Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Proyección de imagen usando un sistema del ultrasonido de alta frecuencia (30 / 45MHZ) Cardiovascular fetal ratón

doi: 10.3791/57210 Published: May 5, 2018

Summary

Proyección de imagen de ultrasonido de alta frecuencia del ratón fetal ha mejorado la resolución de imagen y puede proporcionar la precisa caracterización no invasiva de desarrollo cardíaco y defectos estructurales. El protocolo descrito en este documento está diseñado para realizar la ecocardiografía ratones fetales en tiempo real en vivo.

Abstract

Defectos congénitos del corazón (CHDs) son la causa más común de morbilidad de la niñez y la mortalidad temprana. Detección prenatal de los mecanismos moleculares subyacentes de CHDs es crucial para inventar nuevas estrategias preventivas y terapéuticas. Modelos de ratón mutante son poderosas herramientas para descubrir nuevos mecanismos y modificadores de tensión ambiental que impulsan el desarrollo cardíaco y su posible alteración en el CHDs. Sin embargo, esfuerzos para establecer la causalidad de estos supuestos colaboradores han sido limitado a estudios histológicos y moleculares en experimentos con animales no supervivencia, en la que la vigilancia de los parámetros hemodinámicos y fisiológicos clave es a menudo ausente. En tecnología de imagen se ha convertido en una herramienta esencial para establecer la etiología del CHDs. En particular, la proyección de imagen de ultrasonido se puede utilizar prenatally sin exponer quirúrgicamente a los fetos, lo que permite mantener su fisiología de línea de base y monitoreo del impacto del estrés ambiental en los aspectos hemodinámicos y estructurales de la cámara cardiaca desarrollo. Aquí, utilizamos el sistema de ultrasonido de alta frecuencia (30/45) para examinar el sistema cardiovascular en ratones fetales en E18.5 en el útero en la línea de base y en respuesta a la hipoxia prenatal exposición. Demostrar la viabilidad del sistema para medir el tamaño de la cámara cardiaca, morfología, función ventricular, la frecuencia cardíaca fetal e índices de flujo de arteria umbilical y sus alteraciones en ratones fetales expuestos a hipoxia crónica sistémica en el útero en real tiempo.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Malformaciones congénitas del corazón son los defectos estructurales heterogéneos que se producen durante el desarrollo cardiaco temprano. Avances técnicos de los procedimientos operativos han llevado a mejoras significativas en las tasas de supervivencia de los recién nacidos con el CHDs1,2. Sin embargo, calidad de vida es a menudo comprometido secundario a la hospitalización prolongada y las necesidades de reparación quirúrgica procedimientos1,2,3,4,5en escena. Detección prenatal de los mecanismos moleculares subyacentes de CHDs es crucial para planificar intervenciones tempranas, para llevar a cabo nuevas estrategias de prevención y para mejorar los resultados de toda la vida6,7.

Aunque múltiples factores genéticos y ambientales han sido implicados en la patogenesia del CHDs, establecer la causalidad sigue siendo una necesidad para mejorar el diagnóstico, terapéutica y estrategias preventivas1,8,9 ,10,11,12. Por otra parte, examinar el papel de factores de estrés en el útero y modificadores epigenéticos abre nuevos espacios para futuras investigaciones11,12. La última década ha sido testigo de hecho de rápidos avances en secuencia de la tecnología de última generación incluyendo un solo nucleótido polimorfismo (SNP) microarrays, secuenciación del exoma completo y estudios de metilación del genoma, su utilización en el estudio de la genética causas de enfermedades humanas complejas, incluyendo CHDs1,8,9,10,11 allanando el camino para identificar mutaciones y variantes genéticas que aún no han sido la prueba de su patogenicidad en modelos animales adecuados.

Entre los sistemas del modelo de enfermedad diferentes, el ratón es el modelo animal de la opción, no sólo para investigar mecanismos de CHDs durante cardiogenesis precoz13,14,15,16, sino también para aclarar su impacto en la maduración de la cámara cardíaca y función en la gestación tardía en factores de estrés prenatal y perinatal. Por lo tanto, realizar en vivo caracterización fenotípica de un corazón de ratón mutante fetal, durante etapas tempranas y tardías del desarrollo, es fundamental entender el papel de estas variaciones genéticas y factores ambientales en el desarrollo cardiaco, y el futuro impacto potencial en los procesos de maduración específica de cámara en ratones.

La detección temprana y diagnóstico preciso de defectos cardiacos durante el desarrollo es fundamental para intervención planificación17,18. Ser seguro, simple, portable y repetible, sonografía fetal se ha convertido de hecho en la norma técnica para la evaluación cardiaca en la clínica de la proyección de imagen. Evaluación de la circulación fetal mediante ecografía Doppler ha sido ampliamente utilizado en la práctica clínica no sólo para la detección de defectos cardiacos, sino también para detectar anormalidades vasculares, insuficiencia placentaria y restricción del crecimiento intrauterino y para evaluar el bienestar fetal en respuesta a en el útero insultos incluyendo hipoxemia, enfermedad materna y drogas toxicidad17,18. En paralelo a su valor en la evaluación de enfermedades y defectos humanos, evaluación de ultrasonido de ratones fetales ha ganado cada vez mayor utilidad en la configuración experimental19,20,21,22, 23. En particular, el ultrasonido fetal del corazón (ecocardiografía) permite visualización secuencial en vivo del corazón en desarrollo. Muchos estudios experimentales han utilizado la tecnología de imágenes por ultrasonido para observar el desarrollo cardiovascular fetal en ratones transgénicos fetales. Ecografía Doppler ha sido particularmente útil para aclarar los parámetros fisiopatológicos, tales como los patrones de flujo en la circulación fetal en problemas fisiológicos o enfermedad condiciones10,19. En los seres humanos y animales, anormal flujo o el oxígeno sanguíneo en el feto puede resultar de diversas afecciones que pueden perturbar entorno fetal en el útero y afectar el eje fetoplacentarias, incluyendo anormalidades placentarias, hipoxia materna, diabetes gestacional y constricción vascular farmacéuticamente inducida15,22. Por lo tanto, establecer métodos estandarizados para realizar ultrasonidos Doppler en ratones fetales tremendamente empoderará a los estudios futuros de CHDs, facilitando patrones de flujo de control y principales índices hemodinámicos de los circuitos cardiovasculares durante diferentes etapas del desarrollo cardíaco en modelos de ratón genético.

Ultrasonido de alta frecuencia ha surgido como una poderosa herramienta para medir los parámetros fisiológicos y de desarrollo del sistema cardiovascular en modelos de ratón y enfermedades humanas18. Esta tecnología ha sido perfeccionada en los últimos años. Nosotros y otros investigadores hemos demostrado la viabilidad de este sistema para la realización de estudios de ultrasonido de alta frecuencia el ratón fetal corazón15,19,20,21,22 ,23. El sistema está equipado con transductores de matriz lineal que generan imágenes bidimensionales, dinámicas a velocidades de fotogramas de alta frecuencia (30 a 50 MHz) y mapeo de flujo Doppler color. Estas ventajas, en comparación con sistemas de ultrasonido de baja frecuencia y de la generación anterior de alta frecuencia ultrasonido21,22, proporcionan la sensibilidad necesaria y la resolución para la evaluación en profundidad de la fetal circulatorio sistema, incluyendo la caracterización completa de las estructuras del corazón, función de cámara e índices de flujo de ratones fetales en configuraciones experimentales. En este documento, describiremos los métodos para realizar una evaluación rápida de la circulación cardiopulmonar y circulación feto-placentaria en el día embrionario E18.5 en vivo mediante un sistema de alta frecuencia. Elegimos un transductor de 30/45 MHz que proporciona una resolución axial de aproximadamente 60 μm y una resolución lateral de 150 μm. Sin embargo, un transductor de frecuencia más alta (40/50 MHz) puede ser elegido para analizar etapas anteriores de desarrollo siguiendo una metodología similar. El seleccionado M-modo permite la visualización de los tejidos en movimiento en la niveles de alta resolución temporal (1.000 fotogramas/s). Finalmente, demostramos la factibilidad de ultrasonido de alta detallada caracterización fenotípica completa de estado hemodinámico cardiovascular fetal y función en ratones en condiciones basales y en respuesta a la hipoxia prenatal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

La Universidad de California, Los Ángeles, cuidado Animal y uso Comité ha aprobado todos los procedimientos se muestran en el presente Protocolo. Los experimentos se llevaron a cabo como parte de un estudio en curso bajo protocolos animal activados aprobado por la institucional Animal Care y uso Comité de la Universidad de California, Los Ángeles, California, Estados Unidos. Cuidado y manejo de animales siguieron las normas de la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio.

1. preparación de la alta frecuencia del ultrasonido sistema de imagen

  1. Encienda el sistema de proyección de imagen de ultrasonido y la unidad de vigilancia de Fisiología.
  2. Conectar el transductor de 30/45 MHz.
  3. Coloque el cabezal de exploración correspondiente a su titular cerca de la plataforma de proyección de imagen.
  4. Seleccione la opción Programa de medición cardíaca .
  5. Lugar el ultrasonido gel boca abajo en el envase previo calentamiento a 37 ° C.
  6. Sistema de tubería adecuada para la anestesia de confirmar y verificar los niveles de oxígeno y el isoflurane.
  7. Desinfecte la plataforma de proyección de imagen y el área de trabajo.
  8. Establecer el nivel de la plataforma de proyección de imagen para mantener la temperatura corporal constante y ritmo de las presas.

2. embarazadas ratón preparación

  1. Colocar la presa embarazada ratón (C57/BL6) en la cámara de inducción de la anestesia.
  2. Inducen anestesia utilizando continuamente entregado por inhalación isoflurano (isoflurano 2% - 3%) mezclado con oxígeno al 100% (100% O2) con un caudal de 200 mL/min en la cámara de inducción.
  3. Transferir el animal sedado en la plataforma de proyección de imagen en una posición supina.
  4. Proporcionan sedación estado estacionario mediante el uso de una mascarilla conectada a anestesia tubería sistema entrega isoflurano (1.0-1.5%) mezclado con 100% O2 a 200 mL/min.
    PRECAUCIÓN: Controlar la fuga de gas anestésico mediante un sistema de ventilación equipado con un filtro de carbón conteniendo frasco.
  5. Cinta los miembros suavemente a los electrodos electrocardiográficos incorporados después de la aplicación del gel del electrodo para lograr una supervisión constante de las tasas cardiacas y respiratorias materna.
  6. Ajustar el nivel de isoflurano para mantener un ritmo cardíaco medio de (450 +-50 latidos/minuto (bpm)).
  7. Mantener la temperatura del cuerpo dentro de un rango de 37,0 ° C +/-0.5 ° C. Controlar la temperatura corporal y ritmo cardíaco se muestra en la unidad de control de la fisiología.
  8. Documentar los signos vitales del ratón sedado cada 15 minutos durante todo el procedimiento por imágenes.
  9. Evaluar el nivel de la anestesia mediante la evaluación de postura, frecuencia cardíaca y respuesta a pellizcos del ratón.
  10. Aplicar bálsamo oftálmico (1 gota en cada ojo) para evitar la sequedad del ojo y daño corneal.
  11. Quitar la piel desde el nivel de medio pecho para las extremidades inferiores mediante una crema depilatoria para minimizar la atenuación del ultrasonido. Retire la crema 1-1.5 min después toallitas de uso alternando una gasa húmeda y seca para evitar daños en la piel.

3. embrión identificación

  1. Palpar la pared abdominal suavemente para localizar los fetos y extiéndalas.
  2. Anotar cada embrión en el abdomen de la presa y definir sus orientaciones antero-posterior y dorsal-ventral mediante un marcador.
  3. Utilice el cuello del útero de la presa sedada como un hito. Los fetos en los cuernos uterinos derecho e izquierdos de la etiqueta como L1, L2, L 3, etc. (lado izquierdo) y R1, R2, R3, etc. (lado derecho), respectivamente (figura 1A).
    PRECAUCIÓN: Evitar la propagación de los fetos con fuerza. 1-2 fetos en cada camada pueden superponerse con los otros, haciendo que su posicionamiento y proyección de imagen no fiable. Excluir estos fetos a partir del análisis.

4. fetal corazón visualización y anotación

  1. Aplicar ultrasonido con gel en el abdomen y pásalo con cuidado para evitar formación de burbujas. Añadir más cantidad de gel en el área de exploración de la proyección de imagen.
  2. Coloque la sonda de ultrasonido en su soporte mecánico y movilizar gradualmente hacia la piel en contacto con la capa de gel espeso mientras mira por el corazón mediante el análisis-modo B (figura 1).
  3. Haga clic en el botón exploración de modo B para obtener imágenes 2-D. Usar la vejiga como un punto de referencia para identificar el primer feto colocado en el derecho o el cuerno uterino izquierdo y marcarlo como R1 o L1, respectivamente.
  4. Confirman la orientación derecha e izquierda del feto individual en tiempo real mediante el movimiento de la plataforma de proyección de imagen en el plano horizontal. Exploración de la cabeza a la cola para anotar el hocico, las extremidades y la columna vertebral como puntos de referencia (figura 1B, vídeo 1).
  5. Visualizar el corazón y anotar el ventrículo izquierdo (LV) y el ventrículo derecho (VD). Modo Doppler color de uso para optimizar la visualización del corazón (figura 1 C-G, Videos 1 - 2).
  6. Haga clic en el botón exploración de modo B para obtener un eje corto paraesternal-vista, tienen las LV y RV en su diámetro máximo en el centro del marco de adquisición de datos. Iniciar la proyección de imagen viva (figura 1B-C).
  7. Cambiar la orientación del ratón con respecto a la digitalización de planos para obtener una vista de cuatro cámaras longitudinal (figura 1). En primer lugar, identificar las restantes estructuras del corazón como las aurículas, tabique interventricular y los tractos de salida derecho e izquierdo. Luego, haga que las cámaras ventriculares y atriales en su diámetro máximo. Luego iniciar la adquisición de la imagen.
  8. Excluir las imágenes no óptima, oblicuas del análisis final. Pulse el botón de Cini para obtener grabación continua 'Cineloops' para un mínimo de 10 s, entonces guardar las imágenes grabadas.

5. evaluación de la frecuencia cardíaca Fetal y función Ventricular

  1. Pulse el botón M-modo escaneo para obtener imágenes cardiacas de cuatro planos de la cámara (vídeo 3).
  2. Ver la lista de las grabaciones para el análisis una vez las imágenes de todos los embriones.
  3. Excluir las imágenes no óptima, oblicuas del análisis final.
  4. Haga clic en el botón de análisis para medir espesor de la pared y el diámetro interior izquierda ventricular en diástole (LVID, d; RVID, d) y sístole (LVID, s; RVID, s), como se muestra en la figura 2.
  5. Determinar la frecuencia cardíaca fetal promedio jugando cada uno registrado M-modo trazado y cálculo de la medición de flujo de un ciclo al siguiente flujo ciclo (el espaciamiento entre picos adyacentes).
  6. Realizar varias mediciones (por lo menos 5 por seguimiento) para obtener la frecuencia cardíaca promedio (figura 2).
  7. Medir los cambios temporales entre diámetro diastólico interno ventricular izquierdo (LVID, d) y diámetro interno ventricular izquierdo en sístole final (LVID, s) a través del ciclo cardiaco. Luego calcular el porcentaje de acortamiento fraccional (% FS) como sigue: % FS = [(LVID,d-LVID,s)/LVID, d] x100.
  8. Realizar varias mediciones (por lo menos 5 por seguimiento) para obtener los valores promedio de % de FS.

6. evaluación de parámetros de flujo cardiopulmonar

  1. Ajustar el sector en un ángulo de adquisiciónode menos de 60. Haga clic en el botón Doppler para realizar las mediciones Doppler de onda pulsada desde el plano de proyección de imagen de cámara cuatro de 2-D mediante un transductor de 45 MHz.
    1. En primer lugar, visualizar la bifurcación de la arteria pulmonar para identificar la zona derecha de la salida. A continuación, haga clic en botón de onda pulsada Doppler para obtener el patrón de flujo a través de la pulmonar y las válvulas aórticas (Figura 3A, Video 4).
  2. Obtener mediciones del flujo pulmonar de onda pulsada Doppler seguimiento, incluyendo velocidad sistólica pico (PkV), tiempo de aceleración (AT) y el tiempo de eyección (ET).
  3. Realizar varias mediciones (por lo menos 5 por seguimiento) para obtener las mediciones promedio como se muestra en la Figura 3A (derecha).
  4. Calcular el cociente de ET para cada válvula de salida como un indicador de la permeabilidad del tracto de salida y flujo de la sangre.
  5. Proceder para obtener los patrones de flujo mitral y aórtica de vistas 2D apical cuatro cámara usando la onda pulsada Doppler. En primer lugar, identificar las cámaras ventriculares izquierdas y aurículas izquierdas. A continuación, coloque el volumen de la muestra Doppler de onda pulsada para la grabación de patrones Doppler del flujo mitral y medición velocidad diastólica precoz (E) y velocidad de la contracción auricular (A) (figura 3B)24,25.
  6. Ajustar el volumen de la muestra Doppler para obtener el patrón de la jet Doppler aórtico. Utilizar el jet Doppler aórtico seguimiento para medir la aceleración (AT) y tiempo de eyección (ET) como se muestra en la figura 3B (derecha) (Video 5)

7. evaluar el eje Feto-placentaria

  1. Utilice el análisis Doppler color para visualizar el árbol vascular feto-placentaria y la arteria uterina utilizando el transductor de 45 MHz (Figura 4A).
  2. Identificar los vasos umbilicales (dos arterias y una vena) en el segmento intra amniótico del cordón umbilical, justo después de que el cable sale del abdomen fetal.
  3. Onda pulsada lugar volumen muestra del Doppler para obtener el patrón de flujo de la arteria umbilical (Figura 4A).
  4. Medir los parámetros de flujo pico vascular incluyendo tiempo de aceleración (AT), tiempo de eyección (ET), y pico de velocidad de flujo en sístole final (PkV, s) usando la onda pulsada registro exploración Doppler (Figura 4B).
  5. Obtener 5 ondas consecutivas en cada vaso, en la ausencia de movimientos fetales y los movimientos respiratorios maternos, para medir la velocidad máxima promedio para cada recipiente.
  6. Proceder al próximo embrión.

8. la proyección de imagen de Animal control

  1. Apague el contenedor de isoflurano tras la conclusión del proceso de proyección de imagen.
  2. Continuar la vigilancia de temperatura corporal, frecuencia respiratoria y frecuencia cardíaca durante la fase de recuperación.
  3. Retirar la mascarilla y el sistema de tubería conectado una vez que la presa comienza movimientos espontáneos.
  4. Volver a la presa a una vivienda adecuada y seguir observación según protocolos institucionales de después del procedimiento.
  5. El tiempo para la completa reanudación de la actividad normal del documento.

9. prescripciones y consideraciones técnicas

  1. Limitar el tiempo de procesamiento para fetos de 8 a aproximadamente 1 hora para evitar los efectos adversos de la anestesia prolongada de signos vitales y parámetros fisiológicos.
  2. Completar la formación con 8-10 ratones embarazadas para optimizar técnicas de patrones de adquisición y flujo de imagen, seguimiento en corto tiempo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Análisis estadístico de los índices cardíacos y hemodinámicos fueron realizados fuera de línea. Se calcularon los medios de 5 mediciones consecutivas en 3 imágenes óptimas. Los datos se expresaron como media ± SEM. estudiante t-prueba fue utilizada para inferir comparaciones intergrupos. Valor P ≤0. 05 se consideró estadísticamente significativo.

Siguiendo el protocolo anterior, nos caracteriza el impacto de la exposición crónica a hipoxia prenatal sobre el estado cardiovascular de ratones fetales en la gestación tardía mediante la obtención de grabaciones de ultrasonido en tiempo real de alta frecuencia en los ratones embarazadas C57/BL6 temporizado en día de gestación (GD) 18.5.

Después del establecimiento de grupos de cría, apareamiento exitoso fue confirmada. Presas embarazadas tiempo fueron mantenidos en jaulas bajo un régimen de luz-oscuridad de 12 h con comida y agua ad libitum hasta. En GD14.5, los ratones embarazados tampoco fueron asignados al grupo de normoxia (mantenido en el aire ambiente) o el grupo de hipoxia (colocados en cámara de hipoxia en el 10% FiO2 para inducir Hipoxia sistémica). Después del nacimiento, las presas y sus cachorros permanecieron asignados a su condición experimental hasta día postnatal 7 (P7).

En total, 6 presas fueron estudiadas en estos experimentos y 42 fetos fueron correctamente reflejadas en GD18.5. De estos, datos obtenidos de 36 fetos fueron utilizados para el análisis posterior (tabla 1). Análisis de las tasas de corazón fetales en GD18.5 demostró que fetos hipóxicos sufrieron de bradicardia fetal (tasas más bajas del corazón) y experimentaban una disminución significativa de los índices de función cardíaca fetal (EF % y % FS) (Tabla 1). Notable, velocidades de flujo pico (PkVs) de la arteria umbilical PkVs fueron disminuidos en los fetos expuestos a hipoxia (Figura 4B y tabla 1). Además, la arteria umbilical aceleración tiempo eyección tiempo (a / ET) ratios revelaron significativamente valores más bajos en el hipóxico en comparación con los fetos normoxic, sugiriendo mayor resistencia al flujo vascular umbilical. De acuerdo, espesor de la pared ventricular derecha fue aumentada en fetos expuestos a hipoxia medida en imágenes 2-D/M-modo (figura 5). Dado que el RV asume función dominante de la bomba durante el desarrollo fetal, la placenta sirve como el lecho vascular primario para la oxigenación, estos datos colectivamente sugieren resistencia a flujo elevado en el circuito vascular feto-placentaria que lleva a RV hipertrofia. Lo importante, recién nacidos expuesto la hipoxia ante mortalidad postnatal temprana. Falta de RV y aumento de la resistencia vascular inducida por la exposición crónica a hipoxia prenatal están contribuyendo potencialmente causa. Otros factores, como la toxicidad de redox resultando de lesión de la oxigenación, la mala alimentación y enfermedad materna no pueden ser excluidos. Sin embargo, el mecanismo exacto subyacente de patogenia cardiaca inducida por la hipoxia prenatal y la mortalidad temprana de los fetos quedan por determinar en futuros estudios.

Figure 1
Figura 1: Anotación de ratones Fetal y corazón en el útero utilizando análisis B-modo de visualización y Color Doppler interrogatorio. (A) representación esquemática de ratones fetales identificación y anotación (L: izquierda, R: derecho). (B) imagen representativa de los hitos anatómicos de un feto para guiar la orientación del corazón fetal gestacional día 18,5 de la vista de eje corto paraesternal de ventrículo izquierdo (LV), ventrículo derecho (VD) y septo interventricular (IVS). (C) imagen representativa de paraesternal eje corto del LV y RV con interrogatorio de color para facilitar la visualización de cámara del corazón. (D) Longitudinal de cuatro cámaras más de VI y Vd, atria (LA) y Doppler color de aurícula derecha (RA) a la izquierda. (E) vista de cuatro cámaras Longitudinal de LV y RV, con color Doppler interrogatorio para facilitar la visualización de los tractos de salida: tracto de salida del ventrículo (TSVD), tracto de salida del ventrículo izquierdo (TSVI), aorta (AO) y la salida del ventrículo derecho a la derecha tracto (TSVD). (F) representativo color Doppler interrogatorio del TSVD y PA. (G) representativo color Doppler interrogatorio del TSVI y AO. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: evaluación de la frecuencia cardíaca Fetal y la función Ventricular. (A) representante de M-modo calco obtenidos desde la vista de 4 cámaras de eje largo en GD 18.5. (LV: izquierda ventrículo; RV: Ventrículo derecho; LA: Aurícula izquierda; RA: la aurícula derecha). Método de cuantificación representante (líneas con flecha) (B) de dimensiones ventriculares incluyendo diámetro interno izquierdo y ventrículo derecho en diástole (LVID, d; RVID, d) y sístole (LVID, s; RVID, s), izquierda y derecha el espesor de la pared ventricular en diástole (LVAW, d; Septo Interventricular RVW, d), (IVS), latido a latido medición de HR se muestran desde los cuatro y plano de la proyección de imagen de la cámara. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: pulsado onda Doppler seguimiento de índices de flujo pulmonar, aórtica y Mitral Fetal. (A) imagen representativa de la arteria pulmonar onda pulsada Doppler trazado (izquierda). Métodos de cuantificación (líneas) de los índices de flujo pulmonar PkV (velocidad máxima), en (tiempo de aceleración), ET (tiempo de eyección) aparecen (derecha) desde el vista longitudinal de la cámara de cuatro. (B) imagen representativa de la mitral y aórtica pulsos patrón de flujo Doppler (izquierda) y cuantificación de índices de flujo de la válvula mitral E (velocidad diastólica precoz) y (contracción auricular) y los índices de flujo aórtico a, ET, y PkV (derecha) se muestran de la plano de cuatro cámaras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: evaluación de la circulación Feto-placentaria. (A) Imagen representante de circuitos vasculares feto-placentaria color Doppler interrogatorio (superior) y los registros de ECG maternos (inferior). (B) Imagen representativa de onda pulsada Doppler registro y cuantificación medidas (líneas) de índices de flujo de la arteria umbilical (superior) hipoxia y normoxia control expuesto ratones fetales (inferior). PkV (velocidad máxima), en (tiempo de aceleración), ET (tiempo de eyección). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: evaluación del espesor de la pared del ventrículo derecho en hipoxia trataron ratones fetales. (A, B) Representante de M-modo calco obtenidos desde la visión de cuatro cámaras de eje largo en GD 18.5 en condiciones de normoxia e hipoxia. LV: la izquierda ventrículo, Vd: ventrículo, ventricular derecha de la pared de la derecha. Las líneas indican las medidas cuantitativas de espesor RVW en sístole (s) y diástole (d). RVW (C), cuantificación de s demuestra mayor espesor RVW en ratones fetales hipoxia tratados comparados con normoxia. Barra de error: error estándar de la media. (D) representativas imágenes seccionadas transversalmente del corazón fetal en GD 18.5 que representan mayor grueso de pared de RV en tratar la hipoxia y normoxia tratado grupos. Original ampliación 10 X. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Parámetro unidad Normoxia Hipoxia prenatal
Número de fetos con éxito imagen 20 16
Tasa de mortalidad postnatal 5% 68.75%
Parámetro hemodinámico (Media ± SEM) (Media ± SEM)
Frecuencia cardíaca fetal, bpm 138 ± 4 89 ± 8 ***
Ventrículo izquierdo EF % 71,2 ± 3 55 ± 2 **
Ventrículo izquierdo FS % 43 ± 2 29 ± 4 **
Arteria pulmonar PkV, mm/s 102 ± 10 129 ± 8 **
Arteria pulmonar en relación ET 0,42 ± 0,05 ± 0.35 0.03*
Arteria umbilical PkV, mm/s 58 ± 4 40 ± 1.5* **
Arteria umbilical en relación ET 0,5 ± 0.03 0,42 ± 0.025*
Vena umbilical PkV, mm/s 13 ± 1.2 19,6 ± 3 **
Demora arterial-venosa umbilical, ms 122 ± 4 238 ± 20 *
EF, fracción de eyección; Acortamiento de la FS, fraccional; NA, no disponible; NS, no significativo; PkV, velocidad pico; PkV, d, de la velocidad pico durante la diástole; PkV, s, velocidad pico durante la sístole; Prueba t de Student se utilizó para deducir las diferencias intergrupos. P < 0.005. ** P < 0.01. * P < 0.05 representa una diferencia significativa en las comparaciones entre los grupos. de Student t-test. Importancia no fue dejado en blanco.

Tabla 1: parámetros hemodinámicos de normoxic y ratones hipóxicos fetales gestacional día 18.5. EF, fracción de eyección; Acortamiento de la FS, fraccional; PkV, velocidad pico; EN, tiempo de aceleración; Tiempo de eyección, ET. Prueba t de Student se utilizó para deducir las diferencias intergrupos. *** P < 0.005. P < 0.01, y * P < 0.05 representa una diferencia significativa en la comparación entre los grupos.

Video 1
Video 1: vista de eje corto modo B. Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)

Video 2
Video 2: Doppler Color-vista longitudinal apical. Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)

Video 3
Video 3: modo de M. Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)

Video 4
Video 4: arteria pulmonar – onda pulsada Doppler. Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Enfermedades y malformaciones cardiovasculares están influenciadas sustancialmente por factores genéticos y ambientales elementos19. Previamente hemos demostrado un impacto significativo de la restricción calórica, iniciada durante el segundo trimestre, el feto-placentario flujo circulatorio y la función cardiaca fetal9.

La hipoxia prenatal es otro factor de estrés común durante el desarrollo fetal que puede afectar tremendamente la fisiología feto-placentaria y el sistema circulatorio. El impacto de la exposición de la hipoxia prenatal puede ser más profundo en el contexto de una cardiopatía coronaria hacia la adaptación perinatal deficiente a la vida postnatal. Los ritmos cardíacos anormales y los índices cardiacos detectados en este estudio son de hecho importantes indicadores de estrés cardiaco y fisiología circulatoria placentaria alterada y constituyen así elementos esenciales primarios para la detección de los defectos del desarrollo y consiguientes alteraciones hemodinámicas que pueden ser más pronunciadas en respuesta al estrés hipóxico prenatal conduce a insuficiencia cardíaca temprana. Contrariamente a las expectativas, hipoxia exponen fetos tenían tasas más bajas del corazón. Este fenómeno podría reflejar mecanismos inmaduros autorregulación cardíaca en ratones fetales en respuesta a la hipoxia en el GD18.5. Sin embargo, la patogénesis exacta sigue siendo desconocida.

Aunque otros avanzados métodos, la proyección de imagen tales como MRI cardiaco fetal, permiten en proyección de imagen de estructuras cardiacas durante el desarrollo de20, el estado hemodinámico es a menudo perdido debido a imágenes estáticas y largos procedimientos. La tecnología de ultrasonido no invasivo, por el contrario, permite la realización en vivo proyección de imagen dinámica que mantiene la fisiología de la línea de base. Además, con la disponibilidad de transductores de alta frecuencia con resolución mejorada, la visualización del corazón fetal en las diferentes etapas del desarrollo de cada feto individual puede llegar a ser más factible en ratones transgénicos optimizando la anotación fetal métodos. Por último, el coste del experimento es mucho menor con este método.

En un informe anterior de GH de Kim et al., los autores proporcionan información importante y novedoso con respecto a la proyección de imagen optimización de plan de adquisición de datos mediante el uso de una generación anterior de alta frecuencia ultrasonido proyección de imagen de sistema21. Otro informe de Zhou YQ et al., ha establecido medidas de base de referencia normalizada de la circulación fetal a nivel fisiológico mediante el uso de un ultrasonido de alta frecuencia, equipado con color Doppler sistema22. Por lo tanto, el protocolo presentado aquí complementa protocolos previamente establecidos y se expande para esbozar un método integral que es factible y práctico en tiempo real en un entorno experimental. Un sistema de ultrasonido de avanzada y alta sensibilidad alta frecuencia fue utilizado en este estudio para analizar el circuito feto-placentaria como una unidad. El protocolo delineado es simple y estandarizado para emplear este poderoso sistema efectivamente según lo demostrado por el logro de mediciones cuantificables del impacto de la hipoxia en la circulación fetal en ratones en GD18.5.

Sin embargo, debemos reconocer importantes limitaciones y desafíos de la proyección de imagen cardiaca fatal: agentes primeros, anestésicos, incluyendo el isoflurano, pueden afectar los parámetros fisiológicos del feto. Anestesia prolongada, pérdida de pelo y gel de ultrasonidos pueden conducir a la hipotermia, que puede afectar el ritmo cardíaco y los índices hemodinámicos de la presa, así como los fetos. Actualmente, no hay ningún método disponible para evaluar el nivel de agentes anestésicos y sus efectos sobre el feto. Para evitar esta limitación, valorarán niveles de isoflurano inhalados cuidadosamente para lograr sedación apropiada de las presas, manteniendo su frecuencia cardiaca basal y signos vitales. En segundo lugar, visualizar fetos que se encuentran en el abdomen es difícil y subóptima, conduce a la exclusión de estos fetos de análisis de datos final. El Doppler color permite optimización mejorada de imágenes de secciones y adecuada alineación entre el transductor y el flujo de sangre. En tercer lugar, realizar el análisis simultáneo de todos los fetos requiere eficiencia del operador en la adquisición de imagen y visualización rápida y precisa rápidamente, lo que implica la importancia de la formación práctica.

Por último, pasos clave en este método necesitan ser acentuado incluyendo 1) preparación adecuada del sistema. 2) manteniendo una temperatura corporal estable y pulsaciones del ratón embarazadas. 3) optimizar el flujo de isoflurano para mantener Estados fisiológicos basales de los embriones para adquirir datos confiables. 4) consistente y adquisición de imágenes eficiente en el menor tiempo posible. 5) gestacional edad, sexo y animal cepa son variables importantes que pueden afectar significativamente los resultados. Por lo tanto, el protocolo experimental debe ser diseñado cuidadosamente para tener en cuenta estas variables incluyendo los controles emparejados de la misma cepa animal en interpretación y análisis de datos.

En conclusión, un sistema de ultrasonido de alta frecuencia es un método eficaz para lograr la caracterización fenotípica de los sistemas cardiovascular fetal en el útero con gran valor científico y experimental y posibles aplicaciones futuras que puede incluye 1) comprensión de la dinámica fisiológica durante el desarrollo cardiaco. 2) logrando integral análisis fenotípico de los modelos genéticos de CHDs. 3) aclaración de la circulación feto-placentaria de impacto en el desarrollo de la cámara cardiaca, maduración y adaptación al estrés. 4) realizar el ultrasonido dirigió la inyección fetal para el estudio de las toxinas, teratógenos o agentes terapéuticos en el futuro. 6) desarrollando el seguimiento de marcas en tensión análisis capacidades para obtener la función del miocardio regional detallada del miocardio en desarrollo pueden proporcionar una base para futuros estudios.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ningún conflicto de interés declarado.

Acknowledgments

Agradecemos a la base de la fisiología animal, División de medicina molecular en la UCLA para proporcionar soporte técnico y acceso libre al sistema Vevo 2100 ultrasonido biomicroscopy (UBM). Este estudio fue apoyado por el centro de investigación de salud NIH, niño (5K12HD034610/K12), UCLA-infantil Discovery Institute y fondo de hoy y mañana de los niños y David Geffen escuela de medicina investigación innovación Premio a M. Touma.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vevo 2100 VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada N/A High Freequency Ultrasound Biomicroscopy. The set up is available in animal physiology core facility, division of molecular medicine, UCLA. USA
inbred mice (c57/BL6) Charles River Laboratories N/A Inbread wild type mouse strain

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Touma, M., Reemtsen, B., Halnon, N., Alejos, J., Finn, J. P., Nelson, S. F., Wang, Y. A Path to Implement Precision Child Health Cardiovascular Medicine. Front Cardiovasc Med. 4, 36 (2017).
  2. Triedman, J. K., Newburger, J. W. Trends in Congenital Heart Disease. The Next Decade. Circulation. 133, 2716-2733 (2016).
  3. Gilboa, S. M., et al. Congenital Heart Defects in the United States Estimating the Magnitude of the Affected Population in 2010. Circulation. 134, 101-109 (2016).
  4. Pruetz, J. D., et al. Outcomes of critical congenital heart disease requiring emergent neonatal cardiac intervention. Prenat Diagn. 34, 1127-1132 (2014).
  5. Peterson, C., et al. Mortality among Infants with Critical Congenital Heart Disease: How Important Is Timely Detection? Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 97, (10), 664-672 (2013).
  6. Atz, A. M., et al. Prenatal Diagnosis and Risk Factors for Preoperative Death in Neonates with Single Right Ventricle and Systemic Outflow Obstruction: Screening Data from the Pediatric Heart Network Single Ventricle Reconstruction Trial. J Thorac Cardiovasc Surg. 140, (6), For the Pediatric Heart Network Investigators 1245-1250 (2010).
  7. Lalani, S. R., Belmont, J. W. Genetic Basis of Congenital Cardiovascular Malformations. Eur J Med Genet. 57, (8), 402-413 (2014).
  8. Hanchard, N. A., Swaminathan, S., Bucasas, K., Furthner, D., Fernbach, S., Azamian, M. S., et al. A genome-wide association study of congenital cardiovascular left-sided lesions shows association with a locus on chromosome 20. Hum Mol. 11, 2331-2341 (2016).
  9. Arsenijevic, V., Davis-Dusenbery, B. N. Reproducible, Scalable Fusion Gene Detection from RNA-Seq. Methods Mol Biol. 1381, 223-237 (2016).
  10. LaHaye, S., Corsmeier, D., Basu, M., Bowman, J. L., Fitzgerald-Butt, S., Zender, G., et al. Utilization of Whole Exome Sequencing to Identify Causative Mutations in Familial Congenital Heart Disease. Circ Cardiovasc Genet. 9, (4), 320-329 (2016).
  11. Zaidi, S., Choi, M., Wakimoto, H., Ma, L., Jiang, J., Overton, J. D., et al. De novo mutations in histone modifying genes in congenital heart disease. Nature. 498, (7453), 220-223 (2016).
  12. Leirgul, E., Brodwall, K., Greve, G., Vollset, S. E., Holmstrom, H., Tell, G. S., et al. Maternal Diabetes, Birth Weight, and Neonatal Risk of Congenital Heart Defects in Norway, 1994-2009. Obstet Gynecol. 128, (5), 1116-1125 (2016).
  13. Garry, D. J., Olson, E. N. A Common Progenitor at the Heart of Development. Cell. 127, (6), 1101-1104 (2006).
  14. Postma, A. V., Bezzina, C. R., Christoffels, V. M. Genetics of congenital heart disease: the contribution of the noncoding regulatory genome. J Hum Genet. 61, 13-19 (2016).
  15. Ganguly, A., Touma, M., Thamotharan, S., De Vivo, D. C., Devaskar, S. U. Maternal Calorie Restriction Causing Uteroplacental Insufficiency Differentially Affects Mammalian Placental Glucose and Leucine Transport Molecular Mechanisms. Endocrinology. Oct. 157, (10), 4041-4054 (2016).
  16. Lluri, G., Huang, V., Touma, M., Liu, X., Harmon, A. W., Nakano, A. Hematopoietic progenitors are required for proper development of coronary vasculature. J Mol Cell Cardiol. 86, 199-207 (2015).
  17. Bishop, K. C., Kuller, J. A., Boyd, B. K., Rhee, E. H., Miller, S., Barker, P. Ultrasound Examination of the Fetal Heart. Obstet Gynecol Surv. 72, (1), 54-61 (2017).
  18. He, H., Gan, J., Qi, H. Assessing extensive cardiac echography examination for detecting foetal congenital heart defects during early and late gestation: a systematic review and meta-analysis. Acta Cardiol. 71, (6), 699-708 (2016).
  19. Hobbs, C. A., Cleves, M. A., Karim, M. A., Zhao, W., MacLeod, S. L. Maternal Folate-Related Gene Environment Interactions and Congenital Heart Defects. Obstet Gynecol. 116, (2 Pt 1), 316-322 (2016).
  20. Gabbay-Benziv, R., et al. A step-wise approach for analysis of the mouse embryonic heart using 17.6 Tesla MRI. Magn Reson Imaging. 35, 46-53 (2017).
  21. Kim, G. H. Murine fetal echocardiography. J Vis Exp. (72), e4416 (2013).
  22. Zhou, Y. Q., Cahill, L. S., Wong, M. D., Seed, M., Macgowan, C. K., Sled, J. G. Assessment of flow distribution in the mouse fetal circulation at late gestation by high-frequency Doppler ultrasound. Physiol Genomics. 46, (16), 602-614 (2014).
  23. Greco, A., Coda, A. R., Albanese, S., Ragucci, M., Liuzzi, R., Auletta, L., Gargiulo, S., Lamagna, F., Salvatore, M., Mancini, M. High-Frequency Ultrasound for the Study of Early Mouse Embryonic Cardiovascular System. Reprod Sci. 22, (12), 1649-1655 (2015).
  24. Deneke, T., Lawo, T., von Dryander, S., Grewe, P. H., Germing, A., Gorr, E., Hubben, P., Mugge, A., Shin, D. I., Lemke, B. Non-invasive determination of the optimized atrioventricular delay in patients with implanted biventricular pacing devices. Indian Pacing Electrophysiol J. 10, (2), 73-85 (2010).
  25. Kono, M., Kisanuki, A., Ueya, N., Kubota, K., Kuwahara, E., Takasaki, K., Yuasa, T., Mizukami, N., Miyata, M., Tei, C. Left ventricular global systolic dysfunction has a significant role in the development of diastolic heart failure in patients with systemic hypertension. Hypertens Res. 33, (11), 1167-1173 (2010).
Proyección de imagen usando un sistema del ultrasonido de alta frecuencia (30 / 45MHZ) Cardiovascular fetal ratón
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Touma, M. Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System. J. Vis. Exp. (135), e57210, doi:10.3791/57210 (2018).More

Touma, M. Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System. J. Vis. Exp. (135), e57210, doi:10.3791/57210 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter