Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Identifikation af skeletmuskulatur satellit celler ved immunfluorescens med Pax7 og Laminin antistoffer

doi: 10.3791/57212 Published: April 19, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Nøjagtig identifikation af satellit celler er afgørende for at studere deres funktioner under forskellige fysiologiske og patologiske betingelser. Denne artikel præsenterer en protokol for at identificere satellit celler på voksne skeletmuskulatur sektioner af immunofluorescens-baserede farvning.

Abstract

Immunfluorescens er en effektiv metode, der hjælper til at identificere forskellige celletyper på væv sektioner. For at studere befolkningens ønskede celle, anvendes antistoffer for bestemte celle markører på væv sektioner. I voksne skeletmuskulatur er satellit celler (SCs) stamceller, der bidrager til muskel reparation og regeneration. Det er derfor vigtigt at visualisere og spore satellit cellen befolkningen under forskellige fysiologiske tilstande. I hvile skeletmuskulatur, bor SCs mellem basal lamina og myofiber plasmamembran. Et almindeligt anvendte markør til at identificere SCs på myofibers eller i cellekultur er parrede boks protein Pax7. I denne artikel præsenteres en optimeret Pax7 immunofluorescens protokol på skeletmuskulatur sektioner der minimerer uspecifik farvning og baggrund. Et andet antistof, der genkender et protein (laminin) af basal lamina blev også tilføjet for at hjælpe med at identificere SCs. lignende protokoller kan også bruges til at udføre dobbelt eller tredobbelt mærkning med Pax7 og antistoffer for ekstra proteiner af interesse.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Skeletmuskulatur er sammensat af multinucleated muskelceller, kaldet myotubes, organiseret i myofibers, som genererer kraft og bevægelser gennem sammentrækning. Mest skeletmuskulatur, bortset fra nogle kraniofaciale muskler, er afledt af en midlertidig embryonale struktur kaldet en somite1. Myogenic forløber celler delaminere fra den epitel somite at blive myoblasts. Myoblasts yderligere differentiere i myocytes, der smelter sammen og bliver myotubes til at danne multi nucleated myofibers. Ovenstående proces kaldes myogenesis og er kendetegnet ved tidsligt reguleret kontrol af genekspression. Myogenic prækursorer express Pax3 og Pax7, mens myoblasts express MyoD og/eller Myf5 og myocytes express myogenin og myosins2,3. Muskelvækst er en proces, hvor myofibers bliver større ved at integrere flere myonuclei i eksisterende fibre (hyperplasi) og af en stigning i muskel fiber størrelse (hypertrofi)4. Under muskelvækst er der en bæredygtig kilde til myogenic celler, der har stamcelleforskning egenskaber i, at de kan skelne og selv forny. Disse celler kaldes satellit celler baseret på deres fysiske placering mellem sarcolemma (celle membran af myofiber) og basal lamina5. SCs energisk bidrage til muskelvækst i juvenil fase (de første 2-3 uger af postnatal mus), men bliver inaktiv i hvile voksen muskel6. Bemærkelsesværdigt, de kan aktiveres igen i svar til muskel skader og differentiere sig til nye muskelceller til at reparere beskadigede muskel7.

Stamcelle egenskaber gør studiet af SCs relevante for både grundlæggende muskelbiologi og terapier af muskel sygdomme8. Som et resultat, har det været et område med intens undersøgelse i de seneste årtier. Er sket en enorm fremskridt i dissekere genetik og Epigenetik SCs9,10. Teknikker involveret i isolering og identifikation af SCs i situ var udviklet og optimeret langs vej11. Immunfluorescent farvning tillader identifikation af SCs ved brug af specifikke antistoffer, herunder for Pax7. Dog render knaphed og lille størrelse af SCs kombineret med en stærk auto-fluorescens af voksne skeletmuskulatur væv visualisering udfordrende. Her, vi beskriver en immunfluorescent farvning protokol optimeret til musen muskelvæv for Pax7 og baseret på en eksisterende metode for zebrafisk muskel12. Derudover er en Laminin antistof mærket med en særskilt fluorophore ansat til at identificere basal lamina hvorunder SCs er placeret. Denne protokol tillader konsekvent visualisering af Pax7-positive SCs og myogenic prækursorer under alle testede fysiologiske forhold og udviklingsstadier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I denne protokol, blev forreste hind lemmer muskler af voksen mus (2-6 måneder), tibialis anterior (TA) og extensor digitorum longus (EDL), ansat som et eksempel til at udføre immunofluorescens farvning på deres SCs. Alle de skridt, håndtering af mus og muskel væv dissektioner er blevet godkendt af Animal Care og brug udvalg (ACUC) af NIAMS/NIH.

1. dissekere TA/EDL muskel fra mus Hind lemmer

  1. Aflive mus i en CO2 fyldt eutanasi kammer under retningslinjer for ACUC af NIH. Udføre cervikal dislokation, hvis nødvendigt.
  2. Sætte musen opad på en dissektion pad (liggende). Spray 70% ethanol på sin mave hud. Klip en 1-2 cm åbning vandret på midten af musen mave hud, så deskin musen ved at trække åbningen mod mus fødder. Udsætte den ene side af mus hind lemmer.
  3. Bruge to skarpe pincet: Brug en til at holde de sener, der lægger TA/EDL til anklen, og bruge anden, til at bryde og shear fascia dækker TA/EDL. Når fascia er pillet ud, bruge den skarpe spids af pincet til at frigøre TA/EDL fra tibia knogle ved at køre tip nedenunder TA/EDL muskel.
  4. Afbrød ankel sener med saks mens du stadig holder dem med pincet. Trim musklen med saks langs længderetningen TA/EDL fra anklen til knæet mens du løfter TA/EDL fra ankel side med pincet. Skære knæ-side sener for at frigøre det hele TA/EDL fra skinnebenet.

2. Cryo-indlejring af TA/EDL muskel

  1. Forberede et flydende kvælstof bad i en container, fx., en flydende kvælstof Dewar kolbe. Hæld methylbutane i en lille plastik bæger (ca 20 mL) til halv-fuld. Derefter sætte bægerglasset i flydende nitrogen bad til at fryse den. Efter et par minutter, check at methylbutane er frosset.
    Bemærk: Den flydende kvælstof kan erstattes af en spand med tøris, men den nedfrysning tid er langsommere.
  2. Lægge den dissekeret TA/EDL på den flade del af en lille plastic sprøjte stemplet. Fuldt ud dække TA/EDL med et par dråber af Optimal opskæring temperatur (O.C.T.) sammensatte (indefrysning medium).
  3. Tage methylbutane bæger ud af flydende kvælstof badet og tø overfladen med et varmt objekt (fx., håndtaget på saksen). Hurtigt dækket dukkert i O.C.T. TA/EDL på stemplet ind i den smeltede methylbutane til snap-freeze væv.
  4. Frigøre den indlejrede væv fra stemplet med pincet, og sætte det ind i en 1,5 mL microcentrifuge rør. Glasset anbringes i flydende kvælstof til at gemme det under håndtering flere prøver.
    Bemærk: Den indlejrede væv kan opbevares ved-80 ° C for langsigtet (2 år) eller -20 ° C for kort sigt (6 måneder).

3. kryostater skæring

  1. Tilføj en dråbe af O.C.T. sammensatte på midten af en prøveholder af en kryostaten. Vent, indtil O.C.T. sammensat er næsten størknet. Hurtigt holde den integrerede TA/EDL til O.C.T. sammensatte, vinkelret med ankel-siden ned og knæ-side op.
  2. Montere præparatholderen på en kryostaten, skære væv på 10 µm interval og indsamle cryo-sektioner på frost belagt dias med om 4-8 sektioner på ét dias.
  3. Tørre sektioner ved stuetemperatur i mindst 3 timer at overnatte.
    Bemærk: Selv om tørring sektioner i fryser for natten eller længere er acceptabel, vil det uundgåeligt stige til autofluorescence. For de bedste resultater, tørre sektioner til 0,5 h, derefter gå videre med fiksering og farvning trin straks.
  4. Indsamle dias i et dias boks og bruge dem straks, eller gemme dias på-80 ° C eller -20 ° C til senere brug.

4. forberedelse af reagenser til immunofluorescens farvning

  1. Forberede buffere:
    1. Forberede 2 L 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS) fra 10 x PBS.
    2. Forberede 40 mL 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i 1 x PBS fra 16% PFA.
    3. Forberede 2 L af PBST: 1 x PBS med 0,1% Triton-100.
    4. Forberede 50 mL af PBST-B: PBST med 2% bovint serumalbumin (BSA).
    5. Forberede 10 mL af PBST-B-G: PBST med 2% BSA og 5% normalt ged Serum.
    6. Forberede 1 mL af blokering løsning. Fortyndet AffiniPure Fab fragmentet ged anti-mus IgG (H + L) (1:10) i PBST-B.
    7. Forberede 200 mL af 1 x citratbuffer.
      Bemærk: Bind af løsninger ovenfor er tilstrækkelige til mindst 5 dias. Diskenheder skal tilpasses antallet af dias og størrelsen af diaset containere.
  2. Forberede antistof pletter:
    1. Primære antistoffer (arbejdende koncentration): forberede 1,2 mL af primære antistof mix ved at fortynde Pax7 monoklonalt muse-antistof (IgG1) (1-5 µg/mL) + Laminin polyklonale kanin antistof (0,5-2 µg/mL) + MF20 monoklonalt muse-antistof (IgG2b) (0,5-2,5 µg / mL) i PBST-B-G.
      Bemærk: Monoklonalt muse-antistof, MF20 (IgG2b) er valgfri.
    2. Sekundære antistoffer (arbejdende koncentration): forberede 1,2 mL sekundær antistof mix ved at fortynde ged anti-mus IgG1 cross-adsorberet sekundær antistof, Alexa Fluor 488 (0,5-2 µg/mL) + ged anti-kanin IgG (H + L) meget cross-adsorberet sekundær antistof, Alexa Fluor Plus 555 (0,5-2 µg/mL) + ged anti-mus IgG2b cross-adsorberet sekundær antistof, Alexa Fluor 647 (0,5-2 µg/mL) i PBST-B-G.
      Bemærk: Alexa Fluor 647 er valgfri.

5. immunofluorescens farvning trin

  1. Rehydrere og lave cryo-sektioner med PFA.
    1. Fjerne et par af TA/EDL cryo-sektion dias fra boksen dias. Varm dias i et dias-bedrift bakke ved stuetemperatur.
    2. Brug en flydende blocker pen (PAP pen) til at tegne et område, der omfatter alle cryo-sektionerne på diaset. Denne kreds vil forhindre løsningerne fra flyder væk fra diaset.
    3. Tage bakken til et laboratorium stinkskab. Tilføje 300-500 µL af 4% PFA i diaset i kredsede området at fastsætte sektioner ved stuetemperatur i 10 min. Skyl ud PFA med 1 x PBS mindst 3 x 5 min. i en beholder, dias.
      Forsigtig: PFA er giftigt og farligt affald; Det bør drives med omhu og bortskaffes i en beholder, farligt affald.
  2. Antigen hentning
    1. Fyld en anden dias beholder med 200 mL af citratbuffer.
    2. Overføre dias i containeren. Overføre container med dias til en trykkoger til at koge dias i højtryk mode i 10 min.
    3. Køle container med dræne vand i 10 min. overførsel alle dias til en ny container med PBST (200 mL), skyl dias med PBST for mindst 3 x 5 min.
  3. Blokering
    1. Tilføj vand-gennemblødt kimwipes til bakken holder dias til at oprette et fugtigt miljø for at undgå udtørring af dias.
    2. Flytte dias tilbage til bakken, og tilføje 200 µL blokerende løsning på hvert dias. Dække bakken med en hætte og lad blokering udvikle i 30 min.
      Bemærk: Pax7 antistof er et monoklonalt muse-antistof, så der er uspecifik binding af musen IgG i mus muskelvæv der skaber høj baggrund. Ved hjælp af den AffiniPure Fab fragmentet ged anti-mus IgG (H + L) blokerer musen på musen uspecifik bindende.
  4. Anvende primære antistoffer.
    1. Skyl dias med PBST engang i objektbeholderen dias. Derefter flytte dias tilbage til bakken farvning.
    2. Anvende 200 µL af primære antistof mix på hvert dias, dække bakken med en fælles landbrugspolitik, og lad reaktionen udvikle ved stuetemperatur i 1 time eller ved 4 ° C for natten.
      Bemærk: Overnight reaktionen ved 4 ° C giver det bedste resultat, selv om udvikle reaktion ved stuetemperatur giver tilfredsstillende resultater. Myosin MF20 antistof kan tilføjes i blandingen for at udføre en triple (Pax7, MF20, Laminin) mærkning. MF20 pletter differentierede muskelfibre. Dette trin fungerer også som en anden blokerende skridt med PBST-B-G at reducere potentielle uspecifik bindende fra sekundære antistoffer (ged antistoffer) i de følgende trin.
  5. Anvende sekundære antistoffer.
    1. Vaske ud de primære antistoffer med PBST ved stuetemperatur mindst 3 x 5 min.
    2. Tilføje 200 µL af sekundær antistof mix til hver dias, og tillade reaktion at udvikle ved stuetemperatur i mindst 1 time.
      Bemærk: For Pax7 + Laminin, bruge ged anti-mus IgG1 Alexa 488 og ged anti-kanin Alexa 555.
      Pax7 + Laminin + MF20, tilføje ged anti-mus IgG2b Alexa 647 i blandingen.
    3. Vaske ud de sekundære antistoffer med PBST mindst 3 x 5min.
  6. DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) Counter pletten og montering
    1. Fortynd DAPI (1:20, 000) i PBST i dias beholder, fx10 µL af DAPI i 200 mL af PBST.
    2. Pletten dias i objektbeholderen DAPI i 3 min.
    3. Udviske DAPI med PBST for mindst 5 x 5 min.
    4. Montere dias med montering medium. Dække dias med coverslips.
      Forsigtig: DAPI er giftige og farlige; Det skal håndteres med omhu og bortskaffes i farligt affald flaske.

6. fluorescerende mikroskopi

Bemærk: Immunfluorescent farvning protokollen nævnt ovenfor vil give SCs visualisering med enten en wide-felt fluorescerende eller Konfokal mikroskop. Det kan være i første omgang udfordrende at identificere SCs. Her er nogle anbefalede foranstaltninger, som kan være til hjælp.

  1. Bruge DAPI kanal og lav forstørrelse mål for at visualisere sektioner på diasene.
  2. Skift forstørrelse fra lav til høj. For at overholde SCs, er i det mindste en 20 X mål påkrævet).
  3. Bruge dobbelt filter kuben for 488 (FITC) / 555 (rodamin) at observere både Pax7 og Laminin signaler på samme tid at identificere SCs. Under denne indstilling har signal af Pax7 farvning en bedre kontrast til baggrundsstøjen.
  4. Hurtigt skifte kanal fra FITC til DAPI til korrekt at identificere SCs. Alle SCs bør være Pax7/DAPI-positive.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Efter ovenstående trin, kan SCs visualiseres med succes i voksen hvilende muskel sektioner under en fluorescerende mikroskop (figur 1). Selv om den voksne muskelvæv har stærke auto-fluorescens i visse typer af fibre, de lyse Alexa serien farvestoffer kan overvinde baggrundsstøjen og signalet skiller sig ud (figur 1A, B, pilespidser). To-foton Konfokal mikroskopi indfanger et relativt renere billede (figur 1B) end wide-felt fluorescerende mikroskop (figur 1A). Samme protokol også arbejdet godt på muskelvæv af juvenile mus (figur 2A), musen embryoner (figur 2B), og såret voksen muskelvæv (figur 3). I juvenil og embryonale muskelvæv, er der flere aktiverede SCs (figur 2A, pile) eller Pax7-positive myogenic prækursorer (figur 2B, pile), der har relativt større kerner; Det er således forholdsvis nemmere at visualisere SCs af yngre mus end af voksen mus (figur 2 versus figur 1). I den skadede muskelvæv, der også er mere aktiveret Pax7-positive SCs (figur 3).

Figure 1
Figur 1: billeder af Pax7 og Laminin immunofluorescens på musen voksen hviler muskelvæv. TA/EDL muskel sektioner af voksen mus blev immunostained med Pax7 (grøn) og Laminin (rød) antistoffer, og modvirke farves med DAPI (blå). (A) billed fanget under en wide-felt fluorescerende mikroskop. (B) billed fanget under en Konfokal mikroskop. Skalere barer: 50 µm. pile: SCs fra fibre med lav autofluorescence. Pilespidser: SCs fra fibre med høj autofluorescence. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: billeder af Pax7 og Laminin eller MF20 immunofluorescens på muskelvæv af yngre mus. TA/EDL muskel sektioner af yngre mus blev immunostained med Pax7 (grøn) og Laminin (rød) eller MF20 (magenta) antistoffer, og modvirke farves med DAPI (blå). (A) Postnatal dag 8 (P8) muskel afsnit fanget under en Konfokal mikroskop. (B) embryonale dag 17,5 (E17.5) muskel afsnit fanget under en wide-felt fluorescerende mikroskop. Skalere barer = 50 µm. pile: SCs i P8 muskel afsnit (A); repræsentative Pax7 + myogenic prækursorer i E17.5 muskel afsnit, mens der er mere i billede (B). Disse to billeder blev ændret fra raw-data, også genereres billeder i et offentliggjort papir13 (sfigur 3D) og (sfigur 1B), henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: et repræsentativt billede af Pax7 og Laminin immunofluorescens på tilskadekomne voksen muskelvæv. TA/EDL muskel sektioner af en skadet voksen muskelvæv (7 dage efter skade) var immunostained med Pax7 (grøn) og Laminin (rød) antistoffer, og mod farves med DAPI (blå). Billedet blev taget til fange under en Konfokal mikroskop. Skalalinjen = 50 µm. pile: SCs i afsnittet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den ovennævnte protokol var baseret på en metode til Pax7/MF20 farvning på zebrafisk skeletmuskulatur12. Løsningerne anvendes og blokerer trin er identiske eller lignende. Antistofferne anvendes er identiske. De justerede trin var baseret på funktionerne i musen muskelvæv og SCs. Først, Laminin antistof blev tilføjet i blanding til at visualisere og bekræfte placeringen af SCs. Det var især nyttigt at tælle antallet af SCs under mikroskop, når du bruger dobbelt filter terning af 488/555; Dette forbedret stærkt SC-afledte Pax7 signal at skille sig ud fra støjende autofluorescent baggrund. For det andet, da det Pax7 antistof bruges er en muse-antistof, vi tilføjet en mus på musen blokerende trin (trin 5.3) for at reducere baggrunden som følge af uspecifik bindingen af musen IgG. Tredje var antigen hentning trin (trin 5.2) kritisk til farvning med Pax7 antistof på PFA faste væv.

Samme protokol blev brugt på muskelvæv af yngre mus (unger og embryoner) (figur 2). Faktisk var det relativt nemmere at visualisere SCs i hvalpe end hos voksne mus af samme protokol. Det kan være nyttigt at begynde med farvning SCs på unger til at samle erfaringer før man går videre med voksen muskelvæv. En negativ kontrol uden primære antistoffer (trin 5.4) er også nødvendig i hvert eksperiment. En lignende protokol brugt på paraffinsnit med ekstra paraffin behandling trin. Imidlertid i paraffin afsnit tendens til at have en højere autofluorescence baggrund, som maskeret signaler fra de SCs, der har relativt svagere Pax7 udtryk. Hvis det er muligt, undgå at bruge paraffinsnit. Samme protokol var også ansat på tilskadekomne muskelvæv, der har talrige SCs, og gav lignende resultater til dem, der opnås med den pup muskelvæv (figur 3).

Muskel væv autofluorescence udgør den store hindring at få ren immunofluorescens resultater14. At reducere tørretiden på cryo-sektioner kan mindske autofluorescence og ved hjælp af frisklavede cryo-sektioner kan varmt anbefales. I lighed med andre protokoller15, musen på musen blokerende skridt er forpligtet til at yderligere at reducere baggrunden.

Mens både wide-felt fluorescerende mikroskop og konfokal mikroskop var effektive for SCs visualisering gennem øjet stykker, anbefales brug af Konfokal mikroskop til at fange billeder i høj kvalitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi takker NIAMS Light Imaging sektion for at give mikroskoper og teknisk hjælp. MF20 og Pax7 antistofferne blev indhentet fra de udviklingsmæssige undersøgelser hybridom Bank udviklet i regi af NICHD og vedligeholdes af Department of Biological Sciences, The University of Iowa, Iowa City. Dette arbejde blev støttet af murene forskning Program af NIAMS af National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
methylbutane Sigma-Aldrich M32631
Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound Electron Microscopy Sciences 62550-01
10x PBS Gibco, Themo Fisher 70011-044
16% PFA TED PELLA 50-00-0
Triton-100 Sigma-Aldrich T8787
Normal Goat Serum Thermo Fisher 0 1-6201
AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. 115-007-003
20x Citrate Buffer Thermo Fisher 00 500
Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) Developmental Study Hybridoma Bank N/A
Laminin polyclonal rabbit antibody Sigma-Aldrich L9393
MF20 mono-clonal mouse antibody (IgG2b) (supernatant) Developmental Study Hybridoma Bank N/A
Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher A-21121
Goat anti-Mouse IgG2b cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 647 Thermo Fisher A-21242
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 Thermo Fisher A32732
Leica CM1860 cryostat
Leica DM6000 wide-field fluorescent microscope
Leica DMR wide-field fluorescent microscope
Zeiss LSM510 confocal microscope
Zeiss LSM780 confocal microscope
Cuisinart electronic pressure cooker

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buckingham, M. Gene regulatory networks and cell lineages that underlie the formation of skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, (23), 5830-5837 (2017).
  2. Buckingham, M., Relaix, F. PAX3 and PAX7 as upstream regulators of myogenesis. Semin Cell Dev Biol. 44, 115-125 (2015).
  3. Relaix, F., Buckingham, M. From insect eye to vertebrate muscle: redeployment of a regulatory network. Genes Dev. 13, (24), 3171-3178 (1999).
  4. Chang, N. C., Chevalier, F. P., Rudnicki, M. A. Satellite Cells in Muscular Dystrophy - Lost in Polarity. Trends Mol Med. 22, (6), 479-496 (2016).
  5. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).
  6. Kuang, S., Rudnicki, M. A. The emerging biology of satellite cells and their therapeutic potential. Trends Mol Med. 14, (2), 82-91 (2008).
  7. Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. Satellite cells, the engines of muscle repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, (2), 127-133 (2011).
  8. Rinaldi, F., Perlingeiro, R. C. Stem cells for skeletal muscle regeneration: therapeutic potential and roadblocks. Transl Res. 163, (4), 409-417 (2014).
  9. Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis. Curr Opin Cell Biol. 19, (6), 628-633 (2007).
  10. Giordani, L., Puri, P. L. Epigenetic control of skeletal muscle regeneration: Integrating genetic determinants and environmental changes. FEBS J. 280, (17), 4014-4025 (2013).
  11. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nat Protoc. 10, (10), 1612-1624 (2015).
  12. Feng, X., Adiarte, E. G., Devoto, S. H. Hedgehog acts directly on the zebrafish dermomyotome to promote myogenic differentiation. Dev Biol. 300, (2), 736-746 (2006).
  13. Juan, A. H., et al. Polycomb EZH2 controls self-renewal and safeguards the transcriptional identity of skeletal muscle stem cells. Genes Dev. 25, (8), 789-794 (2011).
  14. Jackson, K. A., Snyder, D. S., Goodell, M. A. Skeletal muscle fiber-specific green autofluorescence: potential for stem cell engraftment artifacts. Stem Cells. 22, (2), 180-187 (2004).
  15. Lepper, C., Conway, S. J., Fan, C. M. Adult satellite cells and embryonic muscle progenitors have distinct genetic requirements. Nature. 460, (7255), 627-631 (2009).
Identifikation af skeletmuskulatur satellit celler ved immunfluorescens med Pax7 og Laminin antistoffer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Feng, X., Naz, F., Juan, A. H., Dell'Orso, S., Sartorelli, V. Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies. J. Vis. Exp. (134), e57212, doi:10.3791/57212 (2018).More

Feng, X., Naz, F., Juan, A. H., Dell'Orso, S., Sartorelli, V. Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies. J. Vis. Exp. (134), e57212, doi:10.3791/57212 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter