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Developmental Biology

Identificación de células satélite del músculo esquelético por inmunofluorescencia con anticuerpos de laminina y Pax7

doi: 10.3791/57212 Published: April 19, 2018
* These authors contributed equally

Summary

La identificación precisa de las células satélite es fundamental para el estudio de sus funciones bajo varias condiciones fisiológicas y patológicas. Este artículo presenta un protocolo para identificar las células satélite en secciones del músculo esquelético adulto por tinción de inmunofluorescencia.

Abstract

La inmunofluorescencia es un método eficaz que ayuda a identificar los diferentes tipos de células en cortes de tejidos. Para estudiar la población de células deseada, anticuerpos para marcadores de células específicas se aplican en secciones de tejidos. En el músculo esquelético adulto, las células satélites (SCs) son células que contribuyen a la regeneración y reparación del músculo. Por lo tanto, es importante visualizar y localizar la población de células satélite en diferentes condiciones fisiológicas. En músculo esquelético en reposo, SCs residen entre la lámina basal y la membrana del plasma del myofiber. Un marcador utilizado para la identificación de SCs en la myofibers o en cultivo celular es la caja apareados proteína Pax7. En este artículo, se presenta un protocolo optimizado de inmunofluorescencia Pax7 en secciones del músculo esquelético que minimiza la tinción inespecífica y fondo. Otro anticuerpo que reconoce una proteína (laminina) de la lámina basal también se agregó ayudar a identificar protocolos SCs. Similar puede emplearse para realizar doble o triple de etiquetado con Pax7 y anticuerpos para proteínas adicionales de interés.

Introduction

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Músculo esquelético está compuesto por células multinucleadas musculares, llamado miotubos, organizado en myofibers, que generan fuerza y movimientos a través de la contracción. Más los músculos esqueléticos, excepto algunos músculos craneofaciales, se derivan de una estructura embrionaria temporal llamada un somite1. Células precursoras miógenas delaminate de la somite epitelial para convertirse en mioblastos. Mioblastos: más se diferencia en miocitos que se fusionan para convertirse en miotubos para formar myofibers multi-nucleated. El proceso anterior se llama miogénesis y se caracteriza por el control temporal regulado de la expresión génica. Precursores miogénicos expresan Pax3 y Pax7, mientras que los mioblastos expresan MyoD y Myf5 y miocitos expresan myogenin y miosinas2,3. Crecimiento muscular es un proceso en el cual myofibers ser más grandes por incorporar más petequiales existentes fibras (hiperplasia) y un aumento en la fibra muscular (hipertrofia) de tamaño4. Durante el crecimiento muscular, hay una fuente sostenible de células miógenas que tienen propiedades de células madre que pueden diferenciarse y autorrenovación. Estas células se denominan células satélite basadas en su ubicación física entre el sarcolema (membrana de la célula de la myofiber) y la lámina basal5. SCs vigorosamente contribuyen al crecimiento del músculo en la etapa juvenil (las primeras 2-3 semanas de postnatales ratones), pero convertido en reposo en reposo muscular adulto6. Notable, puede ser reactivadas en respuesta al músculo de lesiones y se diferencian en nuevas células del músculo para reparar el músculo dañado7.

Las propiedades de la célula de vástago hacen el estudio de SCs relevantes para la biología básica del músculo y terapias musculares enfermedades8. Como resultado, ha sido un área de intensa investigación en las últimas décadas. Una enormes progresos en la genética y epigenética del SCs9,10de disección. Técnicas de aislamiento e identificación de SCs en situ fueron desarrolladas y optimizadas a lo largo de la manera11. Tinción inmunofluorescente permite la identificación de SCs mediante el uso de anticuerpos específicos, incluyendo para Pax7. Sin embargo, la escasez y el tamaño pequeño del SCs combinado con una fuerte auto-fluorescencia del tejido músculo esquelético adulto hacen que la visualización desafiante. Aquí, describimos un protocolo de tinción inmunofluorescente optimizado para el tejido de músculo de ratón para Pax7 y basado en un método existente para músculo de pez cebra12. Además, se emplea un anticuerpo de laminina marcado con un fluoróforo distinto para identificar la lámina basal que el SCs se encuentran. Constantemente, este protocolo permite la visualización de SCs Pax7-positivo y precursores miogénicos bajo condiciones fisiológicas todo probadas y etapas de desarrollo.

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Protocol

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En el presente Protocolo, los músculos de extremidades anteriores de ratones adultos (2-6 meses), tibial anterior (TA) y extensor digitorum longus (EDL), fueron empleados como ejemplo para realizar la inmunofluorescencia que manchaba en las SCs. Todos los pasos manejo de ratones y músculo disecciones de tejidos han sido aprobadas por el cuidado Animal y uso Comité (ACUC) de NIAMS/NIH.

1. disecar el músculo EDL/TA de la extremidades del ratón

  1. Eutanasia el ratón en una cámara de llenado eutanasia CO2 bajo los lineamientos de la ACUC del NIH. Si es necesario, llevar a cabo la dislocación cervical.
  2. Ponga el ratón boca arriba en una plataforma de disección (decúbito supino). Rocíe el etanol al 70% en la piel de su vientre. Corte una abertura horizontal en el centro de la piel del vientre de ratón de 1-2 cm, luego deskin el ratón tirando la apertura hacia los pies del ratón. Exponer a un lado de las extremidades de ratón.
  3. Utilizar dos pinzas afiladas: utilice uno para sujetar los tendones que unen el TA/EDL hasta el tobillo y otro para romper y corte la fascia que cubre el TA/EDL. Una vez que la fascia se pela apagado, usar la punta afilada de las pinzas para separar el TA/EDL del hueso de la tibia mediante la ejecución de la punta por debajo del músculo EDL/TA.
  4. Cortar los tendones del tobillo con unas tijeras mientras aún los mantiene con el fórceps. Corte el músculo con tijeras a lo largo de la línea longitudinal de la TA/EDL desde el tobillo a la rodilla mientras levanta la TA/EDL desde el lado del tobillo con el fórceps. Cortar los tendones de la rodilla-lado para separar el todo TA/EDL de la tibia.

2. crio-inclusión del músculo EDL/TA

  1. Preparar un baño de nitrógeno líquido en un recipiente, por ej., un frasco Dewar de nitrógeno líquido. Vierta Metilbutano en un vaso de plástico pequeño (aproximadamente 20 mL) a la mitad. Luego poner el vaso en el baño de nitrógeno líquido para congelarlo. Después de unos minutos, compruebe que está congelado el Metilbutano.
    Nota: El nitrógeno líquido puede ser sustituido por un cubo de hielo seco, pero el tiempo de congelación es más lento.
  2. Pone la TA/EDL disecada sobre la superficie plana de un pequeño émbolo de plástico. Cubrir por completo la TA/EDL con unas gotas de óptimo corte temperatura (O.C.T.) compuesto (el medio de congelación).
  3. Tomar el vaso Metilbutano fuera el baño de nitrógeno líquido y descongelar la superficie con un objeto caliente (e.g., el mango de las tijeras). Rápidamente dip la O.C.T. cubierto TA/EDL del émbolo en el Metilbutano fundido a presión-congelar el tejido.
  4. Separar el tejido embebido de émbolo con pinzas y ponerlo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Coloque el tubo en nitrógeno líquido para almacenar durante la manipulación de las muestras más.
    Nota: El tejido embebido puede conservarse a-80 ° C para el largo plazo (2 años) o a-20 ° C a corto plazo (6 meses).

3. criostato de seccionamiento

  1. Añadir una gota de O.C.T. compuesto en el centro de un soporte de espécimen de un criostato. Espere hasta que el compuesto O.C.T. casi se solidifica. Pegar rápidamente la TA/EDL incrustado al compuesto O.C.T., perpendicular con el tobillo de lado abajo y el lado de la rodilla para arriba.
  2. Monte el soporte del espécimen en un criostato, cortar el tejido intervalos de 10 μm y recoger el cryo-secciones en toboganes de hielo recubierto con sobre 4-8 secciones en un portaobjetos.
  3. Secar las secciones a temperatura ambiente durante al menos 3 horas hasta toda la noche.
    Nota: Las secciones en el congelador para pasar la noche o más tiempo de secado sea aceptable, inevitablemente aumentará la autofluorescencia. Para mejores resultados, seca las secciones de 0.5 h, luego proceder con la fijación y tinción pasos inmediatamente.
  4. Recoger los portaobjetos en una caja de diapositivas y utilizarlas inmediatamente o almacenar las diapositivas a-80 ° C o -20 ° C para su uso posterior.

4. elaboración de reactivos para la tinción de inmunofluorescencia

  1. Preparación de buffers:
    1. Preparar 2 L de 1 x de tampón fosfato salino (PBS) de PBS 10 x.
    2. Preparar 40 mL de paraformaldehído al 4% (PFA) en PBS 1 x del 16% PFA.
    3. Preparar 2 L de Saft: PBS 1 x con 0,1% Triton-100.
    4. Preparar 50 mL de SAFT SAFT-B: con 2% de albúmina sérica bovina (BSA).
    5. Preparar 10 mL de SAFT-B-G: SAFT con 2% de BSA y un 5% de suero Normal de cabra.
    6. Preparar 1 mL de solución de bloqueo. Diluir AffiniPure Fab fragmento de cabra anti-ratón IgG (H+L) (1:10) en SAFT-B.
    7. Preparar 200 mL de tampón citrato de 1 x.
      Nota: Los volúmenes de las soluciones anteriores son suficientes para al menos 5 diapositivas. Volúmenes deben ajustarse según el número de diapositivas y el tamaño de los envases de la diapositiva.
  2. Preparar las manchas del anticuerpo:
    1. Anticuerpos primarios (concentración de trabajo): preparar 1,2 mL de anticuerpo primario mezcla diluyendo Pax7 del anticuerpo de ratón monoclonal (IgG1) (1-5 μg/mL) + anticuerpos policlonales laminina (0.5-2 μg/mL) + anticuerpo monoclonal de ratón de MF20 (IgG2b) (0.5-2.5 μg / mL) en SAFT-B-G.
      Nota: MF20 anticuerpo monoclonal de ratón (IgG2b) es opcional.
    2. Anticuerpos secundarios (concentración de trabajo): preparar 1,2 mL de anticuerpo secundario mezcla diluyendo cabra anti-ratón adsorbido Cruz secundario anticuerpo IgG1, Alexa Fluor 488 (0.5-2 μg/mL) + cabra anti-conejo IgG (H+L) altamente adsorbido a Cruz de anticuerpo secundario, Alexa Fluor y 555 (0.5-2 μg/mL) + cabra anti-ratón IgG2b adsorbido Cruz anticuerpo secundario, Alexa Fluor 647 (0.5-2 μg/mL) en SAFT-B-G.
      Nota: Alexa Fluor 647 es opcional.

5. pasos de tinción de inmunofluorescencia

  1. Rehidratar y corregir las secciones de crio con PFA.
    1. Quite algunas de las diapositivas de TA/EDL cryo-sección de la caja de diapositivas. Calentar los portaobjetos en una bandeja de retención de corredera a temperatura ambiente.
    2. Utilice una líquido bloqueador pluma pluma (PAP) para dibujar un área que incluye todas las secciones de crio en la diapositiva. Este círculo evitará las soluciones que fluye fuera de la diapositiva.
    3. Llevar la bandeja a una campana de laboratorio. Añadir 300-500 μl de 4% PFA el portaobjetos dentro de la zona en un círculo para fijar las secciones a temperatura ambiente durante 10 min., lavado a la PFA con PBS 1 x por lo menos 3 veces, 5 minutos en un recipiente de la diapositiva.
      PRECAUCIÓN: El PFA es tóxica y un residuos peligrosos; debe ser operado con cuidado y desechar en un recipiente de residuos peligrosos.
  2. Recuperación de antígeno
    1. Llenar otro recipiente diapositiva con 200 mL de tampón citrato.
    2. Transfiera los portaobjetos en el envase. Transferir el contenedor con los portaobjetos a una olla a presión cocinar las diapositivas en modo de alta presión durante 10 minutos.
    3. Enfriar el recipiente con agua durante 10 minutos transferencia de drenaje todas las diapositivas a un nuevo contenedor con SAFT (200 mL), enjuague los portaobjetos con SAFT para por lo menos 3 veces, 5 minutos.
  3. Bloqueo
    1. Añadir kimwipes empapada en agua a la bandeja con las diapositivas para crear un ambiente húmedo para evitar la sequedad de las diapositivas.
    2. Retroceder las diapositivas a la bandeja y añadir 200 μL de la solución sobre cada diapositiva de bloqueo. Cubrir la bandeja con una tapa y deje que el bloqueo desarrollar durante 30 minutos.
      Nota: Pax7 anticuerpo es un anticuerpo monoclonal de ratón, hay Unión inespecífica de ratón IgG en los tejidos de músculo de ratón que crea fondo alta. Usando el AffiniPure Fab fragmento de cabra anti-ratón IgG (H+L) bloquea el atascamiento inespecífico de ratón a ratón.
  4. Se aplican anticuerpos primarios.
    1. Enjuague los portaobjetos con SAFT una vez en el contenedor de la diapositiva. Entonces mueva hacia atrás las diapositivas a la bandeja de tinción.
    2. Aplique 200 μL de mezcla de anticuerpo primario en cada diapositiva, cubrir la bandeja con una tapa y dejar que la reacción a desarrollar a temperatura ambiente durante 1 h o a 4 ° C para pasar la noche.
      Nota: La reacción durante la noche a 4 ° C da el mejor resultado, aunque el desarrollo de la reacción a temperatura ambiente da resultados satisfactorios. El anticuerpo MF20 de miosina puede ser agregado en la mezcla para realizar un triple (Pax7, laminina, MF20) etiquetado. MF20 manchas diferenciadas de las fibras musculares. Este paso sirve también como otro paso de bloqueo con SAFT-B-G para reducir la potencial Unión inespecífica de secundarios anticuerpos (anticuerpos de cabra) en el siguiente paso.
  5. Se aplican anticuerpos secundarios.
    1. Lave hacia fuera los anticuerpos primarios con SAFT a temperatura ambiente por lo menos 3 veces, 5 minutos.
    2. Añadir 200 μL de mezcla de anticuerpos secundarios a cada diapositiva y permitir que la reacción a desarrollar a temperatura ambiente durante al menos 1 h.
      Nota: Para Pax7 + laminina, utilice cabra anti-Mouse IgG1 Alexa 488 y cabra anti-conejo Alexa 555.
      Para Pax7 + laminina + MF20, añadir cabra anti-ratón IgG2b 647 Alexa en la mezcla.
    3. Lave hacia fuera los anticuerpos secundarios con SAFT por lo menos 3 veces, 5 minutos.
  6. DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) contra manchas y montaje
    1. Diluir DAPI (1:20, 000) de SAFT en el contenedor de la diapositiva, por ejemplo, 10 μl de DAPI en 200 mL de SAFT.
    2. Mancha de las diapositivas en el contenedor DAPI por 3 minutos.
    3. Lavar el DAPI con SAFT para por lo menos 5 veces, 5 minutos.
    4. Montar el portaobjetos con medio de montaje. Cubrir el portaobjetos con cubreobjetos.
      PRECAUCIÓN: DAPI es tóxica y peligrosa; debe manejarse con cuidado y dispuesto en la botella de residuos peligrosos.

6. fluorescente microscopia

Nota: El protocolo de tinción inmunofluorescente informado anteriormente permitirá SCs visualización con cualquiera de los dos un gran campo fluorescente o confocal microscopio. Puede ser inicialmente difícil identificar SCs. Aquí están algunos pasos recomendados que pueden ser de ayuda.

  1. Utilizar el canal DAPI y ampliación baja objetivos visualizar las secciones de las diapositivas.
  2. Cambiar la ampliación de bajo a alto. Para observar el SCs, por lo menos un objetivo de 20 X es necesario).
  3. Utilice el cubo de doble filtro para 488 (FITC) / 555 (rodamina) observar Pax7 y laminina señales al mismo tiempo identificar SCs. Bajo esta configuración, la señal de Pax7 tinción tiene un mejor contraste con el ruido de fondo.
  4. Alternar rápidamente el canal de la FITC a DAPI para identificar correctamente el SCs. Todos SCs debe Pax7, DAPI-positivo.

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Representative Results

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Siguiendo los pasos anteriores, se pueden visualizar con éxito SCs en adultos secciones musculares descanso bajo un microscopio de fluorescencia (figura 1). Aunque el tejido muscular adulto tiene auto-fluorescencia fuerte en cierto tipo de fibras, los tintes brillantes de serie Alexa pueden superar el ruido de fondo y la señal está parado hacia fuera (figura 1A, B, flecha). La microscopía confocal de dos fotones captura una imagen relativamente limpia (figura 1B) que el microscopio de fluorescencia de campo amplio (figura 1A). El mismo protocolo también trabajó bien en los tejidos musculares de los ratones jóvenes (figura 2A), embriones de ratón (figura 2B) y heridas de tejidos finos del músculo adulto (figura 3). En tejidos finos del músculo embrionario y juveniles, hay más activados SCs (figura 2A, flechas) o Pax7-positivo precursores miogénicos (figura 2B, flechas) que tienen núcleos relativamente grandes; por lo tanto, es relativamente más fácil de visualizar SCs de los ratones más jóvenes que de ratones adultos (figura 2 y figura 1). En el tejido muscular lesionado, también hay más activación SCs Pax7-positivos (figura 3).

Figure 1
Figura 1: imágenes de inmunofluorescencia Pax7 y laminina en ratón adulto descansando los tejidos musculares. TA/EDL secciones de músculo de ratones adultos immunostained con Pax7 (verde) y anticuerpos de laminina (rojo) y en teñidos con DAPI (azul). (A) imagen capturada bajo un microscopio de fluorescencia de campo amplio. (B) imagen captada con un microscopio confocal. Barras de escala: 50 μm. flechas: SCs de fibras con autofluorescencia bajo. Puntas de flecha: SCs de fibras con alta autofluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: imágenes de Pax7 y laminina o MF20 inmunofluorescencia en tejido muscular de ratones jóvenes. TA/EDL secciones de músculo de ratones más jóvenes immunostained con Pax7 (verde) y laminina (rojo) o anticuerpos MF20 (magenta) y en teñidos con DAPI (azul). (A) día Postnatal 8 sección de músculo (P8) capturadas con un microscopio confocal. (B) día embrionario 17.5 sección de músculo (E17.5) capturado bajo un microscopio de fluorescencia de campo amplio. Barras de escala = 50 μm. flechas: SCs en la sección de músculo P8 (A); Representante Pax7 + precursores miogénicos en E17.5 sección de músculo, mientras que hay más en la imagen (B). Estas dos imágenes fueron modificadas de datos brutos que también generan imágenes en un papel publicado13 (sfigura 3D) y (figura 1B), respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: una imagen representativa de inmunofluorescencia Pax7 y laminina en tejidos finos del músculo adulto herido. TA/EDL músculo secciones de un tejidos músculo adulto lesionado (7 días después de lesión) immunostained con Pax7 (verde) y anticuerpos de laminina (rojo) y en teñidos con DAPI (azul). La imagen fue captada con un microscopio confocal. Barra de escala = 50 μm. flechas: SCs en la sección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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El protocolo anterior se basó en un método de tinción MF20/Pax7 en pez cebra músculo esquelético12. Las soluciones utilizan y el bloqueo de pasos son idénticos o similares. Los anticuerpos utilizados son idénticos. Los pasos ajustados se basaron en las características del tejido de músculo de ratón y SCs. En primer lugar, laminina anticuerpo fue agregado en la mezcla para ayudar a visualizar y confirmar la posición del SCs. Fue especialmente útil contar el número de CS al microscopio cuando se utiliza el cubo de doble filtro de 488/555; Esto realzó grandemente la señal Pax7 SC-derivados destacan del fondo autofluorescent ruidoso. En segundo lugar, puesto que el anticuerpo Pax7 usado es un anticuerpo de ratón, hemos añadido un ratón el ratón bloqueo paso (5.3) para reducir el fondo resultante de la Unión inespecífica de ratón IgG. En tercer lugar, el paso de recuperación de antígeno (paso 5.2) fue crítico para la tinción con anticuerpos Pax7 en PFA tejidos fijados.

El mismo protocolo fue utilizado en los tejidos musculares de los ratones más jóvenes (cachorros y embriones) (figura 2). De hecho, fue relativamente más fácil de visualizar SCs en cachorros que en ratones adultos por el mismo protocolo. Podría ser útil empezar con la tinción SCs en cachorros para ganar experiencia antes de proceder al tejido muscular adulto. Un control negativo sin anticuerpos primarios (paso 5.4) también es necesario en todos los experimentos. Un protocolo similar fue utilizado con éxito en secciones de parafina con parafina extra pasos de procesamiento. Sin embargo, las secciones de parafina tienden a tener un mayor fondo de Autofluorescencia, que enmascara las señales de los CS que tienen relativamente más débil expresión Pax7. Si es posible, evite el uso de secciones de la parafina. El mismo protocolo también fue empleado en los tejidos de músculo lesionado que tienen numerosos SCs y dieron resultados similares a los obtenidos con el tejido fino del músculo del cachorro (figura 3).

Músculo tejido autofluorescence representa el mayor obstáculo en la obtención de resultados de inmunofluorescencia limpia14. Reducir el tiempo de secado de cryo-secciones puede disminuir la autofluorescencia y usando secciones de crio recién preparadas es muy recomendable. Similar a otros protocolos15, el paso de bloqueo del ratón el ratón es necesaria para reducir aún más el fondo.

Mientras que gran campo microscopio de fluorescencia y confocal microscopio eran eficaces para visualización de SCs a través de piezas de ojo, se recomienda el uso de microscopio confocal para capturar imágenes de alta calidad.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a la sección de proyección de imagen de luz de NIAMS para proporcionar la ayuda técnica y microscopios. Los anticuerpos MF20 y Pax7 se obtuvieron de estudios hibridoma Banco desarrollo desarrollado bajo los auspicios de la NICHD y mantenido por el Departamento de ciencias biológicas, la Universidad de Iowa, Iowa City. Este trabajo fue apoyado por el programa de investigación intramuros de NIAMS de los institutos nacionales de salud.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
methylbutane Sigma-Aldrich M32631
Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound Electron Microscopy Sciences 62550-01
10x PBS Gibco, Themo Fisher 70011-044
16% PFA TED PELLA 50-00-0
Triton-100 Sigma-Aldrich T8787
Normal Goat Serum Thermo Fisher 0 1-6201
AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. 115-007-003
20x Citrate Buffer Thermo Fisher 00 500
Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) Developmental Study Hybridoma Bank N/A
Laminin polyclonal rabbit antibody Sigma-Aldrich L9393
MF20 mono-clonal mouse antibody (IgG2b) (supernatant) Developmental Study Hybridoma Bank N/A
Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher A-21121
Goat anti-Mouse IgG2b cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 647 Thermo Fisher A-21242
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 Thermo Fisher A32732
Leica CM1860 cryostat
Leica DM6000 wide-field fluorescent microscope
Leica DMR wide-field fluorescent microscope
Zeiss LSM510 confocal microscope
Zeiss LSM780 confocal microscope
Cuisinart electronic pressure cooker

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References

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Feng, X., Naz, F., Juan, A. H., Dell'Orso, S., Sartorelli, V. Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies. J. Vis. Exp. (134), e57212, doi:10.3791/57212 (2018).More

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