Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Fosterets musen hjerte Imaging bruker høyfrekvente ultralyd (30 / 45MHZ) System

doi: 10.3791/57210 Published: May 5, 2018

Summary

Høyfrekvente ultralyd imaging fosterets musen har forbedret tenkelig oppløsning og gir presis ikke-invasiv karakterisering av hjerte utvikling og strukturelle feil. Protokollen skissert heri er utformet til å utføre sanntid fosterets mus echocardiography i vivo.

Abstract

Medfødt hjertefeil (CHDs) er den vanligste årsaken til barndommen sykelighet og tidlig dødelighet. Prenatal påvisning av underliggende molekylære mekanismer av CHDs er avgjørende for oppfinne nye forebyggende og terapeutisk strategier. Mutant musen modeller er kraftige verktøy for å oppdage nye mekanismer og miljøbelastning modifikatorer som driver enkelte utvikling og deres potensielle endring i CHDs. Men er arbeidet med å etablere årsakssammenheng av disse antatte bidragsyterne har vært begrenset til histologiske og molekylære studier i ikke-overlevelse dyreforsøk, hvilke overvåke nøkkelparameterne fysiologiske og hemodynamic ofte fraværende. Live bildeteknologi har blitt et uunnværlig verktøy å etablere etiologien for CHDs. Spesielt ultralyd imaging kan brukes prenatally uten kirurgisk utsette fostre, slik at opprettholde planlagte fysiologi mens overvåking virkningen av miljøstress på hemodynamic og strukturelle deler av cardiac kammer utvikling. Her, bruker vi høyfrekvente ultralyd (30/45) systemet for å undersøke det kardiovaskulære systemet i fosterets mus på E18.5 i utero på grunnlinjen og svar på prenatal hypoksi eksponering. Vi viser muligheten for systemet å måle cardiac kammer størrelse, morfologi, ventrikkel funksjon, fosterets hjertefrekvens, og umbilical arterien flyt indekser og deres endringer i fosterets mus utsatt for systemisk kronisk hypoksi i utero Real tid.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Medfødte misdannelser av hjertet er heterogene strukturelle feil som oppstår under tidlig hjerte utvikling. Dagens tekniske fremskritt av operative prosedyrer har ført til betydelige forbedringer i overlevelse av spedbarn med CHDs1,2. Livskvalitet er imidlertid ofte kompromittert videregående langvarig sykehusinnleggelse og behov for iscenesatt kirurgisk reparasjon prosedyrer1,2,3,4,5. Prenatal påvisning av underliggende molekylære mekanismer av CHDs er avgjørende for å planlegge tidlig intervensjon, å gjennomføre nye forebygging strategier, og å forbedre livslang resultater6,7.

Selv om flere genetiske og miljømessige faktorer har vært innblandet i CHDs patogenesen, fortsatt etablering av kausalitet et udekket behov å forbedre diagnostiske, terapeutiske og forebyggende strategier1,8,9 ,10,11,12. Videre åpner undersøker rollene i utero stress faktorer og epigenetic modifikatorer nye arenaer for fremtidige undersøkelser11,12. Det siste tiåret har faktisk vitne raske fremskritt innen neste generasjons sekvensering teknologi inkludert single nukleotid polymorfisme (SNP) microarray, hele exome sekvensering og genom hele metylering studier, utnyttelse i å studere den genetisk årsaker til komplekse menneskelige sykdommer, inkludert CHDs1,8,9,10,11 banet vei å identifisere romanen mutasjoner og genetisk varianter som ennå ikke er testet for deres virusets i egnet dyremodeller.

Blant de ulike sykdom modell systemene er musen dyr modell av valg, ikke bare for å undersøke mekanismer for CHDs under tidlig cardiogenesis13,14,15,16, men også å belyse deres innvirkning på cardiac kammer modning og fungere på slutten svangerskapet prenatal og perinatal stress faktorer. Dermed utføre i vivo fenotypiske karakterisering av en mutant fosterets musen hjerte, under både begynnelsen og slutten stadier av utvikling, er avgjørende for å forstå rollen av disse genetiske variasjoner og miljøfaktorer i cardiac utvikling, og den mulige fremtidige virkningen på kammeret bestemt modning prosesser i mus.

Tidlig oppdagelse og nøyaktig diagnose av kardiale defekter under utvikling er avgjørende for intervensjonsradiologi planlegging17,18. Å være sikker, enkel, bærbare og repeterbare, blitt føtal sonography faktisk standard tenkelig teknikk for cardiac evaluering i klinikken. Fosterets sirkulasjon vurdering ved hjelp av Doppler ultralyd har vært mye brukt i klinisk praksis ikke bare for påvisning av kardiale defekter, men også å oppdage vaskulær Misdannelser, morkaken insuffisiens og intrauterine vekst begrensning og vurdere fosterets velvære svar i utero fornærmelser inkludert hypoksemi, mors sykdom og medikament toksisitet17,18. Parallelt med verdien i evalueringen av menneskelig feil og sykdommer, har ultralyd vurdering av fetal mus fått økende verktøyet i eksperimentell innstillinger19,20,21,22, 23. Spesielt kan fosterets hjerte ultralyd (echocardiography) følge i vivo visualisering av utvikle hjerte. Mange eksperimentelle studier har brukt ultralyd-imaging teknologi for å observere fosterets hjerte utvikling i transgene fosterets mus. Doppler ultralyd er spesielt nyttig å belyse patofysiologiske parametrene som flyt mønstre i fosterets sirkulasjon under fysiologiske utfordringer eller sykdom betingelser10,19. I både mennesker og dyr, kan unormale blod flyte eller oksygen forsyning til fosteret skyldes ulike forhold som kan forstyrre fosterets miljø i utero og påvirker fetoplacental aksen, inkludert placental unormalt, mors hypoksi, svangerskapsdiabetes, og pharmaceutically indusert vaskulær innsnevring15,22. Derfor vil etablering av standardiserte metoder for å utføre Doppler ultrasounds på fosterets mus enormt styrke fremtidige studier av CHDs ved å tilrettelegge overvåking flyt mønstre og viktige hemodynamic indeksene av hjerte kretser under ulike stadier av cardiac utvikling i genetisk musen modeller.

Høy frekvens ultralyd har dukket opp som et kraftig verktøy for å måle utviklingsmessige og fysiologiske parametere av det kardiovaskulære systemet i musen modeller og menneskelige sykdommer18. Denne teknologien har blitt ytterligere forbedret de siste årene. Vi og andre forskere har vist muligheten for dette systemet for å gjennomføre ultra høy frekvens ultralyd studier på fosterets musen hjertet15,19,20,21,22 ,23. Systemet er utstyrt med Doppler Fargekartlegging flyt og lineær array transducers som genererer todimensjonal, dynamiske bilder med høy frekvens (30-50 MHz) bildefrekvens. Disse fordelene, sammenlignet med lavfrekvens ultralyd systemer og foregående generasjons høyfrekvent ultralyd21,22, gir den nødvendige sensitivitet og oppløsning for grundig vurdering av de fosterets sirkulasjonssystemet systemet, inkludert omfattende karakteristikk av hjertet strukturer, kammer funksjon og flyt indekser fosterets mus i eksperimentell innstillinger. Her, skissere vi metoder for å utføre rask vurdering av hjerte sirkulasjon og feto-placental sirkulasjon på embryonale dag E18.5 i vivo ved hjelp av en høyfrekvent system. Vi valgte en 30/45 MHz svinger som gir en aksial oppløsning på omtrent 60 µm og en lateral oppløsning på 150 µm. Imidlertid kan en høyere klokkefrekvensen svinger (40/50 MHz) velges analysere tidligere utviklingsstadier ved å følge en lignende metodisk tilnærming. Den valgte M-modusen lar visualisering av vev i gang temporal høyoppløselig nivåer (1000 rammer/s). Til slutt, viser vi muligheten for høy ultralyd for detaljert omfattende fenotypiske karakterisering av fosterets hjerte hemodynamic status og funksjon i mus ved baseline og svar på prenatal hypoksi stress.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

University of California, Los Angeles, Animal Care og bruk komiteen har godkjent alle prosedyrer i denne protokollen. Forsøkene ble utført som del av en pågående studie under aktiv dyr protokoller godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen av University of California, Los Angeles, California, USA. Dyr behandling og omsorg fulgt standarder for og bruk av forsøksdyr.

1. klargjør høyfrekvent Ultralyd Imaging System

  1. Slå på ultralyd imaging systemet og fysiologi overvåking enheten.
  2. Koble 30/45 MHz svingeren.
  3. Plass tilsvarende Skannerhodet på sin holder nær tenkelig plattformen.
  4. Velg Cardiac måling programmet .
  5. Sted ultralyd gel opp ned i beholderen pre oppvarming satt til 37 ° C.
  6. Bekrefte riktig rørsystem for anestesi og kontrollere nivået av oksygen og isoflurane.
  7. Desinfiser tenkelig plattformen og arbeidsområdet.
  8. Angi hvilket varme tenkelig plattformen å opprettholde konstant kroppstemperatur og hjertefrekvens av demninger.

2. gravid musen forberedelse

  1. Plass gravid mus (C57/BL6) demningen i anestesi induksjon kammeret.
  2. Indusere anestesi ved hjelp av kontinuerlig levert inhalasjon-anestesimiddel isoflurane (isoflurane 2% - 3%) blandet med 100% oksygen (100% O2) på en strømningshastighet på 200 mL/min i induksjon kammeret.
  3. Overføre bedøvet dyret på tenkelig plattformen i supine posisjon.
  4. Gir stabil sedasjon ved hjelp av en ansiktsmaske koblet til anestesi rør system-levere isoflurane (1,0% - 1,5%) blandet med 100% O2 på 200 mL/min.
    FORSIKTIG: Kontrollere lekkasje av bedøvende gass ved hjelp av et ventilasjonssystem utstyrt med et kull filter inneholder canister sett.
  5. Tape leddene forsiktig for innebygde electrocardiographic elektrodene etter elektrodegel å oppnå konstant overvåking av mors hjerte- og respirasjonssykdommer priser.
  6. Justere nivået på isoflurane å opprettholde en gjennomsnittlig hjertefrekvens (450 + /-50 slag/minutt (bpm)).
  7. Opprettholde kroppstemperatur innen en rekke 37.0 ° C +/-0,5 ° C. Overvåke kroppstemperatur og hjertefrekvens vises på fysiologi kontrolleren enheten.
  8. Dokumentere vitale bedøvet museklikk hvert 15 min hele tenkelig prosedyren.
  9. Vurdere anestesi ved å evaluere musen er holdning, hjertefrekvens, og respons på tå pinches.
  10. Bruke ophthalmica balsam (1 dråpe i hvert øye) for å hindre øye tørrhet og hornhinnen skade.
  11. Fjern pels fra midten av brystet nivå til beinlidelser ved hjelp av en depilatory fløte for å minimere ultralyd demping. Fjerne krem 1-1,5 min etter program av vekslende våte og tørre gasbind tørker for å hindre skade huden.

3. embryo identifikasjon

  1. Palpate bukveggen forsiktig for å finne fostre og spre dem ut.
  2. Kommentere hver embryo på demningen magen og definere deres anterior-posterior og dorsal ventrale orientering ved hjelp av en markør.
  3. Bruk livmorhalsen bedøvet dammen som et landemerke. Etiketten fostre på venstre og høyre livmor hornene som L1, L2, L 3, etc. (venstre side) og R1, R2 R3, etc. (høyre side), henholdsvis (figur 1A).
    FORSIKTIG: Unngå spredning av fostre kraftig. 1-2 fostre hver kull overlappe med andre, gjør deres plassering og tenkelig upålitelige. Ekskluder disse fostre fra analysen.

4. fosterets hjerte visualisering og merknader

  1. Gjelder forvarmes ultralyd gel på magen og spre den forsiktig å unngå boble dannes. Legge til ekstra mengde gel på området skanning bildebehandling.
  2. Plasser den ultralyd proben på mekanisk eieren og mobilisere det gradvis mot huden kontakt med tykk gel laget mens leter etter det bankende hjertet med skanning B-modus (figur 1).
  3. Klikk skanning B-modus for å få 2D-bilder. Bruk blæren som et landemerke identifisere første fosteret i høyre eller venstre livmor Hornet og merke den som R1 eller L1, henholdsvis.
  4. Bekreft høyre og venstre retningen av personlige fosteret i sanntid ved å flytte tenkelig plattformen vannrett. Skann fra hode til hale å kommentere snute, lemmer og ryggraden som landemerker (figur 1B, Video 1).
  5. Visualiser det bankende hjertet og kommentere venstre ventrikkel (LV) og høyre ventrikkel (RV). Bruk farge Doppler måte å optimalisere hjertet effekten (figur 1 C-G, videoer 1 - 2).
  6. Klikk skanning B-modus for å få en parasternal kort akse-visning, har LV og RV vises i deres maksimale diameter på midten av data oppkjøpet ramme. Start live bildebehandling (figur 1B-C).
  7. Endre retningen på musen når det gjelder skanning fly for å få en langsgående fire-kammer visning (figur 1 d). Først identifisere gjenværende strukturer av hjertet som atria, interventricular septum og venstre og høyre ut traktater. Deretter har ventrikkel og atrial kamrene vises i deres maksimale diameter. Deretter start bildeopptak.
  8. Ekskludere ikke-optimal, skrå bildene fra den endelige analysen. Klikk Cini for å oppnå kontinuerlig opptak 'Cineloops' for minst 10 s, deretter lagre de innspilte bildene.

5. evaluering fosterets hjertefrekvens og ventrikkel funksjon

  1. Klikk skanning M-modus for å få hjerte bilder fra fire kammer fly (Video 3).
  2. Vis listen over opptak analyse når bilder av alle embryoene er fullført.
  3. Ekskludere ikke-optimal, skrå bildene fra den endelige analysen.
  4. Klikk analyser for å måle veggtykkelse og venstre/høyre ventrikkel interne diameter på diastolen (LVID, d; RVID, d) og Systolen (LVID, s; RVID, s), som vist i figur 2.
  5. Bestemme den gjennomsnittlige fosterets hjertefrekvensen ved å spille hver registrert M-modus sporing og beregning måling av en strøm syklus til følgende flyt syklus (avstanden mellom tilstøtende topper).
  6. Utføre flere målinger (minst 5 per sporing) for å få den gjennomsnittlige hjertefrekvensen (figur 2).
  7. Måle den timelige endringer mellom venstre ventrikkel interne diastolisk diameter (LVID, d) og venstre ventrikkel interne diameter på slutten Systolen (LVID, s) gjennom hele hjerte syklusen. Deretter beregner Brøkdelen forkorte prosent (FS %) som følger: FS % = [(LVID,d-LVID,s)/LVID, d] x100.
  8. Utføre flere målinger (minst 5 per sporing) for å få FS % gjennomsnittsverdiene.

6. vurdere hjerte flytparametrene

  1. Justere sektoren i en vinkel på oppkjøp mindre enn 60o. Klikk Doppler for å utføre pulserende bølge Doppler målinger fra 2D-fire kammer-imaging flyet ved hjelp av en 45-MHz svinger.
    1. Først visualisere bifurkasjonen av lungearterien å identifisere det rette ut spor. Deretter Klikk pulserende bølge Doppler for å få strømningsmønsteret gjennom den lunge og aorta ventilene (figur 3A, Video 4).
  2. Få lunge flyt mål fra pulserende bølge Doppler sporing, inkludert topp systolisk hastighet (PkV), akselerasjonen (AT) og utstøting time (ET).
  3. Utføre flere målinger (minst 5 per sporing) for å få gjennomsnittlige målinger som vist i figur 3A (høyre).
  4. Beregne AT / ET forhold for hver utløp ventil som en indikator på utstrømming traktater patency og blodstrøm.
  5. Fortsette å få mitral og aorta flyt mønstre fra 2D-apikale fire kammer visninger ved hjelp av den pulserende wave Doppler. Først identifisere venstre atrial og venstre ventrikkel kamrene. Deretter plasser pulserende bølge Doppler eksempel volumet for opptak av mitral tilsig Doppler mønstre og måle tidlig diastolisk hastighet (E) og atrial kontraksjon hastighet (A) (figur 3B)24,25.
  6. Justere Doppler eksempel volum for å få aorta Doppler jet mønsteret. Bruke aorta Doppler jet sporing for å måle akselerasjon (AT) og utstøting tid (ET) som vist i figur 3B (høyre) (Video 5)

7. vurdere Feto-Placental aksen

  1. Bruk Doppler fargeskanning for å visualisere livmor arterien og feto-placental vaskulær treet ved hjelp av 45 MHz svingeren (figur 4A).
  2. Identifisere umbilical fartøyene (to arterier og en vene) i intra-amniotic segmentet av navlestrengen, like etter ledningen avslutter fosterets magen.
  3. Sted pulserende bølge Doppler eksempel volum å få umbilical arterien strømningsmønsteret (figur 4A).
  4. Måle vaskulær peak flytparametrene inkludert akselerasjon (AT), utstøting tid (ET), og topp flyten hastighet på slutten Systolen (PkV, s) ved hjelp av den pulserende wave Doppler skanning post (figur 4B).
  5. Få 5 påfølgende bølgeformer i hver fartøy, i fravær av fetal bevegelser og mors åndedretts bevegelser, måle gjennomsnittlige høyeste hastigheten for hver fartøy.
  6. Fortsett til neste fosteret.

8. etter bildebehandling dyr overvåking

  1. Slå av isoflurane beholderen etter at avbildingsprosessen.
  2. Fortsette overvåking kroppstemperatur og respirasjonsfrekvens hjertefrekvens i restitusjonsfasen.
  3. Fjern på ansiktsmaske og tilkoblede rørsystem når demningen starter spontan bevegelser.
  4. Hjem dammen til passende bolig fortsette observasjon ifølge standardprotokoller institusjonelle stolpe-fremgangsmåte.
  5. Dokument tid til å fullt gjenopptakelse av normal aktivitet.

9. krav og tekniske betraktninger

  1. Begrense behandlingstiden ~ 8 fostre til ca 1 h å unngå de negative effektene langvarig bedøvelse vitale og fysiologiske parametere.
  2. Komplett trening med 8-10 gravid mus å optimalisere teknikker for bilde oppkjøpet og flyt mønstre sporing i kort tid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Statistiske analyser av cardiac og hemodynamic indekser ble utført frakoblet. Av 5 påfølgende mål i 3 optimale bilder ble beregnet. Dataene ble uttrykt som betyr ± SEM. Student t-test ble brukt til å overvåke mellom grupper sammenligninger. P verdien ≤0.05 ble ansett som statistisk signifikant.

Etter over protokollen preget vi virkningen av kronisk eksponering for prenatal hypoksi kardiovaskulær status fosterets mus på slutten svangerskapet ved å skaffe sanntid høyfrekvent ultralyd innspillinger på C57/BL6 tid gravid musene på svangerskapsdiabetes dag (GD) 18,5.

Etter etableringen av avl grupper, ble vellykket parring bekreftet. Tidsbestemt gravid demninger ble opprettholdt i bur under en 12t lys-mørk regime med mat og vann annonse libitum til. På GD14.5, ble gravid mus heller tildelt gruppen normoxia (vedlikeholdes i luften) eller gruppen hypoksi (plassert i hypoksi kammer på 10% FiO2 å indusere systemisk hypoksi). Etter fødselen forble demninger og deres pups fordeles eksperimentelle tilstanden til postnatal dag 7 (P7).

I totalt, 6 demninger ble studert i disse eksperimentene og 42 fostre var vellykket fotografert på GD18.5. Av disse ble data fra 36 fostre brukt for påfølgende analyse (tabell 1). Analyse av fosterets hjerte priser på GD18.5 viste at hypoxic fostre led av fetal bradykardi (lavere hjerte priser) og opplevde betydelig nedgang i fosterets hjertefunksjon indekser (EF % og FS %) (Tabell 1). Bemerkelsesverdig, peak flow hastigheter (PkVs) av umbilical arterien PkVs ble redusert i hypoksi-eksponerte fostre (figur 4B og tabell 1). Videre umbilical arterien akselerasjon tid/utstøting tid (på / ET) prosenter avslørt betydelig lavere verdier i den hypoxic sammenlignet normoxic fostre, tyder på økt umbilical vaskulær flyt motstand. I avtalen, økt høyre ventrikkel veggtykkelse i hypoksi-eksponerte fostre målt på 2-D/M-modus bilder (figur 5). Siden RV forutsetter dominerende pumpe funksjonen under fosterets utvikling, mens morkaken fungerer som den primære vaskulær sengen for oksygenering, tyder disse data samlet opphøyet flyt motstand i feto-placental vaskulær krets fører til RV hypertrofi. Viktigere, møtte hypoksi utsatt nyfødte tidlig postnatal dødelighet. RV svikt og økt vascular motstand av kronisk eksponering for prenatal hypoksi bidrar potensielt årsaken. Andre faktorer, som redoks toksisitet skyldes re oksygenering skade, dårlig fôring og mors sykdom, kan ikke utelukkes. Likevel, den eksakte underliggende mekanismen for prenatal hypoksi indusert cardiac patogenesen og tidlig lethality av fostre fortsatt skal bestemmes i fremtidige studier.

Figure 1
Figur 1: Fosterets mus Merknad og hjertet visualisering in Utero bruker skanning B-modus og farge Doppler avhør. (A) skjematisk fremstilling av fetal mus identifikasjon og merknader (L: igjen, R: høyre). (B) representativt bilde av anatomiske landemerkene i et foster å styre retningen for svangerskapsdiabetes dag 18,5 fosterets hjerte fra visningen parasternal kort aksen av venstre ventrikkel (LV), høyre ventrikkel (RV) og interventricular septum (IVS). (C) representativt bilde av parasternal kort aksen syn på LV og RV med farge avhør å lette hjertet kammer visualisering. (D) langsgående fire-kammer Vis LV og RV, atria (LA) og høyre atria (RA) farge Doppler. (E) langsgående fire-kammer utsikt over LV og RV, med farge Doppler avhør å lette visualisering av utløp traktater: høyre ventrikkel utløp skrift (RVOT), venstre ventrikkel utløp skrift (LVOT), aorta (AO) og høyre ventrikkel utløp skrift (RVOT). (F) representant farge Doppler avhør av RVOT og PA. (G) representant farge Doppler avhør av LVOT og AO. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: vurdering av fosterets hjertefrekvens og ventrikkel funksjonen. (A) representant M-modus sporing innhentet fra visningen lange akse 4-kammer på GD 18,5. (LV: venstre ventrikkel; RV: Høyre ventrikkel; LA: Venstre Atrium. RA: rett Atrium). (B) representant kvantifisering (arrowed linjer) metode for ventrikkel dimensjoner inkludert venstre og høyre ventrikkel interne diameter på diastolen (LVID, d; RVID, d) og Systolen (LVID, s; RVID, s), venstre og høyre ventrikkel veggtykkelse på diastolen (LVAW, d; RVW, d), Interventricular septum (IVS), og slag til slag måling av HR vises fra fire kammer imaging flyet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: pulserende Wave Doppler sporing av Fetal lunge, aorta og Mitral flyt indekser. (A) representativt bilde av lungearterien pulserende bølge Doppler sporing (venstre). Kvantifisering metoder (linjer) av lunge flyt indekser PkV (peak hastighet), (akselerasjon gang), ET (utstøting tid) er vist (høyre) fra visningen langsgående fire-kammer. (B) representativt bilde av mitral og aorta pulserende Doppler strømningsmønsteret (venstre) og kvantifisering av mitral ventil flyt indekser E (tidlig diastolisk hastighet), en (atrial kontraksjon) og aorta flyt indekser på, ET, og PkV (høyre) vises fra den fire-kammer tenkelig flyet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: vurdering av Feto-placental sirkulasjon. (A) Representant bilde av feto-placental vaskulær kretser ved Doppler avhør (øvre) og mors ECG poster (nedre). (B) Representativt bilde av pulserende bølge Doppler opptak og kvantifisering målinger (linjer) av umbilical arterien flyt indekser i hypoksi (øverst) og normoxia kontroll utsatt fosterets mus (nedre). PkV (peak hastighet), (akselerasjon gang), ET (utstøting tid). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: vurdering av høyre ventrikkel veggtykkelse i hypoksi behandlet fosterets mus. (A, B) Representant M-modus sporing Hentet fra den lange aksen fire-kammer visningen på GD 18,5 i normoxia og hypoksi. LV: venstre ventrikkel, RV: høyre ventrikkel, høyre ventrikkel vegg. Linjene indikerer kvantitativ måling av RVW tykkelse i (s) systolen og diastolen (d). (C) RVW s kvantifisering viser økt RVW tykkelsen i hypoksi-behandlet fosterets mus sammenlignet med normoxia. Feilfelt: Standard feil betyr. (D) representant cross-sectional bilder av fetal hjerter på GD 18,5 viser økt RV veggtykkelse i hypoksi behandlet og normoxia behandlet grupper. Opprinnelige visningsstørrelsen 10 X. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Parameteren, enhet Normoxia Prenatal hypoksi
Antall ble fotografert fostre 20 16
Postnatal dødelighet 5% 68.75%
Hemodynamic Parameter (Gjennomsnittlig ± SEM) (Gjennomsnittlig ± SEM)
Fosterets hjertefrekvens, bpm 138 ± 4 89 ± 8 ***
Venstre ventrikkel EF % 71,2 ± 3 55 ± 2 **
Venstre ventrikkel FS % 43 ± 2 29 ± 4 **
Lungearterien PkV, mm/s 102 ± 10 129 ± 8 **
Lungearterien på ET forhold 0.42 ± 0,05 0,35 ± 0.03*
Umbilical arterien PkV, mm/s 58 ± 4 40 ± 1.5* **
Umbilical arterien på ET forhold 0,5 ± 0,03 0.42 ± 0.025*
Umbilical blodåre PkV, mm/s 13 ± 1.2 19,6 ± 3 **
Umbilical arteriell-venøs forsinkelse, ms 122 ± 4 238 ± 20 *
EF, utstøting brøkdel; FS, fractional forkorte; NA, ikke tilgjengelig; NS, ikke signifikant; PkV, topp hastighet; PkV, d, topp hastighet under diastolen; PkV, s, topp hastighet under Systolen; Student t-test ble brukt for å utlede mellom grupper forskjeller. P < 0.005. ** P < 0,01. * P < 0,05 representerer en betydelig forskjell på tvers av grupper sammenligninger. student t-test. Non-betydning var tomt.

Tabell 1: Hemodynamic parametere normoxic og hypoxic fosterets mus på svangerskapsdiabetes dag 18,5. EF, utstøting brøkdel; FS, fractional forkorte; PkV, topp hastighet; AT, akselerasjon tid; ET, utstøting tid. Student t -test ble brukt for å utlede mellom grupper forskjeller. *** P < 0.005. P < 0,01, og * P < 0,05 representerer en betydelig forskjell på tvers av grupper sammenligning.

Video 1
Video 1: B-modus kort aksen visning. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Video 2
Video 2: farge Doppler-apikale langsgående visning. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Video 3
Video 3: M-modus. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Video 4
Video 4: lungearterien-pulserende bølge Doppler. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hjerte misdannelser og sykdommer er betydelig påvirket av genetiske faktorer og miljømessige elementer19. Vi har tidligere vist en betydelig innvirkning på mors kalori begrensning, startet i andre trimester, på feto-placental sirkulasjons flyt og fosterets hjertefunksjon9.

Prenatal hypoksi er en annen vanlig stressfaktor i fosterets utvikling som enormt påvirker feto-placental fysiologi og sirkulasjonssystemet. Virkningen av prenatal hypoksi eksponering kan være dypere i sammenheng med en CHD fører til dårlig perinatal tilpasning til postnatal liv. Unormal hjerte priser og cardiac indekser i denne studien er faktisk viktige indikatorer for cardiac stress og endret placental sirkulasjons fysiologi, og dermed utgjør vesentlige primære elementer for å oppdage utviklingsmessige defekter og påfølgende hemodynamic endringer som kan bli ytterligere uttalt svar på prenatal hypoxic stress ledende til tidlig hjertesvikt. I motsetning til forventninger hadde hypoksi utsatt fostre lavere hjerte priser. Dette fenomenet kan gjenspeile umodne cardiac autoregulation mekanismer i fosterets mus svar hypoksi på GD18.5. Men er nøyaktig patogenesen ukjent.

Selv om andre avanserte imaging metoder, som for eksempel fosterets hjerte Mr, tillater live bildebehandling av cardiac strukturer under utvikling20, er ofte hemodynamic statusen tapt på grunn av stillbilder og lange prosedyrer. Noninvasive ultralydteknologi, derimot, kan utføre i vivo dynamisk bildebehandling som opprettholder planlagte fysiologi. Videre med tilgjengeligheten av høyfrekvente transdusere med forbedret oppløsning, kan effekten av fosterets hjerte på ulike utviklingsmessige stadier av hver individuelle fosteret bli mer gjennomførbart i transgene mus ved å optimalisere fosterets merknad metoder. Endelig er kostnaden per eksperimentet langt mindre benytter denne metoden.

I en tidligere rapport fra Kim GH et al.gitt forfatterne viktig og romanen innsikt om tenkelig plan optimalisering for datainnsamling ved hjelp av en tidligere generasjon av høyfrekvente ultralyd imaging system21. En annen rapport av Zhou YQ et al., har etablert standardisert planlagte målinger av fosterets sirkulasjon på fysiologisk nivå ved hjelp av en høyfrekvent ultralyd utstyrt med farge Doppler systemet22. Derfor protokollen presenteres her utfyller tidligere etablerte protokoller og utvides til å skissere en omfattende metode som er mulig og praktisk i sanntid i eksperimentell omgivelser. En avansert og svært følsom høyfrekvent ultralyd systemet ble brukt i denne studien skanne feto-placental krets som en enhet. Skissert protokollen er enkel og standardiserte å ansette dette kraftige systemet effektivt som demonstrert ved å oppnå målbare målinger av hypoksi innvirkning på fosterets sirkulasjon i mus på GD18.5.

Likevel, vi bør erkjenne viktige begrensninger og utfordringer av dødelig cardiac imaging: første, bedøvende agenter, inkludert isoflurane, kan påvirke fysiologiske parametere til fosteret. Langvarig anestesi, håravfall og ultralyd gel kan føre til nedkjøling, som kan påvirke hjertefrekvensen og hemodynamic indekser demningen samt fostre. I dag finnes det ingen tilgjengelig metode å evaluere bedøvende agenter og deres konsekvenser for fosteret. For å omgå denne begrensningen, sjarmere vi inhalert Isoflurane nivåer nøye for å oppnå riktig sedasjon av demninger, samtidig som deres basale hjertefrekvens og vitale. Andre er visualisere fostre som ligger dypt i magen vanskelig og suboptimal, fører til at disse fostre fra siste dataanalyse. Fargen Doppler kan bedre optimalisering av tenkelig seksjoner og tilstrekkelig justering mellom svinger og blodstrøm. Tredje krever samtidige analyse av alle fostre operatørens effektivitet i rask og nøyaktig visualisering og bilde oppkjøpet, antyde betydningen av praktisk opplæring.

Til slutt, sentrale trinn i denne metoden må vektlegges inkludert 1) riktige forberedelser av systemet. 2) opprettholde en stabil kroppstemperatur og hjertefrekvens gravid musen. 3) optimalisere flow rate av isoflurane å opprettholde planlagte fysiologiske tilstander av embryo å få pålitelige data. 4) konsekvent og effektiv bildeopptak i kortest mulig tid. 5) gestasjonsalder, sex og dyr stamme er viktige variabler som kan påvirke resultatene. Derfor bør eksperimentelle protokollen utformes forsiktig å ta hensyn til disse variablene ved å inkludere matchede kontroller fra den samme dyr stammen i dataanalyse og tolkning.

Som konklusjon, er en høyfrekvent ultralyd systemet en effektiv metode for å oppnå fenotypiske karakteristikk av fosterets hjerte systemer i utero med viktig eksperimentelle og vitenskapelig verdi og potensielle fremtidige programmer som kan inkluderer 1) forstå fysiologiske dynamikken under hjerte utvikling. 2) å oppnå omfattende fenotypiske analyse av genetisk modeller CHDs. 3) Klargjørende innvirkning feto-placental sirkulasjon cardiac kammer utvikling, modning og tilpasning til stress. 4) utfører ultralyd guidet fosterets injeksjon for å studere giftstoffer, teratogens eller terapeutisk agenter i fremtiden. 6) gjennomføre speckle sporing og belastning analyse evner å få detaljerte regionale hjerteinfarkt funksjon av myokard utvikling kan gi grunnlag for framtidige studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Noen interessekonflikt erklært.

Acknowledgments

Vi takker dyr fysiologi kjernen, divisjon i molekylær medisin ved UCLA for å gi teknisk støtte og åpen tilgang til Vevo 2100 ultralyd biomicroscopy (GIA) systemet. Denne studien ble støttet av NIH/barn Health Research Center (5K12HD034610/K12), UCLA-Children's Discovery Institute og i dag og i morgen Children's Fund, og David Geffen skolen av medisin forskning Innovation award til M. Touma.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vevo 2100 VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada N/A High Freequency Ultrasound Biomicroscopy. The set up is available in animal physiology core facility, division of molecular medicine, UCLA. USA
inbred mice (c57/BL6) Charles River Laboratories N/A Inbread wild type mouse strain

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Touma, M., Reemtsen, B., Halnon, N., Alejos, J., Finn, J. P., Nelson, S. F., Wang, Y. A Path to Implement Precision Child Health Cardiovascular Medicine. Front Cardiovasc Med. 4, 36 (2017).
  2. Triedman, J. K., Newburger, J. W. Trends in Congenital Heart Disease. The Next Decade. Circulation. 133, 2716-2733 (2016).
  3. Gilboa, S. M., et al. Congenital Heart Defects in the United States Estimating the Magnitude of the Affected Population in 2010. Circulation. 134, 101-109 (2016).
  4. Pruetz, J. D., et al. Outcomes of critical congenital heart disease requiring emergent neonatal cardiac intervention. Prenat Diagn. 34, 1127-1132 (2014).
  5. Peterson, C., et al. Mortality among Infants with Critical Congenital Heart Disease: How Important Is Timely Detection? Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 97, (10), 664-672 (2013).
  6. Atz, A. M., et al. Prenatal Diagnosis and Risk Factors for Preoperative Death in Neonates with Single Right Ventricle and Systemic Outflow Obstruction: Screening Data from the Pediatric Heart Network Single Ventricle Reconstruction Trial. J Thorac Cardiovasc Surg. 140, (6), For the Pediatric Heart Network Investigators 1245-1250 (2010).
  7. Lalani, S. R., Belmont, J. W. Genetic Basis of Congenital Cardiovascular Malformations. Eur J Med Genet. 57, (8), 402-413 (2014).
  8. Hanchard, N. A., Swaminathan, S., Bucasas, K., Furthner, D., Fernbach, S., Azamian, M. S., et al. A genome-wide association study of congenital cardiovascular left-sided lesions shows association with a locus on chromosome 20. Hum Mol. 11, 2331-2341 (2016).
  9. Arsenijevic, V., Davis-Dusenbery, B. N. Reproducible, Scalable Fusion Gene Detection from RNA-Seq. Methods Mol Biol. 1381, 223-237 (2016).
  10. LaHaye, S., Corsmeier, D., Basu, M., Bowman, J. L., Fitzgerald-Butt, S., Zender, G., et al. Utilization of Whole Exome Sequencing to Identify Causative Mutations in Familial Congenital Heart Disease. Circ Cardiovasc Genet. 9, (4), 320-329 (2016).
  11. Zaidi, S., Choi, M., Wakimoto, H., Ma, L., Jiang, J., Overton, J. D., et al. De novo mutations in histone modifying genes in congenital heart disease. Nature. 498, (7453), 220-223 (2016).
  12. Leirgul, E., Brodwall, K., Greve, G., Vollset, S. E., Holmstrom, H., Tell, G. S., et al. Maternal Diabetes, Birth Weight, and Neonatal Risk of Congenital Heart Defects in Norway, 1994-2009. Obstet Gynecol. 128, (5), 1116-1125 (2016).
  13. Garry, D. J., Olson, E. N. A Common Progenitor at the Heart of Development. Cell. 127, (6), 1101-1104 (2006).
  14. Postma, A. V., Bezzina, C. R., Christoffels, V. M. Genetics of congenital heart disease: the contribution of the noncoding regulatory genome. J Hum Genet. 61, 13-19 (2016).
  15. Ganguly, A., Touma, M., Thamotharan, S., De Vivo, D. C., Devaskar, S. U. Maternal Calorie Restriction Causing Uteroplacental Insufficiency Differentially Affects Mammalian Placental Glucose and Leucine Transport Molecular Mechanisms. Endocrinology. Oct. 157, (10), 4041-4054 (2016).
  16. Lluri, G., Huang, V., Touma, M., Liu, X., Harmon, A. W., Nakano, A. Hematopoietic progenitors are required for proper development of coronary vasculature. J Mol Cell Cardiol. 86, 199-207 (2015).
  17. Bishop, K. C., Kuller, J. A., Boyd, B. K., Rhee, E. H., Miller, S., Barker, P. Ultrasound Examination of the Fetal Heart. Obstet Gynecol Surv. 72, (1), 54-61 (2017).
  18. He, H., Gan, J., Qi, H. Assessing extensive cardiac echography examination for detecting foetal congenital heart defects during early and late gestation: a systematic review and meta-analysis. Acta Cardiol. 71, (6), 699-708 (2016).
  19. Hobbs, C. A., Cleves, M. A., Karim, M. A., Zhao, W., MacLeod, S. L. Maternal Folate-Related Gene Environment Interactions and Congenital Heart Defects. Obstet Gynecol. 116, (2 Pt 1), 316-322 (2016).
  20. Gabbay-Benziv, R., et al. A step-wise approach for analysis of the mouse embryonic heart using 17.6 Tesla MRI. Magn Reson Imaging. 35, 46-53 (2017).
  21. Kim, G. H. Murine fetal echocardiography. J Vis Exp. (72), e4416 (2013).
  22. Zhou, Y. Q., Cahill, L. S., Wong, M. D., Seed, M., Macgowan, C. K., Sled, J. G. Assessment of flow distribution in the mouse fetal circulation at late gestation by high-frequency Doppler ultrasound. Physiol Genomics. 46, (16), 602-614 (2014).
  23. Greco, A., Coda, A. R., Albanese, S., Ragucci, M., Liuzzi, R., Auletta, L., Gargiulo, S., Lamagna, F., Salvatore, M., Mancini, M. High-Frequency Ultrasound for the Study of Early Mouse Embryonic Cardiovascular System. Reprod Sci. 22, (12), 1649-1655 (2015).
  24. Deneke, T., Lawo, T., von Dryander, S., Grewe, P. H., Germing, A., Gorr, E., Hubben, P., Mugge, A., Shin, D. I., Lemke, B. Non-invasive determination of the optimized atrioventricular delay in patients with implanted biventricular pacing devices. Indian Pacing Electrophysiol J. 10, (2), 73-85 (2010).
  25. Kono, M., Kisanuki, A., Ueya, N., Kubota, K., Kuwahara, E., Takasaki, K., Yuasa, T., Mizukami, N., Miyata, M., Tei, C. Left ventricular global systolic dysfunction has a significant role in the development of diastolic heart failure in patients with systemic hypertension. Hypertens Res. 33, (11), 1167-1173 (2010).
Fosterets musen hjerte Imaging bruker høyfrekvente ultralyd (30 / 45MHZ) System
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Touma, M. Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System. J. Vis. Exp. (135), e57210, doi:10.3791/57210 (2018).More

Touma, M. Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System. J. Vis. Exp. (135), e57210, doi:10.3791/57210 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter