inkludert Sjögrens syndrom2 og stråling skader etter hode og nakke kreft behandling3. Flere metoder har blitt utviklet for å måle spytt produksjonen i gnagere. Disse inkluderer direkte cannulation av excretory salivary duct4, samling av spytt fra munnhulen under vakuum5og samlingen med glass kapillærene6 eller brønnene7,8, 9. direkte cannulation på salivary røret gir den mest nøyaktige og ren spytt. Men dette er en teknisk utfordrende prosedyre, og potensialet for skade ductal utelukker repeterende spytt samlinger fra samme dyret. Samle spytt under vakuum kan føre til variable resultater på grunn av tørking av spytt fra røret. Dette er ytterligere overdrevet i mus med redusert spyttsekresjon. Glass kapillærene tillate innsamling av spytt for senere analyser, men endringer i viskositet av spytt utskilles i syke staten forhindrer effektiv fylling av av kapillær. Videre kan forsøk å feie munnhulen å samle gjenværende spytt føre til skade. Pipetter metoden gir komplett samling, og for den samme operatøren, er det bemerkelsesverdig enhetlige eksperimenter. Men for ukjente årsaker viser denne metoden betydelig variasjon mellom forskjellige operatører. Derfor for å tillate riktig sammenligninger, blir det viktig at den samme operatøren utfører alle eksperimenter relatert til et bestemt prosjekt. Klart, dette er en stor ulempe for et laboratorium.
For å overvinne disse problemene, utviklet en prosedyre som kombinerer spytt samling metoder brukt for mennesker og gnagere. Metoden vattpinne beskrevet nedenfor for å måle pilokarpin-indusert spytt volum er enkelt, reproduserbare, ikke påvirket av operatøren, og kan utføres flere ganger i samme dyret. I tillegg lar den samle spytt for senere analyser av proteiner, immunglobuliner eller andre biomolecules.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen beskrevet nedenfor ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komité og følger etiske retningslinjene som er fastlagt ved National Institutes of Health. Alle data som presenteres i denne rapporten ble generert ved hjelp av kvinnelige mus som var 10-12 ukens av alderen. De følgende stammene mus ble brukt: C57BL/6, BALB/c, DBA1, 129S og (B6XA/J) F1. Alle mus var plassert i barriere bur (5 dyr per bur) i bestemte patogen uten betingelser og fôr og vann ad lib.
1. forberedelse
- For å forberede en lagerløsning av pilokarpin hydrochloride, veier 10 mg av sammensatt og oppløse den i 1.776 mL steril isotonic saltoppløsning av vortexing, å gi en lagerløsning 5.63 mg/ml. Det er ikke nødvendig å sterilisere denne løsningen. Men eventuelt filtrere det gjennom filtere 0,2 µM. Lagre denne lager løsningen i Quidel i-80 oC fryser for inntil 3 måneder. Hver frosne aksje er for enkelt. Når tint, ikke refreeze pilokarpin løsningen.
- Ta 0,6 mL microfuge rør og nøye punch et lite hull i bunnen av hver rør med en oppvarmet 18-gauge nål. Angi disse rør inn 2 mL rørene. Rør må ikke sterilt.
- Bruker en skarp, sterile barberblad, kutt sylindriske absorberende vattpinner i stykker om lag 2 cm i lengde. Klippe brikkene 2 cm diagonalt for å gi 2 konisk formet vattpinner. Plass en vattpinne i hver av 0,6 mL microfuge rør.
- Veie 0,6 mL microfuge røret som inneholder den tørr vattpinnen.
- Overføre musene studier i en ny ren bur med vannflasker. Holde mus uten mat i minst 2 timer før starten av spytt samling å hindre matpartikler fra forurensende spytt samlet.
Merk: Det er ikke nødvendig å holde 1 musen per bur for denne prosedyren. Imidlertid avhengig antall mus i hver bur bestemt institusjonens regler og bestemmelser for dyr bruk. - Like før slutten av 2 h, forberede fungerende pilokarpin løsning (0.0563 mg/mL) fortynne lagerløsning 100 x i sterilt saltvann. Det er ikke nødvendig videre filtrere sterilisere denne løsningen. Alltid holde arbeider pilokarpin løsningen på is.
Merk: Tabell 1 gir mengden pilokarpin skal injiseres for en rekke musen kroppen vekter for å gi en siste dose 0.375 mg/kg kroppsvekt.
2. fremgangsmåte
- Veie hver mus og finne dosen av en anesthetic miks for hver musen benytter tabell 1. Injisere første musen med riktige volumet av bedøvende mix intraperitoneal vei. Angi tiden i 2 minutter (de fleste musen stammer testet i denne protokollen gå for å sove av 2 min). Kontroller at musen er riktig anesthetized av mangel på gangavstand når den plasseres på en flat overflate. Hvis musen er fortsatt gå, vente i ytterligere 2 minutter før du fortsetter til neste trinn. En dråpe smøremiddel ophthalmica salve gjelde begge øynene å hindre tørking.
Merk: I tabell 1, dosen av bedøvende miksen er 0.007 mL/g kroppsvekt. Det optimale området for denne prosedyren er 0.006 til 0.008 mL/g kroppsvekt. Men etter 4 min, hvis musen er fortsatt gå eller viser rykkvise bevegelser, kontakt med den institusjonelle veterinarian for riktig øke dosen av anesthetic. - Bestemme dosen av pilokarpin for musen bruker tabell 1 og injisere riktig intraperitoneal vei. Sette stopuret i 2 minutter og sett musen inn 50 mL restrainer røret til hodet og ører stikker ut av cut slutten. Sett røret i 45 graders vinkel, med hodet ned, og ventrale overflaten vendt oppover. Tape røret til prosedyren styret å holde det fra å flytte.
Merk: Tabell 1 gir dosering for mus mer enn 17 g, som denne prosedyren ikke er forsøkt utført på mus veier under 17 g. - På slutten av 2 min, forsiktig inn et lukket par mikro dissekere tang i munnen og løft underkjeven oppover for å åpne munnen. Skyv tang 1-2 mm videre inn i munnen, sørge for at tungen er sett hviler på den øverste arm av tang. Med et par fine tang, hold den pre vektet tørr vattpinnen nær den koniske spissen.
- Skyv den koniske spissen av vattpinnen i munnen. Ta ut tang samtidig la spissen av vattpinnen i munnhulen.
- Forstå bredere enden av pinnen strekker seg utenfor munnen og rotere slik at den tillater maksimal kontakt med munnen området. Holde pinnen i denne posisjonen i 15 min.
Merk: Dette sikrer at vattpinnen forblir i munnen for varigheten av samlingen. Merk at den koniske spissen av vattpinnen fungerer som en veke og den større delen av vattpinnen forblir utenfor munnen. - På slutten av 15 min, forsiktig Roter vattpinnen å samle noen spytt som ikke har blitt absorbert og plasser våt vattpinnen i 0,6 mL microfuge røret. Lukk røret og sette den i 2 mL tube plassert på is.
Merk: På dette tidspunktet, oral mucosa vises helt tørt. Musen kan nå bli flyttet tilbake til buret sitt for utvinning fra anestesi. - Overføre musen i buret. Plass fuktet mat pellets i buret etter spytt samling å raskere utvanning.
Merk: Mus våkne opp i 10 min etter slutten av samlingen. Injeksjon 0,2 mL forvarmes isotonic saltoppløsning kan også gis å akselerere utvinning. - Fortsett til neste musen. Alle mus bør følges før de har helt utvinnes og er oppegående.
3. målinger
- På slutten av alle samlinger, veie 0,6 mL rør med våt vattpinnen. Beregn forskjellen mellom våt vekt og tørr vekt å få vekten av spytt produsert. Sett 0,6 mL røret med spytt inn 2-mL tube.
- Avskåret caps av 2 ml rørene. Deretter sentrifuge 2 mL rør i 2 minutter på 7500 x g, på 4oC i en mikro sentrifuge gjenopprette spytt. Måle volumet av spytt får brønnene.
- Express resultatene som spytt vekt (mg)10 over 15 min eller forholdet spytt vekt (mg) / mus kroppsvekt (g).
Merk: Hvis volumet av spytt trukket ut av vattpinnen er målt, express resultatene som volumet av spytt gjenopprettet (mL) eller forholdet mellom spytt volum (mL) / mus kroppsvekt (g).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I eksperimentelle mus modellsystemer brukes evnen til å produsere spytt svar til pilokarpin stimulering som en indikator på salivary kjortelen funksjon. Spytt produksjonen ble målt i 11-uke-gamle C57BL/6 kvinnelige mus ved metoden vattpinne. I figur 1Auttrykkes resultatet som mengden av spytt (mg) samlet etter økende doser av pilokarpin. På dose av 1 mg/kg kroppsvekt begynte noen av musene viser nød (ufrivillig riste og skjelve). Derfor ble større doser pilokarpin, utover 1 mg/kg kroppsvekt ikke testet i denne studien. I figur 1Bvises resultatene som forholdet mellom spytt vekt (mg) til musen kroppsvekt (g). Samlet viser disse dataene en god dose svar forholdet mellom pilokarpin beløp og spytt produksjonen. Volumet av spytt utvinnes fra vattpinnen ble også målt. Som vist i figur 1 c, er det en betydelig samsvar mellom spytt vekt og volum lagerførte varer med 0,001 mL 1 mg av spytt.
Resultatene med metoden vattpinne er lik de innhentet med metoden pipette samling. Figur 2A viser at betyr mengden av spytt samlet av metoden vattpinne og Pipetter metoden ligner og forskjellene er statistisk ikke signifikante. Figur 2B Viser at metoden vattpinne ikke bydde innvirkningen estimering av biomolecules i spytt , 2 C og 2D . Faktisk, med metoden Pipetter vattpinne metoden viste en generelt høyere trend i mener nivåer av totale salivary protein (figur 2C), salivary lysozyme aktivitet (figur 2D) og salivary IgA (figur 2E). Imidlertid var disse forskjellene ikke statistisk betydelige.
Spytt samling metoden beskrevet her er i stand til å oppdage forskjeller i spytt produsert av annen mus stammer (Figur 3) og salivary kjortelen hypofunction av forskjellige sykdom forhold (Figur 4). Figur 3A viser resultatene av pilokarpin indusert spytt produksjonen fra 10-12-uke-gamle kvinnelige C57BL/6, BALB/c, DBA1/J og 129S6 mus. 129S6 mus produsert det laveste beløpet av spytt sammenlignet med de andre belastninger. Det bør bemerkes at forskjellene i kroppen vekten av disse musene ikke var signifikant forskjellig (figur 3B). Deretter vattpinne metoden ble brukt til å oppdage salivary kjortelen hypofunction og eksemplene er vist i Figur 4. Figur 4A viser et representativt resultat av salivary kjortelen hypofunction av aktivering av medfødt immunitet etter injeksjon av lipopolysakkarid (LPS) (10 µg/mus, intraperitoneally). Kontroll mus ble injisert med saltvann11. LPS-behandlet mus viser en betydelig nedgang i spytt sammenlignet med kontrollene. Passiv overføring av antistoffer reaktive med Sjögrens syndrom antigen A/Ro52 induserer salivary kjortelen hypofunction, og denne modellen etterligner visse aspekter av Sjögrens syndrom9. Som vist i figur 4B, mus injisert med adjuvant Alun pluss anti-Ro52 antistoffer hadde sammen betydelig lavere spytt produksjonen i forhold til ubehandlet mus eller mus behandlet bare med Alun.
Vattpinne metoden er enkel å implementere og operatør uavhengig. Figur 5 viser spytt produksjonen fra 10-13-uke-gamle kvinnelige C57BL/6 mus, eksperimenter utført på 6 forskjellige tidspunkt av 2 forskjellige operatører. Operatør begynte jeg med bare to måneder av musen håndtering erfaring mens operatøren II hadde 6 måneder tidligere mus håndtering erfaring, men var bare introdusert til spytt samling metoden for en uke. Disse dataene ble generert eksperimenter utført nesten ett år fra hverandre, med 0.375 mg/kg pilokarpin dose. Spytt forholdstallene ved begge operatører viser en rekke målinger (1.84 til 5.87). Operatør is eksperimenter spredt på 10 uker mens operatøren IIS eksperimenter ble utført over 3 dager nesten ett år senere (figur 5A). Spesielt spytt forholdstallene oppnådd over tid var ikke signifikant forskjellig (p = 0.064; Kruskal-Wallis test). Videre sammenligne mellom operatører variasjoner, prosenter av spytt vekt per g kroppsvekt fra 3 eksperimenter for hver operatør var samlet og er vist i figur 5B. Spytt prosenter innhentet av jeg (betyr + SEM; 4.45 + 0,152, n = 38) er ikke vesentlig forskjellig fra operatør 2 (betyr + SEM; 4,21 + 0.169, n = 25; p = 0.296 av Mann Whitney test).
Figur 1: spytt produksjonen er avhengig av pilokarpin dose. C57BL6/J mus (11-uke-gamle kvinner, 5 per gruppe) ble injisert med forskjellige doser av pilokarpin (0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg og 1,0 mg/kg kroppsvekt) og spytt produksjonen ble målt i 15 min. (A) resultatene er representert som mg spytt beløp (gjennomsnittlig ± SEM). (B) Data er representert som mener spytt forhold (mg spytt per g musen kroppsvekt). (C) spytt fra 11-uke-gamle kvinnelige C57BL/6 mus (n = 5) ble samlet inn av metoden vattpinne. Pilokarpin ble brukt på en dose 0.375 mg/kg kroppsvekt. De våte vattpinner var veide for å måle mengden av spytt produsert i mg. Spytt i av vattpinner ble deretter gjenopprettet med sentrifugering, og volumet av den gjenopprettede spytt ble målt. Betydelig avtalen er sett mellom spytt vekten i mg og spytt volum i µL. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: metoden vattpinne påvirker ikke analyse av biomolecules i spytt. Spytt fra 2 grupper av 11-uke-gamle kvinnelige C57BL/6 mus, (n = 5 mus per gruppe), ble samlet inn ved metoden vattpinne eller metoden micropipet. Forskjellene i gjennomsnittlig mengder spytt (A), mener mengder protein (B) mener mengder lysozyme aktivitet (C), og mener mengder IgA mellom 2 er statistisk ikke signifikante. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: metoden vattpinne spytt samling oppdager forskjeller i grunnlinjen spytt produksjonen av ulike stammer mus. (A) spytt fra kvinnelige (10-12-uke-gamle) mus ble samlet i 15 min ved hjelp av en pilokarpin dose 0.375 mg/kg kroppsvekt. (B) gjennomsnittlig vekter mellom gruppene med mus var ikke signifikant forskjellig. Statistisk betydning ble analysert ved Kruskal-Wallis test, etterfulgt av Dunn's flere sammenligninger test. En p < 0,05 ble ansett som viktig. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: vattpinne metoden oppdager salivary kjortelen hypofunction. (A) (B6 X A / J) F1 kvinnelige musene ble injisert med enten LPS løsning (0,1 mg/mL, 0.1 mL per mus, intraperitoneally) eller saltvann og spytt ble målt 26 h senere. En representant eksperimentet viser en signifikant (p = 0.0079) (60%) innom spytt produksjonen hos mus behandlet med LPS. (B) Salivary kjortelen hypofunction ble målt i et eksperimentelle mus modellsystem for Sjögrens syndrom. Tidligere publiserte passiv overføring modell for induksjon av kjertel dysfunksjon var brukt4 med noen modifikasjoner. Kvinnelige C57BL/6 mus (10-12 uker gamle) ble injisert med Alun adjuvant. På dager 14 og 20 musene ble injisert med 0,05 mL av kanin anti-Ro52 serum og spytt produksjonen ble målt etter 24 h. merke en betydelig (p = 0.0003) (50%) innom spytt produksjonen hos mus behandlet med alun og anti-Ro52 serum. Statistisk betydning ble analysert ved Kruskal-Wallis test, etterfulgt av Dunn's flere sammenligninger test. En p < 0,05 ble ansett som viktig. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: metoden vattpinne gir reproduserbar resultater over tid (A) og mellom operatører (B). Metoden vattpinne viser resultater tilsvarende mellom to operatører med forskjellige lengder mus håndtering erfaring i eksperimenter utført over ett år. Planlagte spytt produksjonen i C57BL/6 kvinnelige mus (10-13 uker gammel) ble målt ved hver operatør. Resultatene uttrykkes som vekten av spytt produsert (mg/g kroppsvekt). Datoer av spytt samling på x-aksen og resultatene fra data samlet inn over tid vises (A). Hvert datapunkt representerer ett museklikk, og antall mus analyseres på hver gang vises i parentes. Planlagte spytt prosenter (betyr + SEM) samlet fra 3 eksperimenter vises (B), og er ikke vesentlig forskjellig mellom operatørene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Spytt produksjonen er en kompleks prosess og er påvirket av mange faktorer. Måle salivary kjortelen funksjon i forsøksdyr kan derfor være en utfordring. En ekstra utfordring er at gjentatte målinger av salivary kjortelen funksjon i samme dyret er nødvendig å etablere utbruddet av sykdommen eller å demonstrere utvinningen behandling.
Vattpinne metoden beskrevet i denne rapporten er teknisk enkelt å utføre med flere alternativer for å representere dataene. Resultatene er reproduserbare, med lite variasjon mellom operatører. Metoden kan oppdage en reduksjon i spytt produksjonen i forskjellige modeller av salivary kjortelen dysfunksjon. En betydelig fordel er bruk av inaktivt, svært absorberende polymerer og effektiv gjenoppretting av spytt samlet, slik at måling av salivary biomolecules. En annen fordel med denne metoden er at det er mulig å gjennomføre denne prosedyren samtidig i opptil 2 mus ved en enkelt operatør. Dette er betydelig mer effektiv enn noen av de andre metodene, hvor den blir utført i et enkelt museklikk samtidig.
Variasjon i spytt produksjonen målinger er bane av alle spytt måling teknikker. For å minimere variasjon, er det viktig å følge strengt protokollen. Kritisk trinnene inkluderer: velger samme tid av dagen for faste mus og samle spytt, riktig dosering av bedøvelse og pilokarpin (tabell 1), og nøyaktig vekt registreringer av tørre og våte vattpinner. Forsiktig tid ledelse er nødvendig å sette opp 2 mus samtidig spytt samling.
Som vist i Figur 3, er mengden av spytt produsert av mus påkjenning avhengige. Dermed riktig belastning, alder og kjønn matchet mus bør brukes som kontroller. Titrering av den pilokarpin doseringen, i bestemt belastning og eksperimentelle tilstanden etterforsket, anbefales. Selv om en større dose pilokarpin utover 0,5 mg/kg medfører økt produksjon av spytt, evaluere kjertel hypofunction, anbefales det å bruke en lavere dose. Dette gir mulighet for identifisering av selv små forskjeller i spytt produksjonen mellom den syke og kontrollere mus. Doser 0,5 mg/kg kroppsvekt og 0.375 mg/kg kroppsvekt har blitt brukt med hell å demonstrere salivary kjortelen hypofunction. Det bør imidlertid bemerkes at visse eksperimentell modellsystemer krever kortere eller lengre perioder med samling enn som beskrevet i denne protokollen. Dette bør testes av hvert laboratorium.
En begrensning av denne metoden, og de fleste spytt målemetoder er behovet for anestesi. Rapporten med vakuum-metoden inkluderer ikke bruk av bedøvende5. Imidlertid induserer fravær av anestesi varierende grad av angst i mus. De pleier å kjempe og bite slangen, og som i sin tur kan påvirke spytt produksjonen og samling effektivitet. Isoflurane anestesi i rotter induserer en drop-in pilokarpin indusert spytt produksjonen12. Derimot øker ketamin bronchial og salivary sekreter gjennom sympatisk stimulering13. Vi og andre har brukt ketamin og xylazine blanding som en bedøvende for å måle pilokarpin indusert spytt produksjonen4,7,8,9. Anbefalt område for kirurgiske anestesi er 100-200 mg/kg av ketamin og 5-16 mg/kg av xylazine14. Dosen av 0.006-0.008 mL/g kroppsvekt brukes i denne metoden (tilsvarer 60-80 mg/kg av ketamin og 6-8 mg/kg av xylazine) faller i den nedre enden av anbefalt område og er tilstrekkelig for å gi nivå immobilisering uten dyp bedøvelse .
Metoden vattpinne ble etablert som et alternativ til metoden rutinemessig brukes micropipet. Den store ulempen av metoden Pipetter var høy mellom operatører variasjon og behovet for å samle spytt fra ett museklikk samtidig. Metoden vattpinne løser begge disse problemene. Fordelene inkluderer begrense antall dyr for å oppnå makt i statistiske analyser og økt effektivitet. Erstatte bomull vattpinner med inert polymer vattpinner tilbyr et bedre alternativ siden bomull vattpinner er kjent for å påvirke kvantifisering av biologisk aktive molekyler15.
Gitt enkelhet metoden vattpinne og dens høy reproduserbarhet mellom ulike individer, håpet er at metoden vattpinne vil lette bedre sammenligninger av musen modeller mellom forskere i ulike laboratorier og institusjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikter av interesse å avsløre.
Acknowledgments
Studien ble støttet av et stipend fra National Institutes of Health, National Institute for Dental og Craniofacial forskning (DE025030).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals for saliva collection | |||
| Pilocarpine hydrochloride | Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA | B21410 | Dilute in sterile isotonic saline. Store single use aliquots of 100X stock at -80oC |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia Mix solution | Mix 1 mL ketamine hydrochloride + 0.5 mL xylazine + 8.5 mL sterile isotonic saline in a sterile vial. Can be used for 3 months. | ||
| Zetamine (Ketamine hydrochloride) | Vet One, Boise, Idaho, USA | C3N VT1 | Stock is 100 mg/mL |
| Anased (Xylazine) | Med-Vet International, Mettawa, IL, USA | RXANASED-20 | Stock is 20 mg/mL |
| Isotonic sterile saline | Vet One, Boise, Idaho, USA | 501032 | Used as diluent |
| Artificial tears (lubricant ophthalmic ointment) | Henry Schien, Dublin, OH, USA | 48272 | Used to prevent eyes from drying during the procedure |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials for saliva collection | |||
| SalivaBio Children's swab | Salimetrics, LLC Carlsbad, CA, USA | N/A | Individually wrapped swabs |
| 50 mL polypropylene tubes | VWR, Radnor, PA, USA | 89004-364 | Cut off the bottom 1 cm of the tube. Make sure that the cut edge is smooth. |
| Microcentrifuge tubes 0.6 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-290 | Make holes in the bottom of tube with heated 18 gauge needles |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-298 | |
| Insulin Syringes with permanently attached needles | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 324702 | |
| 18 gauge regular bevel needles | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 305195 | |
| Sterile scalpel blade #11 | Integra York Inc PA, USA | 4-311 | |
| Microdissecting forceps | Roboz, Gaithersburg, MD, USA | RS-5139 | Serrated angular 0.8 mm tip, 4" length |
| Label tape | Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA | sc-224487 | |
| 3 channel timer | Amazon.com, Seattle, WA, USA | B06W2KCYVN | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo, Columbus OH, USA | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals/ reagents for inducing salivary dysfunction | |||
| LPS | Invivogen, San Deigo, CA, USA | tlrl-b5lps | Dissolve in endotoxin free water, and store stock solution at 5 mg/mL . dilute in sterile HBSS 100 ug/mL - inject 100 uL/ moue ip |
| Imject Alum adjuvant | Thermo Scientific | 77161 | Dilute 1:1 in sterile saline. Inject intraperitoneally 0.1 mL/mouse |
| Rabbit anti-Ro52 antiserum | Generated in lab | Immunization of rabbits with recombinant mouse Ro52 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals/ Kits for saliva analyses | |||
| Salivary lysozyme estimation | |||
| EnzChek Lysozyme Assay Kit | Molecular Probes, Eugene, OR, USA | E-22013 | Used as per manufacturer's instructions |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salivary IgA estimation by sandwich ELISA | |||
| Mouse IgA | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 0106-01 | Standards for sandwich ELISA - range 30 ng/mL to 0.5 ng/mL |
| Goat anti- mouse IgA unlabeled | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-01 | Coat at 1 ug/mL in bicarbonate buffer |
| Goat anti- mouse IgA HRP | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-05 | Detection antibody used at 1:4000 dilution |
| TMB substrate | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 555214 | Used as per manufacturer's instructions |
| Immulon 4HBX Microtiter 96 well plates | Thermo Scientific, Rochester, NY, USA | 3855 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salivary protein estimation | |||
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | BioRad, Hercules, CA, USA | 5000006 | For protein estimation as per manufacturer's instructions |
References
- Proctor, G. B.
- Fox, R. I. Sjögren's syndrome. Lancet. 366 (9482), 321-331 (2005).
- Eisbruch, A., Kim, H. M., Terrell, J. E., Marsh, L. H., Dawson, L. A., Ship, J. A. Xerostomia and its predictors following parotid-sparing irradiation of head-and-neck cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 50 (3), 695-704 (2001).
- Marmary, Y., Fox, P. C., Baum, B. J. Fluid secretion rates from mouse and rat parotid glands are markedly different following pilocarpine stimulation. Comp Biochem Physiol A Comp Physiol. 88 (2), 307-310 (1987).
- Lin, A. L., Johnson, D. A., Wu, Y., Wong, G., Ebersole, J. L., Yeh, C. K. Measuring short-term gamma-irradiation effects on mouse salivary gland function using a new saliva collection device. Arch Oral Biol. 46 (11), 1085-1089 (2001).
- Scofield, R. H., Asfa, S., Obeso, D., Jonsson, R., Kurien, B. T. Immunization with short peptides from the 60-kDa Ro antigen recapitulates the serological and pathological findings as well as the salivary gland dysfunction of Sjogren's syndrome. J Immunol. 175 (12), 8409-8414 (2005).
- Deshmukh, U. S., Nandula, S. R., Thimmalapura, P. R., Scindia, Y. M., Bagavant, H. Activation of innate immune responses through Toll-like receptor 3 causes a rapid loss of salivary gland function. J Oral Pathol Med. 38 (1), 42-47 (2009).
- Deshmukh, U. S., Ohyama, Y., Bagavant, H., Guo, X., Gaskin, F., Fu, S. M. Inflammatory stimuli accelerate Sjögren's syndrome-like disease in (NZB x NZW)F1 mice. Arthritis Rheum. 58 (5), 1318-1323 (2008).
- Szczerba, B. M., et al. Interaction between innate immunity and Ro52-induced antibody causes Sjögren's syndrome-like disorder in mice. Ann Rheum Dis. 75 (3), 617-622 (2016).
- Takakura, A., Moreira, T., Laitano, S., De Luca Júnior, L., Renzi, A., Menani, J. Central muscarinic receptors signal pilocarpine-induced salivation. J Dent Res. 82 (12), 993-997 (2003).
- Yao, C., et al. Lipopolysaccharide-induced elevation and secretion of interleukin-1beta in the submandibular gland of male mice. Immunology. 116 (2), 213-222 (2005).
- Knudsen, J., Nauntofte, B., Josipovic, M., Engelholm, S. A., Hyldegaard, O. Effects of isoflurane anesthesia and pilocarpine on rat parotid saliva flow. Radiat Res. 176 (1), 84-88 (2011).
- Kohrs, R., Durieux, M. E. Ketamine: teaching an old drug new tricks. Anesth Analg. 87 (5), 1186-1193 (1998).
- Cold Spring Harbor Protocols. Cold Spring Harb Protoc. , Available from: http://cshprotocols.cshlp.org/ (2006).
- Kozaki, T., Hashiguchi, N., Kaji, Y., Yasukouchi, A., Tochihara, Y. Effects of saliva collection using cotton swab on cortisol enzyme immunoassay. Eur J Appl Physiol. 107 (6), 743-746 (2009).
