Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Плода мышь сердечнососудистой визуализации с помощью системы высокой частоты ультразвука (30/45 МГц)

doi: 10.3791/57210 Published: May 5, 2018

Summary

ВЧ-УЗИ плода мыши улучшилась разрешающей и может предоставить точные неинвазивные характеристика сердца развития и структурных дефектов. Протокола, изложенные в настоящем документе предназначен для выполнения в реальном времени плода мышей эхокардиография в естественных условиях.

Abstract

Врожденных пороков сердца (ХПК) являются наиболее распространенной причиной детской заболеваемости и смертности, рано. Дородовой выявление основных молекулярных механизмов ХПК имеет решающее значение для изобретать новые профилактические и терапевтические стратегии. Мутант мыши модели являются мощными инструментами для себя новые механизмы и экологического стресса модификаторы, которые управляют сердца развития и их потенциальные изменения в ХПК. Однако усилия для установления причинно-следственных связей этих предполагаемых участников были ограничивается гистологические и молекулярных исследований в не выживание экспериментов на животных, в котором мониторинг ключевых физиологические и гемодинамических параметров часто отсутствует. Живой Тепловизионная технология стала важным инструментом для установления этиологии ХПК. В частности, УЗИ может использоваться пренатально без хирургическим путем разоблачения плодов, позволяя поддержание их базовых физиологии при мониторинге воздействия экологического стресса на гемодинамики и структурных аспектов сердечной камеры развития. Здесь мы используем систему высокочастотный ультразвук (30/45) для изучения сердечно-сосудистой системы плода мышей на E18.5 в утробе матери на базовой линии и в ответ на экспозиции дородовой гипоксии. Мы продемонстрируем возможности системы для измерения размер камеры сердца, морфология, функции желудочка, ЧСС плода и пуповинной артерии потока индексов и их изменения плода мышей в системных хронической гипоксии в утробе матери в реальном время.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Врожденные пороки сердца – разнородных структурных дефектов, возникших в процессе раннего развития сердечной. Современные технические достижения оперативных процедур привели к значительным улучшениям в выживаемости новорожденных с ХПК1,2. Однако качество жизни часто является ослабленной средней длительной госпитализации и потребностям для устроили хирургического процедуры1,2,3,,45. Дородовой выявление основных молекулярных механизмов ХПК имеет решающее значение для того, чтобы план раннего вмешательства, осуществлять новые стратегии предупреждения и для улучшения жизни результаты6,7.

Хотя несколько генетических и экологических факторов были вовлечены в патогенез ХПК, установление причинно-следственная связь остается неудовлетворенный улучшить диагностические, терапевтические и превентивные стратегии1,8,9 ,10,,1112. Кроме того изучение роли в утробе матери факторов стресса и эпигеномные модификаторы открывает новые центры для будущих расследований11,12. В последнее десятилетие действительно стали свидетелями стремительного прогресса в технологии следующего поколения последовательности включая microarray Однонуклеотидный полиморфизм единичных нуклеотидных, весь exome последовательности и исследования генома общесистемной метилирования дна, их использование в изучении генетического причины сложных заболеваний человека, включая ХПК1,8,9,10,11 почву для выявления новых мутаций и генетические варианты, которые еще не были проверены на их патогенности в подходящих животных моделях.

Среди различных заболеваний модели систем мышь является животных модель выбора, не только для изучения механизмов ХПК во время ранних cardiogenesis13,14,,1516, но и для выяснения их влияние на сердечной камеры созревания и функции в конце беременности в дородовой период и перинатальных факторов стресса. Следовательно, выполнение в vivo фенотипические характеристики мутант плода мыши сердца, ранних и поздних стадиях развития, важно понять роль этих генетических вариаций и экологических факторов на развитие сердечной, и потенциального будущего воздействия на камеры созревания и конкретных процессов в мышей.

Раннее обнаружение и точная диагностика пороков сердца во время разработки имеет решающее значение для интервенционных планирования17,18. Будучи безопасной, простой, портативные и повторяемости, УЗИ плода действительно стал стандартом изображений техника для сердца оценки в клинике. Плода циркуляции оценки с использованием ультразвуковой допплерографии широко используется в клинической практике не только для обнаружения пороков сердца, но и для выявления сосудистых патологий, недостаточности плаценты и Внутриутробное ограничение роста и для оценки плода благополучия в ответ на оскорбления в утробе матери включая гипоксемия, материнской заболеваемости и наркотиков токсичности17,18. Параллельно с его значение в оценке человека дефектов и болезней оценки УЗИ плода мышей получила повышение полезности в экспериментальной параметры19,20,21,22, 23. В частности УЗИ сердца плода (эхокардиография) позволяет последовательно в vivo визуализации развивающихся сердца. Многие экспериментальные исследования использовали УЗИ технологии для наблюдения за развитие плода сердечно-сосудистой системы у трансгенных мышей плода. Ультразвуковая допплерография оказалась особенно полезной для выяснения патофизиологические параметры, такие как шаблоны потока в плода циркуляции при физиологических проблем или болезней условия10,19. В организме человека и животных ненормальное потока или кислорода кровоснабжение плода может быть результатом различных условий, которые могут нарушить среды плода в утробе матери и влияют на оси фетоплацентарной, включая плацентарных аномалии, материнской гипоксии, гестационный диабет и фармацевтически индуцированных сужение сосудов15,22. Таким образом создание стандартизированных методов для выполнения Допплер УЗИ плода мышей будет чрезвычайно возможностей будущих исследований ХПК путем облегчения мониторинга потока моделей и ключевых гемодинамических показателей сердечно цепей во время различных этапах сердечной развития в генетических мыши модели.

Высокая частота ультразвуковых стала мощным инструментом для измерения развития и физиологических параметров сердечно-сосудистой системы в модели мыши и заболеваний человека18. Эта технология были уточнены в последние годы. Мы и другие исследователи продемонстрировали возможности этой системы для проведения ультравысокой частоты ультразвуковых исследований плода мыши сердце15,19,20,21,22 ,23. Система оснащена Doppler цвет потока картирования и линейного массива преобразователей, которые генерируют двумерных, динамических изображений с частотой кадров, высокой частоты (30-50 МГц). Эти преимущества, по сравнению с низкой частоты ультразвуковых систем и предыдущего поколения высокой частоты ультразвука21,22, обеспечивают необходимую чувствительность и разрешение для углубленной оценки плода кровообращения системы, включая всеобъемлющее характеристика сердце структур, функции камеры и индексов поток плода мышей в экспериментальных условиях. Здесь мы наметим методы для выполнения быстрой оценки кардиопульмональной циркуляции и Фето плацентарного кровообращения в эмбриональных день E18.5 в естественных условиях , используя систему высокой частоты. Мы выбрали 30/45 МГц датчик, который обеспечивает осевой разрешение примерно 60 мкм и латеральное разрешение 150 мкм. Однако высокий частотный преобразователь (40/50 МГц) могут быть выбраны для анализа ранее этапах своего развития, следуя аналогичный методологический подход. M-режим позволяет визуализацию тканей в движении на уровнях высокого временного разрешения (1000 кадров в секунду). Наконец мы продемонстрировать возможности высокой УЗИ для подробного всеобъемлющего фенотипические характеристики плода сердечно гемодинамических статус и функции в мышей на базовом и в ответ на стресс дородовой гипоксии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Калифорнийский университет, Лос-Анджелес, животное уход и использование Комитет одобрил все процедуры, показаны в этом протоколе. Эксперименты были проведены в рамках продолжающегося исследования под активных животных протоколов, одобренных институциональных животное уход и использование комитета университета Калифорнии, Лос-Анджелес, Калифорния, США. Животных обработки и ухода за стандартов руководства для ухода и использования лабораторных животных.

1. Подготовка высокой частоты ультразвуковых изображений системы

  1. Включите ультразвуковой системы визуализации и мониторинга блок физиологии.
  2. Подключение датчика 30/45 МГц.
  3. Поместите головку соответствующего сканирования на держателе рядом платформа отображения информации.
  4. Выберите параметр Сердца программы измерения .
  5. Место, УЗИ гель вниз головой в его предварительно потепления контейнера, равным 37 ° C.
  6. Проверьте соответствующие трубы системы для анестезии и уровень кислорода и изофлюрановая.
  7. Продезинфицируйте платформа отображения информации и рабочей области.
  8. Установите уровень жары изображений платформы для поддержания температуры тела на постоянной и сердечного ритма плотин.

2. Беременные мыши подготовка

  1. Место беременной мышь (C57/BL6) плотины в камере индукции анестезии.
  2. Вызвать обезболивание с помощью непрерывно доставки ингаляционных изофлюрановая (изофлюрановая 2% - 3%), смешанного с 100% кислорода (100% O2) со скоростью потока 200 мл/мин в зале индукции.
  3. Передача седативных животных на платформу обработки изображений в лежачем положении.
  4. Обеспечивают установившегося седативный эффект, используя маску подключен к изофлюрановая системы доставки трубки анестезии (1,0-1,5%) смешивается с 100% O2 200 мл/мин.
    Предупреждение: Контроль утечки анестезирующий газ с помощью системы вентиляции с угольный фильтр, содержащий набор канистру.
  5. Лента конечностей мягко для встраиваемых электрокардиографические электродов после нанесения геля электрода для достижения постоянного мониторинга материнской сердечной и дыхательной ставок.
  6. Отрегулируйте уровень изофлюрановая поддерживать средний сердечный ритм (450 + /-50 ударов в минуту (bpm)).
  7. Поддерживать температуру тела в диапазоне 37.0 ° C +/-0.5 ° C. Контролировать температуру тела и частоты сердечных сокращений, отображаемого на блок контроллера физиологии.
  8. Документ жизненно важные признаки седативных мыши каждые 15 мин на протяжении всей процедуры обработки изображений.
  9. Оцените уровень анестезии, оценивая мыши осанки, сердечного ритма и ответ на носок щепотки.
  10. Применить офтальмологический бальзам (по 1 капле в каждый глаз) чтобы предотвратить сухость глаз и повреждение роговицы.
  11. Удаление мех от середины груди уровня для нижних конечностей с помощью депиляционный крем для сведения к минимуму затухания ультразвука. После приложения путем чередования мокрой и сухой марлевой салфетки для предотвращения повреждения кожи, удалите крем 1-1,5 мин.

3. эмбриона идентификации

  1. Ощупывайте брюшной стенки осторожно, чтобы найти плод и разложил их.
  2. Аннотации каждого эмбриона на животе плотины и определить их передней задней и спинной вентральный ориентации с помощью маркера.
  3. Используйте шейки матки седативных плотины как ориентир. Ярлык плодов на левой и правой маточные рожки L1, L2, L 3, и т.д. (слева) и R1, R2, R3, и т.д. (справа), соответственно (рис. 1A).
    Предупреждение: Во избежание распространения плодов насильственно. 1-2 плодов в каждом помете могут перекрываться с другими, делая их позиционирования и изображений ненадежными. Исключите из анализа этих плодов.

4. плода сердце визуализации и аннотации

  1. Нанесите гель подогретым УЗИ на животе и распространение его тщательно, чтобы избежать формирования пузыря. Добавьте дополнительное количество геля на области сканирования изображений.
  2. Место ультразвуковой зонд на держателе механических и мобилизовать его постепенно к коже, чтобы связаться с слоем густой гель глядя на биение сердца с помощью B-режим сканирования (рис. 1).
  3. Нажмите кнопку B режим сканирования для получения изображения 2-D. Используйте мочевого пузыря как ориентир для определения первого плода, дислоцированные в правом или левом рога матки и пометить его как R1 или L1, соответственно.
  4. Подтвердите правой и левой ориентации отдельных плода в реальном времени, движущихся изображений платформы в горизонтальной плоскости. Сканирования от головы до хвоста для аннотирования морду, конечностей и позвоночника как ориентиры (рис. 1B, 1 видео).
  5. Визуализировать бьющееся сердце и аннотировать левого желудочка (LV) и правого желудочка (RV). Использование цветовой Допплер режим оптимизировать визуализацию сердца (рис. 1 C-G, видео 1 - 2).
  6. Нажмите кнопку B режим сканирования для получения парастернальной короткой оси представление, LV и RV, отображаемые в их максимальный диаметр в центре кадра приобретение данных. Начните жить изображения (рис. 1B-C).
  7. Измените ориентацию мыши относительно проверки плоскости для получения продольной четырехкамерные вид (рис. 1 d). Во-первых Определите оставшиеся структур сердца как предсердия, межжелудочковой перегородки и левый и правый отток участки. Далее имеют предсердий и желудочков камер, отображаемые в их максимальный диаметр. Затем начните получение изображения.
  8. Исключите неоптимальным, наклонный изображения из окончательного анализа. Нажмите кнопку Чини для получения непрерывной записи «Cineloops» для минимум 10 сек, затем сохранить записанные изображения.

5. Оценка сердечных сокращений плода и функции желудочка

  1. Нажмите кнопку M-режим сканирования для получения сердечной изображения из четырех плоскостей камеры (3 видео).
  2. Просмотр списка записей для анализа после завершения изображения всех эмбрионов.
  3. Исключите неоптимальным, наклонный изображения из окончательного анализа.
  4. Нажмите кнопку анализ для измерения толщины стенок и левого/правого желудочка внутренний диаметр на диастола (LVID, d; RVID, d) и Систола (LVID, s; RVID, s), как показано на рисунке 2.
  5. Определите, что средняя ЧСС плода, играя друг записан M-режим трассировки и расчета измерения одного потока цикла в следующем поток цикла (расстояние между соседними пиками).
  6. Выполните несколько измерений (по крайней мере 5 за трассировки) для получения средней частоты сердечных сокращений (рис. 2).
  7. Измерьте временных изменений между левого желудочка внутренний диаметр диастолического (LVID, d) и левого желудочка внутренний диаметр в конце систолы (LVID, s) на протяжении всего сердечного цикла. Затем рассчитать дробных шортинга процент (FS %) следующим образом: FS % = [(LVID,d-LVID,s)/LVID, d] x100.
  8. Выполните несколько измерений (по крайней мере 5 за трассировки) для получения среднего значения % FS.

6. Оценка параметров сердечно-легочными потока

  1. Отрегулируйте сектора на угол приобретения менее 60o. Нажмите кнопку Доплера для выполнения импульсной волны доплеровского измерения от плоскости 2-D четыре камеры изображений с помощью преобразователя 45-МГц.
    1. Во-первых Визуализируйте бифуркации легочной артерии определить правильный отток тракта. Затем нажмите кнопку импульсного волна Doppler чтобы получить шаблон потока через легочной и аортального клапанов (рис. 3A, видео 4).
  2. Получения легких расходометрии от импульсной волны Doppler трассировки, включая пиковой систолической скорости (ПКВ), ускорение времени (AT) и выброса время (ET).
  3. Выполните несколько измерений (по крайней мере 5 за трассировки) для получения среднего измерения, как показано на рисунке 3A (справа).
  4. Рассчитать AT / ET коэффициент для каждого утечка клапан как показатель проходимости участки отток и приток крови.
  5. Перейти к получить шаблоны митрального и аортального потока от апикального четыре камеры 2-D представлений с помощью импульсной волны Doppler. Во-первых определите левого предсердий и левого желудочков камер. Далее поместите объем Doppler образца импульсной волны для записи шаблонов митрального приток Doppler и измерения ранней диастолической скорости (E) и скорость сокращения предсердий () (рис. 3B)24,25.
  6. Регулировка громкости Доплера образец, чтобы получить шаблон аорты Doppler струи. Использовать аорты Doppler jet трассировки для измерения ускорения (AT) и выброса время (ET), как показано на рисунке 3B (справа) (5 видео)

7. Оценка фето плацентарной оси

  1. Используйте цвет доплеровского сканирования для визуализации маточной артерии и фето плацентарной сосудистой дерево с помощью преобразователя 45 МГц (рис. 4A).
  2. Идентифицировать пупочных сосудов (две артерии и один вен) в сегменте интраамниальной пуповины, только после того, как шнур выходит из брюшной полости плода.
  3. Место импульсной волны объем Doppler образца для получения картина течения пуповинной артерии (рис. 4A).
  4. Измерения параметров потока сосудистой пик, включая ускорение времени (время), выброса (ET), и пиковой скорости потока в конце систолы (ПКВ, s) с помощью импульсной волны доплеровского сканирования запись (рис. 4В).
  5. Получите 5 последовательных сигналов на каждом судне, в отсутствие движений плода и матери дыхательных движений, чтобы измерить скорость средняя пик для каждого судна.
  6. Перейти к следующему эмбриона.

8. После обработки изображений животных мониторинг

  1. Выключите изофлюрановая контейнера после завершения процесса визуализации.
  2. Продолжить мониторинг температуры тела, частоты дыхания и пульса на этапе восстановления.
  3. Удалите маску и подключенных труб системы после того, как плотина начинает спонтанных движений.
  4. Возвращение плотины в надлежащее жилье и продолжить наблюдение согласно стандартных институциональных протоколов после процедуры.
  5. Документ время полное возобновление нормальной деятельности.

9. эксплуатационные требования и технические соображения

  1. Ограничьте время обработки ~ 8 плодов до примерно 1 ч. чтобы избежать неблагоприятных последствий длительной анестезии на жизненно важные признаки и физиологических параметров.
  2. Полное обучение с 8-10 беременных мышей для оптимизации методов для изображения моделей приобретения и потока трассировки в короткие сроки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Статистический анализ сердечной и гемодинамических показателей были выполняемых в автономном режиме. Средства 5 последовательных измерений в 3 оптимального изображения были рассчитаны. Данные были высказаны как означает ± SEM. студент t-тест был использован для выведения межгрупповые сравнения. Значение P ≤0.05 считался статистически значимой.

После выше протокол мы характеризуется влияние хронического воздействия дородовой гипоксии на состояние сердечно-сосудистой системы мышей, плода в конце беременности получения реального времени высокой частоты ультразвука записей на беременных мышей C57/BL6 приурочен на гестационный день (GD) 18.5.

После создания племенных групп было подтверждено успешного спаривания. Приурочен беременных плотины были сохранены в клетках под 12 h свето теневой режим с ad libitum продовольствия и воды до. В GD14.5 беременных мышей были выделены либо к группе normoxia (поддерживается в атмосферном воздухе) или в группу гипоксии (помещается в камеру гипоксии на 10% FiO2 побудить системных гипоксии). После рождения плотин и их детенышей оставался выделенных для их экспериментальной состояния до послеродового день 7 (P7).

В целом, 6 плотин были изучены в этих экспериментах и 42 плодов были успешно воспроизведен образ в GD18.5. Из них использовались данные, полученные из 36 плодов для последующего анализа (Таблица 1). Анализ плода ЧСС на GD18.5 показал, что гипоксии плода страдает от брадикардии плода (Нижняя ЧСС) и опытных значительное снижение показателей плода функции сердца (EF % и FS %) (Таблица 1). Удивительно пик скорости потока (PkVs) пупочной артерии PkVs были снижены в подвержены гипоксии плода (рис. 4B и Таблица 1). Кроме того, время пуповинной артерии ускорение времени/выброса (в / ET) коэффициенты показали значительно более низкие значения в гипоксических по сравнению с нормоксические плодов, предложив увеличить пупочных сосудов гидравлическое сопротивление. В соглашении в подвержены гипоксии плода, измеренного на 2-D/M-режим изображения (рис. 5) увеличена толщина стенки правого желудочка. Так как RV предполагает доминирующую насоса функция во время внутриутробного развития, в то время как плацента служит основным сосудистого русла для оксигенации, эти данные коллективно предложить повышенные гидравлическое сопротивление в фето плацентарной сосудистой цепи, ведущие к RV гипертрофия. Важно отметить, что подвергаются гипоксия новорожденных столкнулся с раннего послеродового летальность. RV неудачи и повышение сосудистого сопротивления, вызванных хронического воздействия дородовой гипоксии потенциально способствуют причины. Нельзя исключать и другие факторы, такие как редокс токсичности результате реоксигенации травмы, плохое питание и болезни матери. Тем не менее точный механизм дородовой гипоксии индуцированной сердечной патогенеза и начале летальности плода по-прежнему определяться в будущих исследованиях.

Figure 1
Рисунок 1: Аннотация плода мышей и сердца в утробе матери с помощью сканирования B-режим визуализации и цветной допплер допроса. (A) схематическое представление идентификации плода мышей и аннотация (L: слева, справа R:). (B) представитель изображение анатомические ориентиры в плода для руководства направление гестационный день 18,5 сердца плода с парастернальной короткой оси зрения левого желудочка (LV), правый желудочек (RV) и межжелудочковой перегородки (ИВС). (C) представитель изображение парастернальной короткой оси зрения LV и RV с допроса цвета для облегчения визуализации камеры сердца. (D) продольного 4 камерная вид LV и RV, оставил предсердий (ла) и правый предсердий (RA) цвет Допплер. (E) продольной четырехкамерные вид LV и RV, с цветной допплер допроса для облегчения визуализации отток участки: правый желудочек отток тракта (Антиангинальную), отток тракта левого желудочка (LVOT), аорты (AO) и правый желудочек отток тракта (Антиангинальную). (F) представитель цветные Doppler допроса Антиангинальную и ПА. (G) представитель цветные Doppler допроса LVOT и АО. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: Оценка сердечных сокращений плода и функции желудочка. (A) представитель M-режим трассировки полученных из представления 4-камерная длинной оси на 18,5 GD. (LV: слева желудочка; RV: Правый желудочек; LA: Левое предсердие; RA: право Атриум). (B) представитель количественной (линии со стрелкой) метод размеров желудочков, включая левого и правого желудочка внутренний диаметр на диастола (LVID, d; RVID, d) и Систола (LVID, s; RVID, s), левая и правая толщина стенок желудочков в диастола (LVAW, d; RVW, d), межжелудочковой перегородки (ИВС), и биться в такт измерение HR показаны из четырех изображений плоскости камеры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: импульсная волна Doppler трассировки плода легочной, аортального и митрального клапана потока индексов. (A) представитель изображение легочной артерии импульсной волны Doppler трассировки (слева). Методы количественной оценки (линии) индексов PkV (пик скорости), легочная потока во время (ускорение), ET (время эжекции) отображаются (справа) с продольной четырехкамерные зрения. (B) представитель образ митрального и аортального Импульсный Допплер потока шаблон (слева) и количественной оценки митрального клапана потока индексов E (ранней диастолической скорости) и (сокращение предсердий), аорты потока индексов в, ET, и ПКВ (справа) показаны от 4 камерная изображений самолет. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: Оценка Фето плацентарного кровообращения. (A) Представитель образ фето плацентарной сосудистой цепи, используя цветные Doppler допроса (верхний) и материнской записи ЭКГ (нижний). (B) Представитель изображение импульсной волны Doppler записи и количественного определения измерений (линии) пуповинной артерии потока индексов в гипоксии (верхний) и normoxia управления воздействию плода мышей (нижний). PkV (пик скорости), во время (ускорение), ET (время выброса). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: лечение оценки толщины стенки правого желудочка при гипоксии плода мышей. (A, B) Представитель M-режим трассировки полученных из представления четырехкамерные длинной оси на 18,5 GD в условиях normoxia и гипоксии. LV: слева желудочка, RV: правый желудочек, стенки правого желудочка. Линии показывают количественные измерения толщины RVW систолы (s) и диастола (d). (C) RVW, s количественная оценка показывает увеличение толщины RVW лечение гипоксии плода мышей, по сравнению с normoxia. Ошибка-бар: Стандартная ошибка среднего. (D) представитель поперечные изображения сердца плода в GD 18,5 изображением увеличилась толщина стенки RV в лечение гипоксии и normoxia лечение групп. Оригинальные увеличение 10 X. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Параметр, блок Normoxia Дородовой гипоксии
Количество успешно фотосъемка плодов 20 16
Послеродовой смертности 5% 68,75%
Гемодинамических параметров (Среднее ± SEM) (Среднее ± SEM)
ЧСС плода, bpm 138 ± 4 89 ± 8 ***
Левый желудочек EF % 71.2 ± 3 55 ± 2 **
Левый желудочек FS % 43 ± 2 29 ± 4 **
Легочной артерии PkV, мм/сек 102 ± 10 129 ± 8 **
Легочной артерии на соотношение ET 0,42 ± 0,05 0,35 ± 0.03*
Пупочных артерий PkV, мм/сек 58 ± 4 40 ± 1.5* **
Пупочных артерий на соотношение ET 0.5 ± 0,03 0,42 ± 0.025*
Пупочную вену PkV, мм/сек 13 ± 1,2 19.6 ± 3 **
Пупочную Артериально венозные задержки, МС 122 ± 4 238 ± 20 *
EF, фракция изгнания; FS, дробные сокращения; NA, не имеется; НС, не значительными; ПКВ, пик скорости; ПКВ, d, пик скорости во время фазы; ПКВ, s, пик скорости во время систолы; T-тест студента был использован для выведения межгрупповые различия. P < 0,005. ** P < 0.01. * P < 0,05 представляет существенную разницу в межгруппового сравнения. t тестстудента. Non значение было оставлено пустым.

Таблица 1: гемодинамики нормоксические и гипоксии плода мышей на гестационный день 18.5. EF, фракция изгнания; FS, дробные сокращения; ПКВ, пик скорости; AT, ускорение времени; ET, время эжекции. T -тест студента был использован для выведения межгрупповые различия. *** P < 0,005. P < 0.01, и * P < 0,05 представляет существенную разницу в межгруппового сравнения.

Video 1
Видео 1: B-режиме короткой оси. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)

Video 2
Видео 2: цветные Doppler – апикальной продольной вид. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)

Video 3
Видео 3: М. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)

Video 4
Видео 4: легочной артерии-импульсной волны Doppler. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Сердечно-сосудистые пороки развития и заболевания существенно влиянием генетических факторов и элементов окружающей среды19. Ранее мы продемонстрировали значительное влияние матери ограничение калорий, начато во втором триместре, фето плацентарного кровообращения потока и плода сердечной функции9.

Дородовой гипоксии является еще одним общим фактором стресс во время внутриутробного развития, которые могут значительно повлиять на фето плацентарной физиологии и системы кровообращения. Влияние пренатального гипоксии воздействия могут быть более глубокие в контексте CHD ведет к бедным перинатальной адаптация к послеродовой жизни. Аномальные тарифы сердца и сердечной индексов, обнаруженных в этом исследовании являются действительно важными показателями сердца стресс и изменены плацентарного кровообращения физиологии и таким образом являются важнейшими элементами первичных для обнаружения дефектов развития и последующее гемодинамические изменения, которые могут стать далее произносится в ответ на дородовой период гипоксической стресс приводит к ранней сердечной недостаточности. Вопреки ожиданиям подвержены гипоксии плода были низкими сердца. Это явление может отражать механизмов незрелых саморегуляции сердца плода мышей в ответ гипоксии в GD18.5. Однако точное патогенеза остается неизвестным.

Хотя других дополнительных изображений методы, например плода сердечного МРТ, позволяют жить изображений сердца структур во время развития20, состояние гемодинамики часто теряется из-за статических изображений и длительных процедур. Неинвазивная Ультразвуковая технология, с другой стороны, позволяет выполнять в естественных условиях динамических изображений, которая поддерживает базовые физиологии. Кроме того при наличии высоких частотных преобразователей с расширенной резолюции, Визуализация сердца плода на разных этапах своего развития каждого индивидуального плода может стать более осуществимым у трансгенных мышей, оптимизируя плода аннотации методы. Наконец стоимость одного эксперимента является гораздо менее использование этого метода.

В предыдущем докладе, Ким GH et al.авторы представили важные и новые идеи относительно изображений плана оптимизации для сбора данных с помощью предыдущего поколения высокой частоты ультразвуковых изображений системы21. Еще один доклад, Чжоу YQ et al., создала стандартизированных базовые измерения плода циркуляции на физиологическом уровне, используя высокой частоты ультразвука, с цветовой доплеровской системой22. Таким образом протокол, представленные здесь дополняет ранее установленными протоколами и расширяет наметить комплексного метода, что целесообразно и осуществимо в режиме реального времени в экспериментальных условиях. Расширенные и Высокочувствительный ВЧ ультразвуковой системы была использована в данном исследовании для сканирования фето плацентарной цепи как единое целое. Изложил протокол простых и стандартизированных использовать эту мощную систему эффективно, как это продемонстрировано достижение количественных измерений влияния гипоксии на плода циркуляции в мышах в GD18.5.

Тем не менее, мы должны признать, важные ограничения и проблемы роковой кардиологическим: во-первых, цистит агентов, в том числе изофлюрановая, могут повлиять на физиологические параметры плода. Длительной анестезии, выпадение волос и ультразвуковой гель может привести к гипотермии, который может повлиять на ЧСС и гемодинамических показателей плотины, а также плодов. В настоящее время есть нет доступных метод для оценки уровня анестетиков и их воздействия на плод. Чтобы обойти это ограничение, мы Титруйте вдыхаемого изофлюрановая уровни тщательно, чтобы добиться соответствующих седации плотин, сохраняя при этом их базальная ЧСС и жизненно. Во-вторых визуализация плодов, которые расположены в глубине живота является сложным и субоптимальные, приводит к исключению этих плодов от окончательных данных анализа. Цветной Допплер позволяет Улучшенная оптимизация изображений секций и надлежащего выравнивания между преобразователем и поток крови. В-третьих одновременный анализ всех плодов требует оператора эффективности в быстрой и точной визуализации и изображения приобретение быстро, подразумевая важность практической подготовки.

Наконец, ключевые шаги в этом методе необходимо подчеркнуть включая 1) надлежащей подготовки системы. 2) поддержание стабильной тела температуры и частоты сердечных сокращений для беременных мыши. 3) оптимизация скорости потока изофлюрановая поддерживать базовые физиологических состояний эмбрионов для получения надежных данных. 4) последовательность и приобретения эффективных изображения в кратчайшие сроки. 5) гестационного возраста, пола и животных штамм являются важными переменными, которые могут значительно повлиять на результаты. Таким образом экспериментальный протокол должны тщательно разрабатываться для учета этих переменных, включая соответствующие элементы управления из же животных штамм в анализа и интерпретации данных.

В заключение высокочастотная ультразвуковая система является эффективным методом для достижения фенотипические характеристики сердечно-сосудистой системы плода в утробе матери с важными экспериментальной и научной ценности и потенциальных будущих приложений, которые могут включает 1) понимания физиологических динамики во время разработки сердца. 2) достижение всеобъемлющего фенотипического анализа генетических моделей ХПК. 3) изучение воздействия фето плацентарной обращения на развитие сердечной камеры, созревания и адаптации к стресс. 4) выполнение ультразвук руководствоваться плода инъекции для изучения токсины, тератогены или терапевтических агентов в будущем. 6) реализация спекл трассировки и деформации анализ возможностей получить подробные региональные функции миокарда развивающихся миокарда может служить основой для будущих исследований.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Конфликта интересов не объявлен.

Acknowledgments

Мы благодарим ядро физиологии животных, Отдел молекулярной медицины для оказания технической поддержки и открытом доступе к системе Vevo 2100 ультразвуковая биомикроскопия (UBM) в Лос-Анджелесе. Это исследование было поддержано NIH/ребенка здоровья исследовательский центр (5K12HD034610/K12), Discovery институт UCLA-детей и сегодня и завтра Детский фонд и Дэвид Геффен школа медицины исследований инновации премии м. Тоума.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vevo 2100 VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada N/A High Freequency Ultrasound Biomicroscopy. The set up is available in animal physiology core facility, division of molecular medicine, UCLA. USA
inbred mice (c57/BL6) Charles River Laboratories N/A Inbread wild type mouse strain

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Touma, M., Reemtsen, B., Halnon, N., Alejos, J., Finn, J. P., Nelson, S. F., Wang, Y. A Path to Implement Precision Child Health Cardiovascular Medicine. Front Cardiovasc Med. 4, 36 (2017).
  2. Triedman, J. K., Newburger, J. W. Trends in Congenital Heart Disease. The Next Decade. Circulation. 133, 2716-2733 (2016).
  3. Gilboa, S. M., et al. Congenital Heart Defects in the United States Estimating the Magnitude of the Affected Population in 2010. Circulation. 134, 101-109 (2016).
  4. Pruetz, J. D., et al. Outcomes of critical congenital heart disease requiring emergent neonatal cardiac intervention. Prenat Diagn. 34, 1127-1132 (2014).
  5. Peterson, C., et al. Mortality among Infants with Critical Congenital Heart Disease: How Important Is Timely Detection? Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 97, (10), 664-672 (2013).
  6. Atz, A. M., et al. Prenatal Diagnosis and Risk Factors for Preoperative Death in Neonates with Single Right Ventricle and Systemic Outflow Obstruction: Screening Data from the Pediatric Heart Network Single Ventricle Reconstruction Trial. J Thorac Cardiovasc Surg. 140, (6), For the Pediatric Heart Network Investigators 1245-1250 (2010).
  7. Lalani, S. R., Belmont, J. W. Genetic Basis of Congenital Cardiovascular Malformations. Eur J Med Genet. 57, (8), 402-413 (2014).
  8. Hanchard, N. A., Swaminathan, S., Bucasas, K., Furthner, D., Fernbach, S., Azamian, M. S., et al. A genome-wide association study of congenital cardiovascular left-sided lesions shows association with a locus on chromosome 20. Hum Mol. 11, 2331-2341 (2016).
  9. Arsenijevic, V., Davis-Dusenbery, B. N. Reproducible, Scalable Fusion Gene Detection from RNA-Seq. Methods Mol Biol. 1381, 223-237 (2016).
  10. LaHaye, S., Corsmeier, D., Basu, M., Bowman, J. L., Fitzgerald-Butt, S., Zender, G., et al. Utilization of Whole Exome Sequencing to Identify Causative Mutations in Familial Congenital Heart Disease. Circ Cardiovasc Genet. 9, (4), 320-329 (2016).
  11. Zaidi, S., Choi, M., Wakimoto, H., Ma, L., Jiang, J., Overton, J. D., et al. De novo mutations in histone modifying genes in congenital heart disease. Nature. 498, (7453), 220-223 (2016).
  12. Leirgul, E., Brodwall, K., Greve, G., Vollset, S. E., Holmstrom, H., Tell, G. S., et al. Maternal Diabetes, Birth Weight, and Neonatal Risk of Congenital Heart Defects in Norway, 1994-2009. Obstet Gynecol. 128, (5), 1116-1125 (2016).
  13. Garry, D. J., Olson, E. N. A Common Progenitor at the Heart of Development. Cell. 127, (6), 1101-1104 (2006).
  14. Postma, A. V., Bezzina, C. R., Christoffels, V. M. Genetics of congenital heart disease: the contribution of the noncoding regulatory genome. J Hum Genet. 61, 13-19 (2016).
  15. Ganguly, A., Touma, M., Thamotharan, S., De Vivo, D. C., Devaskar, S. U. Maternal Calorie Restriction Causing Uteroplacental Insufficiency Differentially Affects Mammalian Placental Glucose and Leucine Transport Molecular Mechanisms. Endocrinology. Oct. 157, (10), 4041-4054 (2016).
  16. Lluri, G., Huang, V., Touma, M., Liu, X., Harmon, A. W., Nakano, A. Hematopoietic progenitors are required for proper development of coronary vasculature. J Mol Cell Cardiol. 86, 199-207 (2015).
  17. Bishop, K. C., Kuller, J. A., Boyd, B. K., Rhee, E. H., Miller, S., Barker, P. Ultrasound Examination of the Fetal Heart. Obstet Gynecol Surv. 72, (1), 54-61 (2017).
  18. He, H., Gan, J., Qi, H. Assessing extensive cardiac echography examination for detecting foetal congenital heart defects during early and late gestation: a systematic review and meta-analysis. Acta Cardiol. 71, (6), 699-708 (2016).
  19. Hobbs, C. A., Cleves, M. A., Karim, M. A., Zhao, W., MacLeod, S. L. Maternal Folate-Related Gene Environment Interactions and Congenital Heart Defects. Obstet Gynecol. 116, (2 Pt 1), 316-322 (2016).
  20. Gabbay-Benziv, R., et al. A step-wise approach for analysis of the mouse embryonic heart using 17.6 Tesla MRI. Magn Reson Imaging. 35, 46-53 (2017).
  21. Kim, G. H. Murine fetal echocardiography. J Vis Exp. (72), e4416 (2013).
  22. Zhou, Y. Q., Cahill, L. S., Wong, M. D., Seed, M., Macgowan, C. K., Sled, J. G. Assessment of flow distribution in the mouse fetal circulation at late gestation by high-frequency Doppler ultrasound. Physiol Genomics. 46, (16), 602-614 (2014).
  23. Greco, A., Coda, A. R., Albanese, S., Ragucci, M., Liuzzi, R., Auletta, L., Gargiulo, S., Lamagna, F., Salvatore, M., Mancini, M. High-Frequency Ultrasound for the Study of Early Mouse Embryonic Cardiovascular System. Reprod Sci. 22, (12), 1649-1655 (2015).
  24. Deneke, T., Lawo, T., von Dryander, S., Grewe, P. H., Germing, A., Gorr, E., Hubben, P., Mugge, A., Shin, D. I., Lemke, B. Non-invasive determination of the optimized atrioventricular delay in patients with implanted biventricular pacing devices. Indian Pacing Electrophysiol J. 10, (2), 73-85 (2010).
  25. Kono, M., Kisanuki, A., Ueya, N., Kubota, K., Kuwahara, E., Takasaki, K., Yuasa, T., Mizukami, N., Miyata, M., Tei, C. Left ventricular global systolic dysfunction has a significant role in the development of diastolic heart failure in patients with systemic hypertension. Hypertens Res. 33, (11), 1167-1173 (2010).
Плода мышь сердечнососудистой визуализации с помощью системы высокой частоты ультразвука (30/45 МГц)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Touma, M. Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System. J. Vis. Exp. (135), e57210, doi:10.3791/57210 (2018).More

Touma, M. Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System. J. Vis. Exp. (135), e57210, doi:10.3791/57210 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter