Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Føtal mus kardiovaskulære Imaging ved hjælp af en høj frekvens ultralyd (30 / 45MHZ)

Published: May 5, 2018 doi: 10.3791/57210
Automatic Translation
1,2
1Neonatal/Congenital Heart Laboratory, Cardiovascular Research Laboratory, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 2Children's Discovery and Innovation Institute, Department of Pediatrics, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Summary

Høj-frekvens ultralyd billeddannelse af føtal musen har forbedret imaging opløsning og kan give præcise non-invasiv karakterisering af cardiac udvikling og strukturelle mangler. Protokollen beskrevet heri er designet til at udføre tidstro føtal mus ekkokardiografi i vivo.

Abstract

Medfødt hjertefejl (CHDs) er den mest almindelige årsag til barndommen sygelighed og tidlig dødelighed. Prænatal påvisning af de underliggende molekylære mekanismer af CHDs er afgørende for at opfinde nye forebyggende og terapeutiske strategier. Mutant musen modeller er kraftfulde værktøjer til at opdage nye mekanismer og miljømæssige stress modifikatorer, at drive hjerte udvikling og deres potentielle ændring i CHDs. Men bestræbelserne på at etablere årsagssammenhæng af disse formodede bidragydere har været begrænset til histologiske og molekylære undersøgelser i ikke-overlevelse dyreforsøg, i hvilken overvågning de vigtigste fysiologiske og hæmodynamiske parametre er ofte fraværende. Live imaging-teknologi er blevet et vigtigt redskab til at fastslå ætiologien af CHDs. Især ultrasound imaging kan bruges prænatalt uden kirurgisk udsætter fostre, at opretholde deres oprindelige fysiologi samtidig overvåge virkningen af miljømæssige stress på de hæmodynamiske og strukturelle aspekter af hjerte kammer udvikling. Heri, bruger vi højfrekvente ultralyd (30/45) system til at undersøge det kardiovaskulære system i føtal mus på E18.5 i utero ved baseline og som svar til prænatal hypoxi eksponering. Vi demonstrere gennemførligheden af system til at måle hjerte kammer størrelse, morfologi, ventrikel funktion, fostrets hjertefrekvens, og navlestrengen arterie flow indekser og deres ændringer i føtal mus udsættes for systemisk kronisk hypoxi i utero i real tid.

Introduction

Medfødte misdannelser i hjertet er heterogene strukturelle mangler, der opstår i den tidlige hjerte udvikling. Aktuelle tekniske fremskridt af operationelle procedurer har ført til betydelige forbedringer i overlevelsesrater for spædbørn med CHDs1,2. Livskvalitet er dog ofte kompromitteret sekundært til langvarig hospitalsindlæggelse og behov for iscenesat kirurgisk reparation procedurer1,2,3,4,5. Prænatal påvisning af de underliggende molekylære mekanismer af CHDs er afgørende for at kunne planlægge tidlige indgreb, til at foretage nye forebyggelsesstrategier og forbedre livslang resultater6,7.

Selv om flere genetiske og miljømæssige faktorer har været impliceret i CHDs patogenese, stadig oprettelse af kausaliteten et udækket behov for at forbedre diagnostiske, terapeutiske og forebyggende strategier1,8,9 ,10,11,12. Derudover åbner undersøger roller i utero stressfaktorer og epigenetiske modifikatorer nye spillesteder for fremtidige undersøgelser11,12. Det sidste årti har faktisk oplevet hurtige fremskridt i næste generation sequencing teknologi herunder enkelt nukleotid polymorfisme (SNP) microarray, hele exome sekvensering og genome-wide methylering undersøgelser, deres udnyttelse i at studere den genetiske årsager til komplekse sygdomme hos mennesker, herunder CHDs1,8,9,10,11 på vej til at identificere nye mutationer og genetiske varianter, der endnu ikke har været testet for deres sygdomsfremkaldende evne i passende dyremodeller.

Blandt de forskellige sygdom modelsystemer er musen dyremodel valg, ikke kun for at undersøge mekanismerne i CHDs under tidlige cardiogenesis13,14,15,16, men også at belyse deres indvirkning på hjerte kammer modning og funktion i sen drægtighed i prænatal og perinatal stressfaktorer. Derfor udfører i vivo fænotypiske karakterisering af en mutant føtal mus hjerte, i både tidlige og sene stadier af udvikling, er afgørende for at forstå, hvilken rolle disse genetiske variationer og miljøfaktorer på hjerte udvikling, og den potentielle fremtidige indvirkning på kammer specifikke modning processer i mus.

Tidlig påvisning og præcis diagnose af kardiale defekter under udvikling er afgørende for interventionel planlægning17,18. At være sikker, enkel, bærbare og repeterbare, er føtal Sonografi faktisk blevet standard imaging teknik for kardiale evaluering i klinikken. Føtale cirkulation vurdering ved hjælp af Doppler ultralyd har været meget anvendt i klinisk praksis ikke kun til påvisning af kardiale defekter, men også til at registrere vaskulær abnormiteter, moderkagen insufficiens og intrauterin vækst restriktioner og vurdere fosterets velbefindende i svar på i utero fornærmelser herunder hypoxæmi, moderens sygdom og narkotika toksicitet17,18. Sideløbende til sin værdi i evaluering af menneskelige fejl og sygdomme, har ultralyd vurdering af fostrets mus fået stadig større nytte i eksperimentel indstillinger19,20,21,22, 23. Især tillader fosterets hjerte ultralyd (ekkokardiografi) fortløbende i vivo visualisering af udvikle hjertet. Mange eksperimentelle undersøgelser har brugt ultralyd-imaging-teknologi til at observere fostrets hjerte-kar-udvikling i transgene føtal mus. Doppler ultralyd har været særdeles nyttig til at belyse de patofysiologiske parametre som flow mønstre i føtale cirkulation under fysiologiske udfordringer eller sygdom betingelser10,19. I både mennesker og dyr, kan unormal flow eller ilt blodforsyningen til fosteret skyldes forskellige forhold, der kan forstyrre føtal miljø i utero og påvirke fetoplacental akse, herunder placenta abnormiteter, maternel hypoxi, svangerskabsdiabetes, og farmaceutisk induceret vaskulære konstriktion15,22. Derfor vil etablere standardiserede metoder til at udføre Doppler ultralyd på føtal mus gevaldig bemyndige fremtidige undersøgelser af CHDs ved at lette overvågning flow mønstre og centrale hæmodynamiske indeks af de hjerte-kredsløb under forskellige stadier af cardiac udvikling i genetiske musemodeller.

Høj frekvens ultralyd har vist sig som et kraftfuldt værktøj til at måle de udviklingsmæssige og fysiologiske parametre af det kardiovaskulære system i musemodeller og menneskelige sygdomme18. Denne teknologi har været yderligere raffineret i de seneste år. Vi og andre forskere har påvist muligheden for dette system til ultra-høje frekvens ultralyd undersøgelser på føtal mus hjerte15,19,20,21,22 ,23. Systemet er udstyret med Doppler farve flow kortlægning og lineær array transducere, der genererer to-dimensionelle, dynamiske billeder ved høj frekvens (30 til 50 MHz) billedhastigheder. Disse fordele, i forhold til lav frekvens ultralyd systemer og den forudgående generation af høj frekvens ultralyd21,22, give den nødvendige følsomhed og opløsning for dybdegående vurdering af den føtale kredsløbssygdomme system, herunder omfattende karakterisering af hjertet strukturer, kammer funktion og flow indeks af føtal mus i eksperimentel indstillinger. Heri, skitsere vi metoder for at udføre hurtig vurdering af kardiopulmonale omsætning og feto-placenta omsætning på embryonale dag E18.5 i vivo ved hjælp af en høj frekvens system. Vi valgte en 30/45 MHz transducer, der giver en aksial opløsning af ca 60 µm og en lateral opløsning på 150 µm. Dog kan en højere frekvens transducer (40/50 MHz) blive valgt til at analysere tidligere udviklingsstadier ved at følge en lignende metodisk tilgang. Den valgte M-mode giver mulighed for visualisering af væv i bevægelse på høj tidsmæssige opløsning niveauer (1.000 rammer/s). Endelig vil vise vi gennemførligheden af høj ultralyd for detaljerede omfattende fænotypiske karakterisering af fosterets hjerte-kar-hæmodynamiske status og funktion i mus ved baseline og som svar til prænatal hypoxi stress.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

University of California, Los Angeles, dyrs pleje og brug Udvalget har godkendt alle procedurer i denne protokol. Forsøgene blev udført som en del af en igangværende undersøgelse under aktive dyr protokoller godkendes af den institutionelle Animal Care og brug Udvalget af University of California, Los Angeles, Californien, USA. Animalske håndtering og pleje efterfulgt standarder i vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr.

1. forberedelse højfrekvente Ultrasound Imaging System

  1. Drej på ultralyd billedbehandlingssystem og fysiologi overvågning enhed.
  2. Slut 30/45 MHz transducer.
  3. Sted tilsvarende scanningen hovedet på holderen nær imaging-platformen.
  4. Vælg indstillingen Hjerte måling Program .
  5. Sted ultralyd gel op og ned i transportkassen pre opvarmning til 37 ° C.
  6. Bekræfte passende slanger system for anæstesi og kontrollere niveauer af ilt og isofluran.
  7. Desinficer den billeddiagnostiske platform og arbejdsområdet.
  8. Angiv den varme den billeddiagnostiske platform til at opretholde konstant kropstemperatur og puls af dæmninger.

2. gravide mus forberedelse

  1. Sted den gravide mus (C57/BL6) dam i anæstesi induktion kammer.
  2. Fremkalde anæstesi ved hjælp af løbende leveret slimhindeirritation isofluran (isofluran 2% - 3%) blandet med 100% ilt (100% O2) med en væskehastighed på 200 mL/min. i salen, induktion.
  3. Overføre det bedøvet dyr på imaging platform i en liggende stilling.
  4. Give steady-state sedation ved hjælp af en ansigtsmaske tilsluttet anæstesi slanger system-levere isofluran (1,0% - 1,5%) blandet med 100% O2 på 200 mL/min.
    Forsigtig: Kontrollere udsivningen af bedøvende gas ved hjælp af et ventilationssystem, der er udstyret med en trækul filter indeholdende canister sæt.
  5. Tape lemmer forsigtigt til de integrerede elektrokardiografiske elektroder efter anvendelsen af elektrode gel til at opnå en konstant overvågning af moderens hjerte og respiratorisk satser.
  6. Justere niveauet for isofluran til at opretholde en gennemsnitspuls på (450 +/-50 slag/min (bpm)).
  7. Opretholde kropstemperaturen inden for en række 37.0 ° C +/-0,5 ° C. Overvåge kropstemperatur og puls vises på fysiologi controller-enhed.
  8. Dokumentere vitale bedøvet musen hver 15 min i hele proceduren billeddannelse.
  9. Vurdering af anæstesi ved at evaluere musens kropsholdning, puls og svar til tå pinches.
  10. Anvende oftalmologiske balsam (1 dråbe i hvert øje) for at undgå øjet tørhed og hornhinde skader.
  11. Fjern skind fra midten brystet niveau til underekstremiteterne ved hjælp af en depilatory creme til at minimere ultralyd dæmpning. Fjerne creme 1-1,5 min. efter anvendelse af vekslende våd og tør gaze klude til at forhindre skader på huden.

3. embryo identifikation

  1. Palpere bugvæggen forsigtigt for at finde fostrene og sprede dem ud.
  2. Anmærke hvert embryon på de dam maven og definere deres anterior-posterior og dorsal-ventral retningslinjer ved hjælp af en markør.
  3. Bruge livmoderhalsen bedøvet dæmningen som et vartegn. Mærke fostre på de venstre og højre uterin horn som L1, L2, L 3, etc. (venstre side) og R1, R2, R3, etc. (højre side), henholdsvis (figur 1A).
    Forsigtig: Undgå at sprede fostrene kraftigt. 1-2 fostre i hvert kuld overlapper med de andre, at gøre deres positionering og billeddannelse upålidelige. Udelukke disse fostre fra analysen.

4. fosterets hjerte visualisering og anmærkning

  1. Anvend pre varmede ultralyd gel på maven og sprede det omhyggeligt for at undgå boble dannelse. Tilføje yderligere mængde af gel på området scan Imaging.
  2. Placer ultralydssonde på holderen mekaniske og mobilisere det gradvist mod hud kontakt med tykke gel lag mens udkig bankende hjerte ved hjælp af scanning B-Mode (figur 1).
  3. Klik på knappen scanning B-mode at få 2D-billeder. Bruge blæren som et landemærke til at identificere de første fosteret placeres i højre eller venstre uterin horn og markere den som R1 eller L1, henholdsvis.
  4. Bekræfte den højre og venstre orientering af de enkelte fosteret i realtid ved at flytte den billeddiagnostiske platform i det vandrette plan. Scanne fra hoved til hale til at anmærke snuden, lemmer og rygsøjlen som vartegn (figur 1B, Video 1).
  5. Visualisere bankende hjerte og anmærke venstre hjertekammer (LV) og den højre ventrikel (RV). Brug farve Doppler tilstand til at optimere hjerte visualisering (figur 1 C-G, videoer 1 - 2).
  6. Klik på knappen scanning B-mode for at få en parasternal kort akse-view, har LV og RV vises i deres maksimale diameter på midten af data erhvervelse ramme. Start live imaging (figur 1B-C).
  7. Ændre retningen af mus med hensyn til scanning fly for at opnå en langsgående fire-kammer Se (fig. 1 d). Første, identificere de resterende strukturer af hjertet som forkamre, interventrikulært septum og venstre og højre udstrømning skrifter. Dernæst har de ventrikulære og atriale kamre vises i deres maksimale diameter. Derefter starte billede erhvervelse.
  8. Udelukke de ikke-optimal, skrå billeder fra den endelige analyse. Klik på knappen Cini at få kontinuerlig optagelse 'Cineloops' for et minimum af 10 s, derefter gemme de optagede billeder.

5. evaluering af fosterets puls og ventrikel funktion

  1. Klik på knappen scanning M-mode for at få hjerte billeder fra fire kammer fly (Video 3).
  2. Se listen over optagelser for analyse, når billeder af alle embryoner er komplet.
  3. Udelukke de ikke-optimal, skrå billeder fra den endelige analyse.
  4. Klik på knappen analyser til foranstaltning godstykkelse og venstre/højre ventrikel indre diameter på diastolen (LVID, d; RVID, d) og systolen (LVID, s; RVID, s), som vist i figur 2.
  5. Bestemme den gennemsnitlige fostrets hjertefrekvens ved at spille hver registreret M-mode opsporing og beregning af måling af en strøm cyklus til de følgende flow cyklus (afstanden mellem tilstødende toppe).
  6. Udføre flere målinger (mindst 5 pr. sporing) for at få den gennemsnitlige hjertefrekvens (figur 2).
  7. Måle de tidsmæssige ændringer mellem venstre ventrikel interne diastolisk diameter (LVID, d) og venstre ventrikel indvendig diameter på udgangen systolen (LVID, s) i hele den kardiale cyklus. Derefter beregne fraktioneret forkortelse procentdel (FS %) som følger: FS % = [(LVID,d-LVID,s)/LVID, d] x100.
  8. Udføre flere målinger (mindst 5 pr. sporing) for at få de gennemsnitlige FS % værdier.

6. evaluering af kardiopulmonale Flow-parametrene

  1. Tilpasse sektoren i en vinkel på erhvervelse mindre end 60o. Klik på knappen Doppler at udføre pulserende bølge Doppler målinger fra 2-D fire kammer-billeddannelse fly ved hjælp af en 45-MHz transducer.
    1. Først Visualiser tvedeling af lungepulsåren til at identificere den rigtige udstrømning tarmkanalen. Næste, klik på pulserende bølge Doppler -knappen for at få strømningsmønster gennem den pulmonale og aorta ventiler (figur 3A, Video 4).
  2. Få pulmonal flow målinger fra pulserende bølge Doppler sporing, herunder peak systolisk hastighed (PkV), acceleration tid (AT) og udslyngning tid (ET).
  3. Udføre flere målinger (mindst 5 pr. sporing) for at opnå gennemsnitlige målinger, som vist i figur 3A (til højre).
  4. Beregne ved / ET forhold for hver udstrømning ventil som en indikator for udstrømning skrifter passage og blodgennemstrømningen.
  5. Fortsæt til få mitral og aorta flow mønstre fra 2D-apikale fire kammer visninger ved hjælp af den pulserende bølge Doppler. Første, identificere de venstre atriale og venstre ventrikel kamre. Placer pulserende bølge Doppler prøve lydstyrken for indspilning af mitral indstrømning Doppler mønstre og måle tidlige diastolisk hastighed (E) og atriale kontraktion hastighed (en) (figur 3B)24,25.
  6. Justere Doppler sample volumen for at få aorta Doppler jet mønster. Brug af aorta Doppler jet sporing for at måle acceleration tid (AT) og udslyngning tid (ET) som vist i figur 3B (højre) (Video 5)

7. evaluering af Feto-placenta akse

  1. Brug farve Doppler scanningen til at visualisere den uterine arterie og feto-placenta vaskulær træ ved hjælp af 45 MHz transducer (figur 4A).
  2. Identificere de umbilical fartøjer (to arterier og en vene) i intra-fostervand segment af navlestreng, lige efter ledningen udgange fra fostrets maven.
  3. Sted pulserende bølge Doppler sample volumen at få umbilical arterie strømningsmønster (figur 4A).
  4. Måle vaskulære peak flow-parametrene for herunder acceleration tid (AT), udslyngning tid (ET), og peak flow hastighed på udgangen systolen (PkV, s) ved hjælp af den pulserende bølge Doppler scanning post (figur 4B).
  5. Få 5 på hinanden følgende bølgeformer i hvert fartøj, i mangel af fostrets bevægelser og maternel respiratoriske bevægelser, til at måle den gennemsnitlige peak hastighed for hvert fartøj.
  6. Gå videre til den næste embryo.

8. efter Imaging dyr overvågning

  1. Slukke for isofluran container efter færdiggørelsen af billedprocessen.
  2. Fortsætte overvågning kropstemperatur, respirationsfrekvens og puls under opvågningsfasen.
  3. Fjerne ansigtsmaske og ordningen med tilsluttede slanger, når dæmningen starter spontane bevægelser.
  4. Returnere dæmningen til den passende bolig og fortsat observation efter institutionelle efter indgrebet standardprotokoller.
  5. Dokument tid til fuld genoptagelse af normale aktiviteter.

9. præstationskrav og tekniske overvejelser

  1. Begrænse behandlingstiden for ~ 8 fostre til ca 1 time til at undgå de negative virkninger af langvarig anæstesi på vitale tegn og fysiologiske parametre.
  2. Komplet træning med 8-10 gravide mus til at optimere teknikker til billede erhvervelse og flow mønstre sporing i en kort tidsramme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Statistiske analyser af hjerte og hæmodynamiske indeks blev udført offline. Middel til 5 på hinanden følgende målinger i 3 optimale billeder blev beregnet. Dataene blev udtrykt som betyder ± SEM. Student's t-test blev anvendt til at udlede tværpolitiske sammenligninger. En P -værdi af ≤0.05 blev anset for statistisk signifikant.

Efter den ovennævnte protokol kendetegnet vi virkninger af kronisk udsættelse for prænatal hypoxi på den kardiovaskulære status af føtal mus i sen drægtighed ved at opnå real-time høj frekvens ultralyd optagelser på C57/BL6 timet gravide mus på svangerskabsuge dag (GD) 18,5.

Efter etableringen af avl grupper, blev det bekræftet vellykket parring. Timet gravid dæmninger blev opretholdt i bure under en 12t lys-mørke regime med mad og vand ad libitum indtil. På GD14.5, blev de gravide mus enten tildelt til gruppen normoxia (vedligeholdes i den omgivende luft) eller til gruppen hypoxi (placeret i hypoxi kammer ved 10% FiO2 til at fremkalde systemisk hypoxi). Efter fødslen forblev dæmninger og deres unger tildelt deres eksperimentelle tilstand indtil postnatal dag 7 (P7).

I alt 6 dæmninger blev studeret i disse eksperimenter og 42 fostre var med held afbildet på GD18.5. Af disse blev data indhentet fra 36 fostre brugt til efterfølgende analyse (tabel 1). Analyse af fostrets hjerte rum på GD18.5 viste at hypoksiske fostre lidt fra føtal bradykardi (lavere hjerte rum) og oplevet væsentlig forringelse af føtal hjertefunktion indeks (EF og FS %) (Tabel 1). Bemærkelsesværdigt, peak flow hastigheder (PkVs) af arteria umbilical PkVs var faldet i hypoxi-eksponerede fostre (figur 4B og tabel 1). Derudover umbilical arterie acceleration tid/udslyngning tid (på / ET) nøgletal afslørede betydeligt lavere værdier i det hypoksiske i forhold til normoxic fostre, foreslår øget umbilical vaskulære flow modstand. Enig, blev højre ventrikel vægtykkelse øget i hypoxi-eksponerede fostre målt på 2-D/M-mode billeder (figur 5). Da RV antager dominerende pumpe funktion under fosterudviklingen, mens moderkagen fungerer som den primære vaskulære seng til iltning, tyder disse data kollektivt på forhøjede flow modstand i feto-placenta vaskulære kredsløbet fører til RV hypertrofi. Vigtigere, står hypoxi udsat nyfødte tidligt postnatal dødelighed. RV fiasko og øget vaskulære modstand induceret af kronisk eksponering for prænatal hypoxi potentielt medvirkende årsag. Andre faktorer, som redox toksicitet som følge af fornyet iltning skade, dårlig fodring, og moderens sygdom ikke kan udelukkes. Alligevel er den nøjagtige underliggende mekanisme af prænatal hypoxi induceret hjerte patogenese og den tidlige dødelighed af fostrene stadig skal fastlægges i fremtidige undersøgelser.

Figure 1
Figur 1: Føtal mus Annotation og hjertet visualisering in Utero ved hjælp af Scanning B-Mode og farve Doppler forhør. (A) skematisk gengivelse af føtal mus identifikation og annotation (L: forlod, R: ret). (B) repræsentativt billede af de anatomiske landemærker i et foster til at guide orientering af gestationsalder dag 18,5 fosterets hjerte fra visningen parasternal korte akse af venstre ventrikel (LV), højre hjertekammer (RV) og interventrikulært septum (IVS). (C) repræsentativt billede af parasternal kort akse Se LV og RV med farve forhør at lette hjerte kammer visualisering. (D) langsgående fire-kammer Se LV og RV, venstre forkamre (LA) og højre atrier (RA) farve Doppler. (E) langsgående fire-kammer Se LV og RV, med farve Doppler forhør at lette visualisering af udstrømning skrifter: højre ventrikel udstrømning tarmkanalen (RVOT), venstre ventrikel udstrømning tarmkanalen (LVOT), aorta (AO) og højre hjertekammer udstrømning tarmkanalen (RVOT). (F) repræsentative farve Doppler forhør af RVOT og PA. (G) repræsentative farve Doppler forhør af LVOT og AO. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: vurdering af fostrets hjertefrekvens og ventrikel funktion. (A) repræsentant M-Mode sporing fremstillet af lange akse 4-kammer se på GD 18,5. (LV: venstre ventrikel; RV: Højre hjertekammer; LA: Venstre Atrium; RA: højre Atrium). (B) repræsentative kvantitativ bestemmelse (arrowed linjer) metode af ventrikulær dimensioner herunder venstre og højre ventrikel indre diameter på diastolen (LVID, d; RVID, d) og systolen (LVID, s; RVID, s), venstre og højre ventrikel vægtykkelse på diastolen (LVAW, d; RVW, d), interventrikulært septum (IVS), og slå til beat måling af HR er vist fra fire kammer imaging fly. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: pulserende bølge Doppler sporing af fosterets lunge, aorta- og Mitral Flow indekser. (A) repræsentativt billede af lungepulsåren pulserende bølge Doppler sporing (venstre). Kvantificering metoder (linjer) til pulmonal flow indekser PkV (peak hastighed), på (acceleration tid), ET (udslyngning tid) er vist (til højre) fra visningen langsgående fire-kammer. (B) repræsentativt billede af mitral og aorta pulserende Doppler flow mønster (til venstre) og kvantificering af mitralklap flow indekser E (tidlig diastolisk hastighed) og en (atrieflimren sammentrækning) og aorta flow indekser på ET, og PkV (til højre) er vist fra den fire-kammer tænkelig plan. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: vurdering af Feto-placenta omsætning. (A) Repræsentant billede af feto-placenta vaskulære kredsløb ved hjælp af farve Doppler forhør (øverste) og maternel ECG poster (lavere). (B) Repræsentativt billede af pulserende bølge Doppler registrering og kvantificering målinger (linjer) af navlestrengen arterie flow indekser i hypoxi (øverste) og normoxia kontrol udsat føtal mus (lavere). PkV (peak hastighed), på (acceleration tid), ET (udslyngning tid). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: vurdering af højre hjertekammer vægtykkelse i hypoxi behandlet føtal mus. (A, B) Repræsentant M-Mode sporing fremstillet af lange akse 4-kammer se på GD 18,5 i normoxia og hypoxi betingelser. LV: venstre hjertekammer, RV: højre ventrikel, højre ventrikel væg. Linjer angiver kvantitative målinger af RVW tykkelse i systolen (s) og diastolen (d). (C) RVW, s kvantificering viser øget RVW tykkelse i hypoxi-behandlede føtal mus i forhold til normoxia. Fejllinje: Standard fejl af middelværdien. (D) repræsentativt tværsnit billeder af føtal hjerter på GD 18,5 skildrer øget RV vægtykkelse i hypoxi behandlet og normoxia behandlede grupper. Oprindelige forstørrelse 10 X. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Parameter, enhed Normoxia Prænatal hypoxi
Antallet af held afbildet fostre 20 16
Postnatal dødelighed 5% 68.75%
Hæmodynamiske Parameter (Gennemsnit ± SEM) (Gennemsnit ± SEM)
Fostrets hjertefrekvens, bpm 138 ± 4 89 ± 8 ***
Venstre ventrikel EF % 71.2 ± 3 55 ± 2 **
Venstre ventrikel FS % 43 ± 2 29 ± 4 **
Lungepulsåren PkV, mm/s 102 ± 10 129 ± 8 **
Lungepulsåren på ET forhold 0,42 ± 0,05 0,35 ± 0.03*
Umbilical arterie PkV, mm/s 58 ± 4 40 ± 1.5* **
Umbilical arterie i ET forhold 0,5 ± 0,03 0,42 ± 0.025*
Umbilical vene PkV, mm/s 13 ± 1,2 19,6 ± 3 **
Umbilical arteriel-venøs forsinkelse, ms 122 ± 4 238 ± 20 *
EF, uddrivningsfraktion; FS, fraktioneret afkortning; NA, ikke tilgængelig; NS, ikke betydelig; PkV, peak hastighed; PkV, d, peak hastighed under diastolen; PkV, s, peak hastighed under systolen; Student's t-test blev brugt til at udlede tværpolitiske forskelle. P < 0,005. ** P < 0,01. * P < 0,05 repræsenterer en betydelig forskel mellem grupperne sammenligninger. student's t-test. Non-betydning var tomt.

Tabel 1: hæmodynamiske parametre for normoxic og hypoksiske føtal mus på svangerskabsuge dag 18,5. EF, uddrivningsfraktion; FS, fraktioneret afkortning; PkV, peak hastighed; AT, acceleration tid; ET, udslyngning tid. Student's t -test blev brugt til at udlede tværpolitiske forskelle. *** P < 0,005. P < 0,01, og * P < 0,05 repræsenterer en betydelig forskel mellem grupperne til sammenligning.

Video 1
Video 1: B-mode korte akse Se. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)

Video 2
Video 2: farve Doppler-apikale langsgående Se. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)

Video 3
Video 3: M-Mode. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)

Video 4
Video 4: lungepulsåren – pulserende bølge Doppler. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kardiovaskulære misdannelser og sygdomme i væsentlig grad påvirkes af genetiske faktorer og miljøelementer19. Vi har tidligere påvist betydelig indvirkning af maternel kaloriefattige begrænsning, indledt i løbet af andet trimester på feto-placenta kredsløbssygdomme flow og føtal hjertefunktion9.

Prænatal hypoksi er en anden fælles stressfaktor under fosterudviklingen, der berører gevaldig feto-placenta fysiologi og kredsløbssygdomme. Effekten af prænatal hypoxi eksponering kan være mere dybtgående i forbindelse med en CHD fører til dårlig perinatal tilpasning til postnatal liv. Unormal hjerte rum og hjerte indeks fundet i denne undersøgelse er faktisk vigtige indikatorer for kardiale stress og ændrede placenta kredsløbssygdomme fysiologi, og dermed udgør væsentlige primære elementer til påvisning af de udviklingsmæssige defekter og deraf følgende hæmodynamiske ændringer, der kan blive yderligere udtalt i svar til prænatal hypoksiske stress fører til tidlig hjertesvigt. I modsætning til forventningerne havde hypoxi udsat fostre lavere hjerte rum. Dette fænomen kan afspejle umodne hjerte autoregulation mekanismer i føtal mus som svar på iltsvind på GD18.5. Men den nøjagtige patogenese forbliver ukendt.

Selvom andre avancerede imaging metoder, såsom føtal cardiac MRI, tillader live imaging af cardiac strukturer under udvikling20, er hæmodynamiske status ofte tabt på grund af statiske billeder og langvarige procedurer. Noninvasiv ultralyd teknologi, på den anden side giver mulighed for udførelse i vivo dynamic imaging, der bevarer den oprindelige fysiologi. Yderligere, med tilgængeligheden af højfrekvente transducere med forbedret opløsning, visualisering af fosterets hjerte på forskellige udviklingsstadier af hver individuel fosteret kan blive mere realistisk i Transgene mus ved at optimere føtal anmærkning metoder. Endelig er omkostningerne pr. eksperiment langt mindre ved hjælp af denne metode.

I en tidligere betænkning af Kim GH et al.givet forfatterne vigtige og roman indsigt vedrørende tænkelig plan optimering for dataopsamling ved hjælp af en tidligere generation af høj frekvens ultralyd imaging system21. En anden betænkning af Zhou YQ et al., har etableret standardiseret grundlæggende målinger af føtale cirkulation på det fysiologiske niveau ved hjælp af en høj frekvens ultralyd udstyret med farve Doppler system22. Dermed protokollen præsenteres her supplerer tidligere etablerede protokoller, og udvides til at skitsere en omfattende metode, der er muligt og praktisk i realtid i en eksperimentel indstilling. En avanceret og meget følsomme høj frekvens ultralyd system blev brugt i denne undersøgelse for at scanne feto-placenta kredsløbet som en enhed. Den skitserede protokol er simpel og standardiseret at ansætte denne kraftfulde system effektivt som påvist ved at opnå kvantificerbare målinger af hypoxi indvirkning på føtale cirkulation i mus på GD18.5.

Ikke desto mindre bør vi anerkende vigtige begrænsninger og udfordringer for dødelige hjerte billedbehandling: første, bedøvende stoffer, herunder isofluran, kan påvirke fysiologiske parametre for fosteret. Langvarig anæstesi, hårtab og ultralyds gel kan føre til hypotermi, som kan påvirke puls og hæmodynamiske indeks af dæmningen samt fostrene. I øjeblikket er der ingen tilgængelig metode til at evaluere niveauet for bedøvende stoffer og deres virkninger på fosteret. For at omgå denne begrænsning, titreres vi inhalerede isofluran niveauer omhyggeligt for at opnå passende sedation af dæmninger, samtidig med at deres basale puls og vitale tegn. Andet er visualisere fostre, der er placeret dybt i maven vanskeligt og suboptimal, fører til udelukkelse af disse fostre fra endelige dataanalyse. Farve Doppler giver mulighed for bedre optimering af imaging sektioner og tilstrækkelig tilpasning mellem transducer og blodgennemstrømning. For det tredje kræver udfører samtidige analyse af alle fostre operatørens effektivitet i hurtig og nøjagtig visualisering og image erhvervelse hurtigt, antyde vigtigheden af praktisk uddannelse.

Endelig nøglen skridt i denne metode, der skal understreges, herunder 1) korrekt forberedelse af systemet. 2) fastholder en stabil kropstemperatur og puls for den gravide mus. 3) optimere strømningshastigheden af isofluran at opretholde baseline fysiologiske tilstande af embryoner til at erhverve pålidelige data. 4) ensartede og effektive image erhvervelse inden for kortest mulig tid. 5) svangerskabsuge alder, køn og dyr stamme er vigtige variabler, der kan påvirke resultaterne. Derfor bør den forsøgsplan designes omhyggeligt for at tage højde for disse variabler af herunder matchede kontrol fra den samme dyr stamme i dataanalyse og fortolkning.

Afslutningsvis er en høj frekvens ultralyd system en effektiv metode til at opnå fænotypiske karakterisering af fosterets hjerte-kar-systemer i utero med vigtige eksperimentelle og videnskabelige værdi og potentielle fremtidige applikationer, der kan omfatter 1) forståelse af den fysiologiske dynamics under hjerte udvikling. 2) opnå omfattende fænotypiske analyse af genetiske modeller af CHDs. 3) belyse virkningen feto-placenta omsætning på hjerte kammer udvikling, modning og tilpasning til stress. 4) udfører ultralyd guidede føtal injektion for at studere toksiner, teratogener eller terapeutiske agenter i fremtiden. 6) gennemførelsen af speckle sporing og stamme analyse kapaciteter til at få detaljerede regionale Myokardie funktion i udviklingslandene myokardiet kan danne grundlag for fremtidige undersøgelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Nogen interessekonflikt erklæret.

Acknowledgments

Vi takker Dyrefysiologi core, afdeling for Molekylær medicin på UCLA for den tekniske bistand og åben adgang til Vevo 2100 ultralyd biomicroscopy (UBM) system. Denne undersøgelse blev støttet af NIH/barn sundhed Research Center (5K12HD034610/K12), UCLA-børns Discovery Institute og i dag og i morgen Childrens fond, og David Geffen skole af medicin forskning Innovation award til M. Touma.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vevo 2100 VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada N/A High Freequency Ultrasound Biomicroscopy. The set up is available in animal physiology core facility, division of molecular medicine, UCLA. USA
inbred mice (c57/BL6) Charles River Laboratories N/A Inbread wild type mouse strain

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Touma, M., Reemtsen, B., Halnon, N., Alejos, J., Finn, J. P., Nelson, S. F., Wang, Y. A Path to Implement Precision Child Health Cardiovascular Medicine. Front Cardiovasc Med. 4, 36 (2017).
  2. Triedman, J. K., Newburger, J. W. Trends in Congenital Heart Disease. The Next Decade. Circulation. 133, 2716-2733 (2016).
  3. Gilboa, S. M., et al. Congenital Heart Defects in the United States Estimating the Magnitude of the Affected Population in 2010. Circulation. 134, 101-109 (2016).
  4. Pruetz, J. D., et al. Outcomes of critical congenital heart disease requiring emergent neonatal cardiac intervention. Prenat Diagn. 34, 1127-1132 (2014).
  5. Peterson, C., et al. Mortality among Infants with Critical Congenital Heart Disease: How Important Is Timely Detection? Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 97 (10), 664-672 (2013).
  6. Atz, A. M., et al. Prenatal Diagnosis and Risk Factors for Preoperative Death in Neonates with Single Right Ventricle and Systemic Outflow Obstruction: Screening Data from the Pediatric Heart Network Single Ventricle Reconstruction Trial. J Thorac Cardiovasc Surg. 140 (6), For the Pediatric Heart Network Investigators 1245-1250 (2010).
  7. Lalani, S. R., Belmont, J. W. Genetic Basis of Congenital Cardiovascular Malformations. Eur J Med Genet. 57 (8), 402-413 (2014).
  8. Hanchard, N. A., Swaminathan, S., Bucasas, K., Furthner, D., Fernbach, S., Azamian, M. S., et al. A genome-wide association study of congenital cardiovascular left-sided lesions shows association with a locus on chromosome 20. Hum Mol. 11, 2331-2341 (2016).
  9. Arsenijevic, V., Davis-Dusenbery, B. N. Reproducible, Scalable Fusion Gene Detection from RNA-Seq. Methods Mol Biol. 1381, 223-237 (2016).
  10. LaHaye, S., Corsmeier, D., Basu, M., Bowman, J. L., Fitzgerald-Butt, S., Zender, G., et al. Utilization of Whole Exome Sequencing to Identify Causative Mutations in Familial Congenital Heart Disease. Circ Cardiovasc Genet. 9 (4), 320-329 (2016).
  11. Zaidi, S., Choi, M., Wakimoto, H., Ma, L., Jiang, J., Overton, J. D., et al. De novo mutations in histone modifying genes in congenital heart disease. Nature. 498 (7453), 220-223 (2016).
  12. Leirgul, E., Brodwall, K., Greve, G., Vollset, S. E., Holmstrom, H., Tell, G. S., et al. Maternal Diabetes, Birth Weight, and Neonatal Risk of Congenital Heart Defects in Norway, 1994-2009. Obstet Gynecol. 128 (5), 1116-1125 (2016).
  13. Garry, D. J., Olson, E. N. A Common Progenitor at the Heart of Development. Cell. 127 (6), 1101-1104 (2006).
  14. Postma, A. V., Bezzina, C. R., Christoffels, V. M. Genetics of congenital heart disease: the contribution of the noncoding regulatory genome. J Hum Genet. 61, 13-19 (2016).
  15. Ganguly, A., Touma, M., Thamotharan, S., De Vivo, D. C., Devaskar, S. U. Maternal Calorie Restriction Causing Uteroplacental Insufficiency Differentially Affects Mammalian Placental Glucose and Leucine Transport Molecular Mechanisms. Endocrinology. Oct. 157 (10), 4041-4054 (2016).
  16. Lluri, G., Huang, V., Touma, M., Liu, X., Harmon, A. W., Nakano, A. Hematopoietic progenitors are required for proper development of coronary vasculature. J Mol Cell Cardiol. 86, 199-207 (2015).
  17. Bishop, K. C., Kuller, J. A., Boyd, B. K., Rhee, E. H., Miller, S., Barker, P. Ultrasound Examination of the Fetal Heart. Obstet Gynecol Surv. 72 (1), 54-61 (2017).
  18. He, H., Gan, J., Qi, H. Assessing extensive cardiac echography examination for detecting foetal congenital heart defects during early and late gestation: a systematic review and meta-analysis. Acta Cardiol. 71 (6), 699-708 (2016).
  19. Hobbs, C. A., Cleves, M. A., Karim, M. A., Zhao, W., MacLeod, S. L. Maternal Folate-Related Gene Environment Interactions and Congenital Heart Defects. Obstet Gynecol. 116 (2 Pt 1), 316-322 (2016).
  20. Gabbay-Benziv, R., et al. A step-wise approach for analysis of the mouse embryonic heart using 17.6 Tesla MRI. Magn Reson Imaging. 35, 46-53 (2017).
  21. Kim, G. H. Murine fetal echocardiography. J Vis Exp. (72), e4416 (2013).
  22. Zhou, Y. Q., Cahill, L. S., Wong, M. D., Seed, M., Macgowan, C. K., Sled, J. G. Assessment of flow distribution in the mouse fetal circulation at late gestation by high-frequency Doppler ultrasound. Physiol Genomics. 46 (16), 602-614 (2014).
  23. Greco, A., Coda, A. R., Albanese, S., Ragucci, M., Liuzzi, R., Auletta, L., Gargiulo, S., Lamagna, F., Salvatore, M., Mancini, M. High-Frequency Ultrasound for the Study of Early Mouse Embryonic Cardiovascular System. Reprod Sci. 22 (12), 1649-1655 (2015).
  24. Deneke, T., Lawo, T., von Dryander, S., Grewe, P. H., Germing, A., Gorr, E., Hubben, P., Mugge, A., Shin, D. I., Lemke, B. Non-invasive determination of the optimized atrioventricular delay in patients with implanted biventricular pacing devices. Indian Pacing Electrophysiol J. 10 (2), 73-85 (2010).
  25. Kono, M., Kisanuki, A., Ueya, N., Kubota, K., Kuwahara, E., Takasaki, K., Yuasa, T., Mizukami, N., Miyata, M., Tei, C. Left ventricular global systolic dysfunction has a significant role in the development of diastolic heart failure in patients with systemic hypertension. Hypertens Res. 33 (11), 1167-1173 (2010).

Tags

Udviklingsmæssige biologi spørgsmålet 135 medfødte hjertefejl genetik ekkokardiografi føtale cirkulation Cardiac udvikling hjerte modning hjerte-kar-fysiologi
Føtal mus kardiovaskulære Imaging ved hjælp af en høj frekvens ultralyd (30 / 45MHZ)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Touma, M. Fetal Mouse Cardiovascular … More

Touma, M. Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System. J. Vis. Exp. (135), e57210, doi:10.3791/57210 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter