Summary
Yüksek frekanslı ultrason görüntüleme fetal fare görüntüleme çözümü geliştirdi ve hassas bir non-invaziv kalp geliştirme ve yapısal kusur karakterizasyonu sağlar. Burada özetlenen Protokolü gerçek zamanlı fetal fareler Ekokardiyografi vivo içindegerçekleştirmek için tasarlanmıştır.
Abstract
Konjenital kalp kusurları (CHDs) en yaygın çocukluk morbidite ve erken mortalite nedenidir. Doğum öncesi CHDs temel moleküler mekanizmaları tespiti yeni önleyici ve tedavi edici stratejiler icat için önemlidir. Mutant fare modelleri yeni mekanizmaları ve kalp geliştirme ve onların potansiyel tadilat CHDs içinde sürücü çevresel stres değiştiriciler keşfetmek için güçlü araçlardır. Ancak, bu sözde katkıda bulunan nedensellik kurmak için çaba olmuştur hayatta olmayan hayvan deneyleri, histolojik ve moleküler çalışmalar sınırlı hangi anahtar fizyolojik ve hemodinamik parametreler izleme kez yoktur. Canlı görüntüleme teknolojisi CHDs etyolojisinde kurmak için gerekli bir araç haline gelmiştir. Özellikle, ultrason görüntüleme prenatally cerrahi olarak fetüsler maruz kalmadan kullanılabilir süre kardiyak odası, hemodinamik ve yapısal özellikleriyle ilgili çevresel stres etkisi izleme onların temel fizyolojisi Bakımı sağlayan geliştirme. Burada, yüksek frekanslı ultrason (30/45) sistem kardiyovasküler sistem E18.5 rahim içinde temel yönü, fetal farelerde ve prenatal hipoksi pozlama karşılık olarak incelemek için kullanın. Biz kalp Oda boyutu, Morfoloji, ventrikül fonksiyonları, fetal kalp hızı ve Umbilikal arter akışı endeksleri ve sistemik kronik hipoksi rahim içinde gerçek maruz fetal farelerde onların değişiklikleri ölçmek için sistem fizibilite göstermek zaman.
Introduction
Kalp Konjenital malformasyonlar erken kalp geliştirme sırasında oluşan heterojen yapısal kusurları vardır. İşlem yordamlarını geçerli teknik gelişmeler, bebeklerin CHDs1,2ile sağkalım oranları önemli artışlar açmıştır. Ancak, yaşam kalitesi genellikle uzamış yatış ve ihtiyaçları için güvenliği aşılan ikincil cerrahi onarım prosedürleri1,2,3,4,5sahnelenen içindir. CHDs temel moleküler mekanizmaları doğum öncesi algılama erken müdahaleler, yeni önleme stratejileri taşımak ve ömür boyu sonuçları6,7artırmak için planı için çok önemli olduğunu.
Birden çok genetik ve çevresel faktörler CHDs patogenezinde karıştığı olmuştur rağmen nedensellik kurulması bir karşılanmamış ihtiyaç geliştirmek için tanı, tedavi ve Önleme stratejileri1,8,9 kalır ,10,11,12. Ayrıca, rolleri epigenetik değiştiriciler ve rahim içinde stres faktörlerinin incelenmesi için gelecekteki araştırmalar11,12yeni yerleri açılır. Son on yılda gerçekten tek nükleotit polimorfizmi (SNP) Mikroarray, Bütün exome sıralama ve genom çapında metilasyonu çalışmaları, dahil olmak üzere yeni nesil sıralama teknolojisi genetik eğitim onların kullanımı hızlı gelişmeler tanıklık etmiş CHDs1,8,9,10,11 yeni mutasyonlar ve henüz henüz genetik varyantların tanımlamak için önünü de dahil olmak üzere karmaşık insan hastalıkları neden olur onların patojenitesi uygun hayvan modellerinde test.
Farklı hastalık modeli sistemleri arasında sadece CHDs mekanizmaları sırasında erken cardiogenesis13,14,15,16, aynı zamanda aydınlatmak için soruşturma için tercih, hayvan modeli faredir Kardiyak odası olgunlaşma ve fonksiyon için geç gebelik prenatal ve perinatal stres faktörleri üzerindeki etkilerini. Bu nedenle, bir mutant fetal fare kalp içinde vivo fenotipik karakterizasyonu geliştirme, erken ve geç aşamalarında gerçekleştirmek bu genetik varyasyonları ve kalp geliştirme, çevresel faktörlerin rolü anlamak çok önemlidir ve olası gelecekteki etkisi odası belirli olgunlaşma süreçleri farelerde.
Erken teşhis ve kalp kusurları geliştirme sırasında doğru tanı Girişimsel planlama17,18için kritik. Güvenli, basit, taşınabilir ve tekrarlanabilir olmak, cenin ultrason gerçekten tekniği klinikte Kardiyak değerlendirme için Imaging standart haline gelmiştir. Fetal dolaşım değerlendirme Doppler ultrason kullanarak yaygın klinik pratikte sadece kalp hataları algılama için ama aynı zamanda vasküler anormallikler, plasenta yetmezliği ve intrauterin büyüme kısıtlama algılamak ve değerlendirmek için kullanılmıştır fetal iyilik yanıt olarak rahim içinde hakaret hipoksemi, maternal hastalık ve ilaç toksisitesi17,18de dahil olmak üzere. İnsan hataları ve hastalıkların değerlendirilmesinde değerine paralel olarak artan yardımcı programında deneysel ayarları19,20,21,22ultrason değerlendirmesi fetal farelerin kazanmıştır, 23. Özellikle, fetal kalp ultrason (Ekokardiyografi) gelişmekte olan kalp sıralı vivo içinde görselleştirme sağlar. Birçok deneysel çalışma fetal transgenik farelerde fetal kalp-damar gelişim gözlemlemek için ultrason görüntüleme teknoloji kullanılmıştır. Doppler ultrason gibi fizyolojik sorunları veya hastalık koşulları10,19altında fetal dolaşımda akışı desenleri patofizyolojik parametreleri aydınlatmak özellikle yararlı olmuştur. Hem insan ve hayvanlarda, anormal kan akışı veya oksijen kaynağına fetus fetal çevre rahim içinde bozabilir ve fetoplacental eksen, anne hipoksi plasental anormallikler, dahil olmak üzere etkileyen çeşitli şartlarından neden olabilir, Gestasyonel diyabet ve pharmaceutically indüklenen vasküler daralma15,22. Bu nedenle, Doppler ultrasonlardan fetal fareler üzerinde gerçekleştirmek için standart yöntem oluşturma muazzam CHDs gelecekteki çalışmaların izleme akış desen ve sırasında kardiyovasküler devrelerin anahtar hemodinamik endeksleri kolaylaştırarak güçlendirmek farklı gelişimin kardiyak genetik fare modelleri.
Yüksek frekans ultrason fare modelleri ve insan hastalıkları18Kardiyovasküler sistemde gelişimsel ve fizyolojik parametrelerini ölçmek için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Bu teknoloji son yıllarda daha da rafine. Biz ve diğer araştırmacılar ultra yüksek frekans ultrason çalışmalar fetal fare kalp15,19,20,21,22 yürütmek için bu sistemin fizibilite göstermiştir ,23. Sistem Doppler renk akışı haritalama ve yüksek frekans (30-50 MHz) kare hızları, iki boyutlu, dinamik görüntüler oluşturmak doğrusal dizi dönüştürücüleri bulunuyor. Düşük frekans ultrason sistemleri ve yüksek frekans ultrason21,22, önceki nesil ile karşılaştırıldığında bu avantajları, gerekli duyarlılık ve kararlılık derinlemesine değerlendirme cenin için dolaşım sağlar Sistem, kalp yapıları, odası fonksiyon ve akışı endeksi fetal farelerin kapsamlı karakterizasyonu deneysel ayarları dahil olmak üzere. Burada, bir yüksek frekans sistemi kullanılarak hızlı değerlendirme Kardiyopulmoner dolaşım ve embriyonik gün E18.5 vivo içinde feto plasental kan dolaşımı gerçekleştirmek için yöntemleri anahat. Yaklaşık 60 µm Aksiyel bir çözünürlüğe ve 150 µm yanal çözünürlük sağlar bir 30/45 MHz transducer seçtik. Ancak, daha yüksek bir frekans çevirici (40/50 MHz) benzer bir metodolojik yaklaşım takip ederek daha önce gelişim aşamalarında çözümlemek için seçilebilir. Seçili M-modu hareketli yüksek zamansal çözünürlük seviyeleri (1000 kare/sn), dokuların görselleştirme sağlar. Son olarak, biz yüksek ultrason detaylı kapsamlı fenotipik karakterizasyonu fetal kalp kapaklarının hemodinamik durum ve işlevi satır taban çizgisi, farelerde ve prenatal hipoksi stres yanıt için fizibilite göstermek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
University of California, Los Angeles, hayvan bakım ve kullanım Komitesi bu protokol için gösterilen tüm prosedürleri onayladı. Deneyler kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi, University of California, Los Angeles, Kaliforniya, ABD tarafından onaylanmış etkin hayvan iletişim kuralları altında devam eden bir çalışmanın parçası olarak yapılmıştır. Hayvan kullanım ve bakım standartları Kılavuzu bakım ve kullanım laboratuvar hayvanlarının için izledi.
1. hazırlanması görüntüleme sistemi yüksek frekans ultrason
- Ultrason görüntüleme sistemi ve Fizyoloji izleme birimi açın.
- 30/45 MHz transducer bağlayın.
- Onun sahibi görüntüleme platformu yakınındaki karşılık gelen tarama kafasına bir yer.
- Kardiyak ölçüm programı seçeneğini seçin.
- Ultrason jeli baş aşağı 37 ° C'ye ayarla öncesi ısınma kapsayıcı içinde yer
- Anestezi için uygun boru sistemi onaylamak ve isoflurane ve oksijen seviyesini doğrulayın.
- Dezenfekte görüntüleme platformu ve çalışma alanı.
- Kalp hızı baraj ve sabit vücut ısısını korumak için görüntüleme platformu ısı düzeyini ayarlayın.
2. hamile fare hazırlık
- Hamile fare (C57/BL6) Barajı anestezi indüksiyon odasına koyun.
- Anestezi kullanılarak sürekli olarak inhalational isoflurane (isoflurane % 2-%3) % 100 oksijen (%100 O2) 200 mL/dk indüksiyon odasında bir Debi ile karışık teslim ikna etmek.
- Uyuşturulan hayvanın sırtüstü pozisyonda görüntüleme platformu üzerine aktarın.
- Kararlı durum sedasyon anestezi boru sistemi teslim isoflurane için (% 1.0-%1.5) bağlı bir sağlamlılık kullanarak % 100 ile 200 mL/dk O2 karışık sağlar.
Dikkat: anestezik gaz kaçağı teneke kutu kümesini içeren kömür filtre ile donatılmış bir havalandırma sistemi kullanarak denetleme. - Bacaklarda hafifçe gömülü Elektrokardiyografik elektrotlar için anne kalp ve solunum oranları sürekli izlenmesi elde etmek için sonra uygulama elektrot jel teyp.
- + /-50 atım/dk (bpm) (450) bir ortalama kalp hızı korumak için isoflurane düzeyini ayarlayın.
- 37,0 ° C +/-0,5 ° c aralığında vücut ısısını korumak Vücut ısısı ve nabız Fizyoloji denetleyicisi biriminde görüntülenmesini izleyin.
- Hayati belirtileri uyuşturulan fare görüntüleme yordam boyunca her 15 dk belge.
- Fare duruş, kalp hızı ve yanıt Pinch tırnağa değerlendirerek anestezi düzeyini belirleyin.
- Oftalmik merhem (her gözün içine 1 damla) göz kuruluğu ve kornea hasarı önlemek için geçerli.
- Kürk orta göğüs seviyeden alt ekstremite ultrason zayıflama en aza indirmek için depilatory bir krem kullanarak kaldırın. Cilde zarar önlemek için ıslak ve kuru gazlı bez alternatif tarafından uygulama mendil sonra krem 1-1,5 dk kaldırın.
3. embriyo tanımlama
- Yavaşça fetusa bulup bunları yaymak için karın duvarı muayene et.
- Her embriyo Barajı'nın karnı üzerinde açıklama ekleyin ve bir işaretleyici kullanarak onların ön-arka ve dorsal ventral yönler tanımlayın.
- Serviks uyuşturulan Barajı yer iþareti olarak kullanın. Sol ve sağ rahim boynuzları üzerinde fetusa etiket L1, L2, L 3, vb (sol taraf) ve R1, R2, R3, vb (sağ tarafta), sırasıyla (şekil 1A).
Dikkat: fetusa zorla yayılmasını önlemek. 1-2 fetusa her çöp içinde başkaları ile onların konumlandırma ve görüntüleme güvenilmez hale çakışabilir. Bu fetusa çözümleme dışı bırakmak.
4. fetal kalp görselleştirme ve ek açıklama
- Önceden ısıtılmış ultrason jeli karnına uygulamak ve dikkatle kabarcık oluşumunu önlemek için yayıldı. Jel ek miktar tarama görüntüleme alanı ekleyin.
- Ultrason sonda yer onun mekanik tutucu üzerinde ve yavaş yavaş tarama B-Mode (şekil 1) kullanarak kalbi için bakarken kalın jel katmanıyla iletişim için cilt karşı seferber.
- 2B görüntüleri elde etmek için tarama B modu düğmesini tıklatın. Mesane sağ veya sol rahim boynuz konumlandırılmış ilk cenin tanımlamak ve sırasıyla R1 veya L1, olarak işaretlemek için bir dönüm noktası kullanın.
- Gerçek zamanlı olarak bireysel fetusun sağ ve sol oryantasyon görüntüleme platformu yatay düzlemde hareket ettirerek onaylayın. Burnu, bacaklarda ve omurga simge (şekil 1B, Video 1) açıklama eklemek için kuyruk için baş tarama.
- Kalbi görselleştirmek ve sol ventrikül (LV) ve sağ ventrikül (RV) ek açıklama ekleyebilirsiniz. Kalp görselleştirme optimize etmek için Renkli Doppler modu kullan (şekil 1 C-G, Videolar 1 - 2).
- Bir parasternal kısa eksen-görünümü, elde etmek için tarama B modu düğmesini tıklatın var LV ve onların maksimum çapı veri edinme çerçeve merkezinde görüntülenen RV. Canlı görüntüleme (şekil 1B-C) başlatın.
- Uçakların uzunlamasına dört-odası görünüm (şekil 1 d) elde etmek için tarama ile ilgili olarak fare yönünü değiştirin. İlk olarak, kalan yapılar kalbin Kulakçık, interventricular septum ve sol ve sağ çıkış yolları gibi tanımlayın. Sonra onların en büyük çapı görüntülenen Atriyal ve Ventriküler odaları olması. Resim alma başlatın.
- Uygun olmayan, eğik görüntüler son çözümleme dışı bırakmak. En az 10 sürekli kayıt 'Cineloops' elde etmek için çini düğmesini tıklatın s, sonra kaydet kaydedilen görüntüler.
5. Fetal kalp hızı ve ventrikül fonksiyonu değerlendirilmesi
- Kardiyak görüntüleri dört odası uçaklar (Video 3) elde etmek için tarama M-modu düğmesini tıklatın.
- Görüntüleri tüm embriyoların tamamlandıktan sonra analiz için kayıtlar listesini görüntüleyin.
- Uygun olmayan, eğik görüntüler son çözümleme dışı bırakmak.
- Analiz düğmesini ölçü duvar kalınlığı ve sol/sağ ventrikül iç çapı, diastole (LVID, d; RVID, d) ve Sistol (LVID, s; RVID, s), Şekil 2' de gösterildiği gibi.
- Her oynayarak ortalama fetal kalp hızı M-modu izleme ve ölçüm bir akış döngüsü aşağıdaki akış için hesaplama (bitişik tepeler arasında boşluk) döngüsü kaydedilen belirlemek.
- Ortalama kalp hızı (Şekil 2) elde etmek için birden fazla ölçümleri (en az 5 izleme başına) gerçekleştirin.
- Sol ventrikül iç diyastolik çap (LVID, d) ve sol ventrikül iç çapı, kalp döngüsü boyunca son Sistol (LVID, s) arasındaki zamansal değişiklikleri ölçmek. Kesirli kısalma yüzdesini (FS %) aşağıdaki gibi hesaplar: FS % [(LVID,d-LVID,s)/LVID, d =] x100.
- Birden çok ölçümleri (en az 5 izleme başına) Gönderilerin FS % değerler elde etmek için gerçekleştirin.
6. Kardiyopulmoner akış parametrelerinin değerlendirilmesi
- Sektör Alım açılı az 60oayarlayın. 2-B dört odası görüntüleme uçaktan 45-MHz transducer kullanarak pulsed wave Doppler ölçümleri gerçekleştirmek için Doppler düğmesini tıklatın.
- İlk olarak, doğru çıkış yolu tanımlamak için pulmoner arter bifurkasyon gözünde canlandır. Ardından, pulmoner ve aortik valf (şekil 3A, Video 4) aracılığıyla akış deseni elde etmek için pulsed wave Doppler düğmesini tıklatın.
- Pulmoner akım ölçümleri pulsed wave Doppler izleme, pik sistolik hız (PVK), zaman (AT) ivme ve ejeksiyon zamanı (ET) gibi elde edilir.
- Ortalama ölçüleri (sağda) şekil 3A içinde gösterildiği gibi elde etmek için birden fazla ölçümleri (en az 5 izleme başına) gerçekleştirin.
- AT hesaplamak / ET oranı her çıkış Vana çıkış yolları açıklık bir göstergesi olarak ve kan akışı.
- Mitral ve aort akışı desen kullanarak pulsed wave Doppler 2B apikal dört odası görünümlerinden elde etmek için devam edin. İlk olarak, sol atriyal ve sol ventrikül odaları tanımlayın. Ardından, mitral giriş akımı Doppler desenleri ve ölçüm erken diyastolik hız (E) ve Atriyal kasılma hızı (A) (şekil 3B)24,25kaydetmek için pulsed wave Doppler numune hacmi yerleştirin.
- Aort Doppler jet desen elde etmek için Doppler örnek ses düzeyini ayarlayın. Şekil 3B ' (sağ) gösterildiği gibi ivme (AT) ve ejeksiyon zamanı (ET) ölçmek için izleme aort Doppler (Video 5) kullanmak
7. Feto plasental eksen değerlendirilmesi
- Renkli Doppler tarama uterin arter ve feto plasental vasküler ağaç 45 MHz transducer (şekil 4A) kullanarak görselleştirmek için kullanın.
- Sadece göbek bağını fetal karından çıkar sonra göbek kordonu, içi amniyotik segmentinde göbek gemiler (iki arter ve bir damar) tanımlayın.
- Yer pulsed wave Doppler numune hacmi Umbilikal arter akım paterni (şekil 4A) elde etmek için.
- Ölçmek vasküler en yüksek akış parametrelerinin hızlanma süresi (AT), ejeksiyon zamanı (ET) dahil olmak üzere ve zirve akım hızı son Sistol (PVK, s) adlı pulsed wave Doppler tarama kayıt (şekil 4B) kullanarak.
- 5 ardışık dalga biçimleri her gemi, cenin hareketleri ve her araç için ortalama en yüksek hız ölçmek için anne solunum hareketleri, yokluğunda elde edilir.
- Sonraki embriyo için devam edin.
8. sonrası görüntüleme hayvan izleme
- Görüntüleme işleminin tamamlanmasının ardından isoflurane konteyner dön.
- Vücut ısısı, solunum ve kalp hızı kurtarma aşamasında izleme devam edin.
- Baraj spontan hareketleri başladığında sağlamlılık ve bağlı boru sistemi kaldırın.
- Baraj için uygun konut dönmek ve gözlem standart kurumsal sonrası yordamı protokolleri göre devam etmek.
- Belgeyi normal aktiviteye tam yeniden başlamasını vakti.
9. performans gereksinimleri ve Teknik hususlar
- ~ 8 fetusa uzun süreli anestezi hayati ve fizyolojik parametreler üzerinde olumsuz etkileri önlemek için yaklaşık 1 h için işlem süresi sınırı.
- Eğitim teknikleri görüntü edinme ve akış desenleri bir kısa zaman dilimi içinde izleme için en iyi duruma getirmek için 8-10 hamile fareler ile tamamlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kardiyak ve hemodinamik endeksi İstatistiksel analizler çevrimdışı yapıldı. 3 en iyi resim 5 ardışık ölçüm araçlarının hesaplanır. Verileri ± SEM öğrencinin tdemek gibi ifade edildi-test çalışma karşılaştırmalar anlaması için kullanıldı. ≤0.05 P değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.
Yukarıdaki protokolü, biz kronik kardiyovasküler durum fetal farelerin prenatal hipoksi maruz etkisini geç gebelik de C57/BL6 zaman aşımına uğradı hamile fareler üzerinde gerçek zamanlı yüksek frekans ultrason kayıtları elde ederek karakterize Gestasyonel gün (GD) 18,5.
Gruplar ıslah kuruluş sonra başarılı çiftleşme doğrulandı. Zamanlanmış hamile barajlar ile yiyecek ve su ad libitum kadar 12 h koyu rejim altında kafeslerde muhafaza. GD14.5 hamile fareler de (ortam havası içinde muhafaza) normoxia grup veya (hipoksi odası sistemik hipoksi ikna etmek için % 10 FiO2 yerleştirilir) hipoksi grubuna ayrılmıştır. Doğumdan sonra baraj ve onların pups postnatal güne kadar 7 (P7) deneysel durumlarına ayrılmış kaldı.
Toplam, 6'barajlar bu deneylerde okudu ve 42 fetusa başarıyla GD18.5 görüntüsü. Bunlardan daha sonraki analiz (Tablo 1) 36 fetusa alınan verileri kullanılmıştır. GD18.5, fetal kalp hızı analizi gösterdi hipoksik fetus fetal bradikardi (daha düşük kalp hızı) acı ve deneyimli önemli düşüş fetal kardiyak fonksiyon Endeksi (EF % ve FS %) (Tablo 1). Dikkat çekici, en yüksek akım hızları (PkVs) Umbilikal arter PkVs hipoksi Günese maruz kalan fetus (şekil 4B ve Tablo 1) içinde azalma. Ayrıca, Umbilikal arter ivme zaman/fırlatma zaman (AT / ET) hipoksik düşündüren normoxic fetus için karşılaştırıldığında daha düşük değerleri arttı göbek vasküler akım direnç oranları önemli ölçüde ortaya. Sözleşmesinde, sağ ventrikül duvar kalınlığı 2-D/M-modu görüntüleri (şekil 5) ölçülen fetusa hipoksi maruz artış. Birincil vasküler yatağın oksijenlenme için plasenta görür iken RV fetal gelişim sırasında baskın pompa işlev varsayar beri bu veri toplu olarak yükseltilmiş akış direnci RV için önde gelen feto plasental vasküler devre öneririz hipertrofisi. Önemlisi, hipoksi maruz yenidoğan erken postnatal ölümcül karşı karşıya. RV başarısızlık ve kronik maruz prenatal hipoksi indüklenen artmış vasküler direnç potansiyel neden katkıda bulunuyorlar. Yeniden oksijenasyonu yaralanma, kötü beslenme ve maternal hastalık kaynaklanan Redoks toksisitesi gibi diğer faktörler, dışarıda bırakılamaz. Yine de, gelecek çalışmalar belirlenecek prenatal hipoksi indüklenen kardiyak Patogenez tam temel mekanizması ve fetusa erken ölümcül kalır.
Resim 1: Fetal fareler ek açıklama ve kalp görselleştirme rahim içinde kullanarak tarama B-mod ve Renkli Doppler sorgulama. (A)fetal fareler kimlik ve ek açıklama (L: yaptı, R: sağ) şematik gösterimi. (B) temsilcisi görüntü sol ventrikül (LV), sağ ventrikül (RV) ve interventricular septum (serum) parasternal kısa eksen görünümünden Gestasyonel gün 18,5 fetal kalp yönünü gösterecek bir fetus anatomik yerlerinden. (C) temsilcisi görünümünün resmi parasternal kısa eksen LV ve RV kalp odası görselleştirme kolaylaştırmak için renk sorgulama ile. (D) boyuna dört-odası LV ve RV, sol Kulakçık (LA) ve sağ Kulakçık (RA) Renkli Doppler görüntüleme. (E) boyuna dört-odası görünümünü LV ve RV, Renkli Doppler sorgulama çıkış yolları görselleştirme kolaylaştırmak için: sağ ventrikül çıkım yolu (RVOT), sol ventrikül çıkım yolu (LVOT), aort (AO) ve sağ ventrikül çıkım yolu (RVOT). (F) temsilci Renkli Doppler sorgulama RVOT ve PA (G) temsilci Renkli Doppler sorgulama LVOT ve AO. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: Fetal kalp hızı ve ventrikül fonksiyonu değerlendirmesi. (A)temsilcisi M-modu izleme elde GD 18,5, uzun ekseni 4-odası görünümden. (LV: sol ventrikül; RV: Sağ ventrikül; LA: Sol atriyum; RA: sağ Atrium). (B) temsilcisi miktar (Oklu çizgiler) yöntemi ventrikül boyutları da dahil olmak üzere sol ve sağ ventrikül iç çapı, diastole (LVID, d; RVID, d) ve Sistol (LVID, s; RVID, s), sol ve sağ ventrikül duvar kalınlığı, diastole (LVAW, d; RVW, d), Interventricular septum (serum), ve beat-beat ölçüm İK dört gösterilir uçak Imaging odası. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Wave Doppler izleme Fetal akciğer, aortik ve Mitral akışı endeksi darbe. (A)temsilcisi görüntüsü pulmoner arter pulsed wave Doppler izleme (solda). Miktar yöntemleri (satır) pulmoner akışı endeksi PVK (yüksek hız), (ivme zaman), ET (ejeksiyon zamanı) gösterilir (sağda) boyuna dört-odası görünümden. (B) temsilcisi görüntüsünü mitral ve aortik Pulse Doppler akım paterni (solda) ve mitral kapak akış endeksi E miktar (erken diyastolik hız) ve (Atriyal kasılma) ve aort akışı endeksi saat, ET ve PVK (sağda) üzerinden gösterilir dört-odası görüntüleme uçak. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: Feto-plasenta dolaşımı değerlendirilmesi. (A) Renkli Doppler sorgulama (üst) kullanarak feto plasental vasküler devreleri görüntüsünü temsilcisi ve anne ECG kayıtları (alt). (B) Pulsed wave Doppler kayıt ve miktar ölçümleri (satır) Umbilikal arter akışı endeksi hipoksi (üst) ve normoxia Denetim Temsilcisi görüntüsünü maruz fetal fareler (alt). PVK (yüksek hız), (ivme zaman), ET (ejeksiyon zamanı). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: sağ ventrikül duvar kalınlığı hipoksi içinde değerlendirilmesi tedavi Fetal fareler. (A, B) Temsilcisi M-modu izleme elde normoxia ve hipoksi koşullarda, GD 18,5 uzun eksen dört-odası görünümünde. LV: Sol ventrikül, RV: sağ ventrikül, sağ ventrikül duvar. Çizgiler Sistol (s) ve Diastole (d) RVW kalınlığı nicel ölçüleri gösterir. (C) RVW, s miktar artan RVW kalınlığı fetal fareler hipoksi tedavi için normoxia göre gösterir. Hata çubuğu: Standart hata demek. GD 18,5 tasvir, fetal kalp (D) temsilcisi kesitsel görüntülerini RV duvar kalınlığı tedavi hipoksi ve normoxia tedavi grupları arttı. Özgün büyütmeye 10 X. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Parametre, birim | Normoxia | Prenatal hipoksi |
| Başarıyla görüntülü fetus sayısı | 20 | 16 |
| Doğum sonrası ölüm oranı | % 5 | %68.75 |
| Hemodinamik parametresi | (± SEM demek) | (± SEM demek) |
| Fetal kalp hızı, bpm | 138 ± 4 | 89 ± 8 *** |
| Sol ventrikül EF % | 71.2 ± 3 | 55 ± 2 ** |
| Sol ventrikül FS % | 43 ± 2 | 29 ± 4 ** |
| Pulmoner arter PVK, mm/s | 102 ± 10 | 129 ± 8 ** |
| Pulmoner arter AT ET oranı | 0,42 ± 0,05 | 0,35 ± 0.03* |
| Umbilikal arter PVK, mm/s | 58 ± 4 | 40 ± 1.5* ** |
| ET oranı, Umbilikal arter | 0.5 ± 0.03 | 0,42 ± 0.025* |
| Umbilikal ven PVK, mm/s | 13 ± 1.2 | 19,6 ± 3 ** |
| Umbilikal arter Venöz gecikme, ms | 122 ± 4 | 238 ± 20 * |
| EF, ejeksiyon fraksiyonu; FS, kesirli kısaltılması; NA, mevcut değildir; NS, önemli değil; PVK, en yüksek hız; PVK, d, en yüksek hız diastole sırasında; PVK, s, en yüksek hız Sistol sırasında; Öğrenci t Testi Intergroup farklılıklar anlaması için kullanıldı. P < 0.005. ** P < 0,01. * P < 0.05 arası grup karşılaştırmalar önemli bir fark gösterir. Öğrenci t-Testi. Sigara-önemi boş bırakılmış. | ||
Tablo 1: normoxic ve gebelik gün 18,5 hipoksik fetal fareler hemodinamik parametreler. EF, ejeksiyon fraksiyonu; FS, kesirli kısaltılması; PVK, en yüksek hız; AT, zaman ivme; ET, ejeksiyon zamanı. Öğrenci t testi Intergroup farklılıklar anlaması için kullanıldı. *** P < 0.005. P < 0,01, ve * P < 0.05 arası grup karşılaştırma önemli bir fark gösterir.
Video 1: B-mod kısa eksen görünümü. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Video 2: Renkli Doppler – apikal uzunlamasına görünümü. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Video 3: M-modu. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Video 4: pulmoner arter-pulsed wave Doppler. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hastalıkları ve kardiyovasküler malformasyonlar önemli ölçüde genetik faktörlerin ve çevre öğeleri19tarafından etkilenmiştir. Biz daha önce İkinci trimesterde, feto plasental kan dolaşımı akışı ve fetal kardiyak fonksiyon9tarihinde başlatılan anne kalori kısıtlaması önemli bir etkisi gösterdi.
Prenatal hipoksi muazzam feto plasental fizyolojisi ve dolaşım sistemi etkileyebilir fetal gelişim sırasında başka bir ortak stres faktörü var. Prenatal hipoksi pozlama etkisini doğum sonrası hayata zavallı perinatal adaptasyon için önde gelen bir CHD bağlamında daha derin olabilir. Anormal kalp hızı ve kardiyak endeksi bu çalışmada tespit kalp stres ve değiştirilmiş plasental dolaşım fizyolojisi gerçekten önemli göstergeleri vardır ve böylece gelişimsel kusurlar tespit için gerekli birincil unsurları teşkil ve daha fazla yanıt olarak doğum öncesi hipoksik belirgin hale sonucu hemodinamik değişiklikler erken kalp yetmezliği için önde gelen stres. Beklenenin aksine, hipoksi maruz fetusa daha düşük kalp hızı vardı. Bu fenomen olgunlaşmamış kardiyak autoregulation mekanizmaları hipoksi, GD18.5 yanıt olarak fetal farelerde yansıtabilir. Ancak, tam Patogenezi bilinmemektedir.
Her ne kadar kalp yapıları canlı görüntüleme geliştirme20sırasında diğer gelişmiş fetal kardiyak Mr gibi görüntüleme yöntemleri, izin, hemodinamik durum kez statik görüntüler ve uzun prosedürleri nedeniyle kaybolur. Noninvaziv ultrason teknolojisi, öte yandan, temel fizyolojisi tutar vivo içinde dinamik görüntüleme performans sağlar. Ayrıca, yüksek frekans dönüştürücü ile geliştirilmiş çözünürlük durumu ile fetal kalp görselleştirme farklı gelişim aşamalarında her bireysel fetus fetal ek açıklama optimize ederek transgenik farelerde daha uygun olabilir yöntemleri. Son olarak, deneme başına maliyet bu yöntemle çok daha az olduğunu.
Kim gündüz vdtarafından önceki bir raporda, yazarlar önemli ve yeni anlayışlar ile ilgili veri toplama görüntüleme planı en iyi duruma getirme önceki nesil yüksek frekans ultrason sistemi21Imaging kullanılarak sağlanan. Zhou YQ vd., başka bir raporun Renkli Doppler sistemi22ile donatılmış bir yüksek frekans ultrason kullanarak standart temel ölçü birimlerinin fizyolojik düzeyinde fetal dolaşım kurmuştur. Bu nedenle, burada sunulan Protokolü daha önce kurulan iletişim kuralları tamamlar ve mümkün ve pratik gerçek zamanlı bir deneysel ortamda kapsamlı bir yöntem anahat için genişler. Bir gelişmiş ve son derece hassas yüksek frekans ultrason sistemi bu çalışmada feto plasental devre bir birim olarak taramak için kullanıldı. Basit ve etkili ölçülebilir ölçümleri GD18.5, farelerde fetal dolaşım hipoksi etkisi elde tarafından gösterildiği gibi bu güçlü sistemi istihdam için standart anahat iletişim kuralıdır.
Yine de, biz önemli sınırlamalar ve ölümcül kardiyak görüntüleme zorlukları kabul etmeliyiz: isoflurane, dahil olmak üzere ilk, anestezik ajanların fetüs fizyolojik parametrelerinin etkileyebilir. Uzun süreli anestezi, saç dökülmesi ve ultrasonik jel kalp hızı ve fetusa yanı sıra baraj kapaklarının hemodinamik endeksleri etkileyebilir hipotermi için yol açabilir. Şu anda, anestezik ajanların ve fetus üzerine etkileri düzeyini değerlendirmek için kullanılabilir hiçbir yöntemi vardır. Bu sınırlamayı aşmak için dikkatli bir şekilde onların Bazal kalp hızı ve yaşam belirtileri koruyarak uygun sedasyon baraj ulaşmak için inhale Isoflurane düzeyleri titre. İkincisi, derin karın içinde yer alan fetusa görüntülenmesi zor ve suboptimal, bu fetusa dışlanması için son verileri analiz önde gelen bu. Renkli Doppler görüntüleme bölümü ve dönüştürücü ve kan akımı arasında yeterli uyum geliştirilmiş optimizasyonu sağlar. Üçüncü olarak, aynı anda tüm fetusa analizini gerçekleştirmek hızlı ve doğru görselleştirme ve görüntü edinme operatörün verimliliği hızla, pratik eğitim önemi ima gerekir.
Son olarak, Bu yöntemde anahtar adımlar 1 de dahil olmak üzere vurguladı gerekir) sisteminin uygun hazırlık. 2) kararlı vücut ısısı ve kalp hızı hamile fare için korumak. 3) debisi isoflurane temel fizyolojik Birleşik güvenilir veri elde etmek için embriyoların korumak için en iyi duruma getirme. 4) tutarlı ve verimli resim alma mümkün olan en kısa zaman içinde. 5) Gestasyonel yaş, cinsiyet ve hayvan zorlanma, sonuçları önemli ölçüde etkileyebilecek önemli değişkenlerdir. Bu nedenle, deneysel protokol dikkatle bu değişkenler için veri analizi ve yorumu aynı hayvan zorlanma eşleşen denetimleri ekleyerek hesap için tasarlanmış olması.
Sonuç olarak, bir yüksek frekans ultrason sistemi fenotipik fetal kalp-damar sistemleri rahim içinde önemli deneysel ve bilimsel değeri ve olabilir potansiyel gelecekteki uygulamalar ile karakterizasyonu ulaşmak için etkili bir yöntemdir 1 Ekle) fizyolojik dinamikleri kalp geliştirme sırasında anlama. 2) sağlanması kapsamlı fenotipik analizi genetik modellerini CHDs. 3) kardiyak odası geliştirme, olgunlaşma ve adaptasyon stres etkisi feto plasental kan dolaşımı Elucidating. 4) ultrason gerçekleştirme fetal enjeksiyon toksinler, teratogens veya terapötik ajanlar gelecekteki çalışma için yönlendirilmelidir. 6) uygulama benek izleme ve gerilme analizi yetenekleri gelişmekte olan Miyokardiyum ayrıntılı bölgesel miyokardiyal işlevi elde etmek için bir olarak gelecekteki çalışmaları için sağlayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hiçbir çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz hayvan fizyolojisi çekirdek, Anabilim Dalı moleküler tıp UCLA teknik destek ve Vevo 2100 ultrason biomicroscopy (UBM) sistem açık erişim sağlamak için teşekkür ederiz. Bu çalışmada NIH/çocuk sağlığı Araştırma Merkezi (5K12HD034610/K12), UCLA çocuk Discovery Enstitüsü ve bugün ve yarın Çocuk Fonu tarafından desteklenen ve David Geffen School tıp araştırma yenilik ödülü için M. Touma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vevo 2100 | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | N/A | High Freequency Ultrasound Biomicroscopy. The set up is available in animal physiology core facility, division of molecular medicine, UCLA. USA |
| inbred mice (c57/BL6) | Charles River Laboratories | N/A | Inbread wild type mouse strain |
References
- Touma, M., Reemtsen, B., Halnon, N., Alejos, J., Finn, J. P., Nelson, S. F., Wang, Y. A Path to Implement Precision Child Health Cardiovascular Medicine. Front Cardiovasc Med. 4, 36 (2017).
- Triedman, J. K., Newburger, J. W. Trends in Congenital Heart Disease. The Next Decade. Circulation. 133, 2716-2733 (2016).
- Gilboa, S. M., et al. Congenital Heart Defects in the United States Estimating the Magnitude of the Affected Population in 2010. Circulation. 134, 101-109 (2016).
- Pruetz, J. D., et al. Outcomes of critical congenital heart disease requiring emergent neonatal cardiac intervention. Prenat Diagn. 34, 1127-1132 (2014).
- Peterson, C., et al. Mortality among Infants with Critical Congenital Heart Disease: How Important Is Timely Detection? Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 97 (10), 664-672 (2013).
- Atz, A. M., et al. Prenatal Diagnosis and Risk Factors for Preoperative Death in Neonates with Single Right Ventricle and Systemic Outflow Obstruction: Screening Data from the Pediatric Heart Network Single Ventricle Reconstruction Trial. J Thorac Cardiovasc Surg. 140 (6), For the Pediatric Heart Network Investigators 1245-1250 (2010).
- Lalani, S. R., Belmont, J. W. Genetic Basis of Congenital Cardiovascular Malformations. Eur J Med Genet. 57 (8), 402-413 (2014).
- Hanchard, N. A., Swaminathan, S., Bucasas, K., Furthner, D., Fernbach, S., Azamian, M. S., et al. A genome-wide association study of congenital cardiovascular left-sided lesions shows association with a locus on chromosome 20. Hum Mol. 11, 2331-2341 (2016).
- Arsenijevic, V., Davis-Dusenbery, B. N. Reproducible, Scalable Fusion Gene Detection from RNA-Seq. Methods Mol Biol. 1381, 223-237 (2016).
- LaHaye, S., Corsmeier, D., Basu, M., Bowman, J. L., Fitzgerald-Butt, S., Zender, G., et al. Utilization of Whole Exome Sequencing to Identify Causative Mutations in Familial Congenital Heart Disease. Circ Cardiovasc Genet. 9 (4), 320-329 (2016).
- Zaidi, S., Choi, M., Wakimoto, H., Ma, L., Jiang, J., Overton, J. D., et al. De novo mutations in histone modifying genes in congenital heart disease. Nature. 498 (7453), 220-223 (2016).
- Leirgul, E., Brodwall, K., Greve, G., Vollset, S. E., Holmstrom, H., Tell, G. S., et al. Maternal Diabetes, Birth Weight, and Neonatal Risk of Congenital Heart Defects in Norway, 1994-2009. Obstet Gynecol. 128 (5), 1116-1125 (2016).
- Garry, D. J., Olson, E. N. A Common Progenitor at the Heart of Development. Cell. 127 (6), 1101-1104 (2006).
- Postma, A. V., Bezzina, C. R., Christoffels, V. M. Genetics of congenital heart disease: the contribution of the noncoding regulatory genome. J Hum Genet. 61, 13-19 (2016).
- Ganguly, A., Touma, M., Thamotharan, S., De Vivo, D. C., Devaskar, S. U. Maternal Calorie Restriction Causing Uteroplacental Insufficiency Differentially Affects Mammalian Placental Glucose and Leucine Transport Molecular Mechanisms. Endocrinology. Oct. 157 (10), 4041-4054 (2016).
- Lluri, G., Huang, V., Touma, M., Liu, X., Harmon, A. W., Nakano, A. Hematopoietic progenitors are required for proper development of coronary vasculature. J Mol Cell Cardiol. 86, 199-207 (2015).
- Bishop, K. C., Kuller, J. A., Boyd, B. K., Rhee, E. H., Miller, S., Barker, P. Ultrasound Examination of the Fetal Heart. Obstet Gynecol Surv. 72 (1), 54-61 (2017).
- He, H., Gan, J., Qi, H. Assessing extensive cardiac echography examination for detecting foetal congenital heart defects during early and late gestation: a systematic review and meta-analysis. Acta Cardiol. 71 (6), 699-708 (2016).
- Hobbs, C. A., Cleves, M. A., Karim, M. A., Zhao, W., MacLeod, S. L. Maternal Folate-Related Gene Environment Interactions and Congenital Heart Defects. Obstet Gynecol. 116 (2 Pt 1), 316-322 (2016).
- Gabbay-Benziv, R., et al. A step-wise approach for analysis of the mouse embryonic heart using 17.6 Tesla MRI. Magn Reson Imaging. 35, 46-53 (2017).
- Kim, G. H. Murine fetal echocardiography. J Vis Exp. (72), e4416 (2013).
- Zhou, Y. Q., Cahill, L. S., Wong, M. D., Seed, M., Macgowan, C. K., Sled, J. G. Assessment of flow distribution in the mouse fetal circulation at late gestation by high-frequency Doppler ultrasound. Physiol Genomics. 46 (16), 602-614 (2014).
- Greco, A., Coda, A. R., Albanese, S., Ragucci, M., Liuzzi, R., Auletta, L., Gargiulo, S., Lamagna, F., Salvatore, M., Mancini, M. High-Frequency Ultrasound for the Study of Early Mouse Embryonic Cardiovascular System. Reprod Sci. 22 (12), 1649-1655 (2015).
- Deneke, T., Lawo, T., von Dryander, S., Grewe, P. H., Germing, A., Gorr, E., Hubben, P., Mugge, A., Shin, D. I., Lemke, B. Non-invasive determination of the optimized atrioventricular delay in patients with implanted biventricular pacing devices. Indian Pacing Electrophysiol J. 10 (2), 73-85 (2010).
- Kono, M., Kisanuki, A., Ueya, N., Kubota, K., Kuwahara, E., Takasaki, K., Yuasa, T., Mizukami, N., Miyata, M., Tei, C. Left ventricular global systolic dysfunction has a significant role in the development of diastolic heart failure in patients with systemic hypertension. Hypertens Res. 33 (11), 1167-1173 (2010).
