Her, præsenterede vi metoder til at opdage menneskelige islet autoantistoffer ved hjælp af electrochemiluminescence (ECL) assays. Den protokol, bruges til at forudsige type 1 diabetes, kan udvides ved for at opdage autoantistoffer til andre autoimmune sygdomme.
Indkredse islet autoantistoffer forbundet med type 1 diabetes fører (T1D) vejen til projektet og afskrække denne sygdom i den almindelige befolkning. En roman ECL assay er en ikke-radioaktive flydende fase assay for Holmen autoantistoffer med højere følsomhed og specificitet end den nuværende ‘guld’ standard radio-bindende assay (RBA). ECL assays kan mere præcist definere udbrud af præsymptomatiske T1D ved at skelne de højrisiko, høj-affinitet autoantistoffer fra lav risiko, lav-affinitet autoantistoffer genereret i RBAs og konventionelle enzymmaerket assays (ELISA ). Antigen protein bruges i denne ECL assay er mærket med Sulfo-tag og Biotin, henholdsvis. Hver ECL autoantistof assay, der bruger et bestemt antigen protein behov en optimering skridt, før det kan bruges til laboratoriet. Dette trin er især vigtigt ved fastsættelsen af krav for serum syre behandlinger, koncentrationer og nøgletal for de to forskellige antigener mærket med Sulfo-tag og Biotin. For at udføre analysen, serum prøver er blandet med Sulfo-tag-konjugeret og biotinylated fange antigen protein i fosfatbufferet løsning (PBS), som indeholder 5% bovint serumalbumin (BSA). Bagefter, prøverne inkuberes natten over ved 4 ° C. Den samme dag, er en streptavidin-belagt plade forberedt med blocker buffer og inkuberes natten over ved 4 ° C. På andendagen, vaske streptavidin plade og overføre serum-antigen blandingen på pladen. Pladen anbringes på pladen shaker, sæt den på lav hastighed, og Inkuber ved stuetemperatur i 1 time. Efterfølgende, pladen er vasket igen, og læser buffer er tilføjet. Pladen er så tælles på plade læser maskine. Resultaterne formidles gennem et indeks, der genereres fra intern standard positive og negative kontrol serumprøver.
En nylig midlertidige klassifikationssystem er blevet oprettet for at hjælpe med diagnosticering af indledende faser af T1D hos patienter. Nøjagtig påvisning af menneskelige islet autoantistoffer spiller en vigtig rolle i at identificere og iscenesættelse præsymptomatiske type 1-diabetes, som tilstedeværelsen af holmen autoantistoffer indikerer tilstedeværelsen af β-celle autoimmunitet. På hvilke diabetes påvirker patienter fra den første forekomst af β-celle autoimmunitet symptomatisk sygdommen forbundet med antallet og typen af holmen autoantistoffer, er variabel2,3.
Alder af autoantistof serokonversion, titer og affinitet af holmen autoantistoffer kan påvirke den progression til symptomatisk type 1 diabetes4,5,6,7,8 ,9,10. For nylig, udviklede ECL assays har valideret flittigt, har påvist øget følsomhed, og er mere sygdoms-specifikke10,11,12,13. Disse assays forbedre forudsigelse og iscenesættelse af diabetes risiko gennem tidligere påvisning af holmen autoantistoffer. De mere præcist markerer indledningen af holmen autoimmunitet og ignorere de lav-affinity og lav risiko signaler ikke er relevante for diabetes.
I en ECL assay broen autoantistoffer i serum, hvis tilstede, den Sulfo-tag-konjugeret antigen til biotinylated opsamling antigen i den flydende fase. Efter bridging, er Biotin linker fanget i den faste fase og opdaget gennem ECL af Sulfo-tag på streptavidin belagt plade (figur 1).
I denne anmeldelse, er enkelt antistof ECL assays med menneskelige islet autoantistoffer primært udnyttes. Kort, multipleksede antistof assays baseret på enkelt ECL assays vil blive drøftet. Multiplex analysen kan bruges til at identificere flere, op til 10, autoantistoffer inden for en enkelt godt, ved hjælp af 15 µL serum. Denne enkle høj overførselshastighed assay kan bruges til at skærmen samtidig flere autoantistoffer til flere relevante autoimmune sygdomme i den almindelige befolkning.
