Biochemistry

线粒体钙在分离线粒体和培养细胞中的流入分析

Published: April 27, 2018 doi: 10.3791/57225

Joshua T. Maxwell¹, Chin-Hsien Tsai¹, Tahmina A. Mohiuddin², Jennifer Q. Kwong¹

¹Department of Pediatrics, Emory University School of Medicine, ²Emory College of Arts and Sciences, Emory University

Summary

在这里, 我们提出两个协议, 以测量线粒体 Ca^{2 +}流入孤立的线粒体和培养细胞。对于孤立的线粒体, 我们使用 ca^{2 +}敏感染料钙 green-5N, 详细介绍了一个基于板读取器的 ca^{2 +}导入分析。对于培养细胞, 我们使用 Ca^{2 +}染料 Rhod-2/AM 描述了共焦显微方法。

Abstract

由线粒体处理的 Ca^{2 +}是调节广泛细胞中生理和病理过程的关键功能。准确测量来自线粒体的 ca^{2 +}的流入和流出的能力对于确定线粒体 ca^{2 +}处理在这些进程中的作用非常重要。在本报告中, 我们提出两种方法来测量线粒体 Ca^{2 +}处理在孤立的线粒体和培养细胞。我们首先详细介绍了一个基于平板阅读器的测量线粒体 ca^{2 +}吸收使用 Ca^{2 +}敏感染料钙 green-5N 的平台。基于平板阅读器的格式绕过了对专用设备的需要, 而钙 green-5N 染料非常适合于从分离的组织线粒体中测量 Ca^{2 +} 。对于我们的应用, 我们描述的测量线粒体 Ca^{2 +}吸收线粒体从小鼠心脏组织分离;但是, 此过程可用于测量线粒体 Ca^{2 +}在与其他组织 (如肝脏、骨骼肌肉和大脑) 隔绝的线粒体中摄取量。其次, 我们描述了以共焦显微镜为基础的检测透细胞线粒体 ca^{2 +}使用 Ca^{2 +}敏感染料 Rhod-2/AM 和成像使用2维激光扫描显微术。此通透协议消除了胞浆染料污染, 允许对线粒体 Ca^{2 +}中的变化进行特定记录。此外, 激光扫描显微镜允许高帧率捕获线粒体 Ca^{2 +}的快速变化, 以应对在外部溶液中应用的各种药物或试剂。此协议可用于测量线粒体 Ca^{2 +}在许多细胞类型中的吸收, 包括主要细胞, 如心肌细胞和神经元, 以及永生化细胞系。

Introduction

线粒体是胞内 Ca^{2 +}存储和信号传递的关键站点。数十年的研究表明, 线粒体有能力导入和隔离 Ca^{2 +} ¹^,²。但是, 线粒体不仅仅是 Ca^{2 +}存储的被动站点。在线粒体隔间的 Ca^{2 +}执行基本信号功能, 包括调节代谢输出和激活线粒体介导的细胞死亡通路, 此前已对³进行了回顾。对于代谢调节, Ca^{2 +}增强了 tricarboxylic 酸循环和呼吸链复合体的三基质局部化脱氢酶的活性, 以增加线粒体能量生产 4, 5.与线粒体 ca^{2 +}过载和失调线粒体 ca^{2 +}处理, Ca^{2 +}触发线粒体通透性过渡孔 (MPTP) 开放, 导致线粒体内膜通透,膜电位损失, 线粒体功能障碍, 肿胀, 破裂最终, 细胞死亡⁶^,⁷^,⁸^,⁹。因此, 线粒体 Ca^{2 +}信号直接影响细胞生命和死亡通路通过新陈代谢控制和 MPTP 死亡轴。

近年来, 对线粒体 ca^{2 +}动力学研究的兴趣迅速扩大, 大部分原因是线粒体 ca^{2 +} uniporter 复合体的分子成分的鉴定, 线粒体内作为 Ca^{2 +}的主要模式的膜传送器导入到线粒体矩阵¹⁰^,¹¹^,¹²。uniporter 的这些结构和调控亚基的鉴定提出了基因靶向线粒体 Ca^{2 +}流入调节线粒体功能和功能障碍的可能性, 并促进了研究uniporter 复合体和线粒体 Ca 的贡献^{2 +}流入疾病¹³^,¹⁴^,¹⁵。事实上, 线粒体 Ca^{2 +}信号已牵连到多种疾病的病理, 从心脏病到变性, 癌症¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^, ¹⁹^,²⁰。

考虑到线粒体 ca^{2 +}信号在新陈代谢和细胞死亡中的根本重要性, 并结合线粒体 ca^{2 +}信号影响的生物系统的广泛范围, 评估线粒体 ca^{2 + 的方法}涌入是非常有趣的。毫不奇怪, 测量线粒体 Ca^{2 +}的各种技术和工具已经开发出来。这些方法包括使用荧光 Ca^{2 +}敏感染料²¹^、²²和基因编码的 Ca^{2 +}传感器 (如 cameleon 和 aequorin²³^{) 等工具,} ²⁴。本文的目的是突出显示可测量线粒体 Ca^{2 +}吸收的不同方法和模型系统。我们提出两种实验方法来评估线粒体 Ca^{2 +}涌入容量。以心肌线粒体为例, 我们详细介绍了一个基于平板阅读器的测量线粒体 ca^{2 +}摄取量的平台, 使用 Ca^{2 +}敏感染料钙 green-5N, 最适合于孤立的组织线粒体¹⁴.利用培养的 NIH 3T3 细胞, 我们还描述了一种基于共焦显微成像的检测方法, 用于测量透细胞中线粒体 Ca^{2 +} , 使用 Ca^{2 +}敏感染料 Rhod-2/AM²⁵。

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Protocol

本议定书所述的所有方法均已由埃默里大学机构动物护理和使用委员会批准。

注: 第一部分是用平板阅读器测量线粒体 Ca^{2 +}在孤立的心肌线粒体中的流入的实验程序。

1. 试剂和溶液

使500毫升的 MS EGTA 缓冲线粒体隔离: 225 毫米甘露醇, 75 毫米蔗糖, 5 毫米 4-(2-羟乙基)-1-piperazineethanesulfonic 酸 (HEPES), 1 毫米乙二醇-双 (β氨基乙基醚)-n-, n, n ', n '-四乙酸四酸 (EGTA), pH 值调整为7。4与 KOH。通过0.22 微米的过滤器消毒, 并存储在4摄氏度。在使用前, 请确保 MS EGTA 缓冲器预冷至4摄氏度。
准备100毫升氯化钾缓冲器: 125 毫米氯化钾, 20 毫米 HEPES, 1 毫米₂PO₄, 2 毫米氯化镁₂, 40 微米 EGTA 和 pH 值调整为7.2 与 KOH。把它储存在室温下。
在二甲基亚砜 (亚砜) 上制备1毫米钙 green-5N。钙 green-5N 的库存可以 aliquotted, 并储存在-20 摄氏度。
为 Ca^{2 +}吸收准备基板。
1. 准备1米丙酮酸钠, pH 值7.4。储存在整除数-20 摄氏度。
2. 准备500毫米苹果酸, pH 值7.4。储存在整除数-20 摄氏度。

2. 心肌线粒体的分离

根据制度标准弄死老鼠。
注: 对于我们在制度上批准的安乐死方法, 小鼠被 isofluorane 吸入并因颈椎脱位而被麻醉。
通过打开胸腔, 沿肋骨两侧切开, 心脏两侧, 切断隔膜, 切除心脏组织来收集心脏。
注意: 在这个协议中, 线粒体隔离是从一个成年小鼠 (大约120毫克) 收集的整个心脏进行的, 这应该足够3-4 实验。对于线粒体与其他富含线粒体的组织 (如肝脏) 的分离, 可根据所描述的协议使用多达200毫克的组织。
彻底冲洗组织在25毫升的冰冷1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS), 确保所有的血液被挤出心室。
注: 当液体从心脏挤出时, 心脏会充分冲洗。
用一把锋利的剪刀把心切成5毫升的冰冷 1x PBS 中的小块。
丢弃 PBS 并将碎心组织转移到预冷的7毫升玻璃-聚四氟乙烯 dounce 均质机, 其间隙为0.10 到0.15 毫米。
加入5毫升冰冷 EGTA 缓冲液, 融汇样品, 直到组织片不再可见 (大约11冲程)。
注意: 不要过度融汇组织, 因为目标是获得完整和功能的线粒体。
将匀浆转移到15毫升管上。
离心匀浆在 600 x g 在4°c 为5分钟对球团核和未完整的细胞。
将上清液转移到新鲜的15毫升管, 并将其离心在 1万 x g 处, 4 摄氏度, 以颗粒线粒体为10分钟。
去掉上清, 将线粒体颗粒放在冰上。
用冰冷的 MS-EGTA 缓冲液清洗线粒体颗粒两次。每个洗涤, 并用重悬线粒体颗粒在5毫升的 MS EGTA 缓冲, 离心它在 1万 x 克4摄氏度10分钟, 并丢弃上清。
最后洗完后, 弃上清, 并用重悬 100 ul EGTA 缓冲液中的线粒体。把线粒体放在冰上。
注: 线粒体应用于实验1小时以内。
使用布拉德福德蛋白测定法测定线粒体蛋白浓度²⁶。

3. 基于平板阅读器的线粒体钙摄取量测量

注: 在这里, 它被描述的协议, 以分析线粒体 Ca^{2 +}吸收使用一个多模版读卡器装有注射器。任何能读取钙 green-5N 荧光 (506/532 nm 的激发/发射) 的平板阅读器, 都可以使用自动的试剂注射器来保持从光中保护的反应。

程序板阅读器执行动态读取钙 green-5N 荧光与测量每秒为 1000 s 的总化验时间. 另外, 程序的试剂注射器分配 5 ul 的 CaCl₂解决方案在三十年代, 150s, 300s、480s 和690s 时间点。
注意: CaCl₂注入的时间是用户定义的, 可以根据实验需要进行调整。
将使用 CaCl₂解决方案的试剂注入器作为质数。
注意: CaCl₂解决方案的集中度是用户定义的, 可以在随后的运行中进行调整, 以滴定触发 MPTP 打开所需的 Ca^{2 +}的数量。
将200微克的线粒体添加到一个96井板的单个井中。
在井中加入适量的氯化钾缓冲液, 使线粒体和氯化钾缓冲器的总容积达 197 ul。
添加 1 ul 1 M 丙酮酸, 1 ul 的500毫米苹果的线粒体混合物。吸管轻轻地混合, 并在室温下孵化线粒体与基质2分钟, 使线粒体变得精力充沛。
添加 1 ul 1 毫米钙 green-5N 库存。轻轻地混合吹打。
注: 在添加钙 green-5N 染料后, 保护反应不受光照。
启动预编程的动力学协议和监测钙 green-5N 荧光。

4. 试剂和溶液

注: 第二部分是培养细胞中线粒体 Ca^{2 +}共焦成像的实验程序

使 Tyrode 的溶液 (130 毫米氯化钠, 4 毫米氯化钾, 2 毫米 CaCl₂, 1 毫米氯化镁₂, 10 毫米葡萄糖, 10 毫米 HEPES, pH 7.2 与 KOH)。储存在4摄氏度。使用前请将其预热至室温。
准备洗涤液 (100 毫米醋酸钾, 15 毫米氯化钾, 5 毫米的₂PO₄, 5 毫米毫克 ATP, 0.35 毫米 EGTA, 0.12 毫米 CaCl₂, 0.75 毫米氯化镁₂, 10 毫米磷酸肌酸, 10 毫米 HEPES, pH 7.2 与 KOH)。储存在4摄氏度。使用前请将其预热至室温。
准备通透溶液, 在洗涤液中含有0.005% 皂苷。每天准备新鲜的。
准备 0 Ca^{2 +}内部解决方案 (100 毫米醋酸钾, 15 毫米氯化钾, 0.35 毫米 EGTA, 0.75 毫米氯化镁₂, 10 毫米 HEPES, pH 值调整为7.2 与 KOH)。储存在4摄氏度。使用前请将其预热至室温。
准备包含 Ca^{2 +}的内部解决方案。将 CaCl₂添加到上面的内部解决方案, 以达到所需的可用 Ca^{2 +}的浓度。使用 MaxChelator 程序 (maxchelator.stanford.edu) 计算要添加的 CaCl₂的数量。
准备1毫米 Rhod-2/AM 股票在亚砜和存储它在-20 °c, 直到使用。
准备1毫米 MitoTracker 绿色股票在亚砜和存储它在-20 °c, 直到使用。

5. 用于成像的电镀细胞

洗涤 22 x 22 cm²玻璃盖玻片与100% 乙醇并且允许盖玻片空气干燥。
将玻璃盖玻片放入6井组织培养皿的单个水井中。
注: 盖玻片可涂覆层粘连蛋白、聚 l-赖氨酸或类似基质, 促进细胞附着。
胰蛋白酶处理和平板细胞上的盖玻片瞄准大约70% 汇合日的成像。

6. 用 Rhod-2/AM 和 MitoTracker 绿色装载细胞

准备 Rhod-2/AM-MitoTracker 绿色工作解决方案。添加 20 ul 的 Rhod-2/AM 1 毫米股票, 0.2 ul MitoTracker 绿色1毫米股票, 2.5 ul 的 20% pluronic F-127 到1毫升 Tyrode 的解决方案。Rhod-2 在工作溶液中的最终浓度为20µM, MitoTracker 绿色的最终浓度为200纳米。
从盖玻片中轻轻移除生长介质。
注: 在染料溶液添加之前, 洗涤步骤是不必要的。
将 Rhod-2/AM-MitoTracker 绿色溶液以滴状的方式添加到盖玻片上, 直到盖玻片被覆盖 (每盖玻片大约3-4 滴)。
在室温保护下, 在室温下孵化30分钟, 使细胞与染料一起加载。
酯化 Rhod-2/AM。轻轻地去除 Rhod-2/AM-MitoTracker 绿色溶液, 用新鲜室温 Tyrode 的溶液代替它, 在室温下将其孵化30分钟以保护光线。

7. 线粒体 Rhod-2/AM 和 MitoTracker 绿荧光的共焦成像

将盖玻片转移到显微镜成像室, 用洗涤液填充腔室。
在40X 的相位对比观察单元格的设置下, 调整焦点, 直到单元格可见并聚焦。
Permeabilize Rhod-2/AM-MitoTracker 绿色负载细胞的等离子膜去除细胞质局部 Rhod-2, 同时保留线粒体局部染料。
1. 从盖玻片中取出洗涤液。
2. 用通透解决方案替换约1分钟。
3. 在整个通透过程中直观地监测细胞膜形态学。透细胞会形成粗糙的表面。
4. 通透完成后, 立即删除通透解决方案, 并将其替换为 0 Ca^{2 +}内部解决方案。
同时图像 Rhod-2 荧光 (激发使用 559 nm 激光线和发射波长之间的 575-675 nm) 和 MitoTracker 绿色荧光 (激发使用488nm 激光线和发射波长之间收集505-525 毫微米)。关注透细胞, 显示清晰的定位 Rhod-2 和 MitoTracker 绿色。
减少显微镜激光和增益设置, 使线粒体 Rhod-2 荧光暗淡, 只是可见。
选择显微镜设置以在适当的帧速率和时间过程中获取特定应用程序的2维扫描。建议至少30帧/秒的帧速率来准确捕获线粒体 Ca^{2 +}中变化的动力学。
卸下 0 Ca^{2 +}内部解决方案, 而不干扰单元格或显微镜焦点。
开始图像采集。
添加 Ca^{2 +}-充满内部解决方案在十年代的时间点, 无论是手动或与灌注系统。
选择感兴趣的区域 (ROIs), 包括图像采集软件中线粒体 Rhod-2 和 MitoTracker 绿色信号之间的定位区域。
注: 每一个记录的时间点的任意荧光 (F) 值都是为每个 ROI 获取的。这些值是背景减去并规范化为初始荧光 (在 Ca^{2 +}加法之前;f₀), 并绘制为 f/f₀随着时间的推移, 数据呈现和量化的幅度变化的线粒体 Ca^{2 +}。

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Representative Results

图 1显示了使用基于板阅读器的平台和 Ca^{2 +}染料钙 green-5N, 在孤立的心肌线粒体中线粒体 Ca^{2 +}摄取量测量。在控制条件下 (图 1A), 在含有钙 green-5N 的氯化钾缓冲液中悬浮心肌线粒体, 然后以 CaCl₂ (5 ul 0.6 毫米 CaCl₂解决方案) 的顺序脉冲来挑战, 150s, 300s, 480s 和690s 时间点。CaCl₂添加的时间和数量可以由用户调整, 以便在后续添加之前允许对添加的 Ca^{2 +}进行完全的线粒体摄取。在这种检测中, 钙 green-5N 信号的增加反映了高缓冲 Ca^{2 +}级别。当线粒体导入 ca^{2 +}时, ca^{2 +}从缓冲区中移除, green-5N 钙荧光降低。重要的是, 在第三次添加 ca^{2 +}时, 钙 green-5N 荧光曲线会发生突然和尖锐的变化, 而不是继续从缓冲区中移除 Ca^{2 +} , 并由图1A 中的红色箭头指示。.荧光的突然增加反映线粒体 Ca^{2 +}超载和 MPTP 开放。在 MPTP 激活之前由线粒体占用的 Ca^{2 +}的总数量反映了线粒体 Ca^{2 +}容量, 并且可以表示为μmol Ca^{2 +}/mg 蛋白。通过对添加的钙的定时和浓度进行调整, 可以确定触发渗透率转换所需的 Ca^{2 +}的数量。在图 1B中, 线粒体被预先治疗10分钟室温与10微米 Ru360, 一个良好的特征抑制剂的线粒体 Ca^{2 +} uniporter 复杂²⁷。Ru360 抑制 uniporter 依赖的线粒体 Ca^{2 +}的摄取, 这是由 green-5N 荧光在每个 Ca^{2 +}加法之后的步进增加而证明的。

为 Rhod-2/AM 的线粒体钙共聚焦成像, 我们显示了 NIH 3T3 细胞的代表性结果。MitoTracker 绿色是一种线粒体选择性染料, 优先玷污线粒体网络 (图 2A)。继皂苷介导的等离子膜通透, 胞浆 Rhod-2 被冲走, 留下一个 Rhod-2 染色的线粒体网络, 与 MitoTracker 绿色本地化 (图 2A)。Rhod-2 也可能在非线粒体结构中积聚, 因此要分析的 ROI 应集中在 MitoTracker 绿色与 Rhod-2 的共同定位区域。在控制单元格中, 添加一个包含2微米自由 Ca^{2 +}的 Ca^{2 +}的内部解决方案会导致 Rhod-2 荧光的快速上升, 这在 uniporter 复合体被10微米 Ru360 (图 2B) 抑制时会受到抑制。

图 1: 线粒体 Ca^{2 +}吸收孤立的心肌线粒体。(A)控制心脏线粒体的相对钙 green-5N 荧光图和(B)在室温下用10微米 Ru360 预处理的线粒体, 5 ul 0.6 毫米 CaCl₂ (黑色箭头) 受到挑战。线粒体 Ca^{2 +}重载诱导的渗透率转换用红色箭头表示。请单击此处查看此图的较大版本.

图 2: 透细胞中线粒体 Ca^{2 +}的代表性分析。(A)具有 rhod-2 (红色) 和 MitoTracker 绿色 (绿色) 的3T3 细胞的代表荧光图像, 以及 MitoTracker 与皂苷后的 rhod-2 和通透绿色 (黄色) 的合并图像。(B)在控制条件下 (黑色跟踪) 或10µM Ru360 预处理 (红色跟踪) 在应用2µM 自由 Ca^{2 +}内部解决方案期间, 从单个3T3 细胞 Rhod-2 荧光迹。请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

在这里, 我们描述了两种测量线粒体 Ca^{2 +}流入的方法。基于印版阅读器的钙 green-5N 方法监视 extramitochondrial ca^{2 +}级别, 是一个 ca^{2 +}摄取分析, 非常适合在孤立的线粒体中测量。虽然我们已经显示了来自孤立小鼠心肌线粒体的代表性结果, 但这种检测方法可以很容易地适应线粒体丰富的组织线粒体, 包括肝脏、骨骼肌肉和大脑。此外, 对于传统用于 Ca^{2 +}测量 (如 fluorometers) 的专用设备, 可能无法立即使用, 因此, 板读系统可能是实验室的理想选择。一个板块阅读器可以扫描的有限的最大时间跨度和对预编程试剂添加的需要可能是这种技术的弱点相比 fluorometers, 但是, fluorometers 的成本和可用性可能超过这一好处。通过改变试剂注入器中 ca^{2 +}的浓度, 可以确定线粒体在触发 MPTP 打开之前能够隔离的 ca^{2 +}的数量 (线粒体 Ca^{2 +}容量)。

我们描述的共焦成像协议, 为 Rhod-2/AM 测量线粒体 Ca^{2 +}是理想的培养细胞, 也可以适应初级细胞。在这种方法中, 等离子体膜与皂苷透, 从而使胞浆染料的冲蚀。在这个过程之后, 只有在细胞器中被包裹的染料仍然存在, 允许精确和特定的线粒体荧光测量。此外, 这种透细胞化验允许对 extramitochondrial Ca^{2 +}级别的实验控制, 以及用户定义的条件下, 线粒体被暴露。Rhod-2/AM 共焦成像的线粒体 Ca^{2 +}可用于完整的非透细胞, 但这需要优化染料负荷和脱酯化, 以确保线粒体特定的 Rhod-2 本地化²⁸。Rhod-2/AM 方法的优点是 Rhod-2/AM 在商业上是可用的, 染料可以很容易地应用到各种各样的细胞类型。然而, Rhod-2 染料的定位是一个需要考虑的限制因素。为了确保测量线粒体特异的 Rhod-2 荧光, 第二种光谱不同的染料, 如 MitoTracker 绿, 可用于染色前的线粒体成像。基因编码的 Ca^{2 +}针对线粒体的传感器可能绕过这个问题, 但是, 细胞需要被转染/转基因与传感器结构, 并有足够的时间来表达蛋白质。这并不总是理想的主要细胞生存时间有限, 染料负荷可能是一个玩意的过程。

在这两种协议中, 我们使用 uniporter 复合抑制剂 Ru360 来说明线粒体 Ca^{2 +}流入抑制的效果。Ru360 是 uniporter 抑制的黄金标准, 迄今为止, 它是此 tranporter²⁹唯一已知的特定抑制剂。另外, 钌红也可以使用, 但是, 钌红色是一个非特异性 uniporter 抑制剂, 已被证明也抑制 Ca^{2 +}释放从肌网³⁰。受损的线粒体 Ca^{2 +}处理可能是线粒体功能障碍的标志, 因为 uniporter 复杂依赖的 Ca^{2 +}传输是线粒体膜潜在依赖, 并通过扩展, 这是依赖于呼吸链功能.因此, 线粒体 uncouplers, 如羰基氰化物-4-(三氟甲氧基) 苯腙 (FCCP) 和羰基氰化物 m-氯苯基腙 (CCCP), 其消散线粒体膜电位, 也可作为控制化合物抑制线粒体 Ca^{2 +}流入。由于线粒体是胞内 Ca^{2 +}存储的站点, 因此线粒体可能在胞内空间内作为 ca^{2 +}缓冲区发挥作用。因此, 线粒体 ca^{2 +}处理的更改可能会影响胞浆 ca^{2 +}景观的形状。考虑到线粒体 ca^{2 +}动态可能发挥作用的疾病条件越来越多, 此处说明的方法可用于研究线粒体 ca^{2 +}在动物模型中的流入和细胞模型的疾病。

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Disclosures

作者没有披露报告。

Acknowledgments

这项工作得到了美国心脏协会 (J.Q.K.) 的赠款资助。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Olympus FV1000 Laser Scanning confocal microscope	Olympus	FV1000
Synergy Neo2 Multimode microplate reader with injectors	Biotek
Tissue Homogenizer	Kimble	886000-0022
22 x 22 mm coverslips	Corning	2850-22
96 well plate	Corning	3628
6 well plate	Corning	3506
Calcium Green-5N	Invitrogen	C3737
MitoTracker green FM	Invitrogen	M7514
Rhod-2, AM	Invitrogen	R1244
DMSO	Invitrogen	D12345
Pluronic F-127	Invitrogen	P3000MP
D-Mannitol	Sigma	M9546
Sucrose	EMD Millipore	8510
HEPES	Sigma	H3375
EGTA	Sigma	E8145
Potassium chloride	Fisher	BP366-500
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P0662
Magnesium chloride	Sigma	M2670
Sodium pyruvate	Sigma	P2256
L-malic acid	Sigma	M1125
Calcium chloride	Sigma	C4901
Potassium acetate	Fisher	BP364-500
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187
Phosphocreatine disodium salt	Sigma	P7936
Saponin	Sigma	S7900
Ru360	Calbiochem	557440