Summary
Qui viene mostrato un metodo per la preparazione della matrice extracellulare (TEM) di lingua con decellularizzazione efficiente. Il TEM utilizzabile come funzionale scaffold per la ricostruzione di un modello di carcinoma di cellule squamous (TSCC) lingua in condizioni di coltura statica o agitata.
Abstract
Al fine di costruire un modello efficace e realistico per lingua cellule squamose carcinoma (TSCC) in vitro, i metodi sono stati creati per produrre decellularized lingua extracellulare (TEM) che fornisce funzionale ponteggi per edilizia TSCC. TEM fornisce una nicchia in vitro per la crescita cellulare, differenziazione e migrazione cellulare. Le microstrutture del nativo della matrice extracellulare (ECM) e biochimici composizioni conservate nella matrice decellularizzata forniscono tessuto-specifiche nicchie per l'ancoraggio di cellule. La fabbricazione di TEM può essere realizzata tramite digestione deossiribonucleasi (DNase) accompagnata con una seria di pretrattamento organico o inorganico. Questo protocollo è facile da usare ed assicura l'alta efficienza per il decellularizzati. Il TEM ha mostrato citocompatibilità favorevole per le celle TSCC in condizioni di coltura statica o agitata, che permette la costruzione del modello TSCC. Un bioreattore self-made è stato utilizzato anche per la persistente condizione agitata per la coltura cellulare. TSCC ricostruito utilizzando TEM ha mostrato le caratteristiche e le proprietà che assomiglia l'istopatologia clinica di TSCC, suggerente il potenziale della ricerca TSCC.
Introduction
La lingua ha varie funzioni importanti, come la deglutizione, articolazione e degustazione. Quindi, il danno della funzione di lingua ha grande impatto il patients' qualità di vita1. La malignità più comune nella cavità orale è carcinoma di cellule squamous lingua (TSCC), che di solito si verifica nelle persone che bere alcolici o fumano tabacco2.
Negli ultimi anni, scarsi progressi compiuti nella ricerca fondamentale sulla TSCC. La mancanza di efficienti in vitro ricerca modelli resti per essere uno dei maggiori problemi. Così, la matrice extracellulare (ECM) scopre di essere una potenziale soluzione. Poiché l'ECM è un frame di rete complessa composto da componenti della matrice altamente organizzata, impalcatura materiali aventi un ECM-come la struttura e la composizione sarebbe competente per la ricerca sul cancro. ECM decellularizzati perfettamente è in grado di fornire la nicchia per le cellule dallo stesso origine in vitro, che risulta per essere il vantaggio più significativo di ECM.
ECM può essere mantenuto con componenti cellulari per essere rimosso dal tessuti attraverso il decellularizzazione utilizzando detergenti ed enzimi. Vari componenti della MEC, tra cui collagene, fibronectina e laminina nella matrice decellularizzati forniscono un microambiente nativo-tessuto-come per le cellule coltivate, promuovendo la sopravvivenza, la proliferazione e la differenziazione delle cellule3. Inoltre, l'immunogenicità per trapianto può essere ridotto a un livello minimo con l'assenza di componenti cellulari in ECM.
Finora, sono stati provati metodi di fabbricazione per decellularizzati ECM in diversi tessuti e organi, quali cuore4,5,6,7, fegato8,9,10 ,11, polmone12,13,14,15,16,17e rene18,19 , 20. Tuttavia, nessuna ricerca pertinente ha si trova su un lavoro simile nella linguetta al meglio della nostra conoscenza.
In questo studio, matrice extracellulare decellularizzati lingua (TEM) è stata fabbricata sia in modo efficiente ed economicamente da una serie di trattamento fisico, chimico ed enzimatico. Quindi il TEM è stato utilizzato per ricapitolare TSCC in vitro, mostrando una simulazione appropriata per TSCC comportamento e sviluppo. TEM ha buona biocompatibilità, nonché la capacità di guidare le cellule alla nicchia di tessuto-specifica, che indica che la TEM può avere grande potenziale in TSCC ricerca3. Il protocollo illustrato di seguito fornisce una scelta per i ricercatori che studiano su patogenesi o clinica delle terapie di TSCC.
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Protocol
Tutto il lavoro animale era eseguito in conformità con legge di benessere degli animali, le linee guida istituzionali e approvato dal comitato di uso, Sun Yat-sen University e istituzionali Animal Care.
1. preparazione del TEM
- Eseguire topi di dislocazione cervicale e rimuovere le lingue utilizzando pinzette e forbici chirurgiche sterili.
- Immergere le linguette in etanolo di 75% per 3 minuti, poi mettere ogni lingua in un 1,5 mL tubo Eppendorf (EP) con 1 mL di 10 millimetri di fosfato sterile tamponata (PBS).
Nota: La concentrazione di PBS in tutti i passaggi seguenti è lo stessa come la concentrazione in questo passaggio. - Lisi della cellula da disgelo: congelare le linguette in tubi EP a-80 ° C per 1 h e poi scongelare le lingue a temperatura ambiente per 45 min per 3 cicli.
- Caricare ogni lingua su un pezzo di sutura chirurgica utilizzando un ago chirurgico e avvolgere l'estremità della sutura con un piccolo pezzo di carta stagnola sterile. Eseguire l'operazione in una piastra di coltura 3,5 cm o 6 cm contenente etanolo di 75% in condizioni sterili.
Nota: La lunghezza appropriata di ogni pezzo di sutura chirurgica è di circa 20 cm, e la dimensione appropriata di ogni pezzo di carta stagnola è circa 0,3 cm2 (1 cm × 0,3 cm). La lingua deve essere caricata vicino la carta stagnola. - Sciacquare ogni linguetta con 3 mL di PBS sterile in una piastra di coltura 3,5 cm o 6 cm per 30 s. eseguire questa operazione in condizioni sterili.
- Lavare le linguette con acqua ultrapura: aggiungere ampicilin in una bottiglia di bocca larga con 250 mL di acqua distillata sterile ad una concentrazione finale di 90 µ g/mL. Mettere le lingue al flacone contenente una barra per l'agitazione. Stringere il tappo di bottiglia con parte della sutura rimanendo all'esterno della bottiglia. Eseguire questa operazione in condizioni sterili.
Nota: Fino a 5 lingue possono essere messo nella stessa bottiglia in considerazione twining della sutura. La carta stagnola è all'estremità della sutura in bottiglia per evitare che la lingua scivoli fuori. Le lingue devono trovarsi 2 cm di altezza dal fondo della bottiglia, regolando la lunghezza della sutura rimanendo all'interno della bottiglia. Questa nota è anche per la procedura 1.8, 1.10, 1.12 e 1.16. - Mettere la bottiglia su un agitatore magnetico per 12 h.
- Lavare le linguette con NaCl: aggiungere ampicilin in una bottiglia di bocca larga con 250 mL di sterile 1 M di NaCl a una concentrazione finale di 90 µ g/mL. Spostare le lingue e l'ancoretta nella bottiglia. Stringere il tappo di bottiglia con parte della sutura rimanendo all'esterno della bottiglia. Eseguire questa operazione in condizioni sterili.
- Mettere la bottiglia su un agitatore magnetico per 24 h.
- Lisi di Triton X-100 di cella: aggiungere ampicilin a una concentrazione finale di 90 µ g/mL in una bottiglia a bocca larga con 250 mL di sterile 2% Triton X-100 in PBS. Spostare le lingue e l'ancoretta nella bottiglia. Stringere il tappo di bottiglia con parte della sutura rimanendo all'esterno della bottiglia. Eseguire questa operazione in condizioni sterili.
- Mettere la bottiglia su un agitatore magnetico per 48 h.
- Lavare le linguette con CaCl2/MgCl2: Aggiungi ampicilin in una bottiglia di bocca larga con 250 mL di sterile 5 mM CaCl2/MgCl2 a una concentrazione finale di 90 µ g/mL. Spostare le lingue e l'ancoretta nella bottiglia. Stringere il tappo di bottiglia con parte della sutura rimanendo all'esterno della bottiglia. Eseguire questa operazione in condizioni sterili.
- Mettere la bottiglia su un agitatore magnetico per 24 h.
- Digestione di dnasi: aggiungere 1 mL di Hank equilibrata soluzione salina (HBSS) a ciascuna provetta di EP. Aggiungere la dnasi in HBSS rispettivamente a una concentrazione finale di 300 µM. muovere ogni lingua in ogni provetta di EP, con parte della sutura all'esterno del tubo. Eseguire questa operazione in condizioni sterili.
Nota: Assicurarsi che la parte della sutura che rimane all'interno delle bottiglie nei passaggi precedenti rimane anche all'interno del tubo di EP in questo passaggio e assicurarsi che la parte della sutura che rimane di fuori delle bottiglie nei passaggi precedenti rimane anche all'esterno del tubo di EP in questo passaggio. - Incubare le linguette in tubi EP a 37 ° C per 24 h.
- Lavare le linguette con PBS: aggiungere ampicilin in una bottiglia a bocca larga con 250 mL di PBS sterile ad una concentrazione finale di 90 µ g/mL. Spostare le lingue e l'ancoretta nella bottiglia. Stringere il tappo di bottiglia con parte della sutura rimanendo all'esterno della bottiglia. Eseguire questa operazione in condizioni sterili.
- Mettere la bottiglia su un agitatore magnetico per 24 h.
- Conservare il TEM preparato in PBS sterile a 4 ° C fino all'utilizzo.
2. tridimensionale (3D) ricostituzione di TSCC
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Costruzione di modello statico TSCC
- Seme 1.0 x 106 TSCC celluli (Cal27) in una piastra di coltura di 3,5 cm. Aggiungere 3 mL di Dulbecco modificato dell'Aquila medio/F12 (DF12) contenente 10% siero bovino fetale (FBS), ampicilin 90 µ g/mL e 90 kanamicina µ g/mL.
- Coltura le cellule Cal27 a 37 ° C per 2 o 3 giorni. Assicurarsi che le celle coprono almeno il 60% zona del fondo piatto.
- Caricare TEM sul strato monomolecolare del Cal27 nella piastra di coltura.
- Mettete la teglia in un incubatore a CO2 a 37 ° C per 28 giorni.
- Aggiornare il terreno di coltura ogni giorno durante il processo di coltura delle cellule. La concentrazione di CO2 nell'incubatrice è 5%.
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Costruzione di modello TSCC agitata
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Preparazione di un self-made minibioreactor agitata
- Togliere lo stantuffo da una siringa da 10 mL.
- Scavare un foro (diametro di 1 cm) vicino il terminale inferiore dello stelo e caricare un ancoretta nel foro.
- Scavare un foro (diametro di 0,5 cm) al centro del tappo della bottiglia, una bottiglia di plastica in bocca larga e mettere l'asta del pistone attraverso il tappo.
- Tagliare metà di un tubo di centrifuga da 50 mL e saldarlo sul lato esterno del tappo della bottiglia.
- Collegare ami all'asta avvolgendo l'asta con linee di pesca che sono legati per l'ami.
Nota: Fino a 4 ami possono essere collegati ad un bastone. - Sterilizzare in autoclave il complesso self made prima dell'uso.
Nota: Non sterilizzare in autoclave la bottiglia di plastica bocca larga. Utilizzare una nuova bottiglia di bocca larga di plastica sterile durante la coltura delle cellule.
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Preparazione di un self-made minibioreactor agitata
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Coltura cellulare dinamica
- Seme 1.0 x 106 Cal27 unicellulari nella minibioreactor self-made. Aggiungere 150 mL di mezzo di DF12 che contiene 10% FBS, 90 µ g/mL ampicilin e kanamicina 90 µ g/mL.
