Summary
Hög frekvens ultraljudsundersökningar av fostrets musen har förbättrats imaging upplösning och kan ge exakta noninvasiv karakterisering av hjärt utveckling och strukturella brister. Protokollet beskrivs häri är utformad att utföra realtid fostrets möss ekokardiografi i vivo.
Abstract
Medfödda hjärtfel (CHDs) är den vanligaste orsaken till barndom sjuklighet och förtida dödlighet. Prenatal upptäckt av underliggande molekylära mekanismer för CHDs är avgörande för att uppfinna nya förebyggande och terapeutiska strategier. Mutant mus-modeller är kraftfulla verktyg att upptäcka nya mekanismer och miljöbelastning modifierare som driver hjärt utveckling och deras potentiella förändring i CHDs. Ansträngningar för att upprätta kausalitet av dessa förmodade bidragsgivare har varit är begränsat till histologiska och molekylära studier på icke-survival djurförsök, i vilken övervakning de viktiga fysiologiska och hemodynamiska parametrarna dock ofta frånvarande. Levande bildteknik har blivit ett viktigt verktyg för att fastställa etiologin av CHDs. I synnerhet ultraljudsundersökningar kan användas prenatalt utan kirurgiskt utsätta fostren, gör det möjligt att upprätthålla deras baslinjen fysiologi samtidigt övervaka effekterna av miljömässiga stress på de hemodynamiska och strukturella aspekterna av hjärtats kammare utveckling. Häri, använder vi högfrekvent ultraljud (30/45) systemet för att undersöka det kardiovaskulära systemet i fostrets möss vid E18.5 i livmodern vid baslinjen och i svar på prenatal hypoxi exponering. Vi demonstrera genomförbarheten av systemet för att mäta hjärtats kammare storlek, morfologi, kammarfunktion, fostrets hjärtfrekvens, och navelsträngen artären flöde index och deras förändringar i fostrets möss som utsätts för systemisk kronisk hypoxi i livmodern i real tid.
Introduction
Medfödda missbildningar av hjärtat är heterogena strukturella fel som uppstår under tidig hjärt utveckling. Nuvarande tekniska framsteg av operativa förfaranden har lett till betydande förbättringar i överlevnaden av spädbarn med CHDs1,2. Men är livskvalitet ofta nedsatt sekundärt till långvarig sjukhusvistelse och behov för stegvis kirurgisk reparation förfaranden1,2,3,4,5. Prenatal upptäckt av underliggande molekylära mekanismer för CHDs är avgörande för att planera tidiga insatser, att genomföra nya förebyggande strategier, och att förbättra livslångt resultat6,7.
Även om flera genetiska och miljömässiga faktorer har varit inblandade i CHDs patogenes, fastställa kausalitet är fortfarande ett ouppfyllt behov att förbättra diagnostiska, terapeutiska och förebyggande strategier1,8,9 ,10,11,12. Dessutom öppnar undersöker roller i livmodern stressfaktorer och epigenetiska modifierare nya arenor för framtida utredningar11,12. Det senaste decenniet har verkligen upplevt snabba framsteg i nästa generations sekvensering teknik inklusive single nucleotide polymorphism (SNP) microarray, hela exome sekvensering och genome-wide metylering studier, deras utnyttjande för att studera den genetiska orsakerna till komplexa sjukdomar, inklusive CHDs1,8,9,10,11 banar väg att identifiera nya mutationer och genetiska varianter som ännu inte har testade för deras patogenicitet i lämplig djurmodeller.
Bland de olika sjukdomen modellsystem är musen djurmodell av val, inte bara för att undersöka mekanismer för CHDs under tidig cardiogenesis13,14,15,16, men också att belysa deras inverkan på hjärtats kammare mognad och funktion vid sendräktighet i prenatal och perinatal stressfaktorer. Därför utför i vivo fenotypisk karakterisering av ett mutant fostrets mus hjärta, under både tidiga och sena stadier av utveckling, är avgörande för att förstå rollen som dessa genetiska variationer och miljöfaktorer på hjärt utveckling, och potentiella framtida påverkan på kammaren särskilda mognad processer hos möss.
Tidig upptäckt och korrekt diagnos av hjärtfel under utveckling är avgörande för interventionell planering17,18. Att vara säker, enkel, bärbar och repeterbara, har fostrets sonography verkligen blivit standard bildteknik för hjärt utvärdering i kliniken. Fostrets cirkulation bedömning med hjälp av Doppler ultraljud har använts i klinisk praxis inte bara för att upptäcka hjärtfel, men också att upptäcka vaskulära avvikelser, moderkakan insufficiens och intrauterin tillväxt begränsning och bedöma fostrets välbefinnande svar på Utero förolämpningar inklusive hypoxemi, moderns sjukdom och drog toxicitet17,18. Parallellt till sitt värde vid utvärdering av mänskliga defekter och sjukdomar, har ultraljud bedömning av fostrets möss vunnit allt större nytta i experimentell inställningar19,20,21,22, 23. I synnerhet tillåter fostrets hjärta ultraljud (ekokardiografi) sekventiella i vivo visualisering av utveckla hjärtat. Många experimentella studier har använt ultraljud-imaging teknik för att observera kardiovaskulära fosterutveckling hos transgena fostrets möss. Doppler ultraljud har varit särskilt användbar att klarlägga patofysiologiska parametrarna, såsom flödesmönster i fostrets cirkulation under fysiologiska utmaningar eller sjukdom villkor10,19. Både människor och djur, kan onormal flöde eller syre blodtillförseln till fostret resultera från olika förhållanden som kan störa fostrets miljö i livmodern och påverkar den fetoplacental axeln, inklusive placenta avvikelser, maternell hypoxi, graviditetsdiabetes och farmaceutiskt inducerad vaskulär sammandragning15,22. Därför att att upprätta standardiserade metoder för att utföra Doppler ultraljud på fostrets möss oerhört bemyndigar framtida studier av CHDs genom att underlätta övervakning flödesmönster och nyckel hemodynamiska index av kardiovaskulära kretsar under olika stadier av hjärt utveckling i genetiska musmodeller.
Hög frekvens ultraljud har vuxit fram som ett kraftfullt verktyg för att mäta de utvecklingsmässiga och fysiologiska parametrarna av hjärt-kärlsystemet i musmodeller och mänskliga sjukdomar18. Denna teknik har varit förfinas ytterligare under de senaste åren. Vi och andra forskare har visat genomförbarheten av detta system för ultrahög frekvens ultraljud studier på fostrets mus hjärta15,19,20,21,22 ,23. Systemet är utrustat med Doppler färgmappning flöde och linjär array givare som genererar tvådimensionell, dynamiska bilder med hög frekvens (30 till 50 MHz) bildrutehastigheter. Dessa fördelar, jämfört med låg frekvens ultraljud system och den tidigare generationen högfrekvent ultraljud21,22, tillhandahålla nödvändig känslighet och upplösning för ingående bedömning av den fetala cirkulatorisk system, inklusive omfattande karakterisering av hjärtat strukturer, kammare funktion och flöde index för fostrets möss i experimentell inställningar. Häri, beskriva vi metoder för att utföra snabb bedömning av cardiopulmonary cirkulation och feto-placenta omsättning till embryonala dag E18.5 i vivo genom att använda en hög frekvens system. Vi valde en 30/45 MHz-givare som ger en axiell upplösning av ungefärligt 60 µm och en lateral upplösning på 150 µm. Dock kan en högre frekvens givare (40/50 MHz) väljas för att analysera tidigare utvecklingsstadier genom att följa en liknande metod. Det valda M-läget låter visualisering av vävnader i rörelse på hög temporal upplösning nivåer (1.000 bildrutor/s). Slutligen, vi demonstrera genomförbarheten av hög ultraljud för detaljerad omfattande fenotypisk karakterisering av fostrets kardiovaskulära hemodynamisk status och funktion hos möss vid baseline och svar på prenatal hypoxi stress.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
University of California, Los Angeles, djur vård och användning kommittén har godkänt alla procedurer visas i detta protokoll. Experimenten utfördes som en del av en pågående studie under aktiva djur protokoll godkänts av institutionella djur vård och användning kommittén av University of California, Los Angeles, Kalifornien, USA. Djurhantering och omsorg följt normerna i guiden för skötsel och användning av försöksdjur.
1. förbereda högfrekvent ultraljud Imaging System
- Slå på ultraljud avbildning systemet och fysiologi övervakningsenheten.
- Anslut 30/45 MHz givaren.
- Plats motsvarande genomsökningen huvudet innehavaren nära imaging plattformen.
- Välj alternativet Hjärt mätprogram .
- Plats Ultraljudet gel uppochner i sin pre värmande behållare anges till 37 ° C.
- Bekräfta rätt rörsystem för anestesi och kontrollera halterna av syre och isofluran.
- Desinficera imaging plattformen och arbetsområdet.
- Ställa in den värme imaging plattformen för att upprätthålla konstant kroppstemperatur och puls av fördämningarna.
2. gravid mus förberedelse
- Placera gravid mus (C57/BL6) dammen i anestesi induktion kammaren.
- Inducera anestesi med hjälp av kontinuerligt levereras via inhalation isofluran (isofluran 2% - 3%) blandad med 100% syrgas (100% O2) med en flödeshastighet av 200 mL/min i induktion kammaren.
- Överföra sederad djuret på imaging plattformen i ryggläge.
- Ge steady state sedering med hjälp av en ansiktsmask som är ansluten till den anestesi slangar system-levererar isofluran (1.0-1.5%) blandad med 100% O2 200 mL/min.
FÖRSIKTIGHET: Kontrollera läckage av bedövningsmedel gas med hjälp av ett ventilationssystem utrustad med ett kolfilter som innehåller kapseln. - Tejpa benen försiktigt till inbäddade EKG elektroderna efter tillämpning av elektrodgel att uppnå konstant övervakning av maternell hjärt- och andningsfunktionen priser.
- Justera nivån av isofluran att upprätthålla en snittpuls på (450 +/-50 slag/min (bpm)).
- Upprätthålla kroppstemperaturen inom ett intervall 37,0 ° c +/-0,5 ° C. Övervaka kroppstemperatur och hjärtfrekvens som visas på den fysiologi-styrenhet.
- Dokumentera det livsviktiga teckenet av sederad musen varje 15 min under hela imaging förfarandet.
- Bedöma nivån på anestesi genom att utvärdera musens hållning, puls och svar till tå nypor.
- Tillämpa oftalmologiska balm (1 droppe i varje öga) för att förhindra torra ögon och korneal skada.
- Ta bort pälsen från mitten av bröstet nivå till de nedre extremiteterna genom att använda en hårborttagningsprodukter kräm för att minimera ultraljud dämpning. Ta bort grädde 1-1,5 min efter ansökan av omväxlande våt och torr gasbinda våtservetter för att förhindra skador på huden.
3. embryot identifiering
- Palpera den buk-väggen försiktigt för att lokalisera fostren och sprida ut dem.
- Kommentera varje embryo på dammen buken och definiera deras främre-bakre och dorsal-ventrala orientering med hjälp av en markör.
- Använda livmoderhalsen sederad dammen som ett landmärke. Märka fostren på vänster och höger uterin hornen som L1, L2, L 3, etc. (vänster sida) och R1, R2, R3, etc. (höger sida), respektive (figur 1A).
FÖRSIKTIGHET: Undvik att sprida fostren kraftfullt. 1-2 Foster i varje kull kan överlappa med andra, att göra sin positionering och bildhantering otillförlitliga. Undanta dessa foster från analysen.
4. fostrets hjärta visualisering och annotering
- Applicera pre värmde ultraljud gel på buken och sprida det noga för att undvika bubbla bildandet. Lägga till ytterligare mängd gel på området av scan imaging.
- Placera ultraljud sonden på dess mekaniska hållare och mobilisera det gradvis mot huden att kontakta med tjock gel lagret medan du söker med bultande hjärta använder B-genomsökningsläget (figur 1).
- Klicka på knappen skanning B-läge för att få 2-D-bilder. Använda urinblåsan som ett landmärke för att identifiera första fostret placerad i höger eller vänster livmoderns horn och markera den som R1 eller L1, respektive.
- Bekräfta den höger och vänster orienteringen av enskilda fostret i realtid genom att flytta imaging plattformen i horisontalplanet. Skanna från huvud till svans att kommentera nosen, benen och ryggen som landmärken (figur 1B, Video 1).
- Visualisera med bultande hjärta och anteckna i vänster kammare (LV) och höger kammare (RV). Använd färg Doppler läge att optimera hjärtat visualisering (figur 1 C-G, videor 1 - 2).
- Klicka på knappen skanning B-läge för att få en parasternal kort axel-view, har LV och RV visas i deras maximala diameter i mitten av förvärvet dataramen. Starta live imaging (figur 1B-C).
- Ändra orientering på musen med avseende på skanning plan för att få en längsgående fyra kammare vy (figur 1 d). Först identifiera de återstående strukturerna av hjärtat som atria, interventricular septum och vänster och höger utflöde skrifter. Nästa, har ventrikulära och förmaksflimmer kamrarna visas i deras maximala diameter. Starta sedan bild förvärv.
- Utesluta de icke-optimala, sneda bilderna från den slutliga analysen. Klicka på knappen Cini för att få kontinuerlig inspelning 'Cineloops' för minst 10 s, sedan spara de inspelade bilderna.
5. utvärdering av fostrets hjärtfrekvens och kammarfunktion
- Klicka på knappen skanning M-läge för att få hjärt-bilder från fyra kammare plan (Video 3).
- Visa listan med inspelningar för analys när bilderna av alla embryon är kompletta.
- Utesluta de icke-optimala, sneda bilderna från den slutliga analysen.
- Klicka på knappen analys att mäta väggtjocklek och vänster/höger ventrikulära innerdiameter på diastole (LVID, d; RVID, d) och systole (LVID, s; RVID, s), som visas i figur 2.
- Bestämma den genomsnittliga fostrets hjärtfrekvensen genom att spela varje inspelad M-läge spårning och beräkning av mätning av ett flöde cykel till följande flöde cykel (avståndet mellan intilliggande toppar).
- Utföra flera mätningar (minst 5 per spårning) för att få den genomsnittliga pulsen (figur 2).
- Mäta de tidsmässiga förändringarna mellan vänster ventrikulära diastoliskt innerdiameter (LVID, d) och vänster ventrikulära innerdiameter på slutet systole (LVID, s) hela hjärt cykeln. Sedan beräkna fraktionerad förkortning procentsatsen (FS %) enligt följande: FS % = [(LVID,d-LVID,s)/LVID, d] x100.
- Utföra flera mätningar (minst 5 per spårning) för att erhålla FS % medelvärdena.
6. utvärdera hjärt flödesparametrar
- Justera sektorn i förvärvet vinkel mindre än 60o. Klicka på Doppler för att utföra pulsad våg Doppler mätningar från 2D-fyra kammare-imaging planet med en 45-MHz-givare.
- Först, visualisera bifurkation av lungartären att identifiera rätt utflöde tarmkanalen. Nästa, klicka pulsad våg Doppler för att erhålla flödet mönstret genom den pulmonell och aorta ventiler (figur 3A, Video 4).
- Erhålla pulmonell Flödesmätningarna från pulsade wave Doppler spårning, inklusive topp systoliskt velocity (PkV), accelerationstid (AT) och utmatning time (ET).
- Utföra flera mätningar (minst 5 per spårning) för att erhålla genomsnittliga mätningar som visas i figur 3A (höger).
- Beräkna AT / ET ratio för varje utflödeskapacitet ventil som en indikator på den utflöde skrifter patency och blodflöde.
- Fortsätt att få mitral och aorta flödesmönster från 2-D apikala fyra kammare vyer med hjälp av pulsad vågen Doppler. För det första identifiera vänster förmak och vänster ventrikulära kamrarna. Placera den pulsade våg Doppler provvolymen för inspelning av mitral inflöde Doppler mönster och mäta tidig diastoliskt velocity (E) och förmaksflimmer kontraktion velocity (A) (figur 3B)24,25.
- Justera Doppler provvolymen för att få mönstret aorta Doppler jet. Använda aorta Doppler jet spårning för att mäta acceleration (AT) och utmatning tid (ET) som visas i figur 3B (höger) (Video 5)
7. utvärdera den Feto-placenta axeln
- Använd färg Doppler skanningen för att visualisera den livmoder artär och feto-placenta vaskulär träd med 45 MHz givaren (figur 4A).
- Identifiera de navelsträngen fartyg (två artärer och en ven) i intra-fostervatten segmentet av navelsträngen, strax efter sladden från fostrets buken.
- Plats pulsad våg Doppler provvolymen att erhålla navelsträngen artären flödesmönster (figur 4A).
- Mäta vaskulär peak flow parametrar, bland annat accelerationstid (helst), utmatning (ET) och peak flödeshastigheten på slutet systole (PkV, s) använder pulsade vågen Doppler skanning post (figur 4B).
- Få 5 i rad vågformer i varje fartyg, i avsaknad av fostrets rörelser och maternell respiratoriska rörelser, att mäta den genomsnittliga peak lufthastigheten för varje fartyg.
- Gå vidare till nästa embryot.
8. efter Imaging djur övervakning
- Stäng av isofluran behållaren efter slutförandet av avbildningsprocessen.
- Fortsätta att övervaka andningsfrekvens, kroppstemperatur och hjärtfrekvens under återhämtningsfasen.
- Ta bort ansiktsmask och anslutna slangar systemet när dammen börjar spontana rörelser.
- Återgå dammen till lämpliga bostäder och fortsätta observation enligt standardprotokoll institutionella efter ingreppet.
- Dokumentera tid att full återupptagande av normal aktivitet.
9. funktionskrav och tekniska överväganden
- Begränsa handläggningstiden för ~ 8 foster till ca 1 h för att undvika de negativa effekterna av långvarig anestesi på vitala tecken och fysiologiska parametrar.
- Komplett utbildning med 8-10 dräktiga möss att optimera tekniker för bild förvärv och flöde mönster spårning i en kort tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Statistiska analyser av hjärt- och hemodynamiska index utfördes offline. Hjälpmedlet av 5 på varandra följande mätningar i 3 optimala bilder beräknades. Data var uttryckta i menar ± SEM. Student's t-test användes för att härleda tvärpolitiska jämförelser. Ett P -värde på ≤0.05 ansågs statistiskt signifikant.
Efter ovanstående protokoll kännetecknas vi effekterna av kronisk exponering för prenatal hypoxi på kardiovaskulär status för fostrets möss på sendräktighet genom att erhålla realtid högfrekvent ultraljud inspelningar på C57/BL6 tidsinställda gravida möss vid graviditetsdiabetes dag (GD) 18,5.
Efter etableringen av avel grupper, bekräftades lyckad parning. Tidsinställda gravid dammar upprätthölls i burar under en 12 h ljus-mörker regim med mat och vatten ad libitum tills. På GD14.5 anslogs antingen de dräktiga möss till gruppen normoxia (underhålls i luften) eller till gruppen hypoxi (placeras i hypoxi kammare vid 10% FiO2 att inducera systemisk hypoxi). Efter födseln förblev dammarna och deras pups allokerade till sina experimentella tillstånd till postnatal dag 7 (P7).
I totalt 6 dammar studerades i dessa experiment och 42 foster var framgångsrikt avbildas på GD18.5. Av dessa användes uppgifter från 36 foster för efterföljande analys (tabell 1). Analys av fostrets hjärtfrekvens på GD18.5 visade att hypoxiska foster lidit av fostrets bradykardi (lägre hjärtfrekvens) och upplevt betydande nedgång av fostrets hjärtfunktion index (EF och FS %) (Tabell 1). Anmärkningsvärt, peak flödeshastigheter (PkVs) av navelsträngen artär PkVs minskade i hypoxi-exponerade foster (figur 4B och tabell 1). Dessutom navelsträngen artär acceleration tid/utskjutningen tid (på / ET) nyckeltal avslöjade betydligt lägre värden i den hypoxisk jämfört med de normoxic Foster, vilket tyder på ökade navelsträngen vaskulär flödesmotstånd. Höger kammare väggtjocklek var överens, ökade hypoxi-exponerade foster mätt på 2-D/M-mode bilder (figur 5). Eftersom RV antar dominerande pumpfunktion under fosterutvecklingen, medan moderkakan fungerar som primär vaskulär sängen för syresättning, tyder dessa data kollektivt på förhöjt flödesmotstånd i feto-placenta vaskulär kretsen leder till RV hypertrofi. Ännu viktigare, inför hypoxi utsatta nyfödda tidig postnatal dödlighet. RV misslyckande och ökad vaskulär resistens som induceras av kronisk exponering för prenatal hypoxi bidrar potentiellt orsaka. Andra faktorer, såsom redox toxicitet som följd av förnyad syresättning skada, dålig utfodring och moderns sjukdom uteslutas. Dock återstår den exakta underliggande mekanismen för prenatal hypoxi inducerade hjärt patogenes och tidig dödlighet av fostren bestämmas i framtida studier.
Figur 1: Fostrets möss annotering och hjärtat visualisering i livmodern med hjälp av Scanning B-läge och färg Doppler förhör. (A) Schematisk framställning av fostrets möss identifieradet och annoteradet (L: vänster, R: rätt). (B) representativ bild av anatomiska landmärken i ett foster att styra inriktningen av graviditetsdiabetes dag 18,5 fostrets hjärta från vyn parasternal kort axel av vänster kammare (LV), höger kammare (RV) och interventricular septum (IVS). (C) representativ bild av parasternal kort axis syn på LV och RV med färg förhör att underlätta hjärtat kammare visualisering. (D) längsgående fyra kammare Visa LV och RV, vänster förmak (LA) och rätt atria (RA) färg Doppler. (E) längsgående fyra kammare utsikt över LV och RV, med färg Doppler förhör att underlätta visualiseringen av utflöde skrifter: höger kammare utflöde tarmkanalen (RVOT), vänster kammare utflöde tarmkanalen (LVOT), aorta (AO) och höger kammare utflöde tarmkanalen (RVOT). (F) representativa färg Doppler förhör av RVOT och PA. (G) representativa färg Doppler förhör av LVOT och AO. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: bedömning av fostrets hjärtfrekvens och kammarfunktion. (A) representant M-läge spårning erhållits från vyn långa axeln 4-kammare på GD 18,5. (LV: vänster kammare; RV: Höger kammare; LA: Vänster förmak; RA: höger Atrium). (B) representativ kvantifiering (arrowed linjer) metod för ventrikulär dimensioner inklusive vänster och höger kammare innerdiameter på diastole (LVID, d; RVID, d) och systole (LVID, s; RVID, s), vänster och höger ventrikulära väggtjocklek på diastole (LVAW, d; RVW, d), Interventricular septum (IVS), och slå till beat mätning av HR visas från fyrana kammare imaging planet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: pulsade Wave Doppler spårning av fostrets pulmonell, aorta och Mitral Flow index. (A) representativ bild av lungartären pulsad våg Doppler spårning (vänster). Kvantifiering metoder (linjer) för pulmonell flöde indexen PkV (topp hastighet), på (accelerationstid), ET (utmatning tid) visas (till höger) från vyn längsgående fyra kammare. (B) representativ bild av mitral och aorta pulsad Doppler flödesmönster (vänster) och kvantifiering av mitralisklaffstenos flöde index E (tidig diastoliskt hastighet) och en (förmaksflimmer contraction) och aorta flöde indexen på, ET, och PkV (höger) visas från den fyra-kammare bildplanen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: bedömning av Feto-placenta omlopp. (A) Representativ bild av feto-placenta vaskulär kretsar med färg Doppler förhör (övre) och moderns ECG records (nedre). (B) Representativ bild av pulsad Doppler inspelning och kvantifiering mätning av kantvåg (linjer) av navelsträngen artären flöde index i hypoxi (övre) och normoxia kontroll utsätts fostrets möss (nedre). PkV (topp hastighet), som helst (acceleration), ET (utmatning tid). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: bedömning av höger kammare väggtjocklek i hypoxi behandlas fostrets möss. (A, B) Representant M-läge spårning erhållits från vyn långa axeln fyra-kammare på GD 18,5 i normoxia och hypoxi villkor. LV: vänster kammare, RV: höger kammare, höger kammare väggen. Linjerna anger kvantitativa mätningar av RVW tjocklek i systole (s) och Diastole (d). (C) RVW, s kvantifiering visar ökad RVW tjocklek i fetal hypoxi-behandlade möss som jämfört med normoxia. Felstapel: standardavvikelsen för medelvärdet. (D) representativa tvärsnittsdata bilder av fostrets hjärtan på GD 18,5 föreställande ökade RV väggtjocklek i hypoxi behandlas och normoxia behandlade grupper. Ursprungliga förstoring 10 X. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Parametern, enhet | Normoxia | Prenatal hypoxi |
| Antal framgångsrikt avbildad foster | 20 | 16 |
| Postnatal dödlighet | 5% | 68.75% |
| Hemodynamiska Parameter | (Medelvärde ± SEM) | (Medelvärde ± SEM) |
| Fostrets hjärtfrekvens, bpm | 138 ± 4 | 89 ± 8 *** |
| Vänster kammare EF % | 71,2 ± 3 | 55 ± 2 ** |
| Vänster kammare FS % | 43 ± 2 | 29 ± 4 ** |
| Lungartären PkV, mm/s | 102 ± 10 | 129 ± 8 ** |
| Lungartären AT ET förhållande till | 0,42 ± 0,05 | 0,35 ± 0.03* |
| Navelsträngen artär PkV, mm/s | 58 ± 4 | 40 ± 1.5* ** |
| Navelsträngen artär vid ET förhållande till | 0,5 ± 0,03 | 0,42 ± 0.025* |
| Navel ven PkV, mm/s | 13 ± 1,2 | 19,6 ± 3 ** |
| Navelsträngen arteriell-venös fördröjning, ms | 122 ± 4 | 238 ± 20 * |
| EF, ejektionsfraktion; FS, fraktionerad förkortning; NA, finns inte; NS, inte betydande; PkV, topp hastighet; PkV, d, topp hastighet under diastole; PkV, s, topp hastighet under systole; Student's t-test användes för att härleda tvärpolitiska skillnader. P < 0,005. ** P < 0,01. * P < 0,05 representerar en betydande skillnad mellan grupperna jämförelser. Students t-test. Icke-betydelse var tomt. | ||
Tabell 1: hemodynamiska parametrar normoxic och hypoxisk fostrets möss vid graviditetsdiabetes dag 18,5. EF, ejektionsfraktion; FS, fraktionerad förkortning; PkV, topp hastighet; AT, accelerationstid; ET, utmatning tid. Student's t -test användes för att härleda tvärpolitiska skillnader. *** P < 0,005. P < 0,01, och * P < 0,05 representerar en betydande skillnad mellan grupperna jämförelse.
Video 1: B-läge kort axel se. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Video 2: färg Doppler – apikala längsgående se. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Video 3: M-läge. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Video 4: lungartären – pulsad våg Doppler. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kardiovaskulära missbildningar och sjukdomar påverkas avsevärt av genetiska faktorer och miljöfaktorer19. Vi har tidigare visat en betydande inverkan av maternell kalori begränsning, inleddes under andra trimestern, feto-placenta cirkulatoriska flödet och fostrets hjärtfunktion9.
Prenatal hypoxi är en annan vanlig stressfaktor under fosterutvecklingen som oerhört kan påverka feto-placenta fysiologi och cirkulationssystemet. Effekterna av prenatal hypoxi exponering kan vara mer djupgående i samband med en CHD som leder till dålig perinatal anpassning till postnatal liv. Den onormal hjärtfrekvens cardiac index upptäckt i denna studie är verkligen viktiga indikatorer av hjärt stress och förändrat placenta cirkulatoriska fysiologi och således utgör väsentliga grundläggande element för att upptäcka defekterna och åtföljande hemodynamiska förändringar som kan bli ytterligare uttalade svar på prenatal hypoxisk stress leder till tidig hjärtsvikt. Mot förmodan hade hypoxi utsatt foster lägre hjärtfrekvens. Detta fenomen kan avspegla omogna hjärt självregleringen mekanismer i fostrets möss som svar på hypoxi på GD18.5. Den exakta patogenesen är dock fortfarande okänd.
Även andra avancerade imaging metoder, såsom fostrets cardiac MRI, tillåter levande avbildning av hjärt strukturer under utveckling20, är hemodynamisk status ofta förlorade på grund av statiska bilder och utdragna förfaranden. Noninvasiv ultraljudsteknik, tillåter däremot, utför i vivo dynamisk avbildning som upprätthåller baslinjen fysiologi. Ytterligare, med tillgång till högfrekvent givare med förbättrad upplösning, visualisering av fetala hjärtat i olika utvecklingsstadier av varje enskilda foster kan bli mer genomförbart i transgena möss genom att optimera fostrets anteckning metoder. Slutligen, kostnaden per experiment är betydligt mindre med denna metod.
I en tidigare rapport från Kim GH et al.förutsatt författarna viktigt och nya insikter om vad imaging plan optimering för datainsamling med hjälp av en tidigare generation av högfrekvent ultraljud imaging system21. En annan rapport av Zhou YQ et al., har etablerat standardiserade baslinje mätningar av fostrets cirkulation på fysiologisk nivå med hjälp av en hög frekvens ultraljud utrustad med färg Doppler systemet22. Därför protokollet presenteras här kompletterar tidigare fastställda protokoll, och expanderar för att beskriva en omfattande metod som är genomförbara och praktiska i realtid i en experimentell miljö. Ett avancerat och mycket känsliga högfrekvent ultraljud system användes i denna studie för att skanna feto-placenta kretsen som en enhet. Protokollet beskrivs är enkel och standardiserad att anställa detta kraftfulla system effektivt vilket framgår av att uppnå kvantifierbara mätningar av hypoxi påverkan på fostrets cirkulation hos möss vid GD18.5.
Men vi bör erkänna viktiga begränsningar och utmaningar för dödlig hjärt imaging: första, anestetiska ämnen, inklusive isofluran, kan påverka fysiologiska parametrarna för fostret. Långvarig anestesi, håravfall och ultraljud gel kan leda till hypotermi, vilket kan påverka hjärtfrekvens och hemodynamiska index av dammen samt fostren. För närvarande finns det ingen tillgänglig metod att utvärdera graden av bedövningsmedel och deras påverkan på fostret. För att kringgå denna begränsning, titrera vi inhalerade isofluran nivåer noggrant för att uppnå lämplig sedering av fördämningarna, samtidigt som deras basal hjärtfrekvens och vitala tecken. Andra, visualisera foster som ligger djupt i buken är svårt och suboptimala, leder till uteslutning av dessa foster från slutliga dataanalys. Färg Doppler tillåter förbättrad optimering av imaging sektioner och adekvat anpassning mellan givaren och blodflödet. För det tredje, utför samtidig analys av alla foster kräver operatörens effektivitet i snabb och noggrann visualisering och bild förvärv snabbt, antyda vikten av praktisk utbildning.
Slutligen behöver viktiga steg i denna metod betonas inklusive 1) ordentlig förberedelse av systemet. (2) att upprätthålla en stabil kroppstemperatur och puls för gravida musen. (3) optimera flödet klassar av isofluran att upprätthålla baslinjen fysiologiska stater av embryon att förvärva tillförlitliga uppgifter. (4) konsekvent och effektiv bild förvärv inom kortast möjliga tid. (5) graviditetsdiabetes ålder, kön och djur stam är viktiga variabler som kan påverka resultaten. Därför bör det experimentellt protokollet utformas noga ta hänsyn till dessa variabler genom inklusive matchade kontroller från samma djur stam dataanalys och tolkning.
Sammanfattningsvis, är ett högfrekvent ultraljud system en effektiv metod att uppnå fenotypisk karakterisering av fostrets kardiologi i livmodern med viktiga experimentella och vetenskapliga värde och potentiella framtida tillämpningar som kan inkluderar 1) förstå fysiologiska dynamiken under hjärt utveckling. (2) uppnå omfattande fenotypiska analys av genetiska modeller av CHDs. 3) belysa inverkan feto-placenta cirkulationen på hjärtats kammare utveckling, mognad och anpassning till stress. (4) utför ultraljud guidade fostrets injektion för att studera gifter, teratogener eller terapeutiska medel i framtiden. (6) genomförandet av speckle spårning och stam analys kapacitet att få detaljerade regionala myokardiell funktion utveckla hjärtmuskeln kan utgöra en grund för framtida studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Någon intressekonflikt förklarade.
Acknowledgments
Vi tackar Djurfysiologi kärnan, avdelningen för molekylär medicin vid UCLA för att tillhandahålla teknisk support och öppen tillgång till Vevo 2100 ultraljud biomikroskopi (UBM) systemet. Denna studie stöddes av NIH/barn hälsa Research Center (5K12HD034610/K12), UCLA-barnens Discovery Institute och idag och i morgon Children's Fund, och David Geffen skola av medicin forskning Innovation award till M. Touma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vevo 2100 | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | N/A | High Freequency Ultrasound Biomicroscopy. The set up is available in animal physiology core facility, division of molecular medicine, UCLA. USA |
| inbred mice (c57/BL6) | Charles River Laboratories | N/A | Inbread wild type mouse strain |
References
- Touma, M., Reemtsen, B., Halnon, N., Alejos, J., Finn, J. P., Nelson, S. F., Wang, Y. A Path to Implement Precision Child Health Cardiovascular Medicine. Front Cardiovasc Med. 4, 36 (2017).
- Triedman, J. K., Newburger, J. W. Trends in Congenital Heart Disease. The Next Decade. Circulation. 133, 2716-2733 (2016).
- Gilboa, S. M., et al. Congenital Heart Defects in the United States Estimating the Magnitude of the Affected Population in 2010. Circulation. 134, 101-109 (2016).
- Pruetz, J. D., et al. Outcomes of critical congenital heart disease requiring emergent neonatal cardiac intervention. Prenat Diagn. 34, 1127-1132 (2014).
- Peterson, C., et al. Mortality among Infants with Critical Congenital Heart Disease: How Important Is Timely Detection? Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 97 (10), 664-672 (2013).
- Atz, A. M., et al. Prenatal Diagnosis and Risk Factors for Preoperative Death in Neonates with Single Right Ventricle and Systemic Outflow Obstruction: Screening Data from the Pediatric Heart Network Single Ventricle Reconstruction Trial. J Thorac Cardiovasc Surg. 140 (6), For the Pediatric Heart Network Investigators 1245-1250 (2010).
- Lalani, S. R., Belmont, J. W. Genetic Basis of Congenital Cardiovascular Malformations. Eur J Med Genet. 57 (8), 402-413 (2014).
- Hanchard, N. A., Swaminathan, S., Bucasas, K., Furthner, D., Fernbach, S., Azamian, M. S., et al. A genome-wide association study of congenital cardiovascular left-sided lesions shows association with a locus on chromosome 20. Hum Mol. 11, 2331-2341 (2016).
- Arsenijevic, V., Davis-Dusenbery, B. N. Reproducible, Scalable Fusion Gene Detection from RNA-Seq. Methods Mol Biol. 1381, 223-237 (2016).
- LaHaye, S., Corsmeier, D., Basu, M., Bowman, J. L., Fitzgerald-Butt, S., Zender, G., et al. Utilization of Whole Exome Sequencing to Identify Causative Mutations in Familial Congenital Heart Disease. Circ Cardiovasc Genet. 9 (4), 320-329 (2016).
- Zaidi, S., Choi, M., Wakimoto, H., Ma, L., Jiang, J., Overton, J. D., et al. De novo mutations in histone modifying genes in congenital heart disease. Nature. 498 (7453), 220-223 (2016).
- Leirgul, E., Brodwall, K., Greve, G., Vollset, S. E., Holmstrom, H., Tell, G. S., et al. Maternal Diabetes, Birth Weight, and Neonatal Risk of Congenital Heart Defects in Norway, 1994-2009. Obstet Gynecol. 128 (5), 1116-1125 (2016).
- Garry, D. J., Olson, E. N. A Common Progenitor at the Heart of Development. Cell. 127 (6), 1101-1104 (2006).
- Postma, A. V., Bezzina, C. R., Christoffels, V. M. Genetics of congenital heart disease: the contribution of the noncoding regulatory genome. J Hum Genet. 61, 13-19 (2016).
- Ganguly, A., Touma, M., Thamotharan, S., De Vivo, D. C., Devaskar, S. U. Maternal Calorie Restriction Causing Uteroplacental Insufficiency Differentially Affects Mammalian Placental Glucose and Leucine Transport Molecular Mechanisms. Endocrinology. Oct. 157 (10), 4041-4054 (2016).
- Lluri, G., Huang, V., Touma, M., Liu, X., Harmon, A. W., Nakano, A. Hematopoietic progenitors are required for proper development of coronary vasculature. J Mol Cell Cardiol. 86, 199-207 (2015).
- Bishop, K. C., Kuller, J. A., Boyd, B. K., Rhee, E. H., Miller, S., Barker, P. Ultrasound Examination of the Fetal Heart. Obstet Gynecol Surv. 72 (1), 54-61 (2017).
- He, H., Gan, J., Qi, H. Assessing extensive cardiac echography examination for detecting foetal congenital heart defects during early and late gestation: a systematic review and meta-analysis. Acta Cardiol. 71 (6), 699-708 (2016).
- Hobbs, C. A., Cleves, M. A., Karim, M. A., Zhao, W., MacLeod, S. L. Maternal Folate-Related Gene Environment Interactions and Congenital Heart Defects. Obstet Gynecol. 116 (2 Pt 1), 316-322 (2016).
- Gabbay-Benziv, R., et al. A step-wise approach for analysis of the mouse embryonic heart using 17.6 Tesla MRI. Magn Reson Imaging. 35, 46-53 (2017).
- Kim, G. H. Murine fetal echocardiography. J Vis Exp. (72), e4416 (2013).
- Zhou, Y. Q., Cahill, L. S., Wong, M. D., Seed, M., Macgowan, C. K., Sled, J. G. Assessment of flow distribution in the mouse fetal circulation at late gestation by high-frequency Doppler ultrasound. Physiol Genomics. 46 (16), 602-614 (2014).
- Greco, A., Coda, A. R., Albanese, S., Ragucci, M., Liuzzi, R., Auletta, L., Gargiulo, S., Lamagna, F., Salvatore, M., Mancini, M. High-Frequency Ultrasound for the Study of Early Mouse Embryonic Cardiovascular System. Reprod Sci. 22 (12), 1649-1655 (2015).
- Deneke, T., Lawo, T., von Dryander, S., Grewe, P. H., Germing, A., Gorr, E., Hubben, P., Mugge, A., Shin, D. I., Lemke, B. Non-invasive determination of the optimized atrioventricular delay in patients with implanted biventricular pacing devices. Indian Pacing Electrophysiol J. 10 (2), 73-85 (2010).
- Kono, M., Kisanuki, A., Ueya, N., Kubota, K., Kuwahara, E., Takasaki, K., Yuasa, T., Mizukami, N., Miyata, M., Tei, C. Left ventricular global systolic dysfunction has a significant role in the development of diastolic heart failure in patients with systemic hypertension. Hypertens Res. 33 (11), 1167-1173 (2010).
