Summary
Aquí, presentamos dos protocolos para la medición de mitocondrial Ca2 + afluencia en mitocondrias aisladas y células cultivadas. Para mitocondrias aisladas, detallamos una placa base de lector Ca2 + importación de ensayo utilizando el Ca2 + sensible tinte verde-5N de calcio. Para las células cultivadas, se describe un método de microscopia confocal con el Ca2 + tinte Rhod-2/AM.
Abstract
CA2 + por las mitocondrias es una función crítica, regulación de procesos fisiológicos y patofisiológicos en un amplio espectro de células. La capacidad para medir con precisión el influjo y eflujo de Ca2 + de las mitocondrias es importante para determinar el papel de mitocondrial Ca2 + en estos procesos. En este informe, presentamos dos métodos para la medición de mitocondrial Ca2 + manejo en mitocondrias aisladas y células cultivadas. Primero detallamos una placa lector plataforma para medir mitocondrial Ca2 + absorción utilizando el Ca2 + tinte sensible calcio verde-5N. El formato de placa base de lector evita la necesidad de equipos especializados, y el tinte verde-5N de calcio es ideal para la medición de Ca2 + de las mitocondrias del tejido aislado. Para nuestra aplicación, describimos la medida capta el Ca2 + mitocondrial en mitocondrias aisladas de tejido de corazón de ratón; sin embargo, este procedimiento puede aplicarse para medir mitocondrial absorción de Ca2 + en la mitocondria aislada de otros tejidos como hígado, músculo esquelético y cerebro. En segundo lugar, describimos un análisis basado en la microscopía confocal para medición de mitocondrial Ca2 + en células permeabilized con el Ca2 + sensible tinte Rhod-2/AM y proyección de imagen usando microscopía de escaneo láser 2 dimensiones. Este protocolo de permeabilización elimina la contaminación citosólica de tinte, que permiten grabación específica de cambios mitocondriales Ca2 +. Por otra parte, microscopía de escaneo láser permite velocidades de fotogramas alta capturar cambios rápidos de mitocondrial Ca2 + en respuesta a diferentes drogas o reactivos aplicados en la solución externa. Este protocolo se puede aplicar para medir mitocondrial Ca2 + absorción en muchos tipos de células incluyendo células primarias como las neuronas y miocitos cardiacos y líneas celulares inmortalizadas.
Introduction
Las mitocondrias son sitios críticos de almacenamiento de Ca2 + intracelular y la señalización. Décadas de investigación han demostrado que las mitocondrias tienen la capacidad de importar y el secuestro de Ca2 + 1,2. Las mitocondrias, sin embargo, no son meramente pasivos sitios de almacenamiento de Ca2 + . CA2 + en el compartimiento mitocondrial realiza funciones de señalización fundamentales incluyendo la regulación de la producción metabólica y la activación de las vías de muerte celular mitocondrial mediado, que ha sido previamente revisado3. Para la regulación metabólica, Ca2 + aumenta la actividad de Deshidrogenasas matriz localizada tres del ciclo del ácido tricarboxílico, así como complejos de la cadena respiratoria, para aumentar la producción de energía mitocondrial4,5 . Con sobrecarga de Ca2 + mitocondrial y altera mitocondrial Ca2 + manejo, Ca2 + activa transición de permeabilidad mitocondrial poro abierto (MPTP), llevando a permeabilización de la membrana interna mitocondrial, pérdida potencial de la membrana, la disfunción mitocondrial, inflamación, ruptura y en última instancia, la célula muerte6,7,8,9. Por lo tanto, Ca2 + señalización mitocondrial impacta directamente la vida celular y vías de la muerte a través de control metabólico y eje de MPTP a la muerte.
En los últimos años, allí ha sido expandiendo rápidamente interés en el estudio de Ca2 + dinámica mitocondrial debido en gran parte a la identificación de los componentes moleculares de la Ca2 + uniporter mitocondrial complejo, un interior mitocondrial importación de transportador de membrana que es un modo primario de Ca2 + en la matriz mitocondrial 10,11,12. Identificación de estas subunidades estructurales y reguladoras de la uniporter ha traído la posibilidad de apuntar genético mitocondrial Ca2 + afluencia para modulan la función mitocondrial y la disfunción y facilitó el estudio de la contribución de la uniporter complejo mitocondrial Ca2 + afluencia a enfermedad13,14,15. De hecho, Ca2 + señalización mitocondrial se ha implicado en las patologías de una gran variedad de enfermedades que van desde la enfermedad cardiaca y neurodegeneración, cáncer16,17,18, 19,20.
Dada la importancia fundamental de mitocondrial Ca2 + en el metabolismo y muerte celular y combinado con el amplio alcance de los sistemas biológicos Ca2 + señalización mitocondrial impactos, métodos para evaluar la Ca mitocondrial2 + afluencia son de gran interés. No en vano, se han desarrollado una variedad de técnicas y herramientas para medir mitocondrial Ca2 + . Estos incluyen métodos que utilizan herramientas tales como fluorescente Ca2 +-tintes sensibles21,22 y genéticamente codificado Ca2 + sensores orientados a la mitocondria, como el cameleon y aequorin23, 24. El objetivo de este artículo es destacar diferentes métodos y sistemas de modelo en el que se puede medir la absorción de Ca2 + mitocondrial. Presentamos dos métodos experimentales para evaluar mitocondrial Ca2 + afluencia capacidad. Utilizando mitocondrias cardiacas como ejemplo, detallamos una placa lector plataforma para medir mitocondrial Ca2 + absorción utilizando el Ca2 + sensible tinte verde-5N de calcio que es ideal para las mitocondrias aisladas de tejidos14 . Uso de las células 3T3 NIH cultivadas, también Describimos un análisis de basado en la proyección de imagen de microscopía confocal para medición de mitocondrial Ca2 + en células permeabilized con el Ca2 + sensible tinte Rhod-2/AM25.
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Protocol
Todos los métodos descritos en este protocolo han sido aprobados por el cuidado de Animal institucional y Comité de uso de la Universidad de Emory.
Nota: La primera parte es el procedimiento experimental para medir mitocondrial Ca2 + entrada en la mitocondria cardiaca aislada usando un lector de placas.
1. los reactivos y soluciones
- Tomar 500 mL de buffer EGTA MS para aislamiento mitocondrial: manitol de 225 mM, 75 mM sacarosa, ácido-(2-hydroxyethyl)-1--1-ácido de 5 mM 4 (HEPES), 1 mM el glicol de etileno-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-ácido tetraacético (EGTA), pH ajustado a 7,4 con KOH. Esterilizar con filtro 0,22 μm y almacenar a 4 ° C. Asegúrese de que el buffer EGTA MS es previamente enfriado a 4 ° C antes de usar.
- Preparar 100 mL de solución de KCl: 125 mM KCl, 20 mM HEPES 1 m m KH2PO4, 2 mM de MgCl2, 40 μM EGTA y pH ajustado a 7.2 con KOH. Almacenar a temperatura ambiente.
- Preparación de calcio 1 mM verde-5N stock en dimetil sulfóxido (DMSO). El stock de la verde-5N de calcio puede ser alicuotados y almacenado a-20 ° C.
-
Preparación de sustratos para la absorción de Ca2 + .
- Preparar el piruvato de sodio de 1 M, pH 7,4. Almacenar en alícuotas a-20 ° C.
- Preparar el malato de 500 mM, pH 7,4. Almacenar en alícuotas a-20 ° C.
2. aislamiento de mitocondrias cardiacas
- Eutanasia el ratón según normas institucionales.
Nota: Nuestro método institucionalmente aprobados de eutanasia, ratones fueron anestesiados por inhalación isofluorane y sacrificados por dislocación cervical. - Recoger el corazón por abrir la cavidad torácica, corte a lo largo de ambos lados de las costillas, que flanquean el corazón, cortando el diafragma y extirpando el tejido del corazón.
Nota: En el presente Protocolo, se realiza con aislamiento mitocondrial de todo corazón de un ratón adulto (aproximadamente 120 mg), que debe ser suficiente para 3-4 experimentos. Para el aislamiento mitocondrial de otros tejidos ricos en mitocondrias, como el hígado, hasta 200 mg de tejido puede utilizarse siguiendo el protocolo descrito. - Enjuague el tejido completamente 25 mL de helado 1 x de tampón fosfato salino (PBS) asegurando que es exprimida toda la sangre de los ventrículos.
Nota: El corazón se suficientemente efectúe cuando el líquido exprimido del corazón salga limpia. - Picar el corazón en trozos pequeños en 5 mL de helado de 1 x PBS utilizando un par de tijeras afiladas.
- Descartar el PBS y transferencia de tejido de corazón picado a un homogeneizador de dounce previamente refrigerado 7 mL vidrio-teflon con una separación de 0.10 a 0.15 mm.
- Añadir 5 mL de buffer EGTA MS helada y homogeneizar la muestra hasta piezas de tejido no son visibles (aproximadamente 11 carreras).
Nota: No homogeneizar demasiado el tejido como el objetivo es obtener las mitocondrias intactas y funcionales. - Transferir el homogeneizado en un tubo de 15 mL.
- Centrifugar el homogeneizado a 600 x g a 4 ° C durante 5 minutos para que sedimenten los núcleos y células intactas.
- Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo 15 mL y centrifugar a 10.000 x g a 4 ° C durante 10 minutos para que sedimenten las mitocondrias.
- Deseche el sobrenadante y mantener el pellet mitocondrial en el hielo.
- Lavar el pellet mitocondrial utilizando doble buffer EGTA MS helada. Para cada colada, Resuspender el precipitado mitocondrial en 5 mL de buffer EGTA MS centrifugar a 10.000 x g a 4 ° C por 10 min y descarte el sobrenadante.
- Después del último lavado, eliminar el sobrenadante y resuspender las mitocondrias en 100 μL de tampón de EGTA MS frío hielo. Mantenga las mitocondrias en el hielo.
Nota: Las mitocondrias deben utilizarse para la experimentación dentro de 1 h. - Medir la concentración de la proteína mitocondrial mediante un análisis de la proteína de Bradford26.
3. placa base de lector medición de la absorción de calcio mitocondrial
Nota: Aquí, es descrito el protocolo de análisis mitocondrial Ca2 + absorción con un lector multimodo equipados con inyectores. Cualquier lector de la placa con la capacidad de lectura de la fluorescencia verde-5N calcio (excitación/emisión de 506/532 nm) en un modo cinético con reactivo automatizado pueden utilizarse inyectores para mantener la reacción de la luz.
- Programa lee el lector de placas para realizar una cinética de fluorescencia verde-5N de calcio con mediciones cada segundo por un tiempo de análisis total de 1.000 s. Además, programar los inyectores reactivo para dispensar 5 μL de solución de CaCl2 en los 30 s, 150 s, 300 s , 480 s, 690 s tiempo puntos y.
Nota: La sincronización de las inyecciones de CaCl2 son definidos por el usuario y puede ajustarse a necesidades experimentales. - Prime los inyectores del reactivo con la solución de CaCl2 que se utilizará.
Nota: La concentración de la solución de CaCl2 es definido por el usuario y se puede ajustar en posteriores pruebas para valorar la cantidad de Ca2 + requerido para activar apertura del MPTP. - Añadir 200 μg de mitocondrias a un pozo individual de una placa bien 96.
- Añadir el volumen adecuado de amortiguador de KCl al pozo tal que el volumen total de mitocondrias y buffer KCl viene a 197 μL.
- Añadir 1 μL de piruvato de 1 M y 1 μL de malato de 500 mM a la mezcla de las mitocondrias. Pipetee suavemente a la mezcla e incubar las mitocondrias con los substratos por 2 min a temperatura ambiente para permitir a las mitocondrias ser energizado.
- Añadir 1 μL del stock de verde-5N de calcio 1 mM. Mezclar suavemente por pipeteo.
Nota: Proteja la reacción de la luz después de añadir el tinte verde-5N de calcio. - Iniciar la pre programado cinética protocolo y monitor calcio verde-5N fluorescencia.
4. reactivos y soluciones
Nota: La segunda parte es un procedimiento experimental para la proyección de imagen confocal de mitocondrial Ca2 + en células cultivadas
- Hacer solución de Tyrode (130 mM de NaCl, 4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM de glucosa y 10 mM HEPES, pH 7.2 con KOH). Almacenar a 4 ° C. Caliéntelo a temperatura ambiente antes de usar.
- Preparar solución de lavado (acetato de potasio de 100 mM, 15 mM KCl, 5 m m KH2PO4, 5 mM de Mg-ATP, 0,35 mM EGTA, 0.12 mM CaCl2, 0,75 mM MgCl2, fosfocreatina de 10 mM, 10 mM HEPES, pH 7.2 con KOH). Almacenar a 4 ° C. Caliéntelo a temperatura ambiente antes de usar.
- Preparar solución de permeabilización, que contiene 0.005% de saponina en la solución de lavado. Preparar diariamente.
- Preparar 0 Ca2 + solución interna (100 m m acetato de potasio, 15 mM KCl, 0,35 mM EGTA, 0,75 mM de MgCl2, 10 mM HEPES, pH ajustado a 7.2 con KOH). Almacenar a 4 ° C. Caliéntelo a temperatura ambiente antes de usar.
- Preparar la solución interna que contiene Ca2 +. Añadir CaCl2 a la solución interna arriba para alcanzar la concentración deseada de libre Ca2 +. La cantidad de CaCl2 añadir se calcula utilizando el programa MaxChelator (maxchelator.stanford.edu).
- Preparar 1 mM stock Rhod-2/AM en DMSO y almacenar a-20 ° C hasta su uso.
- Preparar 1 mM MitoTracker verde stock en DMSO y almacenar a-20 ° C hasta su uso.
5. las células de la galjanoplastia para la proyección de imagen
- Lavar 22 x 22 cm2 cubreobjetos de vidrio con etanol al 100% y permite el cubreobjetos a aire seco.
- Coloque el cubreobjetos de vidrio en pocillos individuales de un plato de cultivo de tejidos bien 6.
Nota: Cubreobjetos pueden ser cubierto con laminina, poly-L-lisina o matriz similar para promover la fijación de la célula. - Trypsinize y las células sobre cubreobjetos con el objetivo de confluencia de 70% aproximadamente en el día de la proyección de imagen de la placa.
6. carga las células con el Rhod-2/AM y MitoTracker Green
- Preparar Rhod-2/AM-MitoTracker green solución de trabajo. Añadir 20 μL de Rhod-2/AM 1 mM stock, 0,2 μL de MitoTracker stock de verde de 1 mM y 2,5 μL de pluronic 20% F-127 a 1 mL de solución de Tyrode. La concentración final de Rhod-2 en la solución de trabajo es de 20 μm y la concentración final de MitoTracker green es de 200 nM.
- Suavemente Retire el medio de crecimiento el cubreobjetos.
Nota: Un paso de lavado no es necesario antes de la adición de solución colorante. - Añadir Rhod-2/AM-MitoTracker solución verde de forma gota a gota sobre el cubreobjetos hasta que el cubreobjetos esté a cubierto (aproximadamente 3-4 gotas por cubreobjetos).
- Incubar durante 30 min a temperatura ambiente protegido de la luz para permitir que las células de carga con los tintes.
- De esterificar Rhod-2/AM. Quite con cuidado el Rhod-2/AM-MitoTracker solución verde, reemplazarlo con solución de Tyrode fresca temperatura e incubar durante 30 min a temperatura ambiente protegido de la luz.
7. proyección de imagen confocal de la Rhod-2/AM mitocondrial MitoTracker fluorescencia
- Transferir el cubreobjetos al microscopio de cámara y llenar la cámara con solución de lavado.
- En configuración para observar células en contraste de fase 40 X, ajustar el foco hasta que las células sean visibles y en foco.
-
Permeabilizar la membrana plasmática de Rhod-2/AM-MitoTracker green cargado quitar localizada citosol Rhod-2, conservando el tinte localizada en las mitocondrias de las células.
- Quite el cubreobjetos a la solución de lavado.
- Reemplazar con solución de permeabilización durante aproximadamente 1 minuto.
- Controlar visualmente la morfología de la membrana plasmática a través del proceso de permeabilización. Las células permeabilized desarrollará una superficie rugosa.
- Cuando termine la permeabilización, inmediatamente retire la solución de permeabilización y sustituirla por 0 Ca2 + solución interna.
- Al mismo tiempo la imagen Rhod-2 fluorescencia (excitación usando la 559 nm láser línea y emisión recogido en longitudes de onda entre 575-675 nm) y MitoTracker verde fluorescencia (excitación usando la línea de láser 488nm y emisión en longitudes de onda entre 505-525 nm). Se centran en células permeabilized mostrando un claro colocalización de Rhod-2 y MitoTracker verde.
- Disminuir el laser microscopio y obtener configuración tales que la fluorescencia de Rhod-2 mitocondrial es débil y apenas visible.
- Seleccione configuración de microscopio para adquirir 2 dimensiones analiza en un curso de ritmo y tiempo de marco apropiado para la aplicación específica. Se recomienda una velocidad de al menos 30 fotogramas/s para capturar con precisión la cinética de los cambios en mitocondrial Ca2 +.
- Retire la Ca 02 + solución interna sin molestar a las células o el enfoque del microscopio.
- Iniciar la adquisición de la imagen.
- Añadir Ca2 +-solución interna repleta en el momento de s 10 punto ya sea manualmente o con un sistema de perfusión.
- Seleccione las regiones de interés (ROIs) para abarcar regiones de colocalización entre Rhod-2 mitocondrial y MitoTracker verde señal en el software de adquisición de imagen.
Nota: Se obtienen valores de fluorescencia arbitraria (F) para cada momento de la grabación de cada retorno de la inversión. Estos valores son antecedentes restan y normalizado a la fluorescencia inicial (antes de Ca2 + adición; F0) y graficados como F/F0 en el tiempo para la presentación de datos y cuantificación de la amplitud del cambio de mitocondrial Ca2 +.
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Representative Results
La figura 1 muestra mitocondrial Ca2 + mediciones de absorción en la mitocondria cardiaca aislada utilizando la plataforma de placa base de lector y el Ca2 + calcio verde-5N del tinte. Bajo condiciones de control (figura 1A), mitocondria cardiaca fueron suspendida en tampón de KCl que contiene calcio verde-5N y luego desafiado con pulsos secuenciales de CaCl2 (5 μL de una solución de CaCl2 de 0,6 mM) añadidos a los 30 s, 150 s, 300 s, 480 s y 690 s tiempo puntos. El tiempo y la cantidad de CaCl2 adiciones pueden ajustarse por el usuario para permitir la completa captación mitocondrial de agregado Ca2 + antes de adiciones posteriores. En este ensayo, aumento de señal verde-5N de calcio refleja niveles de Ca2 + buffer elevada. Como las mitocondrias importación Ca2 +, Ca2 + se elimina de la memoria intermedia y la fluorescencia verde-5N de calcio disminuye. Lo importante, en la tercera incorporación de Ca2 +, la curva de fluorescencia verde-5N de calcio sufre una repentina y fuerte inflexión hacia arriba, en vez de seguir eliminar Ca2 + de la solución tampón y está indicada por la flecha roja en figura 1A . Este repentino aumento en fluorescencia refleja sobrecarga de Ca2 + mitocondrial y la apertura del MPTP. La cantidad total de Ca2 + por mitocondrias antes de la activación de MPTP refleja la capacidad de Ca2 + mitocondrial y puede expresarse como μmol de Ca2 +/mg la proteína. Haciendo ajustes para la sincronización y las concentraciones de calcio añadido, la cantidad de Ca2 + necesaria para desencadenar la transición de permeabilidad puede ser determinado. En la figura 1B, las mitocondrias eran tratadas previamente por 10 min a temperatura ambiente con 10 μM Ru360, un inhibidor de la bien caracterizado de la mitocondrial Ca2 + uniporter complejo27. Ru360 inhibe uniporter-dependiente mitocondrial Ca2 + absorción, y esto se evidencia por el aumento paso a paso en fluorescencia verde-5N de calcio después de cada adición de Ca2 + .
Para la proyección de imagen confocal de calcio mitocondrial con Rhod-2/AM, nos muestran los resultados representativos de las células 3T3 NIH. MitoTracker green es un colorante selectivo de las mitocondrias que tiñe preferentemente la red mitocondrial (figura 2A). Después de saponina-mediada la permeabilización de la membrana plasmática, Rhod-2 citosólica es arrastrado, dejando un Rhod-2 teñidos red mitocondrial que se localiza junto con el verde de MitoTracker (figura 2A). Rhod-2 también puede acumularse en estructuras no mitocondrial, retorno de la inversión de que se analizará debe enfocarse de regiones de colocalización entre los MitoTracker green y Rhod-2. En las células control, la adición de Ca2 +-solución interna llena que contiene 2 μM gratis Ca2 + causa un rápido incremento en la fluorescencia Rhod-2, que se inhibe al complejo de uniporter se inhibe con 10 μM Ru360 (figura 2B).
Figura 1: Mitocondrial Ca2 + absorción en mitocondrias cardiacas aisladas. (A) gráficos de fluorescencia verde-5N de calcio relativo de mitocondrias de corazón de control y (B) las mitocondrias pretratadas con 10 μM Ru360 durante 10 min a temperatura ambiente, desafió con 5 μL de 0,6 mM CaCl2 (flechas negras). Mitocondrial Ca2 + permeabilidad inducida por sobrecarga de transición se indica con la flecha roja. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Análisis representativos de mitocondrial Ca2 + en células permeabilized. (A) imagen representativa de la fluorescencia de las células 3T3 cargado con rhod-2 (rojo) y MitoTracker green (verde) y las imágenes combinadas de rhod-2 y MitoTracker green (amarillo) después de permeabilización con saponina. (B) Rhod-2 fluorescente rastro de una célula 3T3 solo durante la aplicación de 2 μm gratis Ca2 + solución interna en condiciones control (trazo negro) o después de 10 μm Ru360 pre-tratamiento (trazo rojo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aquí, describimos a dos enfoques diferentes para medir mitocondrial Ca2 + afluencia. Placa lector basado en calcio verde-5N método monitores extramitochondrial Ca2 + niveles y es un Ca2 + absorción ensayo que es ideal para mediciones en mitocondrias aisladas. Aunque hemos mostrado resultados representativos de aislados murino mitocondria cardiaca, este ensayo puede ser fácilmente adaptado para las mitocondrias aisladas de tejidos con alta abundancia mitocondrial incluyendo hígado, músculo esquelético y cerebro. Por otra parte, el sistema de lector de placas puede ser una opción ideal para laboratorios donde equipo especializado usado tradicionalmente para el Ca2 + medidas, como fluorómetros, puede no estar inmediatamente disponible. La limitada máxima duración que puede escanear un lector de placas y la necesidad de programar previamente adiciones de reactivo puede ser una debilidad de esta técnica en comparación con fluorómetros, sin embargo, el costo y la disponibilidad de fluorómetros puede compensar este beneficio. Variando la concentración de Ca2 + en los inyectores de reactivo, puede determinarse la cantidad de Ca2 + que las mitocondrias son capaces de secuestrar antes de dispararla MPTP apertura (la mitocondrial Ca2 + capacidad).
El protocolo de imagen confocal que describimos para las mediciones de Rhod-2/AM de mitocondrial Ca2 + es ideal para las células cultivadas y también puede ser adaptado para células primarias. En este método, la membrana plasmática es permeabilized con saponina, que permite el lavado de tinte citosólica. Sólo tinte atrapado en organelos sigue después de este procedimiento, que permite una medición precisa y específica de fluorescencia mitocondrial. Por otra parte, este ensayo celular permeabilized permite control experimental sobre extramitochondrial Ca2 + niveles así como las condiciones definidas por el usuario bajo el cual se exponen las mitocondrias. Proyección de imagen confocal Rhod-2/AM de mitocondrial Ca2 + se puede utilizar en células intactas, no permeabilized pero esto requiere la optimización de la carga de tinte y la esterificación para asegurar una mitocondria específica de localización Rhod-228. Los puntos fuertes del método Rhod-2/AM son que Rhod-2/AM está comercialmente disponible y el tinte puede aplicarse fácilmente a una amplia variedad de tipos celulares. La localización de la tintura de Rhod-2, sin embargo, es una limitación a tener en cuenta. Para asegurar la medición de la fluorescencia de Rhod-2 específicos de la mitocondria, un segundo tinte espectral distinta, como MitoTracker green, puede usarse para teñir mitocondrias antes de la proyección de imagen. Codificada genéticamente Ca2 + sensores orientados a la mitocondria pueden evitar este problema, sin embargo, las células necesitan ser transfectadas/transduced con la construcción del sensor y tener tiempo suficiente para expresar la proteína. Esto no es siempre ideal para pilas con tiempo de supervivencia limitada, y colorante de carga puede ser un proceso de ahorro de tiempo.
En ambos protocolos, hemos utilizado el inhibidor complejo de uniporter Ru360 para ilustrar el efecto mitocondrial Ca2 + afluencia inhibición. Ru360 es el estándar de oro para la inhibición de uniporter y hasta la fecha, es el único inhibidor específico conocido de este tranporter29. Como alternativa, rutenio rojo también puede ser usada, sin embargo, rutenio rojo es un inhibidor de uniporter inespecífico que se ha demostrado que también inhiben la Ca2 + liberación del retículo sarcoplásmico30. Alteración mitocondrial Ca2 + manejo puede ser un signo de disfunción mitocondrial, como uniporter dependiente del complejo Ca2 + transporte es dependiente y, por extensión, esto es dependiente en función de la cadena respiratoria potencial de membrana mitocondrial . Por lo tanto, uncouplers mitocondriales, como el carbonilo cianuro -4-(de trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) y cianuro de carbonilo m- clorofenil hidrazona (CCCP), que se disipe el potencial de membrana mitocondrial también pueden utilizarse como control compuestos para inhibir la mitocondrial Ca2 + afluencia. Puesto que las mitocondrias son sitios de almacenamiento de Ca2 + intracelular, las mitocondrias pueden funcionar como Ca2 + amortiguadores dentro del espacio intracelular. Por lo tanto, alteraciones en el manejo de Ca2 + mitocondrial pueden afectar la forma del paisaje2 + Ca citosólico. Teniendo en cuenta el creciente número de condiciones de enfermedad, donde la dinámica de Ca2 + mitocondrial puede desempeñar un papel, los métodos aquí podrían aplicarse al estudio de la mitocondrial Ca2 + afluencia en modelos animales y modelos celulares de la de la enfermedad.
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Disclosures
Los autores no tienen ninguna revelación al informe.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por donaciones de fondos de la Asociación Americana del corazón (J.Q.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Olympus FV1000 Laser Scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Synergy Neo2 Multimode microplate reader with injectors | Biotek | ||
| Tissue Homogenizer | Kimble | 886000-0022 | |
| 22 x 22 mm coverslips | Corning | 2850-22 | |
| 96 well plate | Corning | 3628 | |
| 6 well plate | Corning | 3506 | |
| Calcium Green-5N | Invitrogen | C3737 | |
| MitoTracker green FM | Invitrogen | M7514 | |
| Rhod-2, AM | Invitrogen | R1244 | |
| DMSO | Invitrogen | D12345 | |
| Pluronic F-127 | Invitrogen | P3000MP | |
| D-Mannitol | Sigma | M9546 | |
| Sucrose | EMD Millipore | 8510 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| EGTA | Sigma | E8145 | |
| Potassium chloride | Fisher | BP366-500 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P0662 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M2670 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| L-malic acid | Sigma | M1125 | |
| Calcium chloride | Sigma | C4901 | |
| Potassium acetate | Fisher | BP364-500 | |
| Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Phosphocreatine disodium salt | Sigma | P7936 | |
| Saponin | Sigma | S7900 | |
| Ru360 | Calbiochem | 557440 |
References
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