Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Identifikasjon av Skjelettmuskel satellitt celler av Immunofluorescence med Pax7 og Laminin antistoffer

doi: 10.3791/57212 Published: April 19, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Nøyaktig identifikasjon av satellitt celler er avgjørende for å studere deres funksjoner under ulike fysiologiske og patologiske forhold. Denne artikkelen presenterer en protokoll for å identifisere satellitt celler på voksen Skjelettmuskel deler av immunofluorescence-baserte flekker.

Abstract

Immunofluorescence er en effektiv metode som bidrar til å identifisere ulike celletyper på vev deler. For å studere befolkningen ønsket celle, brukes antistoffer for bestemt celle markører på vev deler. I voksen skjelettmuskulatur er satellitt celler (SCs) stilk celler som bidrar til muskel reparasjon og gjenfødelse. Derfor er det viktig å visualisere og spore befolkningen satellitt cellen under ulike fysiologiske forhold. Hvile skjelettmuskulatur, ligger SCs mellom basale lamina og myofiber plasma membran. En vanlig markør for å identifisere SCs i myofibers eller i cellekultur er sammenkoblet boksen protein Pax7. I denne artikkelen presenteres en optimalisert Pax7 immunofluorescence protokoll på skjelettmuskulatur deler som minimerer uspesifisert flekker og bakgrunn. En annen antistoff som gjenkjenner et protein (laminin) av den basale lamina ble også lagt identifisere SCs. ligner protokoller kan også brukes til å utføre dobbel eller trippel merking med Pax7 og antistoffer for ekstra proteiner av interesse.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Skjelettmuskel består av multinucleated muskelceller, kalt myotubes er organisert i myofibers, som genererer kraft og bevegelser gjennom sammentrekning. Mest skjelettlidelser muskler, med unntak av noen craniofacial muskler, er avledet fra en midlertidig embryonale struktur kalt somite1. Myogenic forløper celler delaminate fra den epithelial somite å bli myoblasts. Myoblasts videre differensiere i myocytter at sikringen for å bli myotubes til flere kjerne myofibers. Over prosessen kalles myogenesis og er preget av timelig regulert kontroll av genuttrykk. Myogenic forløpere uttrykke Pax3 og Pax7, mens myoblasts express MyoD og/eller Myf5 og myocytter express myogenin og myosins2,3. Muskelvekst er en prosess der myofibers bli større ved å innlemme flere myonuclei i eksisterende fiber (hyperplasia) og en økning i muskel fiber størrelse (hypertrofi)4. Under muskelvekst er det en bærekraftig kilde myogenic celler som har stamcelleforskningen egenskaper ved at de kan differensiere og selvstendig fornye. Disse cellene kalles satellitt cellene basert på deres fysiske plassering mellom sarcolemma (celle membran av myofiber) og de basale lamina5. SCs kraftig bidra til muskelvekst i juvenile scenen (de første 2-3 uker postnatal mus), men bli quiescent i hviler voksen muskel6. Bemerkelsesverdig, de kan være aktivert på nytt svar på muskel skader og skille ut nye muskelceller å reparere det skadede muskel7.

Egenskapene stamcelleforskningen gjøre studiet av SCs relevant for både grunnleggende muskel biologi og behandling av muskel sykdommer8. Som et resultat har det vært et område av intens gransking i de siste tiårene. En enorm fremgang har blitt gjort i dissekere arvelighetsforskning og epigenetics SCs9,10. Teknikker involvert i isolere og identifisere SCs i situ ble utviklet og optimalisert langs måten11. Immunofluorescent flekker kan identifikasjon av SCs ved bruk av spesifikke antistoffer, inkludert som for Pax7. Imidlertid gjengi knapphet og størrelsen av SCs kombinert med en sterk auto-fluorescens av voksen skjelettlidelser muskelvev visualisering utfordrende. Her beskriver vi en immunofluorescent fargeprotokoll optimalisert for musen muskelvev for Pax7 og basert på en eksisterende metode for sebrafisk muskler12. I tillegg er en Laminin antistoff merket med en distinkt fluorophore ansatt å identifisere de basale lamina som SCs er plassert. Denne protokollen kan konsekvent visualisering av Pax7-positive SCs og myogenic forløpere under alle testet fysiologiske forhold og utviklingsstadier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I denne protokollen, ble de fremre hind lem musklene voksen mus (2-6 måneder), anterior tibialis (TA) og extensor digitorum longus (EDL), brukt som et eksempel å utføre immunofluorescence flekker på deres SCs. Alle trinnene mus og muskel vev disseksjoner er godkjent av Animal Care og bruk Committee (ACUC) av NIAMS/NIH.

1. dissekere TA/EDL muskelen fra musen Hind Ben

  1. Euthanize musen i en CO2 fylt euthanasia kammer under retningslinjene for ACUC av NIH. Utføre cervical forvridning hvis nødvendig.
  2. Sette opp den musen på en disseksjon pad (ryggen). Spray 70% etanol på magen huden. Kutte en 1-2 cm åpning vannrett på midten av musen magen huden, så deskin musen ved å trekke åpningen mot musen føttene. Utsett ene musen hind lem.
  3. Bruk to skarpe tang: Bruk en for å holde sener knytter TA/EDL til ankelen, og bruk den andre en å bryte og skjær fascia dekker TA/EDL. Når fascia atskilt fra, kan du bruke skarp spissen av Tang koble TA/EDL fra tibia benet ved å kjøre spissen under TA/EDL muskelen.
  4. Avskåret ankel sener med saks mens du holder dem med tang. Trim muskler med saks langs langsgående TA/EDL fra ankelen til kneet mens du løfter TA/EDL fra ankelen side med tang. Kuttet kne-side sener for å løsne den hele TA/EDL fra tibia.

2. Cryo-innebygging av TA/EDL muskel

  1. Forberede en flytende nitrogen bad i en container, f.eks., en flytende nitrogen Dewar kolbe. Hell methylbutane i en liten plast kanne (ca 20 mL) til halvfull. Så putte begeret i flytende nitrogen badekaret å fryse det. Etter noen minutter, sjekk at methylbutane er frosset.
    Merk: Det flytende nitrogenet kan erstattes av en bøtte med tørris, men fryse tiden er tregere.
  2. Lå den dissekert TA/EDL på den flate delen av en liten plast sprøytestempelet. Fullt ut dekk TA/EDL med noen dråper av Optimal kutte temperatur (O.C.T.) sammensatte (frysing medium).
  3. Ta methylbutane begeret ut av flytende nitrogen badet og tine overflaten med en varm gjenstand (f.eks., håndtaket saks). Raskt dekket dukkert i O.C.T. TA/EDL på stempelet i smeltet methylbutane å snapin-fryse vevet.
  4. Koble den innebygde vev fra stempelet med tang, og legg den i en 1,5 mL microcentrifuge tube. Sett røret i flytende nitrogen å lagre den under behandling av flere prøver.
    Merk: Den innebygde vev kan lagres ved-80 ° C lang sikt (2 år) eller 20 ° C kort sikt (6 måneder).

3. kryostaten snitting

  1. Legg en dråpe O.C.T. sammensatte på midten av prøven innehaver av en kryostaten. Vent til O.C.T. sammensatte er nesten befestet. Raskt stikke den innebygde TA/EDL til den O.C.T. sammensatt, vinkelrett med ankel-side ned og kne-side opp.
  2. Montere prøveholderen på en kryostaten kuttet vev ved 10 µm og samle cryo-delene på frost belagt lysbilder med om 4-8 deler på ett lysbilde.
  3. Tørre delene ved romtemperatur for minst 3 h overnight.
    Merk: Selv om tørking delene i fryseren for natten eller lenger er akseptable, det vil uunngåelig øke autofluorescence. For best resultat, tørr avsnittene for 0,5 h, så fortsette med fiksering og flekker trinnene umiddelbart.
  4. Samle inn lysbildene i en lysbilde og bruk, eller lagre lysbilder på-80 ° C eller 20 ° C for senere bruk.

4. forberedelse av reagenser til Immunofluorescence flekker

  1. Forbered buffere:
    1. Forberede 2 L 1 x fosfat bufret saltvann (PBS) fra 10 x PBS.
    2. Forberede 40 mL 4% paraformaldehyde (PFA) i 1 x PBS fra 16% PFA.
    3. Forberede 2 L PBST: 1 x PBS med 0,1% Triton-100.
    4. Forberede 50 mL av PBST-B: PBST med 2% bovin serum albumin (BSA).
    5. Forberede 10 mL av PBST-B-G: PBST med 2% BSA og 5% Normal geit Serum.
    6. Forberede 1 mL av sperring løsning. Fortynne AffiniPure Fab Fragment geit anti-musen IgG (H + L) (1:10) i PBST-B.
    7. Forberede 200 mL 1 x citrate buffer.
      Merk: Volum av løsningene ovenfor er nok for minst 5 lysbilder. Volumer bør justeres i henhold til antallet lysbilder og størrelsen på lysbildet beholdere.
  2. Forbered antistoff flekker:
    1. Primære antistoffer (arbeider konsentrasjon): forberede 1,2 mL av primære antistoff fortynne Pax7 musen monoklonalt antistoff (IgG1) (1-5 µg/mL) + Laminin polyklonale kanin antistoff (0,5-2 µg/mL) + MF20 musen monoklonalt antistoff (IgG2b) (0,5-2.5 µg / mL) i PBST-B-G.
      Merknad: MF20 musen monoklonalt antistoff (IgG2b) er valgfrie.
    2. Sekundær antistoffer (arbeider konsentrasjon): forberede 1,2 mL av sekundær antistoff fortynne geit anti-musen IgG1 kryss-adsorbert sekundære antistoff, Alexa Fluor 488 (0,5-2 µg/mL) + geit anti-kanin IgG (H + L) svært kryss-adsorbert sekundære antistoff, Alexa Fluor pluss 555 (0,5-2 µg/mL) + geit anti-musen IgG2b kryss-adsorbert sekundære antistoff, Alexa Fluor 647 (0,5-2 µg/mL) i PBST-B-G.
      Merk: Alexa Fluor 647 er valgfritt.

5. immunofluorescence flekker trinn

  1. Rehydrate og fikse cryo-delene med PFA.
    1. Fjern noen TA/EDL cryo-delen lysbildene fra boksen lysbildet. Varm lysbildene i et lysbilde-holder brett ved romtemperatur.
    2. Bruk en flytende blokkering penn (PAP penn) for å trekke et område som omfatter alle cryo-delene på lysbildet. Denne sirkelen vil hindre løsninger strømmer ut av lysbildet.
    3. Ta skuffen til laboratoriet avtrekksvifte. Legge til 300-500 µL på 4% PFA inn i lysbildet innen sirkel å fikse delene ved romtemperatur for 10 min. vask ut PFA med 1 x PBS minst 3 x 5 min i lysbildet beholder.
      FORSIKTIG: PFA er giftig og en farlig avfall Det bør brukes med forsiktighet og kastes inn i en farlig avfall container.
  2. Antigen henting
    1. Fyll en annen lysbildet beholder med 200 mL citrate buffer.
    2. Overføre lysbildene i beholderen. Overføre beholderen med lysbilder til en trykkoker koker lysbildene i høytrykk modus for 10 min.
    3. Avkjøl beholderen med drenering vann for 10 min. overføre alle lysbilder til en ny container med PBST (200 mL), skyll lysbilder med PBST for minst 3 x 5 min.
  3. Blokkerer
    1. Legge til vann-gjennomvåt kimwipes skuffen holde lysbildene for å skape et fuktig miljø for å unngå tørking av lysbildene.
    2. Flytte lysbildene tilbake til skuffen, og legge 200 µL av blokkering løsning på hvert lysbilde. Dekke skuffen med en cap og la blokkering utvikle for 30 min.
      Merk: Pax7 antistoffer er en mus monoklonalt antistoff, så det er uspesifikke binding av musen IgG i musen muskler vev som skaper høye. Bruke AffiniPure Fab Fragment geit anti-musen IgG (H + L) blokkerer mus-på-mus uspesifikke bindingen.
  4. Bruke primære antistoffer.
    1. Skyll lysbildene med PBST i beholderen lysbildet. Deretter Flytt lysbildene tilbake til farging skuffen.
    2. Bruke 200 µL av primære antistoff blanding på hvert lysbilde, dekke skuffen med en cap og la reaksjonen utvikle ved romtemperatur 1t eller 4 ° C for overnatting.
      Merk: Overnatting reaksjonen på 4 ° C gir det beste resultatet, men utvikle reaksjonen ved romtemperatur gir tilfredsstillende resultater. Myosin MF20 antistoffer kan legges i blandingen til å utføre en trippel (Pax7, Laminin, MF20) merking. MF20 flekker differensiert muskelfibre. Dette trinnet fungerer også som et blokkerende steg med PBST-B-G for å redusere potensielle uspesifikke binding fra sekundær antistoffer (geit antistoffer) i følgende trinn.
  5. Bruke sekundære antistoffer.
    1. Vask ut primære antistoffer med PBST ved romtemperatur minst 3 x 5 min.
    2. Legge til 200 µL av sekundær antistoff blanding i hvert lysbilde, og la reaksjonen å utvikle ved romtemperatur for minst 1 time.
      Merk: For Pax7 + Laminin, bruke geit anti-musen IgG1 Alexa 488 og geit anti-kanin Alexa 555.
      For Pax7 + Laminin + MF20, legge geit anti-musen IgG2b Alexa 647 i miksen.
    3. Vask ut sekundære antistoffer med PBST minst 3 x 5min.
  6. DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) mot flekken og montering
    1. Fortynn DAPI (1:20, 000) i PBST i lysbildet beholderen, f.eks10 µL av DAPI i 200 mL av PBST.
    2. Stain lysbildene i beholderen DAPI i 3 minutter.
    3. Bleke DAPI med PBST i minst 5 x 5 min.
    4. Montere lysbildene med montering medium. Lokk glir med coverslips.
      FORSIKTIG: DAPI er giftige og farlige; Det bør håndteres med forsiktighet og kastes i farlig avfall flasken.

6. fluorescerende mikroskopi

Merk: Den immunofluorescent fargeprotokoll rapportert ovenfor vil tillate SCs visualisering med enten et bredt felt fluorescent eller AC confocal mikroskop. Det kan være utgangspunktet utfordrende å identifisere SCs. Her er noen anbefalte trinn som kan være til hjelp.

  1. Bruk DAPI kanal og lav forstørrelse mål for å visualisere delene på lysbildene.
  2. Bytte forstørrelsen fra lav til høy. For å observere SCs, minst 20 X målet er nødvendig).
  3. Bruke dobbelt filter kuben for 488 (FITC) / 555 (Rhodamine) å observere både Pax7 og Laminin signaler samtidig å identifisere SCs. Under denne innstillingen har signalet fra Pax7 flekker en bedre kontrast til bakgrunnsstøy.
  4. Raskt veksle kanal fra FITC å DAPI å identifisere SCs. Alle SCs skal Pax7/DAPI-positive.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Følge trinnene ovenfor, SCs kan være vellykket visualisert i voksen hvile muskel deler under fluorescerende mikroskop (figur 1). Selv om voksen muskelvev har sterk auto-fluorescens i visse typer fiber, de lyse Alexa serien fargestoffer kan overvinne bakgrunnsstøy og signalet skiller seg ut (figur 1A, B, pilespisser). To-fotonet AC confocal mikroskopi fanger en relativt renere bildet (figur 1B) enn wide-field fluorescerende mikroskopet (figur 1A). Samme protokoll også jobbet bra på muskel vev av juvenile mus (figur 2A), mouse embryoer (figur 2B), og skadet voksen muskel vev (Figur 3). I juvenile og embryonale muskel vev, det er mer aktivert SCs (figur 2A, piler) eller Pax7-positive myogenic prekursorer (figur 2B, piler) som har relativt større kjerner; Derfor er det relativt lettere å visualisere SCs yngre mus enn voksne mus (figur 2 versus figur 1). Skadet muskel vev, det er også flere aktivert Pax7-positive SCs (Figur 3).

Figure 1
Figur 1: bilder av Pax7 og Laminin immunofluorescence på musen voksen hviler muskel vev. TA/EDL muskel deler av voksen mus var immunostained med Pax7 (grønn) og Laminin (rød) antistoffer, og mot farget med DAPI (blå). (A) bildet tatt under fluorescerende mikroskop wide-feltet. (B) bildet tatt under AC confocal mikroskop. Skalere barer: 50 µm. piler: SCs av fiber med lav autofluorescence. Pilspisser: SCs av fiber med høy autofluorescence. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: bilder av Pax7 og Laminin eller MF20 immunofluorescence på muskel vev av yngre mus. TA/EDL muskel deler av yngre mus var immunostained med Pax7 (grønn) og Laminin (rød) eller MF20 (magenta) antistoffer, og mot farget med DAPI (blå). (A) Postnatal dag 8 (P8) muskel delen fanget under AC confocal mikroskop. (B) embryonale dag 17,5 (E17.5) muskel delen fanget under et bredt felt fluorescerende mikroskop. Skalere barer = 50 µm. piler: SCs i P8 muskel del (A); representant Pax7 + myogenic forløpere i E17.5 muskel delen, mens det er flere i bildet (B). Disse to bildene ble endret fra rådata som også genererte bilder i utgitte13 (sfigur 3D) og (sfigur 1B), henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: et representativt bilde av Pax7 og Laminin immunofluorescence på skadde voksen muskel vev. TA/EDL muskel deler av en skadet voksen muskel vev (7 dager etter skader) var immunostained med Pax7 (grønn) og Laminin (rød) antistoffer, og mot farget med DAPI (blå). Bildet tatt under AC confocal mikroskop. Skala bar = 50 µm. piler: SCs i delen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Over protokollen var basert på en metode for Pax7/MF20 flekker på sebrafisk Skjelettmuskel12. Løsningene brukt og blokkerer trinnene er identiske eller lignende. Antistoffer brukes er identiske. Justert trinnene var basert på funksjonene i musen muskelvev og SCs. Først Laminin antistoff ble lagt inn i blandingen til å visualisere og kontrollere plasseringen av SCs. Det var spesielt nyttig å telle antall SCs under mikroskopet ved dobbelt filter kuben av 488/555; Dette forbedret sterkt SC-avledet Pax7 signalet å skille seg ut fra støyende autofluorescent bakgrunnen. Andre siden Pax7 antistoffer brukes er en mus antistoff, lagt vi en mus-på-mus blokkerer trinn (trinn 5.3) for å redusere bakgrunnen fra uspesifikke binding av musen IgG. Tredje var antigen henting trinn (trinn 5.2) avgjørende for farging med Pax7 antistoffer på PFA fast vev.

Samme protokoll ble brukt på muskel vev av yngre mus (pups og embryo) (figur 2). Det var faktisk relativt lettere å visualisere SCs i pups enn i voksen mus ved samme protokoll. Det kan være nyttig å starte med flekker SCs på pups å få erfaring før du fortsetter med voksen muskelvev. En negativ kontroll uten primære antistoffer (trinn 5.4) er også nødvendig i hver eksperiment. En lignende protokoll ble brukt på parafinsnitt med ekstra parafin behandlingstrinnene. Men pleier parafinsnitt å ha en høyere autofluorescence bakgrunn, som maskert signaler fra SCs som har relativt svakere Pax7 uttrykk. Hvis mulig, unngå å bruke parafinsnitt. Samme protokoll var også ansatt på skadde muskel vev som har mange SCs, og ga lignende resultater til de med det pup muskelvev (Figur 3).

Muskel vev autofluorescence representerer store hinder i å oppnå rene immunofluorescence resultater14. Reduserer tørking av cryo-deler kan redusere autofluorescence og bruke nylagde cryo-partiene anbefales. Ligner andre protokoller15, mus-på-mus blokkerer trinnet er nødvendig å redusere bakgrunnen.

Mens både wide-field fluorescerende mikroskop og AC confocal mikroskop var effektive for SCs visualisering gjennom øyet stykker, anbefales bruk av AC confocal mikroskop å fange bilder av høy kvalitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi takker NIAMS lys tenkelig inndelingen for mikroskop og teknisk hjelp. MF20 og Pax7 antistoffer ble innhentet fra utviklingsmessige studier Hybridoma banken utviklet i regi av NICHD og vedlikeholdt av departementet av biologisk vitenskap, The University of Iowa, Iowa City. Dette arbeidet ble støttet av Intramural Research Program av NIAMS av National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
methylbutane Sigma-Aldrich M32631
Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound Electron Microscopy Sciences 62550-01
10x PBS Gibco, Themo Fisher 70011-044
16% PFA TED PELLA 50-00-0
Triton-100 Sigma-Aldrich T8787
Normal Goat Serum Thermo Fisher 0 1-6201
AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. 115-007-003
20x Citrate Buffer Thermo Fisher 00 500
Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) Developmental Study Hybridoma Bank N/A
Laminin polyclonal rabbit antibody Sigma-Aldrich L9393
MF20 mono-clonal mouse antibody (IgG2b) (supernatant) Developmental Study Hybridoma Bank N/A
Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher A-21121
Goat anti-Mouse IgG2b cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 647 Thermo Fisher A-21242
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 Thermo Fisher A32732
Leica CM1860 cryostat
Leica DM6000 wide-field fluorescent microscope
Leica DMR wide-field fluorescent microscope
Zeiss LSM510 confocal microscope
Zeiss LSM780 confocal microscope
Cuisinart electronic pressure cooker

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buckingham, M. Gene regulatory networks and cell lineages that underlie the formation of skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, (23), 5830-5837 (2017).
  2. Buckingham, M., Relaix, F. PAX3 and PAX7 as upstream regulators of myogenesis. Semin Cell Dev Biol. 44, 115-125 (2015).
  3. Relaix, F., Buckingham, M. From insect eye to vertebrate muscle: redeployment of a regulatory network. Genes Dev. 13, (24), 3171-3178 (1999).
  4. Chang, N. C., Chevalier, F. P., Rudnicki, M. A. Satellite Cells in Muscular Dystrophy - Lost in Polarity. Trends Mol Med. 22, (6), 479-496 (2016).
  5. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).
  6. Kuang, S., Rudnicki, M. A. The emerging biology of satellite cells and their therapeutic potential. Trends Mol Med. 14, (2), 82-91 (2008).
  7. Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. Satellite cells, the engines of muscle repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, (2), 127-133 (2011).
  8. Rinaldi, F., Perlingeiro, R. C. Stem cells for skeletal muscle regeneration: therapeutic potential and roadblocks. Transl Res. 163, (4), 409-417 (2014).
  9. Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis. Curr Opin Cell Biol. 19, (6), 628-633 (2007).
  10. Giordani, L., Puri, P. L. Epigenetic control of skeletal muscle regeneration: Integrating genetic determinants and environmental changes. FEBS J. 280, (17), 4014-4025 (2013).
  11. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nat Protoc. 10, (10), 1612-1624 (2015).
  12. Feng, X., Adiarte, E. G., Devoto, S. H. Hedgehog acts directly on the zebrafish dermomyotome to promote myogenic differentiation. Dev Biol. 300, (2), 736-746 (2006).
  13. Juan, A. H., et al. Polycomb EZH2 controls self-renewal and safeguards the transcriptional identity of skeletal muscle stem cells. Genes Dev. 25, (8), 789-794 (2011).
  14. Jackson, K. A., Snyder, D. S., Goodell, M. A. Skeletal muscle fiber-specific green autofluorescence: potential for stem cell engraftment artifacts. Stem Cells. 22, (2), 180-187 (2004).
  15. Lepper, C., Conway, S. J., Fan, C. M. Adult satellite cells and embryonic muscle progenitors have distinct genetic requirements. Nature. 460, (7255), 627-631 (2009).
Identifikasjon av Skjelettmuskel satellitt celler av Immunofluorescence med Pax7 og Laminin antistoffer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Feng, X., Naz, F., Juan, A. H., Dell'Orso, S., Sartorelli, V. Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies. J. Vis. Exp. (134), e57212, doi:10.3791/57212 (2018).More

Feng, X., Naz, F., Juan, A. H., Dell'Orso, S., Sartorelli, V. Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies. J. Vis. Exp. (134), e57212, doi:10.3791/57212 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter