Summary
Hoge-frequentie echografie beeldvorming van de foetale muis kan imaging resolutie is verbeterd en nauwkeurige niet-invasieve karakterisering van cardiale ontwikkeling en structurele gebreken. Het protocol hierin geschetst is ontworpen om uit te voeren real-time foetale muizen echocardiografie in vivo.
Abstract
Aangeboren hartafwijkingen (CHDs) zijn de meest voorkomende oorzaak van morbiditeit van de kindertijd en vroege mortaliteit. Prenatale opsporing van de moleculaire mechanismen van CHDs is van cruciaal belang voor het uitvinden van nieuwe preventieve en therapeutische strategieën. Mutant Muismodellen zijn krachtige instrumenten om nieuwe mechanismen en milieudruk modifiers dat station cardiale ontwikkeling en hun mogelijke wijziging in CHDs te ontdekken. Inspanningen om de causaliteit van deze vermeende leverden geweest is beperkt tot histologische en moleculaire studies in non-survival dierproeven, die toezicht op de essentiële fysiologische en hemodynamische parameters echter vaak afwezig is. Levende imaging technologie is een essentieel instrument om de etiologie van CHDs geworden. In het bijzonder, echografie beeldvorming kan geïnduceerd worden gebruikt zonder operatief bloot de foetussen, waardoor het behoud van hun fysiologie basislijn terwijl de gevolgen van de milieudruk over de hemodynamische en structurele aspecten van cardiale kamer ontwikkeling. Hierin, wij gebruiken het systeem van hoge-frequentie echografie (30/45) te onderzoeken van het cardiovasculaire systeem bij foetale muizen bij E18.5 in utero op de basislijn en in reactie op blootstelling van de prenatale hypoxie. We aantonen de haalbaarheid van het systeem voor het meten van de cardiale kamer grootte, morfologie, ventriculaire functie, foetale hartslag, en navelstreng slagader stroom indexen en hun wijzigingen in de foetale muizen blootgesteld aan systemische chronische hypoxie in utero in echte tijd.
Introduction
Aangeboren afwijkingen van het hart zijn heterogene structurele gebreken die zich tijdens de vroege ontwikkeling van de cardiale voordoen. Vooruitgang van de huidige operationele procedures die hebben geleid tot aanzienlijke verbeteringen in de overlevingscijfers van zuigelingen met CHDs1,2. Kwaliteit van leven is echter vaak gecompromitteerde secondary met langdurige hospitalisatie en behoeften voor reparatie van chirurgische procedures1,2,3,4,5geënsceneerd. Prenatale opsporing van de moleculaire mechanismen van CHDs is van cruciaal belang om het plan van de vroege interventies, voor het verrichten van nieuwe preventiestrategieën, en ter verbetering van de levenslange resultaten6,7.
Hoewel meerdere genetische en ecologische factoren zijn betrokken bij CHDs pathogenese, blijft tot oprichting van de causaliteit een unmet behoefte om diagnostische, therapeutische en preventieve strategieën1,8,9 ,10,11,12. Bovendien opent onderzoekt de rol van in utero stressfactoren en epigenetische modifiers nieuwe locaties voor toekomstige onderzoeken11,12. De afgelopen tien jaar is inderdaad getuige geweest van snelle vooruitgang in de technologie volgende generatie sequencing met inbegrip van één nucleotide polymorphism (SNP) microarray, hele exome sequencing en methylation van genoom-brede studies, hun gebruik in het bestuderen van de genetische modificatie oorzaken van complexe ziekten bij de mens, met inbegrip van CHDs1,8,9,10,11 is de weg effent naar het identificeren van nieuwe mutaties en genetische varianten die nog niet hebben getest voor hun pathogeniteit geschikt diermodellen.
Onder de andere ziekte modelsystemen is muis de diermodel van keuze, niet alleen voor het onderzoek naar mechanismen van CHDs tijdens de vroege cardiogenesis13,14,15,16, maar ook om te verhelderen hun effect op cardiale kamer rijping en functie op late zwangerschap in prenatale en perinatale stressfactoren. Vandaar, het uitvoeren van in vivo fenotypische karakterisering van een mutant foetale muis hart, tijdens zowel de vroege en de late stadia van ontwikkeling, is cruciaal om te begrijpen van de rol van deze genetische variaties en milieufactoren op cardiale ontwikkeling, en de mogelijke toekomstige gevolgen voor kamer specifieke rijping processen in muizen.
Vroegtijdige opsporing en accurate diagnose van cardiale afwijkingen tijdens ontwikkeling is essentieel voor Interventionele planning17,18. Wordt veilig, eenvoudig, draagbare en herhaalbare, foetale echografie is inderdaad uitgegroeid tot de standaard imaging techniek voor cardiale evaluatie in de kliniek. Beoordeling van de foetale circulatie met behulp van Doppler echografie wijd gebruikt in de klinische praktijk niet alleen voor de detectie van cardiale afwijkingen, maar ook om vasculaire afwijkingen, placenta insufficiëntie en uteriene groei beperking te detecteren en te evalueren het foetale welzijn in reactie op in utero beledigingen hypoxemia, maternale ziekte, alsmede drug toxiciteit17,18. Parallel aan de waarde bij de evaluatie van de menselijke gebreken en ziekten, heeft echografie beoordeling van foetale muizen opgedaan toenemende utility in experimental instellingen19,20,21,22, 23. In het bijzonder, kunt foetale hart echografie (echocardiografie) sequentiële in vivo visualisatie van het ontwikkelende hart. Vele experimentele studies hebben echografie-imaging technologie gebruikt om het observeren van foetale cardiovasculaire ontwikkeling in transgene foetale muizen. Doppler echografie is vooral handig voor het ophelderen van de pathofysiologische parameters, zoals de stromingspatronen in de foetale circulatie onder fysiologische uitdagingen of10,19van de voorwaarden van de ziekte. Bij zowel mensen als dieren, kan abnormale stroom of zuurstof bloedtoevoer naar de foetus voortvloeien uit verschillende omstandigheden die kunnen verstoren milieu van de foetus in utero en beïnvloeden de fetoplacental as, met inbegrip van de afwijkingen van de placenta, maternale hypoxie, Zwangerschapsdiabetes en farmaceutisch geïnduceerde vasculaire vernauwing15,22. Daarom, tot vaststelling van gestandaardiseerde methoden voor het uitvoeren van Doppler ultrasone klanken op foetale muizen zal enorm de emancipatie van toekomstige studies van CHDs doordat de stromingspatronen toezicht en belangrijke hemodynamische indexcijfers van de cardiovasculaire circuits tijdens verschillende stadia van ontwikkeling van de cardiale in genetische Muismodellen.
Hoge frequentie echografie heeft ontpopt als een krachtig instrument voor het meten van de ontwikkelings- en fysiologische parameters van het cardiovasculaire systeem in muismodellen en ziekten bij de mens18. Deze technologie is verder verfijnd geweest in de afgelopen jaren. Wij en andere onderzoekers hebben aangetoond de haalbaarheid van dit systeem voor de uitvoering van ultra-hoge frequentie echografie studies naar de foetale muis hart15,19,20,21,22 ,23. Het systeem is uitgerust met Doppler kleur flow mapping en lineaire matrix omvormers die het genereren van tweedimensionale, dynamische beelden met hoge frequentie (30 tot 50 MHz) framesnelheden. Deze voordelen, in vergelijking met lage frequentie echografie systemen en de vorige generatie van hoge frequentie echografie21,22, voorzien in de nodige gevoeligheid en resolutie grondige evaluatie van de foetale bloedsomloop systeem, met inbegrip van uitgebreide karakterisering van hart structuren, kamer functie en stroom indexcijfers van de foetale muizen in experimentele instellingen. Hierin duidelijk naar voren komt methoden voor het uitvoeren van snelle beoordeling van cardiopulmonale omloop en feto-placenta embryonale dag E18.5 in vivo verkeer met behulp van een hoogfrequent systeem. We kozen voor een 30/45 MHz transducer waarmee een axiale resolutie van ongeveer 60 µm en een laterale resolutie van 150 µm. Echter, een hogere frequentie omvormer (40/50 MHz) kan worden gekozen voor het analyseren van eerder ontwikkelingsstadia door een vergelijkbare methodologische aanpak te volgen. De geselecteerde M-modus kunnen de visualisatie van weefsels in beweging op hoge temporele resolutie niveaus (1.000 frames/s). Tot slot, we de haalbaarheid van hoge echografie voor gedetailleerde uitgebreide fenotypische karakterisering van foetale cardiovasculaire hemodynamische status en functie in muizen op basislijn en in reactie op stress prenatale hypoxie aantonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De Universiteit van Californië, Los Angeles, Animal Care en gebruik Comité heeft alle procedures weergegeven in dit protocol goedgekeurd. De experimenten werden uitgevoerd als onderdeel van een lopend onderzoek onder actieve dierlijke protocollen die zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité van University of California, Los Angeles, Californië, USA. Dierlijke behandeling en zorg volgden de normen van de gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren.
1. voorbereiding van de hoge frequentie echografie Imaging systeem
- Zet de echografie imaging systeem en de fysiologie controle eenheid.
- Sluit de 30/45 MHz transducer.
- Plaats de corresponderende scan hoofd op de houder in de buurt van de imaging platform.
- Selecteer de optie Cardiale meting programma .
- Plaats de echografie gel ondersteboven in de vooraf opwarming van de aarde container ingesteld op 37 ° C.
- Passende slangen systeem voor anesthesie bevestigen en controleer of het gehalte aan zuurstof en Isofluraan.
- Desinfecteer het imaging platform en het werkgebied.
- Stel het niveau van de warmte van de imaging platform te handhaven constante lichaamstemperatuur en de hartslag van de dammen.
2. zwangere muis voorbereiding
- Plaats de dam zwanger muis (C57/BL6) in de anesthesie-inductie-zaal.
- Induceren anesthesie met behulp van voortdurend geleverde respiratoire Isofluraan (Isofluraan 2% - 3%) gemengd met 100% zuurstof (100% O2) op een debiet van 200 mL/min bij de kamer van de inductie.
- Overdracht van het ingetogen dier op de imaging platform in een liggende positie.
- Bieden steady-state sedatie met behulp van een gelaatsmasker aangesloten op de anesthesie buis systeem-leveren Isofluraan (1,0% - 1,5%), gemengd met 100% O2 op 200 mL/min.
Let op: Regelen de lekkage van verdoving gas met behulp van een ventilatiesysteem voorzien van een houtskool filter met busje set. - Tape de ledematen zachtjes naar de ingesloten electrocardiographic elektroden na toepassing van de elektrode gel om de constante controle van de maternale cardiale en respiratoire tarieven.
- Pas het niveau van Isofluraan te handhaven van een gemiddelde hartslag van (450 +/-50 slagen/min (bpm)).
- Handhaven van de lichaamstemperatuur binnen een bereik van 37.0 ° C +/-0,5 ° C. Toezicht op de lichaamstemperatuur en de hartslag wordt weergegeven voor de eenheid van de domeincontroller van de fysiologie.
- Het document van de vitale functies van de ingetogen muis elke 15 minuten gedurende de hele procedure imaging.
- Beoordelen van het niveau van de verdoving door de houding, de hartslag en de reactie tot teen snuifjes van de muis te evalueren.
- Ophthalmic balsem (1 druppel in elk oog) toepassen om oog droogheid en hoornvlies schade te voorkomen.
- Verwijder de bont uit de mid borstniveau aan de onderste ledematen met behulp van een ontharende room om te minimaliseren van echografie demping. Verwijder crème 1-1,5 min na toepassing door afwisselend natte en droge gaas veegt ter voorkoming van schade aan de huid.
3. de embryo identificatie
- Palperen van de buikwand zachtjes te vinden van de foetussen hen uitspreiden.
- Aantekeningen toevoegen aan elk embryo over de dam buik en hun anterior-posterior en dorsale-ventrale oriëntaties definiëren met behulp van een marker.
- Gebruik de baarmoederhals van de ingetogen dam als een mijlpaal. Label van de foetussen op de links en rechts uteriene hoorns als L1, L2, 3 L, etc. (links) en R1, R2, R3, enz (rechts), respectievelijk (figuur 1A).
Let op: Vermijd verspreiding van de foetussen krachtig. 1-2 foetussen in elk nest kunnen overlappen met de anderen, waardoor hun positionering en beeldvorming onbetrouwbaar. Deze foetussen uitsluiten in de analyse.
4. foetale hart visualisatie en aantekening
- Voorverwarmde ultrageluid-gel van toepassing op de buik en verspreid het zorgvuldig om te voorkomen dat de formatie van de zeepbel. Voeg extra hoeveelheid gel op het gebied van scan imaging.
- Plaats de echografie-sonde op haar mechanische houder en mobiliseren het geleidelijk naar de huid contact met de dikke gel laag terwijl op zoek naar het kloppende hart met behulp van de B-scanmodus (Figuur 1).
- Klik op de scanknop B-modus om te verkrijgen van 2D-afbeeldingen. Gebruik de blaas als een mijlpaal markeren als R1 of L1, respectievelijk te identificeren van de eerste foetus gepositioneerd in het recht of de linker uteriene hoorn.
- Bevestig de linker- en richting van de individuele foetus in real-time door de imaging platform in het horizontale vlak te bewegen. Scannen van kop naar staart aantekeningen van de snuit, de ledematen en de wervelkolom als monumenten (figuur 1B, Video 1).
- Visualiseer het kloppend hart en aantekeningen van de linker ventrikel (LV) en het rechterventrikel (RV). Gebruik Doppler kleurmodus voor het optimaliseren van de hart-visualisatie (Figuur 1 C-G, video's 1 - 2).
- Klik op de scanknop B-modus om te verkrijgen van een parasternal korte as-view, hebben de LV en RV in hun maximale diameter in het midden van overname gegevensframe weergegeven. Start live imaging (figuur 1B-C).
- Wijzig de afdrukstand van de muis met betrekking tot het scannen van vliegtuigen om te verkrijgen van een longitudinaal bekeken voor vier-kamer (Figuur 1 d). Kies eerst de resterende structuren van het hart zoals de atria, hart en links en rechts uitstroom traktaten. Vervolgens hebben de kamers van het ventriculaire en atriale weergegeven in hun maximale diameter. Start Beeldacquisitie.
- De niet-optimale, schuine images uitsluiten van de definitieve analyse. Klik op de knop van de Cini om te verkrijgen van de continu opname 'Cineloops' voor een minimum van 10 s, vervolgens opslaan de opgenomen beelden.
5. evaluatie van de foetale hartslag en ventriculaire functie
- Klik op de scanknop M-modus om te verkrijgen van cardiale beelden van vier vlakken van de kamer (Video 3).
- Bekijk de lijst van de opnamen voor analyse als de beelden van alle de embryo's voltooid zijn.
- De niet-optimale, schuine images uitsluiten van de definitieve analyse.
- Klik op de knop analyse aan de wanddikte van de maatregel en de links/rechts-ventriculaire interne diameter aan de diastole (LVID, d; RVID, d) en systole (LVID, s; RVID, s), zoals afgebeeld in Figuur 2.
- Bepaal de gemiddelde foetale hartslag door het spelen van elk opgenomen M-modus traceren en de berekening van de meting van één cyclus naar de volgende stroom cyclus (de afstand tussen aangrenzende toppen).
- Het uitvoeren van meerdere metingen (ten minste 5 per tracering) om te verkrijgen van de gemiddelde hartslag (Figuur 2).
- Het meten van de temporele veranderingen tussen linker ventriculaire diastolische binnendiameter (LVID, d) en links ventriculaire interne diameter aan het einde systole (LVID, s) gedurende de cardiale cyclus. Fractionele verkorting percentage (FS %) dan als volgt berekenen: FS % = [(LVID,d-LVID,s)/LVID, d] x100.
- Uitvoeren van meerdere metingen (ten minste 5 per tracering) om te verkrijgen van de gemiddelden van de FS-%.
6. evaluatie van de cardiopulmonale Flow Parameters
- Aanpassen van de sector onder een hoek van overname minder dan 60o. Klik op de Doppler knop met een 45-MHz transducer pulsed wave Doppler metingen uitvoeren vanaf de 2-D vier kamer-imaging vliegtuig.
- Eerst, visualiseer de bifurcatie van de longslagader te identificeren van de juiste uitstroom tractus. Klik vervolgens op pulsed wave Doppler knop om op te halen van het patroon van de stroom via de longen en de aorta kleppen (figuur 3A, Video 4).
- Pulmonaire stroom metingen verkrijgen pulsed wave Doppler traceren, inclusief piek systolische snelheid (PkV), versnelling tijd (AT) en uitwerpen tijd (ET).
- Het uitvoeren van meerdere metingen (ten minste 5 per tracering) om te verkrijgen van gemiddelde afmetingen zoals aangegeven in figuur 3A (rechts).
- Berekenen van de AT / ET verhouding voor elk ventiel als een indicator van de uitstroom traktaten bij uitstroom en bloed stroom.
- Ga verder met het verkrijgen van de mitralisklep en de aortaklep stromingspatronen uit 2D-apicale vier kamer weergaven met behulp van de gepulseerde Golf Doppler. Eerst de linker atriale en linker ventriculaire kamers. Vervolgens plaatst u de pulsed wave Doppler monstervolume voor het opnemen van de mitralisklep instroom Doppler patronen en meten vroege diastolische snelheid (E) en atriale contractie snelheid (A) (figuur 3B)24,25.
- Doppler monstervolume om te verkrijgen van de aorta Doppler jet patroon aanpassen. De aorta Doppler jet tracering voor het meten van versnelling tijd (AT) en uitwerpen (ET), zoals aangegeven in figuur 3B (rechts) (Video 5) gebruiken
7. de evaluatie van de Feto-placenta as
- Gebruik de kleur Doppler scan om te visualiseren van de uteriene slagader en feto-placenta vasculaire structuur met behulp van de 45 MHz transducer (figuur 4A).
- Identificeer de navelstreng schepen (twee slagaders en een ader) in het intra-vruchtwater segment van de navelstreng, net na het snoer aan de foetale buik onttrekkingen.
- Plaats gepulseerde Golf Doppler monstervolume te verkrijgen van de navelstreng ader stroom patroon (figuur 4A).
- Meten van vasculaire piek stroom parameters waaronder versnelling tijd (AT), uitwerpen tijd (ET) en piek stroomsnelheid op einde systole (PkV, s) met behulp van de gepulseerde Golf Doppler scannen record (figuur 4B).
- Verkrijgen van 5 opeenvolgende golfvormen in elk drukvat, het ontbreken van foetale bewegingen en moeders respiratoire bewegingen, voor het meten van de gemiddelde piek snelheid voor elk vaartuig.
- Ga verder met de volgende embryo.
8. Imaging post dierlijke controle
- Uitschakelen van de container van de Isofluraan na afloop van de procedure.
- Blijven volgen van lichaamstemperatuur, ademhaling en hartslag tijdens de herstelfase.
- Verwijder de gelaatsmasker en het systeem aangesloten leidingen zodra de dam spontane bewegingen begint.
- De dam terug tot de passende huisvesting en observatie volgens standaardprotocollen institutionele na procedure.
- Document de tijd om de volledige hervatting van de normale activiteiten.
9. prestatie-eisen en technische overwegingen
- De verwerkingstijd voor ~ 8 foetussen tot ongeveer 1 h om te voorkomen dat de negatieve effecten van langdurige narcose op vitale functies en fysiologische parameters te beperken.
- Training met 8-10 zwangere muizen voor het optimaliseren van de technieken voor afbeelding verwerving en stroom patronen traceren in een kort tijdsbestek te voltooien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Statistische analyses van cardiale en hemodynamische indices werden offline uitgevoerd. Het middel 5 opeenvolgende metingen in 3 optimale beelden werden berekend. De gegevens werden uitgedrukt als bedoel ± SEM. Student t-test werd gebruikt voor het afleiden van de interfractiewerkgroep vergelijkingen. Een P -waarde van ≤0.05 werd beschouwd als statistisch significant.
Naar aanleiding van het bovengenoemde protocol gekenmerkt we de impact van chronische blootstelling aan prenatale hypoxie op de cardiovasculaire status van foetale muizen in late zwangerschap door het verkrijgen van real-time hoge frequentie echografie opnames op de C57/BL6 getimede zwangere muizen op zwangerschapsduur dag (GD) 18,5.
Na de oprichting van het fokken van groepen, werd succesvolle paring bevestigd. Getimede zwangere dammen werden onderhouden in kooien onder een regime van de licht-donker 12u met voedsel en water ad libitum tot. De zwangere muizen werden op GD14.5, ofwel toegewezen aan de groep van de normoxia (behouden in de lucht) of aan de groep van de hypoxie (geplaatst in hypoxie kamer op 10% FiO2 voor het opwekken van systemische hypoxie). Na de geboorte bleven de dammen en hun pups toegewezen aan hun experimentele conditie tot postnatale dag 7 (P7).
In totaal, 6 dammen in deze experimenten werden bestudeerd en 42 foetussen werden met succes beeld op GD18.5. Hiervan werden gegevens verkregen uit 36 foetussen gebruikt voor latere analyse (tabel 1). Analyse van de tarieven van het foetale hart op GD18.5 bleek dat hypoxische foetussen leed aan foetale bradycardie (lagere tarieven van het hart) en ervaren significante daling van de foetale hartfunctie indexcijfers (EF % en FS %) (Tabel 1). Opmerkelijk, piek stroomsnelheden (PkVs) van de navelstreng ader PkVs werden verlaagd in hypoxie-blootgesteld foetussen (figuur 4B en tabel 1). Anderzijds de navelstreng ader versnelling tijd/uitwerpen tijd (AT / ET) ratio's bleek aanzienlijk lagere waarden in de hypoxische t.o.v. de normoxic foetussen, suggereren verhoogd navelstreng vasculaire stromingsweerstand. Eens, werd rechts-ventriculaire wanddikte verhoogd in hypoxie-blootgesteld foetussen als gemeten op 2-D/M-mode beelden (Figuur 5). Aangezien de RV wordt ervan uitgegaan dominante pomp functie tijdens de foetale ontwikkeling, dat terwijl de placenta als de primaire vasculaire bed voor zuurstoftoevoer fungeert, stel deze gegevens collectief verhoogde stromingsweerstand in het feto-placenta vasculaire circuit leidt tot RV hypertrofie. Belangrijker, hypoxie blootgesteld pasgeborenen geconfronteerd vroege postnatale letaliteit. RV falen en toegenomen vasculaire weerstand veroorzaakt door chronische blootstelling aan prenatale hypoxie dragen mogelijk oorzaak. Andere factoren, zoals redox toxiciteit als gevolg van opnieuw oxygenatie letsel, slechte voeding en moeders ziekte kunnen niet worden uitgesloten. Niettemin blijven de exacte onderliggende mechanisme van prenatale hypoxie geïnduceerde cardiale pathogenese en de vroege letaliteit van de foetussen te bepalen in toekomstige studies.
Figuur 1: Aantekening van het foetale muizen en hart visualisatie in Utero met behulp van Scanning B-modus en kleuren Doppler ondervraging. (A) Schematische weergave van de identificatie van de foetale muizen en aantekening (L: verliet, R: recht). (B) representatief beeld van de anatomische bezienswaardigheden in een foetus bij de oriëntatie van de zwangerschapsduur dag 18,5 foetale hart van de parasternal korte axis Bekijk linker ventrikel (LV), rechterventrikel (RV) en hart septum (IVS). (C) representatieve foto van parasternal korte as LV en RV met kleur ondervraging te vergemakkelijken hart kamer visualisatie. (D) longitudinale vier-kamer bekijken van de LV en de RV, liet atria (LA) en juiste atria (RA) kleur Doppler. (E) longitudinale vier-kamer uitzicht op LV en RV, met kleur Doppler ondervraging te vergemakkelijken van de visualisatie van uitstroom traktaten: rechter ventrikel uitstroom tractus (RVOT), linker ventrikel uitstroom tractus (LVOT), aorta (AO) en rechterventrikel uitstroom tractus (RVOT). (F) vertegenwoordiger kleur Doppler ondervraging van RVOT en PA (G) vertegenwoordiger kleur Doppler ondervraging van LVOT en AO. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: beoordeling van foetale hartslag en ventriculaire functie. (A) vertegenwoordiger M-Mode tracering is verkregen van de lange as 4-kamer uitzicht op GD 18,5. (LV: verlaten ventrikel; RV: Rechterventrikel; LA: Linkerboezem; RA: rechts Atrium). (B) vertegenwoordiger kwantificering (gestreept lijnen) methode van ventriculaire afmetingen, met inbegrip van links en rechts-ventriculaire interne diameter aan de diastole (LVID, d; RVID, d) en systole (LVID, s; RVID, s), links en rechts ventriculaire wanddikte op diastole (LVAW, d; RVW, d), hart septum (IVS), en beat-beat meting van HR worden weergegeven van de vier kamer imaging vliegtuig. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Pulsed Wave Doppler tracering van foetale pulmonaire, aortaklep en mitralisklep Flow Indices. (A) representatieve afbeelding van longslagader pulsed wave Doppler tracering (links). Kwantificering methoden (lijnen) van pulmonaire stroom indices PkV (piek snelheid), (versnelling tegelijk), ET (ejectie keer) weergegeven (rechts) vanuit de longitudinale vier-kamer. (B) representatief beeld van de mitralisklep en de aortaklep gepulseerde Doppler stroom patroon (links) en kwantificering van de mitralisklep stroom indexcijfers E (vroege diastolische snelheid) en een (atriale samentrekking) en aorta stromen indexen op, ET en PkV (rechts) worden getoond van de vier-kamer imaging vliegtuig. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: beoordeling van Feto-placenta omloop. (A) Vertegenwoordiger beeld van feto-placenta vasculaire schakelingen met behulp van color Doppler ondervraging (bovenste) en moeders ECG records (Neder). (B) Representatief beeld van gepulste Golf Doppler opname en kwantificering metingen (lijnen) van de navelstreng ader stroom indexcijfers in hypoxie (bovenste) en normoxia control blootgesteld foetale muizen (Neder). PkV (piek snelheid), (versnelling tegelijk), ET (ejectie keer). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: beoordeling van de dikte van de wand van de rechterventrikel in hypoxie behandeld foetale muizen. (A, B) Vertegenwoordiger M-Mode tracering verkregen de lengteas vier-kamer uitzicht op GD 18,5 in normoxia en hypoxie omstandigheden. LV: verlaten ventrikel, RV: rechter ventrikel, rechts-ventriculaire muur. Lijnen geven aan kwantitatieve metingen van RVW dikte in systole (s) en Diastole (d). (C) de RVW, s kwantificering toont verhoogde RVW dikte in hypoxie-behandelde foetale muizen in vergelijking met normoxia. Foutbalk: de standaardfout van het gemiddelde. (D) vertegenwoordiger transversale beelden van foetale hart op GD 18,5 beeltenis verhoogd RV wanddikte in hypoxie behandeld en groepen van de normoxia behandeld. Oorspronkelijke vergroting 10 X. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Parameter, eenheid | Normoxia | Prenatale hypoxie |
| Aantal met succes verbeelde foetussen | 20 | 16 |
| Postnatale sterfte | 5% | 68.75% |
| Hemodynamische Parameter | (Gemiddelde ± SEM) | (Gemiddelde ± SEM) |
| Foetale hartslag, bpm | 138 ± 4 | 89 ± 8 *** |
| Linkerventrikel EF % | 71.2 ± 3 | 55 ± 2 ** |
| Linkerventrikel FS % | 43 ± 2 | 29 ± 4 ** |
| Longslagader PkV, mm/s | 102 ± 10 | 129 ± 8 ** |
| Longslagader AT ET ratio | 0.42 ± 0,05 | 0.35 ± 0.03* |
| Navelstreng slagader PkV, mm/s | 58 ± 4 | 40 ± 1.5* ** |
| Navelstreng ader op ET ratio | 0,5 ± 0,03 | 0.42 ± 0.025* |
| Navelstreng ader PkV, mm/s | 13 ± 1,2 | 19.6 ± 3 ** |
| Navelstreng arterial-veneuze vertraging, ms | 122 ± 4 | 238 min of meer 20 * |
| EF, ejectie Fractie; FS, fractionele verkorten; NB, niet beschikbaar; NS, niet significant; PkV, piek snelheid; PkV, d, piek snelheid tijdens de diastole; PkV, s, piek snelheid tijdens de systole; Van de student t-test werd gebruikt voor het afleiden van de interfractiewerkgroep verschillen. P < 0.005. ** P < 0,01. * P < 0.05 een significant verschil in Inter groep vergelijkingen vertegenwoordigt. van de student t-test. Non-betekenis was leeg. | ||
Tabel 1: hemodynamische parameters van normoxic en hypoxische foetale muizen bij zwangerschapsduur dag 18,5. EF, ejectie Fractie; FS, fractionele verkorten; PkV, piek snelheid; AT, versnelling tijd; ET, uitwerpen tijd. Van de student t -test werd gebruikt voor het afleiden van de interfractiewerkgroep verschillen. *** P < 0.005. P < 0,01, en * P < 0.05 vertegenwoordigt een significant verschil in Inter groep vergelijking.
Video 1: korte as B-wijzemening. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Video 2: Color Doppler-apicale longitudinaal bekeken. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Video 3: M-Mode. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Video 4: longslagader – pulsed wave Doppler. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cardiovasculaire misvormingen en ziekten worden sterk beïnvloed door genetische factoren en milieuelementen19. Wij hebben eerder aangetoond een significant effect van maternale calorie beperking, dat is geïnitieerd tijdens het tweede trimester, op feto-placenta bloedsomloop stroom en foetale hartfunctie9.
Prenatale hypoxie is een andere gemeenschappelijke factor van de stress tijdens de foetale ontwikkeling die enorm de feto-placenta fysiologie en bloedsomloop beïnvloeden kan. Het effect van prenatale hypoxie blootstelling kan worden verdiept in het kader van een CHD leidt tot slechte perinatale aanpassing aan postnatale leven. De abnormale hartslag en cardiale indices gedetecteerd in deze studie zijn inderdaad belangrijke indicatoren van cardiale stress en veranderde placenta bloedsomloop fysiologie, en dus vormen essentiële primaire elementen voor het opsporen van de ontwikkelingstoxiciteit gebreken en daaruit voortvloeiende hemodynamische wijzigingen die verder kunnen worden uitgesproken naar aanleiding van prenatale hypoxische stress leidt tot vroege hartfalen. In tegenstelling tot de verwachtingen hadden hypoxie blootgesteld foetussen lagere tarieven van het hart. Dit verschijnsel kan weerspiegelen onvolwassen cardiale autoregulatie mechanismen in de foetale muizen in reactie op hypoxie op GD18.5. De exacte pathogenese blijft echter onbekend.
Hoewel andere geavanceerde imaging methoden, zoals foetale Cardiale MRI, toestaan live beeldvorming van cardiale structuren tijdens ontwikkeling20, is de hemodynamische status vaak verloren als gevolg van statische afbeeldingen en langdurige procedures. Noninvasive echografie-technologie, aan de andere kant, kunnen uitvoeren van in vivo dynamische imaging dat de Fysiologie van de basislijn onderhoudt. Verder, met de beschikbaarheid van hoge frequentie omvormers met verhoogde resolutie, de visualisatie van het foetale hart op verschillende ontwikkelingsstadia van elke individuele foetus kan worden meer haalbaar in transgene muizen door het optimaliseren van foetale aantekening methoden. Tot slot, de kosten per experiment is veel minder gebruik van deze methode.
In een vorig rapport door Kim GH et al.verstrekt de auteurs belangrijke en nieuwe inzichten met betrekking tot de beeldvorming plan optimalisatie voor data-acquisitie met behulp van een vorige generatie van hoge frequentie echografie imaging systeem21. Een ander rapport door Zhou YQ et al., heeft gestandaardiseerde basislijnmetingen van foetale circulatie op fysiologisch niveau vastgesteld met behulp van een echografie van de hoge frequentie uitgerust met kleur Doppler systeem22. Vandaar, het protocol hier gepresenteerd is een aanvulling op de eerder vastgestelde protocollen en uitgebreid overzichtsweergave een uitgebreide methode haalbaar en praktisch in real-time in een experimentele omgeving. Een geavanceerde en zeer gevoelige hoge frequentie echografie systeem werd in deze studie gebruikt voor het scannen van het feto-placenta circuit als een eenheid. Het overzicht protocol is eenvoudige en gestandaardiseerde dit krachtige systeem effectief zoals aangetoond door het bereiken van meetbare metingen van hypoxie effect op de foetale circulatie in muizen op GD18.5 in dienst.
Niettemin moeten we erkennen belangrijke beperkingen en uitdagingen van fatale cardiale beeldvorming: eerste, verdoving agenten, met inbegrip van Isofluraan, van invloed kunnen zijn op de fysiologische parameters van de foetus. Langdurige narcose, haaruitval en ultrasone gel kunnen leiden tot onderkoeling, die kan de hartslag en hemodynamische indexcijfers van de dam, evenals de foetussen beïnvloeden. Op dit moment is er geen beschikbare methode te beoordelen van het niveau van de verdoving agenten en hun effecten op de foetus. Om deze beperking te omzeilen, Titreer we geïnhaleerde Isofluraan niveaus zorgvuldig om passende sedatie van de dammen, met behoud van hun basale hartslag en de vitale functies. Ten tweede, visualiseren van foetussen die diep in de buik liggen is moeilijk en suboptimaal, wat leidt tot uitsluiting van deze foetussen van definitieve data-analyse. De kleur Doppler kunt verbeterde optimalisatie van imaging secties en voldoende uitlijning tussen de transducer en doorbloeding. Ten derde, uitvoeren van gelijktijdige analyses van alle foetussen vereist de exploitant van de efficiëntie in snelle en accurate visualisatie en afbeelding overname snel, impliceert het belang van praktische opleiding.
Ten slotte moeten de belangrijke stappen in deze methode worden benadrukt met inbegrip van 1) een goede voorbereiding van het systeem. 2) handhaving van een stabiele temperatuur en hartslag voor de zwangere muis. 3) het optimaliseren van het debiet van Isofluraan om fysiologische staten van de basislijn van de embryo's om betrouwbare gegevens te vergaren. 4) Consistent en efficiënt Beeldacquisitie binnen de kortst mogelijke tijd. 5) gestational leeftijd, geslacht, en dierlijke stam zijn belangrijke variabelen die de resultaten aanzienlijk kunnen beïnvloeden. Het experimentele protocol moet daarom zorgvuldig worden ontworpen om de rekening voor deze variabelen door matched controles uit dezelfde dierlijke stam in data-analyse en interpretatie.
Kortom, is een hoge frequentie echografie systeem een effectieve methode om fenotypische karakterisering van foetale cardiovasculaire systemen in utero met belangrijke experimentele en wetenschappelijke waarde en potentiële toekomstige toepassingen die kunnen inclusief 1) inzicht in de fysiologische dynamiek tijdens de ontwikkeling van de cardiale. 2) actualisering uitgebreide fenotypische analyse van genetische modellen van CHDs. 3) het effect feto-placenta verkeer op cardiale kamer ontwikkeling, rijping en aanpassing wil ophelderen. 4) uitvoeren van de echografie begeleide foetale injectie om te bestuderen van toxines, teratogens of therapeutische middelen in de toekomst. 6) de uitvoering van de spikkel tracering en stam analyse mogelijkheden om het verkrijgen van gedetailleerde regionale myocardiale functie van het ontwikkelende myocardium een basis verschaffen voor toekomstige studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflict verklaard.
Acknowledgments
Wij danken de Dierenfysiologie kern, Afdeling Moleculaire Geneeskunde aan de UCLA voor het verstrekken van technische ondersteuning en open toegang tot het Vevo 2100 echografie biomicroscopy (UBM) systeem. Deze studie werd ondersteund door het hulpprogramma voor het onderzoek van de NIH/kind-gezondheidscentrum (5K12HD034610/K12), de UCLA-Children's Discovery Institute en vandaag en morgen Children's Fund, en David Geffen School of Medicine Research Innovation award naar M. Touma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vevo 2100 | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | N/A | High Freequency Ultrasound Biomicroscopy. The set up is available in animal physiology core facility, division of molecular medicine, UCLA. USA |
| inbred mice (c57/BL6) | Charles River Laboratories | N/A | Inbread wild type mouse strain |
References
- Touma, M., Reemtsen, B., Halnon, N., Alejos, J., Finn, J. P., Nelson, S. F., Wang, Y. A Path to Implement Precision Child Health Cardiovascular Medicine. Front Cardiovasc Med. 4, 36 (2017).
- Triedman, J. K., Newburger, J. W. Trends in Congenital Heart Disease. The Next Decade. Circulation. 133, 2716-2733 (2016).
- Gilboa, S. M., et al. Congenital Heart Defects in the United States Estimating the Magnitude of the Affected Population in 2010. Circulation. 134, 101-109 (2016).
- Pruetz, J. D., et al. Outcomes of critical congenital heart disease requiring emergent neonatal cardiac intervention. Prenat Diagn. 34, 1127-1132 (2014).
- Peterson, C., et al. Mortality among Infants with Critical Congenital Heart Disease: How Important Is Timely Detection? Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 97 (10), 664-672 (2013).
- Atz, A. M., et al. Prenatal Diagnosis and Risk Factors for Preoperative Death in Neonates with Single Right Ventricle and Systemic Outflow Obstruction: Screening Data from the Pediatric Heart Network Single Ventricle Reconstruction Trial. J Thorac Cardiovasc Surg. 140 (6), For the Pediatric Heart Network Investigators 1245-1250 (2010).
- Lalani, S. R., Belmont, J. W. Genetic Basis of Congenital Cardiovascular Malformations. Eur J Med Genet. 57 (8), 402-413 (2014).
- Hanchard, N. A., Swaminathan, S., Bucasas, K., Furthner, D., Fernbach, S., Azamian, M. S., et al. A genome-wide association study of congenital cardiovascular left-sided lesions shows association with a locus on chromosome 20. Hum Mol. 11, 2331-2341 (2016).
- Arsenijevic, V., Davis-Dusenbery, B. N. Reproducible, Scalable Fusion Gene Detection from RNA-Seq. Methods Mol Biol. 1381, 223-237 (2016).
- LaHaye, S., Corsmeier, D., Basu, M., Bowman, J. L., Fitzgerald-Butt, S., Zender, G., et al. Utilization of Whole Exome Sequencing to Identify Causative Mutations in Familial Congenital Heart Disease. Circ Cardiovasc Genet. 9 (4), 320-329 (2016).
- Zaidi, S., Choi, M., Wakimoto, H., Ma, L., Jiang, J., Overton, J. D., et al. De novo mutations in histone modifying genes in congenital heart disease. Nature. 498 (7453), 220-223 (2016).
- Leirgul, E., Brodwall, K., Greve, G., Vollset, S. E., Holmstrom, H., Tell, G. S., et al. Maternal Diabetes, Birth Weight, and Neonatal Risk of Congenital Heart Defects in Norway, 1994-2009. Obstet Gynecol. 128 (5), 1116-1125 (2016).
- Garry, D. J., Olson, E. N. A Common Progenitor at the Heart of Development. Cell. 127 (6), 1101-1104 (2006).
- Postma, A. V., Bezzina, C. R., Christoffels, V. M. Genetics of congenital heart disease: the contribution of the noncoding regulatory genome. J Hum Genet. 61, 13-19 (2016).
- Ganguly, A., Touma, M., Thamotharan, S., De Vivo, D. C., Devaskar, S. U. Maternal Calorie Restriction Causing Uteroplacental Insufficiency Differentially Affects Mammalian Placental Glucose and Leucine Transport Molecular Mechanisms. Endocrinology. Oct. 157 (10), 4041-4054 (2016).
- Lluri, G., Huang, V., Touma, M., Liu, X., Harmon, A. W., Nakano, A. Hematopoietic progenitors are required for proper development of coronary vasculature. J Mol Cell Cardiol. 86, 199-207 (2015).
- Bishop, K. C., Kuller, J. A., Boyd, B. K., Rhee, E. H., Miller, S., Barker, P. Ultrasound Examination of the Fetal Heart. Obstet Gynecol Surv. 72 (1), 54-61 (2017).
- He, H., Gan, J., Qi, H. Assessing extensive cardiac echography examination for detecting foetal congenital heart defects during early and late gestation: a systematic review and meta-analysis. Acta Cardiol. 71 (6), 699-708 (2016).
- Hobbs, C. A., Cleves, M. A., Karim, M. A., Zhao, W., MacLeod, S. L. Maternal Folate-Related Gene Environment Interactions and Congenital Heart Defects. Obstet Gynecol. 116 (2 Pt 1), 316-322 (2016).
- Gabbay-Benziv, R., et al. A step-wise approach for analysis of the mouse embryonic heart using 17.6 Tesla MRI. Magn Reson Imaging. 35, 46-53 (2017).
- Kim, G. H. Murine fetal echocardiography. J Vis Exp. (72), e4416 (2013).
- Zhou, Y. Q., Cahill, L. S., Wong, M. D., Seed, M., Macgowan, C. K., Sled, J. G. Assessment of flow distribution in the mouse fetal circulation at late gestation by high-frequency Doppler ultrasound. Physiol Genomics. 46 (16), 602-614 (2014).
- Greco, A., Coda, A. R., Albanese, S., Ragucci, M., Liuzzi, R., Auletta, L., Gargiulo, S., Lamagna, F., Salvatore, M., Mancini, M. High-Frequency Ultrasound for the Study of Early Mouse Embryonic Cardiovascular System. Reprod Sci. 22 (12), 1649-1655 (2015).
- Deneke, T., Lawo, T., von Dryander, S., Grewe, P. H., Germing, A., Gorr, E., Hubben, P., Mugge, A., Shin, D. I., Lemke, B. Non-invasive determination of the optimized atrioventricular delay in patients with implanted biventricular pacing devices. Indian Pacing Electrophysiol J. 10 (2), 73-85 (2010).
- Kono, M., Kisanuki, A., Ueya, N., Kubota, K., Kuwahara, E., Takasaki, K., Yuasa, T., Mizukami, N., Miyata, M., Tei, C. Left ventricular global systolic dysfunction has a significant role in the development of diastolic heart failure in patients with systemic hypertension. Hypertens Res. 33 (11), 1167-1173 (2010).