Holmen autoantistoffer er i øjeblikket de mest pålidelige biomarkører for autoimmunitet af type 1 diabetes. De markerer starten på Holmen specifikke autoimmunitet og bestemme overt sygdom risici. ECL-analysen for Holmen autoantistoffer, er blevet udførligt valideret i flere nationale og internationale type 1 diabetes kliniske forsøg. Analysen har vist øget følsomhed og specificitet i forhold til nuværende ‘guld’ standard RBAs. ECL analysen har vist sin overlegne fordel for højere sygdom specificitet af diskriminerende høj-affinitet og højrisiko islet autoantistoffer fra lav risiko, lav-affinitet signaler genereret af RBA. Dette er især bemærket i emner, der er kun én islet autoantistof positive og har aldrig udviklet sig til type 1-diabetes. De fleste af disse lav affinitet autoantistoffer fandtes for at være tabt under opfølgning test udført i løbet af måneder til år, opfører sig som en» forbigående positiv.» Som tidligere hypotese, disse lav affinitet ‘single’ autoantistoffer sandsynligvis resulterede fra vaccination med en cross-reactive molekyle. Mens højere affinitet skyldes højere risiko islet autoantistoffer immunisering med islet antigener, selv. Derudover har ECL-assays vist evnen til at opstået før tidspunktet for ‘serokonversion’ fra nuværende standard radio-bindende assays (RBA) af år i børn med præ-diabetes, der blev fulgt til klinisk diabetes fra fødslen. En igangværende internationale kliniske forsøg, miljømæssige determinanter for Diabetes i den unge (TEDDY), afhænger af nøjagtig påvisning at lokalisere timing og udseendet af den første islet autoantistof ‘serokonversion’ til at markere starten af holmen autoimmunitet og til at identificere miljømæssige udløser. En mulig årsag til øget følsomhed i ECL assay er at analysen indfanger alle immunglobulin klasser: IgG, IgM, IgA, eller IgE, snarere end den traditionelle RBA eller ELISA, som kun er afhængige af påvisning af IgG.
I ECL assays, for nogle særlige autoantistoffer ligesom IAA, synes binding af autoantistoffer til antigenet at blive hæmmet af nogle komponent i normalt humant serum. For at fjerne eller frigive denne hæmning, var behandling af serumprøver nødvendigt at gøre før serum blev inkuberet med antigen. Som vist i [figur 5], ECL-IAA assay, bindende aktiviteter både mus insulin monoklonalt antistof og patienters serum autoantistoffer med antigenet blev styrket. Forsuringen af serumprøver, bruges i antistof assays, er normalt anvendes til at fjerne tilknytningen af allerede eksisterende bundne komplekser. Mekanismen bag hvordan IAA signaler er hæmmet i humant serumprøver og udgivet af forsuring af serum vides ikke, men denne metode er blevet brugt i andre ECL baseret assays14,15.
I nogle tilfælde, når mærkning molekyler, er enten Biotin eller Sulfo-tag, den mærkning positionsinside af antigen proteinmolekyler på eller meget nær centrale epitoper af antistof bindende, som kan forstyrre den bindende aktivitet til antistoffer. Dette vil reducere assay følsomhed og kan helt nedrive analysen. For rutine mærkning procedure, er maksimering eller mætning ønskede for hver antigen protein molekyle til at generere maksimale aktivitet eller signal pr. mærket molekyle ved at maksimere mærkning kapacitet af alle mulige mærkning position. Umættede mærkning bør udføres ved at reducere det molære forholdet mellem mærkning molekyler (Biotin og Sulfo-tag) til antigen protein, hvis mærkning på antigenet bliver en mulig årsag til afbrydelse af antistof bindende aktivitet. Major epitoper kan være bedre reserverede og afbrydelse af antistof bindende aktivitet kan frigives ved hjælp af den umættede mærkning strategi i de fleste tilfælde.
Hvert assay bør omfatte en intern standard høje positive og negative kontrol for indeksberegningerne af ukendte prøver. En lav positiv kontrol nær assay’s øvre grænse for normale kontrolelementer er vigtigt at medtage til overvågning af assay følsomhed. Laboratoriet bør holde nok delprøver af standard positive og negative kontroller til lang tids brug og alle delprøver skal opbevares ved-20 ° C. For assay kvalitetssikring, assays skal køres i dubletter for hver prøve og hvert positivt resultat bør bekræftes ved at gentage prøven i et separat assay. En tredje assay er nødvendig, når den anden genfremsatte assay ikke er enig med den første analysen og resultaterne af to undersøgelser, som er enige om (fx., +, + eller-, -), vil være den endelige bestemmelse af et positivt eller negativt resultat.
Med platformen til enkelt ECL assays, kan en multiplex assay udvides efter fra disse. Det kan samtidig bestemme op til 10 forskellige autoantistoffer i én enkelt godt med en lille mængde af serum. I øjeblikket er fire islet autoantistoffer herunder IAA, GADA, IA-2A og ZnT8A lig betydning for risiko Forudsigelsen af progression til T1D i begge slægtninge af patienter med T1D og den almindelige befolkning. De metoder, der anvendes til screening af disse 4 autoantistoffer ved hjælp af nuværende enkelt autoantistof målinger er besværligt og ineffektivt, især for store skala population screening. Vigtigere, op til 40% af patienter med T1D har en ekstra autoimmun tilstand16,17,18. Desværre, der er ingen nem og billig værktøj til at screene for disse betingelser. Multiplex ECL analysen er ikke kun i stand til at kombinere 4 nuværende store islet autoantistof assays til én, men også er i stand til yderligere kombinere flere autoantistof assays fra andre relevante autoimmune sygdomme. Dette gør det muligt at effektivt gennemføre high throughput screening for flere autoimmune sygdomme samtidig i stor skala populationer. I multiplex ECL analysen, som vist i [figur 6], vil hvert antigen-antistof kompleks dannet i væske-fase være tilbageholdende til en specifik linker kilde spot i samme godt. Signalmodtager på plade læser maskine er købedygtig anerkende signaler fra 10 forskellige kilder af steder. Dog kan steder med en ekstrem høj signal generere et højt assay baggrund og forårsage interferens til nærliggende steder gennem cross-talk. Af denne grund, bør de øvre grænse signaler til hver autoantistof assay begrænses til færre end 20.000 tæller. Vores erfaring, bør autoantistoffer med lavere baggrunde placeres relativt langt væk fra disse steder at have højere tæller når den spot kort er designet. For langsigtede undersøgelser ved hjælp af multiplex ECL assays, anbefales det, at den samme linker bruges til samme autoantistof analysen til at holde analysen konsekvent.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af NIH give DK32083, JDRF Grant 2-SRA-2015-51-Q-R.
Human recombinant proinsulin protein(PINS) | AmideBio | Human Proinsulin, Rec | |
Human recombinant GAD65 protein | Diamyd | rhGAD65 | |
Human recombinant IA-2 protein | Creative BioMart | IA2 | |
1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
10x PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 70011-044 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | SIGMA-ALORICH | A7906-500G | |
96-well PCR plate | Fisher | 14230232 | |
Streptavidin coated plate | MSD | L15SA | |
Zeba sizing spin column | Thermo Fisher Scientific | 89890 | |
Twen-20 | Fisher | BP337-500 | |
HCl | Fisher | A144-500 | |
NaOH | Fisher | SS255-1 | |
Trizma Base | Fisher | BP152-5 | |
EZ-Link Biotin | Thermo Fisher Scientific | PI21329 | |
Sulfo-tag | MSD | R91AO-1 | |
Blocker A | MSD | R93AA-1 | |
4x Read Buffer T with Surfactant | MSD | R92TC-1 | |
EZ-Link NHS-PEG4-Biotin | ThermoScience | 21329 | |
Sulfo-TAG | MSD | R91AO-1 | |
96-well polymerase chain reaction (PCR) plate | Fisher brand | 14230232 | |
96-Well Streptavidin plate | MSD GOLD | L 15SA-1 | |
Zeba Spin Desalting Column | ThermoScience | PL208984 | |
96-well Plate Shaker | Perkin Elmer | 1296-003 | |
Plate Reader | MSD | QuickPlex SQ120 | |
Benchtop centrifuge with bucket rotary | Beckman | Allegra X-15R |