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Immunology and Infection

인간의 섬 신경에 대 한 Electrochemiluminescence 분석 실험

doi: 10.3791/57227 Published: March 23, 2018

Summary

여기, 우리는 인간의 섬 자가 electrochemiluminescence (ECL) 분석 실험을 사용 하 여 검색 하는 방법을 제시. 타입 1 당뇨병을 예측 하는 데 사용 되는 프로토콜 자가 다른 자가 면역 질환에 대 한 검색에 따라 확장할 수 있습니다.

Abstract

1 형 당뇨병과 관련 된 섬 자가 정확히 파악 (T1D) 리드 프로젝트 및 일반 인구에 있는이 질병을 억제 하는 방법. 새로운 ECL 분석 결과 높은 감도와 특이성 현재 '골드' 표준 라디오 바인딩 분석 결과 (RBA) 보다 섬 신경에 대 한 nonradioactive 액체 단계 분석 결과가 이다. ECL 분석 보다 정확 하 게 RBAs, 그리고 기존의 효소 연결 된 immunosorbent 분석 실험 (ELISA에 생성 된 낮은 위험, 낮은 친 화력 신경에서 위험, 높은 선호도 자가 구분 하 여 presymptomatic T1D의 발병을 정의할 수 있습니다. ). ECL 분석 결과이에 사용 되는 항 원 단백질 Sulfo 태그와 Biotin, 각각 표시 됩니다. 특정 항 원 단백질을 사용 하 여 각 ECL autoantibody 분석 결과 실험실 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다 최적화 단계를 필요 합니다. 이 단계는 혈 청 산 성 트리 트 먼 트, 농도, 및 Sulfo 태그와 Biotin 표시 된 두 개의 서로 다른 항 원의 비율에 대 한 요구 사항을 결정 하는 데 특히 중요 합니다. 분석 결과 수행 하기 위해 혈 청 샘플은 혼합 Sulfo 태그 활용 및 biotinylated 캡처 항 원 단백질에 인산 염 버퍼 솔루션 (PBS), 5%를 포함 하 소 혈 청 알 부 민 (BSA). 나중에, 예제는 인 큐베이 팅 하룻밤 4 ° c.에 같은 날 streptavidin 입히는 격판덮개 차단기 버퍼와 함께 준비 되 고 하룻밤에 4 ° c. 인 큐베이 팅 둘째 날에는 streptavidin 접시를 세척 하 고 접시에 혈 청 항 원 혼합물을 전송 합니다. 판 통에 접시를 놓고 낮은 속도로 그것을 설정 하 고 1 시간에 대 한 실 온에서 품 어. 그 후, 접시를 다시 세척 하 고 리더 버퍼 추가 됩니다. 접시는 접시 리더 기계에 다음 계산 됩니다. 결과 내부의 양수와 음수를 제어 하는 표준 혈 청 샘플에서 생성 되는 인덱스를 통해 전달 됩니다.

Introduction

최근 준비 분류 체계는 환자에서 T1D의 초기 단계의 진단을 지원 하기 위해 만들어졌습니다. 인간의 섬 신경의 정확한 탐지 식별에 중요 한 역할 그리고 presymptomatic 준비 제 1 형 당뇨병, 섬 자가 존재 β-세포 면역의 존재를 나타냅니다. 당뇨병에 징후 질병에 β-세포 면역의 초기 발생에서 영향을 미치는 환자 수와 섬 신경의 종류와 관련 된 속도가 변수2,3.

Autoantibody 혈, titer, 그리고 섬 신경의 선호도의 시대 증상 타입-1 당뇨병4,5,6,7,8 진행의 속도 영향을 미칠 수 있습니다. ,910. 최근에, 개발된 ECL 분석 실험, 광범위 하 게 검증 된 감도 증가 증명 하고있다 그리고 더 많은 질병-특정10,11,,1213. 이 분석 실험 강화 섬 신경의 이전 검색을 통해 당뇨병 위험의 준비와 예측. 그들은 더 정확 하 게 섬 autoimmunity의 개시를 표시 하 고 당뇨병 관련이 없는 낮은 친 화력과 낮은 위험 신호를 무시 한다.

ECL 분석 결과, 혈 청에 있는 자가 있으면, 액체 단계에서 Sulfo 태그 활용 된 항 원 biotinylated 캡처 항 원에 다리. 브리징, 후 Biotin 링커 단단한 단계에 고 ECL 통해 Sulfo 태그 streptavidin 입히는 격판덮개 (그림 1)에 의해 감지.

이 리뷰에서 인간의 섬 자가 함께 단일 항 체 ECL 분석을 주로 활용 하 고 있습니다. 간단히, 다중화 항 체 분석 실험 단일 ECL 분석에 따라 논의 될 것입니다. 멀티플렉스 분석 결과 15 µ L의 혈 청을 사용 하 여 잘, 10, 하나의 내 신경까지 여러를 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다. 이 간단한 높은 처리량 분석 결과 화면, 동시에, 일반 인구에서 여러 관련 자가 면역 질환에 대 한 여러 신경에 사용할 수 있습니다.

Protocol

1. 버퍼 준비

  1. 버퍼 (2 x PBS, pH 7.9) 라벨: 이온된 (DD) 증류수의 400 Ml에서 100 mL 10 x PBS의 추가, NaOH와 7.9에 pH를 조정.
  2. Biotin의 3 m m: 버퍼 라벨의 588 µ L에서 1mg Biotin의 해산.
  3. 3mm Sulfo 태그: 버퍼 라벨의 50 µ L에 Sulfo 태그의 해산 150 nmol.
  4. 항 원 버퍼 (5 %BSA): 1 x PBS의 500 Ml, 25 g 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 추가.
  5. 0.5 M 초 산 솔루션을 준비 합니다.
  6. Tris HCl 버퍼 pH 9.0의 1.0 M: 준비 1 M Tris-HCl 9.0 HCl로 pH를 조정 하 고, 버퍼.
  7. 코팅 버퍼 (3% 차단 A): 1 x PBS의 500 Ml, 추가 차단 A. 15 g
  8. 세척 버퍼 (0.05% 트윈 20, PBST): 1 x PBS의 5000 Ml에서 2.5 mL 트윈 20의 추가.
  9. 읽기 버퍼 (계면 활성 제와 읽기 버퍼 T x 2): DD 물 500 Ml, 500 mL 계면 활성 제 (자료 테이블)와 읽기 버퍼 T x 4의 추가.
  10. -20 ° C 냉장고에 Biotin과 Sulfo 태그를 저장 합니다.
    참고: 모두 Biotin과 Sulfo 태그 솔루션 항상 갓 준비 해야 레이블 프로시저의 바로 전에.

2. 인간의 섬 Autoantigen Biotin과 Sulfo 태그 라벨

참고: 높은 농도의 항 원, 이들 mg/mL, 보다 효율적인 라벨 반응 좋습니다.

  1. Biotin과 Sulfo 태그에 대 한 인간의 섬 autoantigen의 어 금 니 비율을 결정 합니다.
    1. 분자 무게에 의해 항 원 무게를 분할 하 여 항 원 어 금 니 번호를 가져올.
    2. 작은 분자량 (≤ 10 kd)와 항 원에 대 한 1: 5의 어 금 니 비율을 사용 하 여 더 큰 분자량과 항 원에 대 한 1시 20분의 어 금 니 비율 (> 50 kd).
    3. 농도 의해 몰 수를 나누어 Biotin 또는 Sulfo 태그에 대 한 볼륨을 계산 합니다.
  2. 인간의 섬 autoantigen Biotin 또는 Sulfo 태그와 어 금 니 비율 1: 5의 믹스.
    참고: ph 7.9 크기 조정 스핀을 사용 하 여 PBS 버퍼 x 2로 교환 한다 tris 또는 글리신 버퍼 시스템 단백질 열.
  3. Biotin과 Sulfo 태그 빛에 민감한 때문에, 알루미늄 호 일로 반응 튜브 커버. 상 온 (RT) 1 시간에 대 한 반응을 품 어.
  4. 부 화, 동안 프라임 스핀 열 PBS 버퍼 x 디스 2 열에 3 번. 원심 2 분 1000 x g에서 솔루션 각 시간.
    참고: 현재 라벨 반응, 브리징, 통해 여전히 발생 하 고 중지 해야 합니다.
  5. 레이블이 지정 된 인간의 섬 autoantigen 정화 하 여 라벨 반응을 중지 합니다. 정화, 스핀 열 통해 autoantigen를 통과 하 고 2 분 1000 x g 열 원심.
  6. 항 원 단백질 및 최종 볼륨을 사용 하 여 레이블이 지정 된 항 원 농도 (µ g / µ L)를 결정 합니다.
    참고: 약, 있을 것입니다 분류 항 원의 90-95% 보존 후 모든 스핀 열 전달.
  7. 약-80 ° c.에 레이블이 지정 된 항 원 및 저장소 분류 항 수

3. 정의 최고의 농도 및 비율 두 분류 항 원에 대 한 분석 결과 (검사기 보드 분석 결과)에 대 한

  1. 2 혈 청 샘플, 높은 긍정 및 1 네거티브, 각 200 µ L의 총 볼륨 하나를 준비 합니다.
  2. 혈 청의 aliquot 4 µ L까지 최종 볼륨은 잘 PCR 96 잘 접시 당 20 µ L 1 x PBS를 추가. 그림 2A와 같이 높은 긍정적인 샘플 및 부정적인 샘플에 대 한 나머지 절반에 대 한 접시의 절반을 사용 합니다.
  3. 10 µ L 비타민 b 복합체의 Sulfo 태그에 표시 된 그림 2A로 두 다르게 분류 항 원에 대 한 항 원 및 행위 직렬 희석 분류의 10 µ L를 추가 합니다. 한 분류 항에 대 한 수평 직렬 희석 및 다른 분류 항 원에 대 한 수직 직렬 희석 실행 합니다.
  4. 5.3 9.1에서 설명 하는 분석 결과 단계의 나머지 부분을 계속.
  5. 그림 2B에 부정적인 샘플에서 해당 신호 각각에 대 한 높은 긍정적인 샘플에서 신호의 비율을 계산 합니다.
  6. Biotin에 최고의 농도 식별 하 고 Sulfo 태그 최고 또는 네거티브 긍정적인의 높은 비율에 가까운 지점을 선택 하 여 항 원 표시. 비율을 식별 하는 부정적인 샘플에서 낮은 배경 신호를 고려 하십시오.
    참고: 분석 결과 하루 1 단계 6 단계 4 포함 되어 있습니다.

4. 준비 Biotin/Sulfo-태그 항 원 표시의 정확한 농도 사용 하 여 항 원 버퍼

  1. 검사기 보드 분석 결과에 따라 각 항의 합리적인 농도 선택 합니다.
  2. 3 mL 접시, 합리적인 Biotin/Sulfo-태그 분류 항 버퍼에 대 한 항 원 농도 사용 하 여 당 항 원 솔루션의 준비.

5. 분류 항 원과 혈 청 샘플을 품 어

참고:이 섹션에서 두 프로토콜, 혈 청 산 성 치료를 하지 않고과 혈 청 산 치료 하나 있습니다. IAA 분석 결과 제외한 모든 섬 autoantibody 분석 IAA 분석 결과 이러한 단계를 생략 하 고 단계 5.6 5.9에서에서 혈 청 산 치료 프로토콜을 사용 하 여 단계 5.1-5.5에서에서 산 치료 혈 청 하지 않고 일반 프로토콜을 사용 합니다.

  1. 혈 청의 aliquot 4 µ L까지 최종 볼륨은 잘 PCR 96 잘 접시 당 20 µ L 1 x PBS를 추가.
  2. 잘 당 분류 항 원 솔루션의 20 µ L를 추가 합니다.
  3. 빛을 피하기 위해 호 일 씰링과 PCR 플레이트 커버.
  4. 2 시간에 대 한 실시간에 (저속) 통에 접시를 넣어.
  5. 4 ° C 냉장고에 접시를 넣고 품 어 하룻밤 (18-24 h).
    참고: 5.9 5.6에서 단계의 다음 프로토콜은만 위해 IAA 분석 결과 및 다른 autoantibody 분석 실험이이 단계를 건너뜁니다.
  6. 혼합 15 µ L의 혈 청 0.5 M 초 산 각 혈 청 샘플의 18 µ L로. 45 분 RT에이 혼합물을 품 어.
  7. 비타민 b 복합체의 Sulfo-태그 레이블이 검사기 보드 분석 결과에 따라 항 원 antigen 버퍼를 사용 하 여 합리적인 농도와 항 원 솔루션을 준비 합니다. 각 잘, Biotin Sulfo 태그를 포함 하는 항 원 버퍼의 aliquot 35 µ L 분류 항 원, 새로운 PCR 격판덮개로.
  8. 45 분 인큐베이션 (5.6 단계) 단계를 완료 하기 전에 항 원 접시 (단계 5.6)에 각 측에 1 M Tris 버퍼 pH 9.0의 8.3 µ L를 추가 합니다. 그것은 Tris 버퍼와 항 원 간의 혼합을 제한 해야 합니다. 즉시 단계 5.6, 각 우물에서에서 산 처리는 혈 청의 25 µ L를 전송 하 고 솔루션을 선동. 빛을 피하기 위해 호 일 씰링과 PCR 플레이트 커버.
  9. 2 헤 4 ℃ 냉장고에 접시를 넣어에 대 한 실시간에 셰이 커 (저속)에 접시를 넣어 고 품 어 접시 하룻밤 (18-24 h).

6. 준비 Streptavidin 플레이트

  1. 4 ℃ 냉장고에서 streptavidin 접시 하 고 실시간에와 서 접시를 허용
  2. Streptavidin 접시 RT에 일단 각 잘을 3% 차단 A의 150 µ L를 추가 합니다.
  3. 커버 호 일 씰링과 PCR 접시.
  4. 4 ℃ 냉장고에서 플레이트를 밤새 품 어.
    참고: 분석 결과 주 2 단계 9 단계 7 포함 되어 있습니다.

7. 전송 혈 청/항 Streptavidin 플레이트에 잠복

  1. 다음 날, 냉장고에서 streptavidin 접시를 꺼내 고 접시에서 버퍼를 삭제. 테이블에 몇 가지 마른 종이 수건 밖으로 설정 하 고 우물 안에 없다 더 많은 버퍼 때까지 접시를 거꾸로 누릅니다.
  2. 잘 당 PBST의 150 µ L로 빈 streptavidin 접시를 총 세 세척 접시에서 PBST을 삭제.
  3. 전송 30 µ L의 혈 청/항 streptavidin 접시에 잘 당 잠복.
  4. 빛을 피하기 위해 호 일 접시 커버. 1 시간에 대 한 실시간에 낮은 설정에서 접시, 흔들.

8. 세척 접시 및 읽기 버퍼를 추가

  1. 삭제는 접시에서 잠복. 잘 당 PBST의 150 µ L을 추가 하 고 총 세 세척 접시에서 PBST을 삭제.
  2. 세척, 후 읽기 버퍼의 당 150 µ L를 추가 합니다.
    참고:이 플레이트 판독기 컴퓨터에 격판덮개를 읽는 방법에 영향을 미칠 것입니다 때문에 솔루션에 기포를 방지 하기 위해 중요 하다.

9. 접시 읽기 및 데이터 분석

  1. 플레이트 리더 기계에 접시를 계산 합니다. 항 체 값 (CPS) 초당 수로 표시 됩니다.
  2. 상대 인덱스 플레이트 리더 기계 로부터 받은 항 체 수준을 전달 합니다. 다음 방정식에서 인덱스를 계산.
    값을 인덱스 [CPS (샘플)-CPS (부정적인 제어)] = / [CPS (긍정적인 제어)-CPS (부정적인 제어)].
  3. 긍정적이 고 부정적인 항 체 결과 100 건강 한 제어 과목 (어떤 알려진된 자가 면역 질환과 당뇨병의 가족 역사 없이 없이 비 당뇨병 개인) 99th 백분위 수에 따라 양성, 정의 대 한 커트 오프를 사용 하 여 식별 합니다.

Representative Results

그림 2 는 검사기 보드를 표시합니다. 그것은 Biotin의 그 250 ng/mL 및 250 ng/mL Sulfo 태그 분류 항은 분석 결과 배경, 그리고의 비율으로 높은 긍정적인 컨트롤 샘플, 부정적인 컨트롤 샘플에서 신호를 고려 하는 분석 결과에 사용 하는 가장 합리적인 농도의 표시 긍정 부정적인 신호. 을 최적화 된이 두 분류 항 원 농도 분석 결과 T1D와 건강 한 컨트롤 100 100 새롭게 진단된 된 환자에서 혈 청 샘플 수행 했다. 0.023의 인덱스 값은 양성의 분석 결과 컷오프로 정의 했다. 이 특성 (ROC) 곡선 그림 3A에서 운영 하는 수신기를 사용 하 여 건강 한 컨트롤에서 환자와 99% 특이성 85% 감도를 나타냅니다. 알 수 없는 샘플에 대 한 분석 결과 내부 표준 높은 반응, 낮은 긍정 및 부정적인 컨트롤 샘플 실시 됐다. CPS의 결과에 표시 됩니다 표 2A. 높고 낮은 긍정적인 컨트롤의 CPS 17903 [(19940+15866)/2 빨간색으로 강조 표시 됩니다 의미] 839 [(857+820)/2], 그리고 부정적인 컨트롤 168 [(170+165)/2 녹색으로 강조 표시 됩니다]. 알 수 없는 샘플에 대 한 인덱스 계산 "(CPS샘플-168)/(17903-168)." 표 2B 모든 샘플에 대 한 계산 된 인덱스 값을 보여 줍니다. 0.023는 또한 표 2A에 빨간색으로 작성 된 CPS 값에 해당 하는 빨간색으로 작성 하는 보다 큰 인덱스 값입니다. 이러한 값은 긍정적인 결과 보다 건강 한 제어 인구 99번째 백분위 수로 정의 됩니다. 표 2 c에서와 같이 분석 결과 높은 배경을 해야한다 불합리 한 항 원 농도 사용 하는 경우 긍정적인 항 체의 저급은 A2, A5, D1, 및 H4 테이블 2D에 회색으로 강조 표시 값 처럼 그리울 것 이다.

Figure 1
그림 1 : 단일 ECL IAA 분석 결과 대가 판 캡처의 그림. 섬 autoantibody Sulfo 태그 활용 streptavidin 입히는 격판덮개에 단단한 단계에 있는 biotinylated 캡처 항 원에 항 원 혈 청 다리에. 플레이트 캡처 Sulfo 태그 활용된 항 원의 검출 ECL 통해 수행 됩니다. 이 그림에서 유, 수정 된 . 11. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : 결정 분석 결과 양성의 컷오프가 ROC 곡선. 감도 85%에 해당 하는 특이성의 99번째 백분위 수 선정 되었다 고 0.023의 인덱스 값으로 표시 됩니다. 분석 결과의이 상한 100 건강 한 컨트롤에서 찍은. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 : ECL IAA 신호를 차단 하는 정상적인 인간 혈 청의 그림. A: 인슐린 단일 클론 항 체 (모 압)으로 ECL IAA 분석 실험에서 신호 과감 하 게 정상적인 인간 혈 청의 추가 의해 차단 되었습니다. 비교할 때 PBS에서 모 압, 인간의 혈 청은 산으로 대우 될 때 신호 복원 부분적으로 되었다. B: 4 환자 세라와 ECL IAA 분석 결과에서 신호 산 성 치료 크게 향상 했다. 이 그림에서 유, 수정 된 . 11. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4 : 의 Mutiplex ECL 분석 결과 그림. 항 체 항 원 복합물은 특정 링커와 액체 단계에서 형성 된다. 특정 항 체-항 원-링커 단지는 잘 같은 특정 링커 관광 명소의 각 제 지. 플레이트 리더 기계 관광 명소의 다른 소스에서 신호를 구별할 수 이며 각각 10 다른 채널에 CPS 카운트를 제공 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Table 1
표 1: 농도 및 Biotin의 비율을 결정 하는 검사기 보드 분석 결과 Sulfo 태그 표시 항. A: 원시 CPS 접시 및 다른 반쪽에 부정적인 혈 청의 절반에 높은 긍정적인 혈 청 검사기 보드 판에 대 한 건의. Biotinylated 항 원 농도 시리즈에서 가로로 희석 했다 고 Sulfo 태그 분류 항 원 농도 시리즈에서 수직으로 희석 되었다. B:는 CPS의 비율 값 부정적인 혈 청에서 그들의 해당 CPS의 각각에 대하여 높은 긍정적인 혈 청에서 계산 됩니다. 노란색 강조 표시 된 웰 스 대표 패널 b에서 네거티브 긍정적인의 최고의 비율 이 비율은 250 ng/mL Biotin에 해당 하며 250 ng/mL Sulfo 태그 표시 패널 A 부정적인 혈 청에 대 한 수락 가능 하 게 낮은 CPS 수 있는 항 원 농도. 이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Table 2
표 2: 시험 결과의 분석. A: 원시 CPS 시험 접시에서 빨간색과 녹색으로 강조 표시 하는 표준 부정적인 컨트롤에서 강조 표시 표준 및 로우 긍정적인 컨트롤과 계산 합니다. 각 샘플 분석 결과에서 중복 되었다. B: 분석 결과 프로토콜에 설명 된 대로 인덱스 값 계산 했다. 0.023 보다 큰 모든 인덱스 값은 빨간색으로 강조 표시, 긍정적인 결과로 정의 했다. C: 원시 CPS는 불합리 한 항 원 농도 사용 된 샘플의 동일한 집합을 가진 시험 접시에서 계산 합니다. 이 높은 배경 귀착되 고 일반적으로 검색, 일부 낮은 반응 패널 B와 같이 패널 디에 회색으로 강조 하는 네거티브에 개조 되었다 이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

섬 신경은 타입-1 당뇨병의 면역에 대 한 가장 신뢰할 수 있는 biomarkers 현재. 그들은 섬 특정 자가 면역의 개시를 표시 하 고 명백한 질병 위험을 결정 합니다. ECL 분석 결과 섬 신경에 대 한 광범위 하 게 여러 국가 및 국제 타입-1 당뇨병 임상 시험에서 유효성이 검증 되었습니다. 분석 결과 보여주었다 증가 감도 특이성 전류 '골드'에 비해 표준 RBAs. ECL 분석 결과 차별 높은 선호도와 위험이 높은 섬 자가 RBA에 의해 발생 하는 낮은 위험, 낮은 선호도 신호에서 더 높은 질병 특이성에 대 한 그것의 우수한 장점을 보이고 있다. 이 과목만 단일 섬 autoantibody 긍정적인 사람에 특히 주의 하 고 제 1 형 당뇨병에 결코 진행. 이러한 낮은 친 화력 신경 동안 손실 될 것을 발견 했다의 대부분 테스트 년 개월 이내 '과도 긍정적인.'로 서 행동 후속 이전 가설, 이러한 낮은 선호도 '단일' 자가 가능성이 cross-reactive 분자 면역에서 결과. 높은 선호도, 동안 높은 위험 섬 자가 스스로 섬 항 원 가진 면역에서 유래 했다. 또한, ECL 분석 년 출생에서 임상 당뇨병을 미행 했다 사전 당뇨병을 가진 아이 들에 의해 현재 표준 라디오 바인딩 분석 실험 (RBA)에서 '혈'의 시간을 antedate 수 설명 했다. 지속적인 국제 임상 시험는 환경 결정 요인의 당뇨병에는 영 (테 디), 타이밍 및 첫 번째 섬 autoantibody 섬의 처음을 표시 하는 ' 혈'의 모양을 정확 하 게 정확한 감지에 따라 달라 집니다. 면역 및 환경 트리거를 식별. ECL 분석 결과에 감도 증가 대 한 가능한 이유는 그 분석 결과 캡처 모든 면역 글로불린 클래스: IgG, IgM, IgA, ige의 보다는 오히려 전통적인 RBA 또는 ELISA IgG의 탐지에만 의존 하는.

ECL 분석 실험, IAA, 같은 일부 특정 신경에 대 한 자가 항 원에의 바인딩 정상적인 인간 혈 청에 있는 일부 구성 요소에 의해 저해 될 것으로 보인다. 제거 하거나이 저해를 해제, 혈 청 샘플의 산 성 치료 전에 혈 청은 항 원과 인 큐베이 팅 할 필요 했다. [그림 5]에 표시 된 ECL IAA 분석 결과로 마우스 인슐린 단일 클론 항 체와 항 원 가진 환자의 혈 청 신경의 바인딩 활동은 크게 향상 되었습니다. 항 체 분석 실험에서 사용 하는 혈 청 샘플의 산성화 끊을 기존 바운드 단지에 일반적으로 적용 됩니다. IAA 신호는 인간의 혈 청 샘플에 저해 방법과 혈 청의 산성화에 의해 발표 뒤에 메커니즘은 알려져 있지, 하지만이 방법은 다른 ECL 기반 분석14,15에 사용 되었습니다.

몇 가지 경우, 분자 라벨, 비오 틴 또는 항 원 단백질 분자의 라벨 positionsinside Sulfo 태그에는, 또는 항 체 바인딩을 항 체 바인딩 활동을 방해할 수 있는 주요 epitopes 가깝습니다. 이 분석 결과 감도 감소 시킬 것 이다 하 고 완전히 분석 결과 아래로 찢을 수 있다. 루틴 절차를 라벨에 대 한 극대화 또는 채도 모든 가능한 라벨 위치 라벨 용량을 극대화 하 여 최대 활동 또는 레이블이 분자 당 신호를 생성 하기 위해 각 항 원 단백질 분자에 대 한 원한다. 불포화 라벨 (Biotin과 Sulfo 태그) 분자 항 원 단백질에 항 체 바인딩 활동의 중단에 대 한 가능한 이유 되는 항 원에 라벨 라벨의 어 금 니 비율을 감소 시켜 수행 되어야 한다. 주요 epitopes 예약 더 수 있으며 항 체 바인딩 작업의 중단 불포화 라벨 전략을 사용 하 여 대부분의 경우에서 출시 될 수 있습니다.

각 분석 결과 내부 표준 높은 긍정 및 부정적인 제어 알 수 없는 샘플의 인덱스 계산에 포함 되어야 합니다. 일반 컨트롤의 분석 결과 상한 근처 낮은 긍정적인 통제 분석 결과 감도의 모니터링에 대 한 포함 하도록 중요 하다. 실험실 장기 사용에 대 한 표준 긍정적이 고 부정적인 컨트롤의 충분 한 aliquots를 유지 해야 하 고 모든 aliquots는-20 ° c.에 저장 되어야 한다 분석 결과 품질 보증, 각 샘플에 대 한 중복에서 분석 실험을 실행 해야 합니다 및 별도 분석 결과에 샘플을 반복 하 여 모든 긍정적인 결과 확인 해야 합니다. 세 번째 분석 결과 두 번째 확인 분석 결과 첫 번째 분석 결과 동의 하는 2 개의 분석 실험의 결과와 동의 하지 않는 경우 필요 (예:., +, + 또는-,-), 긍정적 이거나 부정적인 결과의 최종 결정 될 것입니다.

플랫폼으로 단일 ECL 분석 실험에 대 한 설정, 다중화 된 분석 결과 이들에서 시 확장 수 있습니다. 그것은 동시에 최대 10 다른 신경에 혈 청의 작은 금액으로 한 단일 잘 확인할 수 있습니다. 현재, 4 개의 섬 자가 IAA를 포함 하 여, 4 월, IA-2A, 및 ZnT8A가 T1D와 일반 인구 환자의 두 친척에서 T1D 진행의 위험 예측에 대 한 중요성. 현재 단일 autoantibody 측정을 사용 하 여 이러한 4 자가 검사에 대 한 활용 방법을 힘들고 비효율적이 고, 특히 대규모 인구 심사에 대 한 있습니다. 중요 한 것은, 최대 T1D 환자의 40% 있다 추가 면역 상태16,,1718. 불행히도, 이러한 조건에 대 한 화면을 간단 하 고 저렴 한 도구가입니다. 멀티플렉스 ECL 분석 결과 오직 하나, 4 현재 주요 섬 autoantibody 분석 실험 결합 가능 하지만 또한 더욱 다른 관련 자가 면역 질환에서 더 많은 autoantibody 분석을 결합 하 여 수 있습니다. 이 효율적으로 대규모 인구에서 동시에 여러 자가 면역 질환에 대 한 심사는 높은 처리량을 가능 하 게. 멀티플렉스 ECL 분석 결과에서 [그림 6]와 같이 액체 단계에서 형성 된 각 항 체 항 원 복합물 것 이다 수 제 지 같은 특정 링커 소스 자리에 잘. 플레이트 리더 기계에 신호 수신기는 관광 명소의 10 다른 소스 로부터 신호를 인식할 수 있습니다. 그러나, 매우 높은 신호 명소 높은 분석 결과 배경 생성 하 고 크로스 토크를 통해 인접 장소에 간섭을 일으킬 수 있습니다. 이러한 이유로, 각 autoantibody 분석 결과 대 한 상한 신호 미만 20000 카운트에 제한 되어야 합니다. 우리의 경험에서는, 더 낮은 배경 가진 자가 높은 카운트 자리 지도 설계 하는 데 그 장소에서 상대적으로 멀리 배치 되어야 합니다. 장기 연구 멀티플렉스 ECL 분석 실험을 사용 하 여, 같은 링커 같은 autoantibody 분석 결과 대 한 분석 결과 일관성 유지를 사용할 수 것이 좋습니다.

Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

이 작품은 NIH에 의해 지원 되었다 DK32083, JDRF 그랜트 2-SRA-2015-51-Q-R를 부여.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human recombinant proinsulin protein(PINS) AmideBio Human Proinsulin, Rec
Human recombinant GAD65 protein Diamyd rhGAD65
Human recombinant IA-2 protein Creative BioMart IA2
1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010-023
10x PBS, pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 70011-044
Bovine Serum Albumin (BSA) SIGMA-ALORICH A7906-500G
96-well PCR plate  Fisher 14230232
Streptavidin coated plate MSD L15SA
Zeba sizing spin column Thermo Fisher Scientific 89890
Twen-20 Fisher BP337-500
HCl Fisher A144-500
NaOH Fisher SS255-1
Trizma Base Fisher BP152-5
EZ-Link Biotin Thermo Fisher Scientific PI21329
Sulfo-tag MSD R91AO-1
Blocker A MSD R93AA-1
4x Read Buffer T with Surfactant MSD R92TC-1
EZ-Link NHS-PEG4-Biotin ThermoScience 21329
Sulfo-TAG MSD R91AO-1
96-well polymerase chain reaction (PCR) plate Fisher brand 14230232
96-Well Streptavidin plate MSD GOLD L 15SA-1
Zeba Spin Desalting Column ThermoScience PL208984
96-well Plate Shaker Perkin Elmer 1296-003
Plate Reader MSD QuickPlex SQ120
Benchtop centrifuge with bucket rotary Beckman Allegra X-15R

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References

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인간의 섬 신경에 대 한 Electrochemiluminescence 분석 실험
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Gu, Y., Zhao, Z., Miao, D., High, H., Yang, T., Yu, L. Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies. J. Vis. Exp. (133), e57227, doi:10.3791/57227 (2018).More

Gu, Y., Zhao, Z., Miao, D., High, H., Yang, T., Yu, L. Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies. J. Vis. Exp. (133), e57227, doi:10.3791/57227 (2018).

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