- Caricare TEM sul minibioreactor utilizzando l'ami allegati all'asta.
- Stringere il tappo del flacone e mettere il minibioreactor su un agitatore magnetico. Attivare il minibioreactor a 200 rpm in un incubatore a CO2 a 37 ° C per 7-14 giorni.
Nota: La concentrazione di CO2 nell'incubatore CO2 è 5%.
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Representative Results
Questo protocollo per la preparazione di TEM risulta per essere efficiente e appropriato. Il TEM ha mostrato decellularizzazione perfetto rispetto ai tessuti di madrelingua. L'efficacia di decellularizzazione è stata confermata da ematossilina-eosina (HE) (Figura 1A-B). HE i risultati di macchiatura ha rivelato la scomparsa completa di macchiatura nucleare nel TEM (Figura 1B). Inoltre, contenuto quantificazione del DNA dal lavoro precedente ha indicato che il DNA è stato quasi completamente rimosso da TEM3. Questo protocollo ha mostrato anche raro danno all'integrità del tessuto durante la rimozione di componenti delle cellule (Figura 1B).
3D ricostituzione di TSCC utilizzando TEM e un self-made minibioreactor (Figura 2A-B) raggiunto risultati soddisfacenti. HA colorazione ha mostrato che le cellule di Cal27 nel TEM ha presentato caratteristiche patologiche tipiche TSCC (Figura 2C-D). Le cellule in condizioni di coltura agitata presentavano migrazione di singola cellula (Figura 2C) o migrazione collettiva (Figura 2D) nelle zone differenti della lesione. In condizioni di coltura statica, Cal27 cellule formate anche strutture dilagante nel TEM, ma ci sono voluti un tempo più lungo (Figura 2E). Inoltre, una linea cellulare di osteosarcoma umano U2OS inoltre è stato introdotto allo stesso sistema cultura agitata. Anche se le cellule U2OS potrebbero vivere nel terreno di coltura, non sono stati trovati nel TEM (Figura 2F). Il TEM ha mostrato diversi biocompatibilità per diversi tipi di cellule tumorali, suggerendo che le cellule differenti del tumore potrebbero essere necessario differenti microambienti a fiorire.
Figura 1 : Preparazione del TEM. (A) HE macchiatura delle lingue autoctone dai topi. Barra della scala = 100 µm. (B) HE macchiatura di decellularizzazione TEM dai topi. Barra della scala = 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Ricostituzione di TSCC da TEM. (A) la descrizione di un minibioreactor self-made. (B) la visualizzazione della posizione TEM-caricamento di un minibioreactor self-made. (C) HE colorazione dei 14 giorni agitata TSCC coltivate con TEM. Fenomeni di invasione unicellulare sono indicati da frecce nere. Barra della scala = 50 µm. (D) egli macchiatura di TSCC coltivate agitata di 14 giorni con TEM. Fenomeni di invasione collettiva sono indicati da frecce nere. Barra della scala = 50 µm. (E) egli macchiatura di 28 giorni statico coltivate TSCC con TEM. Fenomeni di invasione unicellulare sono indicati da frecce nere. Barra della scala = 100 µm. (F) HE macchiatura delle cellule di U2OS coltivate agitate di 14 giorni con TEM. Barra della scala = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Un protocollo ben consolidato per la fabbricazione di ECM decellularizzati dovrebbe mantenere la composizione di ECM nativa durante la rimozione di componenti cellulari nei tessuti quasi completamente21. Nonostante i protocolli di decellularizzazione attualmente segnalati che richiedono perfusione attraverso il sistema vascolare per rimuovere materiali cellulari di trasporto convettivo, agitazione meccanica è stata adottata qui, conosciuto come un metodo semplice ed economico tradizionale22 , 23 , 24 , 25 , 26. Inoltre, poiché la lingua è ricca di lingualis e ha pochi vasi vascolari ingombranti, questo protocollo è più adatto per tessuti di lingua di altri protocolli descritti sopra.
Inoltre, questo protocollo per la produzione di TEM effettua un appropriato decellularizzazione di forza moderata, evitando la distruzione o la dissoluzione della membrana base che può essere causata da decellularizzazione ad alta resistenza come sodio dodecil solfato ( SDS) trattamento3. Inoltre, il protocollo anche lavorato efficacemente nella lingua di ratto e maiale (dati non mostrati), suggerendo che il metodo potrebbe essere comunemente utilizzato su linguette da varie specie3.
Vale la pena notare che ci sono alcuni passaggi critici o dettagli in questo protocollo, che possono direttamente influenzare i risultati. Un passo importante è la digestione delle cellule di lingua da DNasi. Se il tempo di digestione non è sufficiente o la dnasi non funziona in modo efficiente, difficilmente si otterrebbe il decellularizzazione della linguetta. Un'altra cosa che dovrebbe essere notata è che la velocità di rotazione per il bioreattore non dovrebbe essere troppo veloce, considerando il danno a TEM. Inoltre, un ambiente sterile per questa operazione è molto importante nel protocollo.
Nonostante le rigide regole di cui sopra, il protocollo per la preparazione di TEM può essere regolato in una certa misura. Lavare le linguette con acqua ultrapura o PBS per qualche ora in più rispetto al tempo che il protocollo suggerisce ovviamente non pregiudicherebbe la fabbricazione di TEM. Tuttavia, poiché il protocollo ha bisogno di quasi una settimana per preparare il TEM, esso non può soddisfare richieste immediate di TEM.
Il TEM Mostra grande valore in costruzione di modello TSCC. Insieme a un self-made minibioreactor, sospeso Cal27 cellule possono attaccare in TEM e forma simile struttura infiltrativo che assomiglia umano TSCC istopatologia3. Questo potrebbe essere un modello ideale per il monitoraggio e indagare l'invasione e la metastasi di TSCC in vitro. Il modello potrebbe anche beneficiare il lavoro sul test antidroga su TSCC. In considerazione di tutti questi, il protocollo presentato qui può avere grande potenziale nella ricerca TSCC.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono il supporto di assegni di ricerca dalla Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (31371390), il programma del progetto di sviluppo High-Tech di stato (2014AA020702) e il programma di Guangdong Science and Technology (2016B030231001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57-BL/6J mice | Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center | ||
| Ethanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory | HB15-GR-2.5L | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A501218 | |
| Potassium chloride | Sangon Biotech | A100395 | |
| Dibasic Sodium Phosphate | Guangzhou Chemical Reagent Factory | BE14-GR-500G | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sangon Biotech | A501211 | |
| 1.5 mL EP tube | Axygen | MCT-150-A | |
| Ultra-low temperature freezer | Thermo Fisher Scientific | ||
| 3.5 cm cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 153066 | |
| 6 cm cell culture dish | Greiner | 628160 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | V900502 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 746495 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 449164 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Magnesium sulphate | Sangon Biotech | A601988 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 158968 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | PHR1487 | |
| Surgical suture | Shanghai Jinhuan | ||
| 250 mL wide-mouth bottle | SHUNIU | 1407 | |
| Magnetic stirrer | AS ONE | 1-4602-32 | |
| CO2 incubator | SHEL LAB | SCO5A | |
| 10 mL syringe | Hunan Pingan | ||
| 50 mL centrifuge tube | Greiner | 227270 | |
| Cal27 cell | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Tongue squamous cell carcinoma cell line | |
| U2OS cell | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Human osteosarcoma cell line | |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D0547 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Hepes free acid | BBI | A600264 | |
| FBS | Hyclone | SH30084.03 | |
| 4 °C fridge | Haier | ||
| Water purifier | ELGA | ||
| Hemocytometer | BLAU | 717805 |
References
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