Summary
Здесь мы представляем два протокола для измерения митохондриальной Ca2 + приток в изолированных митохондриях и культивируемых клеток. Для изолированных митохондриях, мы подробно плиты на основе чтения Ca2 + импорта с помощью Ca2 + чувствительной пробирного красителя кальция Грин 5N. Для культивируемых клеток мы описываем confocal микроскопии метод, с помощью Ca2 + краситель кондицио-2/AM.
Abstract
CA2 + обработка митохондрий функция критической регулирования физиологических и патофизиологических процессов в широком спектре клеток. Способность точно измерить приток и измеряем Ca2 + от митохондрий имеет важное значение для определения роли митохондриальной Ca2 + обработка в этих процессах. В настоящем докладе мы представляем два метода для измерения митохондриальной Ca2 + обработка в изолированных митохондриях и культивируемых клеток. Мы сначала подробно пластины читателя-платформа для измерения митохондриальной Ca2 + поглощения с использованием Ca2 + чувствительной краситель кальция Грин 5N. На основе чтения формат пластины обходит потребность в специализированном оборудовании, и краска кальция Грин 5N идеально подходит для измерения Ca2 + от изолированных ткани митохондрий. Для нашего приложения мы описываем измерения митохондриальной Ca2 + поглощения в митохондриях, изолированных от мыши ткани сердца; Однако эта процедура может применяться для измерения митохондриальной Ca2 + поглощения в митохондриях, изолированный от других тканей, таких как печень, скелетные мышцы и мозг. Во-вторых мы описываем конфокальной микроскопии основанные assay для измерения митохондриальной Ca2 + в permeabilized клеток с помощью Ca2 + чувствительной краситель кондицио-2/AM и обработки изображений с использованием 2-мерной лазерной сканирующей микроскопии. Этот протокол permeabilization устраняет загрязнения цитозольной краситель, позволяя для конкретной записи изменений в митохондриальной Ca2 +. Кроме того лазерной сканирующей микроскопии позволяет высокие частоты кадров для захвата быстрого изменения митохондриального Ca2 + в ответ на различные препараты или реагентов, применяемых в решении внешней. Этот протокол может применяться для измерения митохондриальной Ca2 + поглощения во многих типах клеток, включая клетки первичной например культивировании и нейронов и увековечен клеточных линий.
Introduction
Митохондрии являются важнейшие объекты внутриклеточных Ca2 + хранения и сигнализации. Десятилетия исследований показали, что митохондрии имеют возможность импорта и секвестр Ca2 + 1,2. Митохондрии, однако, являются не просто пассивные узлы Ca2 + хранения. CA2 + в отсеке митохондриальной выполняет основные сигнальные функции, включая регулирование метаболических вывода и активации пути смерти клетки митохондриального опосредованной, который был рассмотрен ранее3. Для регуляции метаболизма Ca2 + усиливает деятельность трех матрица локализованных дегидрогеназ цикла трикарбоновых кислот, а также дыхательной цепи комплексов, увеличить митохондриального энергетического производства4,5 . С митохондриальных Ca2 + перегрузки и dysregulated митохондриальных Ca2 + обработка Ca2 + триггеры митохондриальной проницаемость переходного поры (MPTP) открытие, приводит к permeabilization внутреннюю мембрану митохондрий, мембрана потенциальные потери, митохондриальной дисфункции, отеки, разрыв и в конечном счете, клеточной смерти6,,78,9. Таким образом митохондриальных Ca2 + сигнализации непосредственно влияет на сотовый жизнь и смерть пути через метаболического контроля и оси MPTP-смерть.
В последние годы, там быстро растет интерес к изучению динамики митохондриальной Ca2 + в большую часть для идентификации молекулярных компонентов митохондриальной Ca2 + Унипорт комплекс, митохондриальных внутренняя транспортер мембраны, которая является основным режимом Ca2 + импорт в митохондриальной матрицы 10,,1112. Выявление этих структурных и регламентационных субблоков Унипорт вывел возможность генетически ориентации митохондриальной Ca2 + приток чтобы модулировать митохондриальной функции и дисфункции и способствовало изучение вклад Унипорт комплекс и митохондриальной Ca2 + притока к болезни13,14,15. Действительно митохондриальных Ca2 + сигнализации был вовлечен в патологии разнообразных заболеваний, начиная от болезни сердца нейродегенеративные и рака на16,,1718, 19,20.
Учитывая основополагающее значение митохондриальной Ca2 + сигнализации в метаболизм и клеточную смерть и в сочетании с широким охватом биологических систем, митохондриальных Ca2 + сигнализации воздействий, методы оценки митохондриальной Ca2 + приток представляют большой интерес. Не удивительно был разработан целый ряд методов и инструментов для измерения митохондриальной Ca2 + . К ним относятся методы, которые используют инструменты, такие как флуоресцентные Ca2 +-чувствительных красители21,22 и генетически закодированный Ca2 + датчики ориентированы на митохондрии, например cameleon и Экворин23, 24. Цель этой статьи — выделить различные методы и модели систем, в которых может быть измерена митохондриальной Ca2 + поглощения. Мы представляем две экспериментальные методы для оценки митохондриальной Ca2 + приток потенциала. Использование сердечной митохондрий в качестве примера, мы подробно пластины читателя-платформа для измерения митохондриальной Ca2 + поглощения с помощью Ca2 + чувствительной красителя Грин 5N кальция, который идеально подходит для изолированных ткани митохондрий14 . Используя искусственный низ 3T3 клеток, мы также описывают конфокальная микроскопия на основе изображений assay для измерения митохондриальной Ca2 + в permeabilized клетки, с помощью Ca2 + чувствительной краситель кондицио-2/AM25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные в настоящем протоколе были одобрены институциональный уход животных и использование комитета университета Эмори.
Примечание: Первая часть является экспериментальная процедура измерения митохондриальной Ca2 + приток в изолированных сердечной митохондрий, используя читателя пластины.
1. реагенты и решения
- Сделать 500 мл MS-EGTA буфера для митохондриального изоляции: 225 мм маннитол, сахароза 75 мм, 5 мм 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic кислота (HEPES), 1 мм этиленгликоля bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-tetraacetic кислота (EGTA), рН, скорректированы до 7,4 с Кох. Стерилизовать его через фильтр 0,22 мкм и хранить при 4 ° C. Убедитесь, что буфер MS-EGTA предварительно охлажденным до 4 ° C перед использованием.
- Подготовка 100 мл хлористого калия буфера: 125 мм KCl, 20 HEPES, 1 мм х2PO4, 2 мм MgCl2, 40 мкм EGTA и рН скорректирована с 7,2 с Кох. Храните при комнатной температуре.
- Подготовка 1 мм кальция Грин 5N складе диметилсульфоксида (ДМСО). Зеленый 5N запас кальция может быть aliquotted и хранятся при температуре-20 ° C.
-
Подготовьте субстратов для Ca2 + поглощения.
- Подготовка 1 М пируват натрия, рН 7,4. Храните его в аликвоты при-20 ° C.
- Подготовка 500 мм малат, рН 7,4. Храните его в аликвоты при-20 ° C.
2. изоляция сердца митохондрий
- Усыпить мыши в соответствии организационных стандартов.
Примечание: Для наших институционально утвержденным методом эвтаназии, мышей были наркоз при вдыхании isofluorane и жертву шейки матки дислокации. - Собирайте сердца, открыв грудной полости, разрезания вдоль обеих сторон ребра, окаймляющие сердце, убирания диафрагмы и иссечения ткани сердца.
Примечание: В настоящем Протоколе, митохондриальных изоляции производится от всего сердца, собранных от взрослой мыши (примерно 120 мг), которая должна быть достаточной для 3-4 экспериментов. Для митохондриального изоляции от других митохондрии богатых тканей, таких как печень могут использоваться до 200 мг ткани после описанных протокол. - Промывайте ткань тщательно в 25 мл ледяной 1 x фосфатный буфер (PBS) обеспечение того, чтобы все крови выдавливается из желудочков.
Примечание: Сердце будет достаточно промыть когда жидкости выдавливается сердце работает четко. - Фарш сердце на мелкие кусочки в 5 мл ледяной 1 x PBS с помощью острых ножниц.
- Отменить PBS и передавать предварительно охлажденные 7 мл стекла тефлон dounce гомогенизатор 0,10-0,15 мм зазором фарша сердечной ткани.
- Добавьте 5 мл ледяной MS-EGTA буфера и гомогенизации образец до тех пор, пока кусочки ткани, больше не видны (примерно 11 инсультов).
Примечание: Не чрезмерно гомогенизировать ткани, как цель состоит в том, чтобы получить нетронутыми и функциональных митохондрий. - Передача огневки до 15 мл.
- Центрифуга огневки на 600 x g при 4 ° C за 5 мин до Пелле ядер и нерушимой клетки.
- Супернатант передать свежие 15 мл и центрифуги на 10000 x g при 4 ° C на 10 минут, чтобы Пелле митохондрий.
- Отменить супернатант и держать митохондриальной гранул на льду.
- Вымойте митохондриальной Пелле, дважды с помощью ледяной MS-EGTA буфера. Для каждого мытья Ресуспензируйте митохондриальной Пелле в 5 мл буфера MS-EGTA, центрифуги на 10000 x g при 4 ° C на 10 мин и удалить супернатант.
- После окончательного вымыть удалить супернатант и Ресуспензируйте митохондрий в 100 мкл лед холодной MS-EGTA буфера. Держите митохондрии на льду.
Примечание: Митохондрий должно использоваться для экспериментов в течение 1 ч. - Измерение концентрации митохондриальных белок, используя Assay протеина Брадфорд26.
3. плита на основе чтения измерение митохондриальной кальция поглощения
Примечание: Здесь, это описал протокол для анализа митохондриальной Ca2 + поглощения с использованием многомодового пластины читатель оснащен инжекторов. Любого листа читателя с возможностью чтения кальция Грин 5N флуоресцирования (возбуждение/излучение 506/532 нм) в кинетическую режиме с автоматизированной реагент может использоваться форсунки держать реакции, защищенном от света.
- Программа читателя пластины для выполнения кинетическая читать кальция Грин 5N. флуоресценции с измерений каждую секунду для всего пробирного время 1000 s. Дополнительно, программа реагент инжекторы отказаться 5 мкл раствора CaCl2 на 30 сек, 150 s, 300 s , 480 s и 690 s время пунктов.
Примечание: Время CaCl2 инъекции, определяемые пользователем и может быть скорректирована для экспериментальной нужд. - Премьер реагент инжекторы с раствором2 CaCl использоваться.
Примечание: Концентрация раствора2 CaCl определяется пользователем и может быть скорректирована в последующих запусков к Титруйте количество Ca2 + требуется вызвать MPTP открытия. - Добавьте 200 мкг митохондрий в отдельных также 96 хорошо плиты.
- Добавьте соответствующий объем буфера KCl и таким образом, что общий объем митохондрии и KCl буфер приходит к 197 мкл.
- Добавьте в смесь митохондрии 1 мкл пируват 1 М и 1 мкл малат 500 мм. Накапайте осторожно, чтобы смешивать и инкубировать митохондрии с субстратами для 2 мин при комнатной температуре, чтобы позволить митохондрий стать под напряжением.
- Добавьте 1 мкл акций Грин 5N кальция 1 мм. Смешайте нежно закупорить.
Примечание: Защищайте реакции от света после добавления красителя Грин 5N кальция. - Начало запрограммированных кинетическая протокол и монитор кальция Грин 5N флуоресценции.
4. реактивы и решения
Примечание: Вторая часть является экспериментальная процедура конфокальная томография митохондриальной Ca2 + в культивируемых клеток
- Сделайте Tyrode в раствор (130 мм NaCl, 4 мм KCl, 2 мм CaCl2, 1 мм MgCl2, глюкоза 10 мм и 10 мм HEPES, рН 7,2 с Кох). Хранить при 4 ° C. Нагреть до комнатной температуре перед использованием.
- Приготовьте промывочный раствор (ацетат калия 100 мм, 15 мм KCl, 5 мм х2PO4, 5 мм Mg-АТФ, 0,35 мм EGTA, 0.12 мм2CaCl, 0,75 мм MgCl2, фосфокреатин 10 мм, 10 мм HEPES, рН 7,2 с Кох). Хранить при 4 ° C. Нагреть до комнатной температуре перед использованием.
- Готовят раствор Permeabilization, который содержит сапонин 0,005% в промывочный раствор. Готовят свежий ежедневно.
- Подготовить 0 Ca2 + внутреннее решение (100 мм калия ацетат, 15 мм KCl, 0,35 мм EGTA, 0,75 мм2MgCl 10 мм HEPES, рН, скорректирована с 7,2 с Кох). Хранить при 4 ° C. Нагреть до комнатной температуре перед использованием.
- Подготовка внутренних раствор, содержащий Ca2 +. Добавьте CaCl2 внутреннее решение выше для достижения желаемой концентрации свободного Ca2 +. Количество2 CaCl для добавления рассчитывается с помощью программы MaxChelator (maxchelator.stanford.edu).
- Подготовка 1 мм кондицио-2/на складе в ДМСО и храните его при 20 ° C до использования.
- Подготовка 1 мм MitoTracker зеленый складе в ДМСО и храните его при 20 ° C до использования.
5. покрытие клетки для изображений
- Вымойте 22 x 22 см2 стекла coverslips с 100% этанола и дайте высохнуть coverslips воздуха.
- Место coverslips стекла в индивидуальные добра 6-ну тканевые культуры блюдо.
Примечание: Coverslips могут быть покрыты с Ламинин, поли L-лизин или аналогичные матрицы содействовать клеток вложение. - Trypsinize и пластина клетки на coverslips, направленных для приблизительно 70% слияния в день изображений.
6. Загрузка клетки с кондицио-2/AM и MitoTracker зеленый
- Подготовить кондицио-2/AM-MitoTracker зеленый рабочее решение. Добавьте 20 мкл кондицио-2/AM 1 мм штока, 0.2 мкл акций MitoTracker зеленый 1 мм и 2,5 мкл плюрониевого F-127 20% по 1 мл раствора в Tyrode. Конечная концентрация кондицио-2 в рабочем растворе 20 мкм и конечная концентрация MitoTracker зеленый 200 Нм.
- Аккуратно удалите роста СМИ из coverslip.
Примечание: Мыть шаг не является необходимым до того раствор красителя. - Добавьте кондицио-2/AM-MitoTracker зеленый раствор в прикапывают моды на coverslip пока coverslip не просто покрыты (примерно 3-4 капель в coverslip).
- Инкубируйте 30 мин при комнатной температуре в защищенном от света, чтобы позволить клетки для загрузки с красителями.
- Де эстерифицировать кондицио-2/AM. Аккуратно удалите кондицио-2/AM-MitoTracker зеленый решение, заменить его на свежий комнатной температуре Tyrode решения и Инкубируйте 30 мин при комнатной температуре в защищенном от света.
7. конфокальный изображений митохондриальной кондицио-2/AM и флуоресценции MitoTracker зеленый
- Передача coverslip для изображений камеры микроскопа и заполнить камеры с промывочного раствора.
- В разделе Параметры для наблюдения клеток в Фазовый контраст на 40 X Отрегулируйте фокус до тех пор, пока клетки видны и в фокусе.
-
Разрушения плазматической мембраны кондицио-2/AM-MitoTracker зеленый загружен клетки для удаления локализованных цитозоль кондицио-2, сохраняя митохондрии локализованных красителя.
- Удаление промывочный раствор из coverslip.
- Замените его Permeabilization решения для приблизительно 1 мин.
- Визуально контролировать морфология плазматической мембраны на протяжении всего процесса permeabilization. Permeabilized клетки разработает шероховатую поверхность.
- При полной permeabilization, немедленно удалите решение Permeabilization и заменить его с 0 Ca2 + внутреннее решение.
- Одновременно изображения флуоресценции кондицио-2 (возбуждение, используя 559 Нм лазерной линии и выбросах, собранные на длинах волн между 575-675 Нм) и MitoTracker Зеленая флуоресценция (возбуждение, используя 488nm лазерной линии и выбросах, собранные на длинах волн между 505-525 Нм). Фокус на permeabilized клетки, отображение ясно colocalization кондицио-2 и MitoTracker зеленый.
- Уменьшить лазерных микроскопов и получить параметры таким образом, что митохондриальной флуоресценции кондицио-2 dim и просто видно.
- Выберите параметры Микроскоп, чтобы приобрести 2-мерных сканирование на соответствующий кадр скорости и времени курс для конкретного приложения. Частота кадров по крайней мере 30 кадров/сек рекомендуется точно захватить Кинетика изменения митохондриального Ca2 +.
- Удалите 0 Ca2 + внутреннее решение не нарушая клетки или Микроскоп фокус.
- Начало захвата изображений.
- Добавить Ca2 +-изобилует внутреннего решения в 10 s время точка либо вручную, либо с системой перфузии.
- Выберите регионы интереса (ROI) для охвата регионов colocalization между митохондриальной кондицио-2 и MitoTracker зеленый сигнал в приобретение изображений программное обеспечение.
Примечание: Произвольные флуоресцирования (F) значения для каждой точки время записи получаются для каждого ROI. Эти значения являются фон вычитается и нормализуется до первоначального флюоресценция (до Ca2 + дополнение; F0) и печать как F/F0 со временем для представления данных и количественной оценки амплитуды изменения митохондриального Ca2 +.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 1 показывает митохондриальной Ca2 + измерения поглощения в изолированные сердца митохондрий, используя платформу на основе чтения пластины и Ca2 + краситель кальция Грин 5N. В условиях управления (рис. 1а), сердечной митохондрии были приостановлены в буфере KCl, содержащие кальций Грин 5N и затем оспаривается с последовательные импульсы CaCl2 (5 мкл 0.6 мм CaCl решение2 ) Добавлено на 30 сек, 150 s, 300 s, 480 s и 690 s время пунктов. Сроки и количество CaCl2 дополнения могут регулироваться пользователем для полного митохондриальной поглощение добавлен Ca2 + до последующих дополнений. В этот assay увеличение кальция Грин 5N сигнала отражает повышенный буфера Ca2 + уровнях. Как митохондрии импорта Ca2 +, Ca2 + удаляется из буфера и флуоресценции Грин 5N кальция уменьшается. Важно отметить, что в третьем добавлением Ca2 +, кривая флуоресценции Грин 5N кальция подвергается внезапного и резкого перегиба вверх, вместо того, чтобы удалить Ca2 + из буфера и обозначается красной стрелкой в Рисунок 1A . Это резкое увеличение флуоресценции отражает митохондриальной Ca2 + перегрузки и открытия MPTP. Общее количество Ca2 + принятые митохондрий до активации MPTP отражает митохондриальной Ca2 + потенциала и может быть выражена как мкмоль Ca2 +/mg белка. Путем корректировки сроков и концентрации кальция добавил, количество Ca2 + требуется вызвать проницаемость переходного периода могут быть определены. В рисунке 1B, митохондрии были предварительно обработаны за 10 мин при комнатной температуре с 10 мкм Ru360, хорошо изученных ингибиторов митохондриальных Ca2 + Унипорт комплекс27. Ru360 ингибирует Унипорт зависимых митохондриальной Ca2 + поглощения, и это подтверждается поэтапного увеличения в кальция Грин 5N флуоресценции после каждого Ca2 + дополнение.
Для конфокальный изображений митохондриальной кальция, используя кондицио-2/AM, мы покажем представитель результаты от НИЗ 3T3 клеток. MitoTracker Грин — митохондрий селективные красителя, преференциально пятна митохондриальной сети (рисунок 2A). После сапонин опосредованная permeabilization плазматической мембраны цитозольной кондицио-2 это смыл, оставляя кондицио-2 окрашенных митохондриальной сеть, которая совместно локализуется с зеленым MitoTracker (рис. 2A). Кондицио-2 могут также накапливаться в не митохондриальной структур, так что ROI для анализа должны быть посвящены регионов совместно локализации между MitoTracker зеленый и кондицио-2. В ячейках управления, добавление Ca2 +-изобилует внутреннего раствор, содержащий 2 мкм бесплатно Ca2 + вызывает быстрый рост флуоресценции кондицио-2, который препятствует когда Унипорт комплекс ингибируется с 10 мкм Ru360 (рис. 2B).
Рисунок 1: Митохондриальной Ca2 + поглощения в изолированных митохондриях сердца. (A) графики относительной кальция Грин 5N флуоресценции управления сердце митохондрий и митохондриях (B) , предварительно обработанных с 10 мкм Ru360 10 мин при комнатной температуре, оспаривается с 5 мкл 0.6 мм CaCl2 (черные стрелки). Митохондриальной Ca2 + перегрузки индуцированной проницаемость переходного обозначен красной стрелкой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Представитель Анализ митохондриальной Ca2 + в permeabilized клетках. (A) образ представителя флуоресценции клеток 3T3 загружен с кондицио-2 (красный) и MitoTracker Грин (зеленый) и объединенного изображения кондицио-2 и MitoTracker Грин (желтый) после permeabilization с сапонин. (B) кондицио-2 Флюоресцентная трассировки из одной 3T3 клетки во время применения раствора 2 мкм бесплатно Ca2 + внутренних контрольных условиях (черный след) или после 10 мкм Ru360 предварительной обработки (красный след). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы опишем два различных подхода для измерения митохондриальной Ca2 + приток. Плиты на основе чтения кальция Грин 5N метод мониторов extramitochondrial Ca2 + уровнях и Ca2 + поглощение assay который хорошо подходит для измерений в изолированных митохондриях. В то время как мы показали представитель результаты от изолированных митохондриях мышиных сердца, этот assay может быть легко адаптирована для митохондрий изолированных от тканей с высоким митохондриальной изобилия, включая печень, скелетные мышцы и мозг. Кроме того система чтения пластины может быть идеальным вариантом для лабораторий, где специализированного оборудования, традиционно используемые для Ca2 + измерений, как fluorometers, не могут быть немедленно доступны. Ограничено максимальное время промежуток что плита читатель может сканировать и необходимость предварительной программы реагент дополнения могут быть слабость этого метода по сравнению с fluorometers, однако, стоимость и наличие fluorometers могут перевесить это пособие. Варьируя концентрации Ca2 + в реагент инжекторов, можно определить количество Ca2 + что митохондрии способны поглощать прежде чем спровоцируют MPTP открытия (митохондриальной Ca2 + емкость).
Конфокальный изображений протокол, который мы описываем кондицио-2/AM измерений митохондриальной Ca2 + идеально подходит для культивируемых клеток и также может быть адаптирована для начальных ячеек. В этом методе плазматической мембраны является permeabilized с сапонин, который позволяет для размыва цитозольной красителя. После этой процедуры, позволяя точные и конкретные измерения митохондриальной флуоресценции остается только краска, захваченного в органеллы. Кроме того этот assay permeabilized клетки позволяет для экспериментального контроля над extramitochondrial Ca2 + уровней, а также определяемые пользователем условий, при которых подвергаются митохондрий. Кондицио-2/AM конфокальная томография митохондриальной Ca2 + могут быть использованы в клетках нетронутыми, не permeabilized, но это требует оптимизации загрузки красителя и де этерификации обеспечить митохондрий конкретных кондицио-2 Локализация28. Преимущества метода кондицио-2/AM, что кондицио-2/AM коммерчески доступных и краска может быть легко применен к широкий спектр типов клеток. Локализация краска кондицио-2, однако, является ограничением для рассмотрения. Для обеспечения измерений флуоресценции митохондрий конкретных кондицио-2, второй спектрально собственный красителя, например зеленый MitoTracker, могут использоваться для пятно митохондрии до изображений. Генетически закодированный Ca2 + датчики ориентированы на митохондрии может обойти этот вопрос, однако, клетки должны быть transfected/преобразованы с помощью датчика конструкции и иметь достаточно времени, чтобы выразить белка. Это не всегда идеально подходит для начальных ячеек с ограниченным выживания время, и краска загрузки может быть экономия времени процессом.
В обоих протоколах мы использовали Унипорт комплекса ингибитора Ru360 для иллюстрации эффект митохондриальной Ca2 + приток ингибирование. Ru360 является золотым стандартом для ингибирования Унипорт и на сегодняшний день это единственный известный конкретные ингибитор этой tranporter29. Кроме того рутений красный также могут быть использованы, однако, рутений красный является ингибитор неспецифические Унипорт, что было показано, также препятствуют Ca2 + освобождение от саркоплазматический ретикулум30. Нарушением митохондриальной Ca2 + обработка может быть признаком митохондриальной дисфункции, как Унипорт комплекс зависимых Ca2 + транспорт митохондриальной мембраны потенциальных зависимой и, соответственно, это зависит от функции дыхательной цепи . Таким образом митохондриальных uncouplers, например карбонильных цианид -4- phenylhydrazone (trifluoromethoxy) (FCCP) и карбонильных цианида m- хлорфенил гидразоны (CCCP) которые рассеивать митохондриальной мембраны потенциал, может также использоваться в качестве элемента управления соединения для ингибирования митохондриальной Ca2 + приток. Так как Митохондрии являются сайты внутриклеточных Ca2 + хранения, митохондрий может функционировать как Ca2 + буферы внутриклеточным пространстве. Таким образом изменения в митохондриальной Ca2 + обработка может повлиять на форму цитозольной Ca2 + ландшафта. Учитывая растущее число условий болезни, где митохондриальной Ca2 + динамика может играть определенную роль, методы, показанные здесь может применяться к изучению митохондриальной Ca2 + приток в животных и сотовой модели из болезни.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы имеют не раскрытия информации для доклада.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантовое финансирование от Американской ассоциации сердца (J.Q.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Olympus FV1000 Laser Scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Synergy Neo2 Multimode microplate reader with injectors | Biotek | ||
| Tissue Homogenizer | Kimble | 886000-0022 | |
| 22 x 22 mm coverslips | Corning | 2850-22 | |
| 96 well plate | Corning | 3628 | |
| 6 well plate | Corning | 3506 | |
| Calcium Green-5N | Invitrogen | C3737 | |
| MitoTracker green FM | Invitrogen | M7514 | |
| Rhod-2, AM | Invitrogen | R1244 | |
| DMSO | Invitrogen | D12345 | |
| Pluronic F-127 | Invitrogen | P3000MP | |
| D-Mannitol | Sigma | M9546 | |
| Sucrose | EMD Millipore | 8510 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| EGTA | Sigma | E8145 | |
| Potassium chloride | Fisher | BP366-500 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P0662 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M2670 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| L-malic acid | Sigma | M1125 | |
| Calcium chloride | Sigma | C4901 | |
| Potassium acetate | Fisher | BP364-500 | |
| Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Phosphocreatine disodium salt | Sigma | P7936 | |
| Saponin | Sigma | S7900 | |
| Ru360 | Calbiochem | 557440 |
References
- Deluca, H. F., Engstrom, G. W. Calcium uptake by rat kidney mitochondria. P Natl Acad Sci USA. 47, 1744-1750 (1961).
- Lehninger, A. L., Rossi, C. S., Greenawalt, J. W. Respiration-dependent accumulation of inorganic phosphate and Ca ions by rat liver mitochondria. Biochem Biophys Res Co. 10, 444-448 (1963).
- Kwong, J. Q. The mitochondrial calcium uniporter in the heart: energetics and beyond. J Physiol. 595 (12), 3743-3751 (2017).
- Denton, R. M. Regulation of mitochondrial dehydrogenases by calcium ions. Biochim Biophys Acta. 1787 (11), 1309-1316 (2009).
- Jouaville, L. S., Pinton, P., Bastianutto, C., Rutter, G. A., Rizzuto, R. Regulation of mitochondrial ATP synthesis by calcium: evidence for a long-term metabolic priming. P Natl Acad Sci USA. 96 (24), 13807-13812 (1999).
- Haworth, R. A., Hunter, D. R. The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. II. Nature of the Ca2+ trigger site. Arch Biochem Biophys. 195 (2), 460-467 (1979).
- Hunter, D. R., Haworth, R. A. The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. I. The protective mechanisms. Arch Biochem Biophys. 195 (2), 453-459 (1979).
- Kwong, J. Q., Molkentin, J. D. Physiological and pathological roles of the mitochondrial permeability transition pore in the heart. Cell Metab. 21 (2), 206-214 (2015).
- Luongo, T. S., et al. The mitochondrial Na+/Ca2+ exchanger is essential for Ca2+ homeostasis and viability. Nature. 545 (7652), 93-97 (2017).
- De Stefani, D., Patron, M., Rizzuto, R. Structure and function of the mitochondrial calcium uniporter complex. Biochim Biophys Acta. 1853 (9), 2006-2011 (2015).
- Baughman, J. M., et al. Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 341-345 (2011).
- De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabo, I., Rizzuto, R. A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).
- Pan, X., et al. The physiological role of mitochondrial calcium revealed by mice lacking the mitochondrial calcium uniporter. Nat Cell Biol. 15 (12), 1464-1472 (2013).
- Kwong, J. Q., et al. The Mitochondrial Calcium Uniporter Selectively Matches Metabolic Output to Acute Contractile Stress in the Heart. Cell Rep. 12 (1), 15-22 (2015).
- Luongo, T. S., et al. The Mitochondrial Calcium Uniporter Matches Energetic Supply with Cardiac Workload during Stress and Modulates Permeability Transition. Cell Rep. 12 (1), 23-34 (2015).
- Brown, D. A., et al. Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure. Nat Rev Cardiol. 14 (4), 238-250 (2017).
- Logan, C. V., et al. Loss-of-function mutations in MICU1 cause a brain and muscle disorder linked to primary alterations in mitochondrial calcium signaling. Nat Genet. 46 (2), 188-193 (2014).
- Lewis-Smith, D., et al. Homozygous deletion in MICU1 presenting with fatigue and lethargy in childhood. Neurol Genet. 2 (2), e59 (2016).
- Tosatto, A., et al. The mitochondrial calcium uniporter regulates breast cancer progression via HIF-1alpha. EMBO Mol Med. 8 (5), 569-585 (2016).
- Cardenas, C., et al. Selective Vulnerability of Cancer Cells by Inhibition of Ca(2+) Transfer from Endoplasmic Reticulum to Mitochondria. Cell Rep. 15 (1), 219-220 (2016).
- Dedkova, E. N., Blatter, L. A.
- Florea, S. M., Blatter, L. A. The role of mitochondria for the regulation of cardiac alternans. Front Physiol. 1, 141 (2010).
- Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nat Protoc. 1 (3), 1057-1065 (2006).
- Bonora, M., et al. Subcellular calcium measurements in mammalian cells using jellyfish photoprotein aequorin-based probes. Nat Protoc. 8 (11), 2105-2118 (2013).
- Zima, A. V., Kockskamper, J., Mejia-Alvarez, R., Blatter, L. A. Pyruvate modulates cardiac sarcoplasmic reticulum Ca2+ release in rats via mitochondria-dependent and -independent mechanisms. J Physiol. 550 (Pt 3), 765-783 (2003).
- Kruger, N. J. The Bradford method for protein quantitation. Methods Mol Biol. 32, 9-15 (1994).
- Zazueta, C., Sosa-Torres, M. E., Correa, F., Garza-Ortiz, A. Inhibitory properties of ruthenium amine complexes on mitochondrial calcium uptake. J Bioenerg Biomembr. 31 (6), 551-557 (1999).
- Davidson, S. M., Duchen, M. R. Imaging mitochondrial calcium signalling with fluorescent probes and single or two photon confocal microscopy. Methods Mol Biol. 810, 219-234 (2012).
- Matlib, M. A., et al. Oxygen-bridged dinuclear ruthenium amine complex specifically inhibits Ca2+ uptake into mitochondria in vitro and in situ in single cardiac myocytes. J Biol Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).
- Chamberlain, B. K., Volpe, P., Fleischer, S. Inhibition of calcium-induced calcium release from purified cardiac sarcoplasmic reticulum vesicles. J Biol Chem. 259 (12), 7547-7553 (1984).
