Summary
Hipofunção das glândulas salivares é uma consequência frequente da terapia de radiação e doença auto-imune. Reprodutível avaliação da função da glândula salivar em modelos do rato destas doenças é um desafio técnico. Aqui, um método simples para a medição exata e reproduzível da produção de saliva em camundongos é descrito.
Abstract
Pacientes com síndrome de Sjögren, uma doença auto-imune que afectam as glândulas exócrinas, desenvolvem a inflamação das glândulas salivares e reduziram a produção de saliva. Da mesma forma, a produção de saliva é severamente comprometida em pacientes recebendo tratamento com radiação para câncer de cabeça e pescoço. Modelos de roedores, desenvolvidos para imitar essas condições clínicas, facilitam uma compreensão da patogênese da doença e permitam o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. Portanto, a capacidade de precisão reproducibly e repetidamente medir a função da glândula salivar em modelos animais é crítica. Base em procedimentos previamente descritos na literatura, um método foi desenvolvido que atende a esses critérios e foi utilizado para avaliar a função da glândula salivar em camundongos. Uma vantagem adicional deste novo método é que ele é facilmente dominado e tem pouca variação inter operador. Função da glândula salivar é avaliada como a quantidade (volume ou peso) ou taxa (mL/min) de saliva produzida em resposta à estimulação de pilocarpina. A saliva coletada é uma boa fonte para as análises do teor de proteínas, as concentrações de imunoglobulinas e outras biomoléculas.
Introduction
As glândulas salivares produzem saliva em resposta a uma variedade de estímulos neurológicos e mecânica1. Os estímulos são transportados através do sistema nervoso simpático e parassimpático aos receptores adrenérgicos e colinérgicos na glândula. Pilocarpina é um agente colinérgico, Pará-simpaticomimética que atua predominantemente sobre os receptores muscarínicos. Na glândula salivar, que induz a produção de saliva, agindo sobre os receptores de acetilcolina muscarínicos M31. Produção de saliva, após a administração de pilocarpina é um indicador da capacidade de responder à estimulação das glândulas salivares e é comumente usada como uma medida da função da glândula salivar.
Medição da produção de saliva é fundamental no estudo de doenças das glândulas salivares, incluindo Síndrome de Sjögren2 e lesão de radiação de tratamento de câncer cabeça e pescoço3a seguir. Diversos métodos foram desenvolvidos para medir a produção de saliva em roedores. Estes incluem canulação direta do Ducto excretor salivar4, coleta de saliva da cavidade oral sob vácuo5e coleção usando de capilares de vidro6 ou7,uma micropipeta,8, 9. direto a canulação do ducto salivar fornece saliva mais preciso e puro. No entanto, este é um procedimento tecnicamente desafiador, e o potencial para causar lesão ductal impede a coleções de saliva repetitiva do mesmo animal. Coleta de saliva sob vácuo pode levar a resultados variáveis devido à secagem da saliva do tubo. Esta perda é mais exagerada em camundongos com salivação reduzida. Capilares de vidro permitem a coleta de saliva para análises subsequentes, no entanto, as alterações na viscosidade da saliva secretada no estado doente impede enchimento eficiente do capilar. Além disso, as tentativas de varrer a cavidade oral para coletar saliva residual podem causar ferimentos. O método de pipeta permite a coleção completa, e para o mesmo operador, é notavelmente consistente entre as experiências. No entanto, por razões desconhecidas, esse método mostra uma variação significativa entre os diferentes operadores. Portanto, para permitir comparações apropriadas, torna-se imperativo que o mesmo operador realiza todas as experiências relacionadas a um projeto específico. Claramente, isto representa uma grande desvantagem para um laboratório.
Para superar esses problemas, um procedimento foi desenvolvido que combina métodos de recolha de saliva usada para seres humanos e roedores. O método da zaragatoa, descrito abaixo para medir o volume de saliva induzidas pela pilocarpina é simples, reprodutível, não influenciada pelo operador e pode ser executado repetidamente no mesmo animal. Além disso, permite a coleta de saliva para posteriores análises de proteínas, imunoglobulinas ou outras biomoléculas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
O protocolo descrito abaixo foi aprovado pelo Comitê de uso e cuidado institucional do Animal e segue as diretrizes éticas estabelecidas pelos institutos nacionais de saúde. Todos os dados apresentados neste relatório foram gerados usando ratos fêmeas que eram 10-12 semanas de idade. Foram utilizadas as seguintes cepas de ratos: C57BL/6, BALB/c, DBA1, 129S e F1 (B6XA/J). Todos os ratos foram alojados em gaiolas de barreira (5 animais por gaiola) em condições específicas isentos de organismos patogénicos e fornecidos a ração e água ad libitum.
1. preparação
- Para preparar uma solução de cloridrato de pilocarpina, pesa 10 mg do composto e dissolvê-lo em 1,776 mL de solução salina isotônica estéril vortexing, para dar uma solução stock de 5,63 mg/mL. Não há nenhuma necessidade para esterilizar esta solução. Mas, se desejado, filtrá-la através de um filtro de 0,2 µM. Loja desta solução em alíquotas múltiplas em um freezer-80 oC por até 3 meses. Cada estoque congelado é para uso individual. Uma vez descongelado, não volte a congelar a solução pilocarpina.
- Levar a 0,6 mL tubos de microcentrífuga e cuidadosamente um buraco pequeno na parte inferior de cada tubo com uma agulha de calibre 18 aquecida. Defina esses tubos para tubos de 2 mL. Os tubos não precisam ser estéril.
- Usando uma lâmina de barbear afiada, estéril, corte cilíndricos cotonetes absorventes em cerca de 2 cm de comprimento. Corte cada pedaço de 2 cm na diagonal para dar 2 cotonetes em forma cônicas. Coloque um cotonete em cada um dos tubos de microcentrífuga de 0,6 mL.
- Pese o tubo de microcentrífuga de 0,6 mL contendo o swab seco.
- Transferi os ratos para ser estudado em uma nova gaiola limpa com garrafas de água. Manter os ratos sem comida pelo menos 2 h antes do início da coleta de saliva para impedir que partículas de comida que está contaminando a saliva coletada.
Nota: Não é necessário manter o 1 rato por gaiola para este procedimento. No entanto, o número de ratos colocados em cada gaiola depende da instituição específica de regras e regulamentos para uso de animais. - Pouco antes do fim de 2h, prepare a solução de trabalho de pilocarpina (0,0563 mg/mL) diluindo a solução-mãe de 100x em soro fisiológico estéril. Não é necessário mais filtro esterilizar esta solução. Mantenha sempre a solução pilocarpina no gelo.
Nota: A tabela 1 dá a quantidade de pilocarpina deve ser injetado para uma gama de pesos de corpo do mouse para dar uma dose final de 0,375 mg/kg de peso corporal.
2. o procedimento
- Pesar cada rato e determinar a dose da mistura anestésica para cada mouse usando a tabela 1. Injete o primeiro rato com o volume adequado da mistura anestésica por via intraperitoneal. Defina o temporizador para 2 min (maioria das cepas de rato testado neste protocolo ir para dormir por 2 min). Certifique-se de que o mouse é devidamente anestesiado pela falta de andar quando colocado sobre uma superfície plana. Se o mouse ainda está andando, espere 2min adicional antes de prosseguir para a próxima etapa. Aplique uma gota de lubrificante pomada oftálmica de ambos os olhos para impedir a secagem.
Nota: Na tabela 1, a dose da mistura anestésica é 0,007 mL/g de massa corporal. O intervalo ideal para este procedimento é 0,006 a 0,008 mL/g de massa corporal. No entanto, após 4 min, se o mouse ainda é andar ou exibindo movimentos espasmódicos, consulta com o veterinário institucional para adequadamente, aumentando a dose de anestésico. - Determinar a dose de pilocarpina para o mouse usando a tabela 1 e injetar a quantidade adequada por via intraperitoneal. Definir o timer por 2 min e colocar o mouse no tubo de retenção de 50 mL até a cabeça e orelhas fica fora do corte final. Coloque o tubo em um ângulo de 45 graus, com a cabeça para baixo e a superfície ventral virada para cima. Fita do tubo para a placa de procedimento para mantê-lo de se mover.
Nota: A tabela 1 fornece dosagem para ratos, mais de 17 g, como este procedimento não tem sido tentado em ratos com peso abaixo de 17 g. - No final de 2 min, gentilmente Insira um par fechado de micro pinça de dissecação na boca e levantar a mandíbula inferior para cima para abrir a boca. Empurre a pinça 1-2 milímetros mais dentro da boca, certificando-se de que a língua é vista descansando no braço superior da pinça. Com outro par de pinças bem, segure o cotonete seco pré-pesados perto de sua ponta cônica.
- Deslize suavemente a ponta cónica do cotonete na boca. Retire a pinça, deixando a ponta do swab na cavidade oral.
- Segure a ponta mais larga da zaragatoa estendendo-se fora da boca e girá-lo para permitir a máxima área de contato com a boca. Fique com o cotonete nesta posição por 15 min.
Nota: Isso garante que o swab permanece na boca para a duração da coleção. Note que a ponta cónica do cotonete atua como um pavio, e a maior parte do swab permanece fora da boca. - No final de 15 min, delicadamente gire o swab para coletar qualquer saliva que não foi absorvido e coloque o cotonete molhado no tubo de microcentrífuga de 0,6 mL. Fechar o tubo e configurá-lo no tubo 2 mL colocado no gelo.
Nota: Neste momento, a mucosa oral aparecerá completamente seca. O mouse pode agora ser voltou para sua gaiola para a recuperação da anestesia. - Transferi o rato na gaiola. Coloque o alimento umedecido pelotas na gaiola após a coleta de saliva para ajudar a reidratação mais rápida.
Nota: Os ratos acordar dentro de 10 min após o final da coleção. Injeção subcutânea de salina isotônica pré-aquecido de 0,2 mL também pode ser dada para acelerar a recuperação. - Prossiga para o próxima do mouse. Todos os ratos devem ser monitorizados até que tenham completamente recuperados e são ambulatoriais.
3. as medições
- No final de todas as coleções, pese os tubos de 0,6 mL com o cotonete molhado. Calcule a diferença entre o peso molhado e seco para obter o peso da saliva produzida. Coloca o tubo de 0,6 mL saliva de volta no tubo de 2 mL.
- Corte as tampas dos tubos de 2 ml. Em seguida, centrifuga os tubos de 2 mL por 2 min a 7500 x g, em 4oC em uma centrífuga micro para recuperar a saliva. Medir o volume de saliva obtido utilizando uma micropipeta.
- Expressar os resultados como saliva peso (mg)10 a mais de 15 min, ou como uma relação do peso de saliva (mg) / peso corporal (g) de rato.
Nota: Se o volume de saliva extraído fora o swab foi medido, expressar os resultados como o volume de saliva recuperado (mL) ou a proporção do volume de saliva (mL) / peso corporal (g) de rato.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nos sistemas de modelo experimental do mouse, a capacidade de produzir saliva em resposta à estimulação de pilocarpina é usada como um indicador da função das glândulas salivares. Produção de saliva era medida em ratos fêmeas de C57BL/6 de 11 semanas de idade pelo método cotonete. Na figura 1A, os resultados são expressos como a quantidade de saliva (mg) coletado após doses crescentes de pilocarpina. Com a dose de 1 mg/kg de peso corporal, alguns dos ratos começaram a ter angústia (involuntário a tremer e tremer). Portanto, doses mais elevadas de pilocarpina, além de 1 mg/kg de peso corporal não foram testadas neste estudo. Na figura 1B, os resultados são representados como a proporção de peso de saliva (mg) para o peso do corpo do mouse (g). Coletivamente, estes dados mostram uma relação de resposta boa dose entre produção de quantidade e saliva de pilocarpina. O volume da saliva recuperada o swab também foi medido. Como mostrado na Figura 1, há uma concordância significativa entre o peso de saliva e volume onde 1 mg de saliva é igual a 0,001 mL.
Os resultados obtidos com o método da zaragatoa são semelhantes aos obtidos com o método de coleta de pipeta. Figura 2A mostra que a quantidade média de saliva coletada pelo método da zaragatoa e o método de pipeta é muito semelhante, e as diferenças são estatisticamente não significativas. Figura 2B 2C e 2D mostram que o método da zaragatoa não teve impacto estimativa de biomoléculas na saliva. Na verdade, em comparação com o método de pipeta, o método da zaragatoa mostrou uma tendência global superior nos níveis médios de proteína salivar total (Figura 2), atividade de lisozima salivar (Figura 2D) e IgA salivar (Figura 2E). No entanto, estas diferenças foram estatisticamente não significativas.
O método de coleta de saliva descrito aqui é capaz de detectar diferenças na quantidade de saliva produzida por cepas de mouse diferente (Figura 3) e hipofunção das glândulas salivares induzida por condições diferentes da doença (Figura 4). Figura 3A mostra resultados de produção de saliva de pilocarpina induzida de camundongos C57BL/6 e BALB/c, DBA1/J 129S6 fêmeas 10 12-week-old. Os ratos 129S6 produziram a menor quantidade de saliva em comparação com as outras estirpes. Deve notar-se que as diferenças entre os pesos de corpo destes ratos não foram significativamente diferentes (Figura 3B). Em seguida, foi utilizado o método de swab para detectar hipofunção das glândulas salivares, e dois exemplos são mostrados na Figura 4. A figura 4A mostra um resultado representativo da hipofunção das glândulas salivares induzida pela ativação da imunidade inata, após injeção de lipopolissacarídeo (LPS) (10 µ g/rato, intraperitonealmente). Controle de ratos foram injetados com salina11. Ratos tratados com LPS mostram uma queda significativa na saliva comparado aos controles. Transferência passiva de anticorpos reativos com antígeno de síndrome de Sjögren A/Ro52 induz a hipofunção das glândulas salivares, e este modelo imita certos aspectos da síndrome de Sjögren9. Como mostrado na Figura 4B, ratos injetaram com alum adjuvante mais anticorpos anti-Ro52, juntos, tiveram significativamente menor produção de saliva, em comparação com ratos não tratados ou ratos tratadocom apenas com alum.
O método da zaragatoa é simples de implementar e operador independente. A Figura 5 mostra a produção de saliva de ratos fêmeas 10 13-week-old C57BL/6, em experimentos realizados em 6 pontos diferentes de tempo por 2 operadores diferentes. Operador, que eu comecei com apenas 2 meses de mouse tratamento experiência enquanto operador II tinha 6 meses de prévio mouse manipulando a experiência, mas só foi introduzida para o método de coleta de saliva durante uma semana. Esses dados foram gerados em experiências realizadas por quase um ano separados, usando 0,375 mg/kg dose de pilocarpina. Os rácios de saliva obtidos por ambos os operadores mostram uma gama de leituras (1.84 para 5,87). Operador do que experimentos atravessava um período de 10 semanas enquanto experimentos do operador II foram realizados ao longo de 3 dias consecutivos quase um ano mais tarde (Figura 5A). Notavelmente, os rácios de saliva obtidos ao longo do tempo não foram significativamente diferentes (p = 0,064; Teste de Kruskal-Wallis). Para comparar mais variações inter operador, os rácios de peso de saliva por g de massa corporal de 3 experimentos para cada operador foram agrupados e são mostrados na Figura 5B. Rácios de saliva obtida pelo operador I (média + SEM; 4.45 + 0.152, n = 38) não são significativamente diferentes do operador 2 (média + SEM; 4.21 + 0,169; n = 25; p = 0,296 pelo teste de Mann-Whitney).
Figura 1: produção de Saliva é dependente da dose de pilocarpina. Camundongos C57BL6/J (11 semanas de idade fêmeas, 5 por grupo) foram injetados com diferentes doses de pilocarpina (0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg e 1,0 mg/kg peso corporal) e a produção de saliva era medida durante 15 min. (A) os resultados são representados como a quantidade de saliva de mg (média ± SEM). (B) os dados são representados como proporção média de saliva (saliva de mg por peso do corpo do mouse g). (C) Saliva de camundongos C57BL/6 fêmeas de 11 semanas de idade (n = 5) foi coletado pelo método de cotonete. Pilocarpina foi usada na dose de 0,375 mg/kg de peso corporal. Os cotonetes molhados foram pesados para medir a quantidade de saliva produzida em mg. A saliva nas zaragatoas então foi recuperada por centrifugação, e os volumes de saliva recuperado foram medidos. O acordo significativo é visto entre o saliva de peso em mg e saliva volume em µ l. , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: O método da zaragatoa não afeta a análise de biomoléculas em saliva. Saliva de 2 grupos de camundongos C57BL/6 fêmeas de 11 semanas, (n = 5 ratos por grupo), foi coletado pelo método cotonete ou pelo método de micropipetas. As diferenças nos volumes médios de saliva (A), a média de quantidades de proteína (B), quer dizer a quantidade de atividade de lisozima (C) e quantidades de IgA entre os 2 grupos são estatisticamente não significativas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: O método da zaragatoa de coleta de saliva detecta diferenças na produção de saliva de linha de base por diferentes cepas de ratos. (A) Saliva de ratos fêmeas (10-12-semanas) foram coletados por 15 min, usando uma dose de pilocarpina de 0,375 mg/kg de peso corporal. (B) os pesos de corpo médio entre os grupos de ratos não foram significativamente diferentes. Significância estatística foi analisada pelo teste de Kruskal-Wallis, teste, seguido de Dunn do teste de comparações múltiplas. Um p < 0,05 foi considerado significativo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: método de Swab detecta hipofunção das glândulas salivares. (A) (A B6 X / J) ratos fêmeas F1 foram injetados com qualquer solução de LPS (0,1 mg/mL, 0,1 mL por rato, intraperitonealmente) ou solução salina e saliva foi medido 26 h mais tarde. Uma experiência representativa mostra uma significativa (p = 0.0079) gota (60%) na produção de saliva em ratos tratados com LPS. (B) hipofunção da glândula salivar foi medida em um sistema de modelo experimental do mouse para a síndrome de Sjögren. O modelo publicado anteriormente transferência passiva para indução de disfunção glandular foi utilizado4 com poucas modificações. Camundongos C57BL/6 fêmeas (10-12 semanas de idade) foram injetados com adjuvante de alum. Nos dias 14 e 20 ratos foram injetados com 0,05 mL de soro de coelho anti-Ro52 e a produção de saliva era medida após 24 h. Observe uma significativa (p = 0.0003) queda (50%) na produção de saliva em camundongos tratados com soro alúmen e anti-Ro52. Significância estatística foi analisada pelo teste de Kruskal-Wallis, teste, seguido de Dunn do teste de comparações múltiplas. Um p < 0,05 foi considerado significativo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: O método da zaragatoa produz resultados reprodutíveis, ao longo do tempo (A) e entre operadores (B). O método do esfregaço mostra resultados comparáveis entre os dois operadores com diferentes comprimentos de mouse experiência em experiências realizadas em mais de um ano de tratamento. Produção de saliva de base em ratos fêmeas C57BL/6 (10-13 semanas de idade) foi medida por cada operador. Resultados são expressos em peso de saliva produzida (mg/g de massa corporal). Datas de coleta de saliva estão no eixo x e os resultados dos dados recolhidos ao longo do tempo são mostrados (A). Cada ponto de dados representa um rato, e o número de ratos analisados em cada tempo é mostrado entre parênteses. Rácios de saliva do linha de base (média + SEM), pool de 3 experimentos são mostrados (B)e não são significativamente diferentes entre os operadores. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Produção de saliva é um processo complexo e é influenciada por muitos fatores. Portanto, medir a função da glândula salivar em animais de laboratório pode ser um desafio. Um desafio adicional é que medidas repetidas da função das glândulas salivares no mesmo animal são necessárias para estabelecer o início da doença ou para demonstrar a recuperação após o tratamento.
O método da zaragatoa descrito neste relatório é tecnicamente simples para realizar com várias opções para representar os dados. Os resultados obtidos são reprodutíveis, com pouca variação inter operador. O método pode detectar uma redução na produção de saliva em diferentes modelos de disfunção das glândulas salivares. Uma vantagem significativa é o uso de polímeros inertes, altamente absorventes e recuperação eficiente da saliva coletada, permitindo a medição de biomoléculas salivares. Outra vantagem deste método é que é possível realizar este procedimento simultaneamente em até 2 ratos cada vez por um único operador. Isto é significativamente mais eficiente do que alguns dos outros métodos, onde ela é realizada em um único rato por vez.
A variabilidade nas medidas de produção de saliva têm sido a ruína de todas as técnicas de medição de saliva. Para minimizar a variabilidade, é importante respeitar estritamente o protocolo. Passos críticos incluem: selecionando o mesmo tempo do dia para os ratos de jejum e coleta de saliva, adequado a dosagem do anestésico e pilocarpina (tabela 1) e registros de peso exato de cotonetes secos e molhados. Gestão do tempo cuidado é necessário para definir até 2 ratos por vez para coleta de saliva.
Como mostrado na Figura 3, a quantidade de saliva produzida por ratos é dependente de tensão. Assim, adequado a estirpe, idade e sexo ratos combinados devem ser utilizados como controles. Titulação de dosagem a pilocarpina, para a estirpe específica e a condição experimental a ser investigado, é altamente recomendada. Apesar de uma dose maior de pilocarpina além de 0,5 mg/kg induz o aumento da produção de saliva, para avaliar a hipofunção glandular, é recomendável usar uma dose mais baixa. Isto permite a identificação de até mesmo pequenas diferenças na produção de saliva, entre o doente e controlar ratos. Doses de 0,5 mg/kg de peso corporal e 0,375 mg/kg de peso corporal têm sido utilizados com sucesso para demonstrar a hipofunção das glândulas salivares. No entanto, deve notar-se que certos sistemas de modelo experimental podem exigir períodos mais curtos ou mais longos da coleção do que o descrito neste protocolo. Isso deve ser testado por cada laboratório.
Uma limitação desse método, e a maioria dos métodos de medição da saliva é a necessidade de anestesia. O relatório com o método de vácuo não inclui o uso de anestésico5. No entanto, a ausência de anestesia induz níveis variados de ansiedade nos ratos. Eles tendem a lutar e morder o tubo, e que por sua vez, pode influenciar a eficiência de produção e coleta de saliva. Anestesia de isoflurano em ratos induz uma de produção de saliva12drop-in pilocarpina induzida. Em contraste, cetamina aumenta a secreção salivar e brônquica através da estimulação simpática13. Nós e os outros usaram com sucesso a quetamina e xilazina mistura como anestésico para medir pilocarpina induzido saliva produção4,7,8,9. O intervalo recomendado para anestesia cirúrgica é 100-200 mg/kg de ketamina e 5-16 mg/kg de xilazina14. A dose de 0,006-0,008 mL/g de massa corporal usado neste método (corresponde a 60-80 mg/kg de ketamina e 6-8 mg/kg de xilazina) cai na extremidade inferior do intervalo recomendado e é suficiente para fornecer um nível consistente de imobilização sem anestesia profunda .
O método da zaragatoa estabeleceu-se como uma alternativa para o método de micropipetas rotineiramente utilizados. A grande desvantagem do método pipeta foi a alta variabilidade inter operador e a necessidade de coletar a saliva de um rato de cada vez. O método da zaragatoa resolve ambos os problemas. Os benefícios incluem a limitação do número de animais necessários para alcançar o poder em análises estatísticas e aumento de eficiência. Substituindo cotonetes com cotonetes de polímero inerte para oferecer uma opção melhor desde cotonetes são conhecidos para quantificação de moléculas biologicamente ativas15de impacto.
Dada a simplicidade do método cotonete e sua grande reprodutibilidade entre diferentes indivíduos, espera-se que o método da zaragatoa facilitará melhores comparações dos modelos do rato entre instituições e pesquisadores em diferentes laboratórios.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar.
Acknowledgments
O estudo foi suportado por um fundo do National Institutes of Health, Instituto Nacional de dentária e Craniofacial Research (DE025030).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals for saliva collection | |||
| Pilocarpine hydrochloride | Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA | B21410 | Dilute in sterile isotonic saline. Store single use aliquots of 100X stock at -80oC |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia Mix solution | Mix 1 mL ketamine hydrochloride + 0.5 mL xylazine + 8.5 mL sterile isotonic saline in a sterile vial. Can be used for 3 months. | ||
| Zetamine (Ketamine hydrochloride) | Vet One, Boise, Idaho, USA | C3N VT1 | Stock is 100 mg/mL |
| Anased (Xylazine) | Med-Vet International, Mettawa, IL, USA | RXANASED-20 | Stock is 20 mg/mL |
| Isotonic sterile saline | Vet One, Boise, Idaho, USA | 501032 | Used as diluent |
| Artificial tears (lubricant ophthalmic ointment) | Henry Schien, Dublin, OH, USA | 48272 | Used to prevent eyes from drying during the procedure |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials for saliva collection | |||
| SalivaBio Children's swab | Salimetrics, LLC Carlsbad, CA, USA | N/A | Individually wrapped swabs |
| 50 mL polypropylene tubes | VWR, Radnor, PA, USA | 89004-364 | Cut off the bottom 1 cm of the tube. Make sure that the cut edge is smooth. |
| Microcentrifuge tubes 0.6 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-290 | Make holes in the bottom of tube with heated 18 gauge needles |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-298 | |
| Insulin Syringes with permanently attached needles | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 324702 | |
| 18 gauge regular bevel needles | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 305195 | |
| Sterile scalpel blade #11 | Integra York Inc PA, USA | 4-311 | |
| Microdissecting forceps | Roboz, Gaithersburg, MD, USA | RS-5139 | Serrated angular 0.8 mm tip, 4" length |
| Label tape | Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA | sc-224487 | |
| 3 channel timer | Amazon.com, Seattle, WA, USA | B06W2KCYVN | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo, Columbus OH, USA | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals/ reagents for inducing salivary dysfunction | |||
| LPS | Invivogen, San Deigo, CA, USA | tlrl-b5lps | Dissolve in endotoxin free water, and store stock solution at 5 mg/mL . dilute in sterile HBSS 100 ug/mL - inject 100 uL/ moue ip |
| Imject Alum adjuvant | Thermo Scientific | 77161 | Dilute 1:1 in sterile saline. Inject intraperitoneally 0.1 mL/mouse |
| Rabbit anti-Ro52 antiserum | Generated in lab | Immunization of rabbits with recombinant mouse Ro52 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals/ Kits for saliva analyses | |||
| Salivary lysozyme estimation | |||
| EnzChek Lysozyme Assay Kit | Molecular Probes, Eugene, OR, USA | E-22013 | Used as per manufacturer's instructions |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salivary IgA estimation by sandwich ELISA | |||
| Mouse IgA | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 0106-01 | Standards for sandwich ELISA - range 30 ng/mL to 0.5 ng/mL |
| Goat anti- mouse IgA unlabeled | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-01 | Coat at 1 ug/mL in bicarbonate buffer |
| Goat anti- mouse IgA HRP | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-05 | Detection antibody used at 1:4000 dilution |
| TMB substrate | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 555214 | Used as per manufacturer's instructions |
| Immulon 4HBX Microtiter 96 well plates | Thermo Scientific, Rochester, NY, USA | 3855 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salivary protein estimation | |||
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | BioRad, Hercules, CA, USA | 5000006 | For protein estimation as per manufacturer's instructions |
References
- Proctor, G. B.
- Fox, R. I. Sjögren's syndrome. Lancet. 366 (9482), 321-331 (2005).
- Eisbruch, A., Kim, H. M., Terrell, J. E., Marsh, L. H., Dawson, L. A., Ship, J. A. Xerostomia and its predictors following parotid-sparing irradiation of head-and-neck cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 50 (3), 695-704 (2001).
- Marmary, Y., Fox, P. C., Baum, B. J. Fluid secretion rates from mouse and rat parotid glands are markedly different following pilocarpine stimulation. Comp Biochem Physiol A Comp Physiol. 88 (2), 307-310 (1987).
- Lin, A. L., Johnson, D. A., Wu, Y., Wong, G., Ebersole, J. L., Yeh, C. K. Measuring short-term gamma-irradiation effects on mouse salivary gland function using a new saliva collection device. Arch Oral Biol. 46 (11), 1085-1089 (2001).
- Scofield, R. H., Asfa, S., Obeso, D., Jonsson, R., Kurien, B. T. Immunization with short peptides from the 60-kDa Ro antigen recapitulates the serological and pathological findings as well as the salivary gland dysfunction of Sjogren's syndrome. J Immunol. 175 (12), 8409-8414 (2005).
- Deshmukh, U. S., Nandula, S. R., Thimmalapura, P. R., Scindia, Y. M., Bagavant, H. Activation of innate immune responses through Toll-like receptor 3 causes a rapid loss of salivary gland function. J Oral Pathol Med. 38 (1), 42-47 (2009).
- Deshmukh, U. S., Ohyama, Y., Bagavant, H., Guo, X., Gaskin, F., Fu, S. M. Inflammatory stimuli accelerate Sjögren's syndrome-like disease in (NZB x NZW)F1 mice. Arthritis Rheum. 58 (5), 1318-1323 (2008).
- Szczerba, B. M., et al. Interaction between innate immunity and Ro52-induced antibody causes Sjögren's syndrome-like disorder in mice. Ann Rheum Dis. 75 (3), 617-622 (2016).
- Takakura, A., Moreira, T., Laitano, S., De Luca Júnior, L., Renzi, A., Menani, J. Central muscarinic receptors signal pilocarpine-induced salivation. J Dent Res. 82 (12), 993-997 (2003).
- Yao, C., et al. Lipopolysaccharide-induced elevation and secretion of interleukin-1beta in the submandibular gland of male mice. Immunology. 116 (2), 213-222 (2005).
- Knudsen, J., Nauntofte, B., Josipovic, M., Engelholm, S. A., Hyldegaard, O. Effects of isoflurane anesthesia and pilocarpine on rat parotid saliva flow. Radiat Res. 176 (1), 84-88 (2011).
- Kohrs, R., Durieux, M. E. Ketamine: teaching an old drug new tricks. Anesth Analg. 87 (5), 1186-1193 (1998).
- Cold Spring Harbor Protocols. Cold Spring Harb Protoc. , Available from: http://cshprotocols.cshlp.org/ (2006).
- Kozaki, T., Hashiguchi, N., Kaji, Y., Yasukouchi, A., Tochihara, Y. Effects of saliva collection using cotton swab on cortisol enzyme immunoassay. Eur J Appl Physiol. 107 (6), 743-746 (2009).
