Summary
効率的な decellularization による舌の細胞外マトリックス (TEM) の準備のためのメソッドを示しています。TEM は、静的または撹拌培養条件下で舌扁平上皮癌 (TSCC) モデルの復興のため、機能的な足場として使用できます。
Abstract
舌扁平上皮細胞癌 (TSCC)の in vitroの効果的かつ現実的なモデルを構築するためにメソッドの作成された食材脱舌細胞外マトリックス (TEM) TSCC 建設のため機能的な足場を提供します。TEM は、細胞の増殖・分化・細胞の生体外でニッチを提供します。ネイティブの細胞外マトリックス (ECM) と decellularized のマトリックスで保持される生化学的組成の微細構造は、セルを固定の組織固有のニッチを提供します。TEM の作製は、深刻な有機または無機の前処理を伴うデオキシリボヌクレアーゼ (DNase) 消化によって実現できます。このプロトコルは操作が簡単ででき、decellularization の高効率。TEM は、TSCC モデルの構築を可能にする静的または撹拌培養条件下で TSCC 細胞の良好な細胞を示した。自作バイオリアクターは細胞培養のための永続的な撹拌条件にも使われました。TEM を使用して再建された TSCC を示した特性と TSCC 病理臨床に似たプロパティ TSCC 研究の可能性を示唆しています。
Introduction
舌は嚥下、構音、味など、様々 な重要な機能です。したがって、舌機能障害では、患者の生活の質の1が大きな影響を与える。口腔内の最も一般的な悪性腫瘍は舌扁平上皮癌 (TSCC) アルコールを飲酒や喫煙タバコ2人で通常発生します。
近年では、ほとんど進展は、TSCC に関する基礎的研究で達成されています。効率的な体外研究の欠如は、遺跡の最大の問題の 1 つをモデル化します。したがって、細胞外マトリックス (ECM) は、潜在的な解決策になることが判明します。ECM は、高度に組織化されたマトリックス成分から成る複雑なネットワーク フレームは、ECM のような構造と組成を持つ足場材料なので癌研究主務。脱 ECM は、同じ起源の in vitro、ECM の最も重要な利点であることが判明したから細胞の完全にニッチを提供できます。
ECM は、洗剤や酵素を使用して decellularization を組織から削除されている細胞成分を保持ことができます。脱マトリックスのコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンを含む各種の ECM コンポーネントは、生存、増殖、および3細胞の分化を促進、培養細胞のネイティブの組織のような微小環境を提供します。また、移植の免疫原性は、ECM の細胞成分の有無と最低限のレベルに削減できます。
これまでのところ、脱 ECM の作製方法は、さまざまな組織、器官、心臓4,5,6、7、肝8,9,10 などで試されています。 ,11、肺12,13,14,15,16,17、および腎臓18,19,20します。 ただし、関連研究が見つかりません我々 の知識を最大限に舌で同様の作業をします。
本研究では脱舌の細胞外マトリックス (TEM) は一連の物理・化学・酵素治療により効率的にそして安くを作製しました。TEM は、TSCC 動作と開発のための適切なシミュレーションを示す TSCC体外、要約に使用されました。TEM では、TEM TSCC 研究3で大きな可能性があることを示す組織固有のニッチにセルをガイドする機能のほか、良い生体適合性。ここに示すプロトコルは、病因または TSCC の臨床治療研究の選択肢を提供します。
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Protocol
すべての動物の仕事は、動物福祉法、制度のガイドラインに従って実施されますされ、機関動物ケアおよび使用委員会、孫逸仙大学によって承認されました。
1. TEM の準備
- 頚部転位によってマウスを実行し、滅菌手術用はさみとピンセットを使用して舌を削除します。
- 3 分、75% エタノールで舌に没頭し、それぞれ舌を入れて 1.5 mL エッペン (EP) 10 mM 滅菌リン酸 1 mL 管バッファー ソリューション (PBS)。
注: すべての次の手順で PBS の濃度はこの手順で濃度と同じです。 - 凍結融解によるセル換散:-80 ° c 1 時間、EP チューブで舌を凍結し、3 回 45 分間室温で舌を解凍します。
- 手術針を使用して外科的縫合部分にそれぞれの舌を読み込み、滅菌アルミ箔の小片で縫合糸の端をラップします。無菌状態で 75% のエタノールを含む 3.5 cm や 6 cm の培養皿で操作を実行します。
注: 個々 の手術用縫合糸の適切な長さは約 20 cm、アルミ箔の各部分の適切な大きさは 0.3 cm2 (1 × 0.3 cm)。舌は、アルミ箔に近い読み込む必要があります。 - 30 s. 実行無菌状態でこの操作のため 3.5 cm や 6 cm の培養皿で 3 ml の滅菌 PBS の各舌をすすいでください。
- 超純水水で舌を洗う: 90 μ g/mL の最終的な集中に滅菌超純水の 250 ml 広口瓶の中にアンピシリンを追加。攪拌棒の入ったボトルに舌を入れてください。残りのボトル外縫合部とボトル キャップを締めます。無菌状態でこの操作を実行します。
注: 縫合の巻きつきを考慮した同じ瓶にで 5 舌までを置くことができます。アルミ箔は、舌をオフに滑りを防ぐためにボトルでは縫合糸の端。舌は、ボトルの内側に残り縫合糸の長さを調整することによって、ボトルの底から 2 センチ配置必要があります。このメモはまた 1.8、1.10、1.12、1.16 の手順です。 - マグネチックスターラー 12 h のためにボトルを置きます。
- 塩化ナトリウムと舌を洗う: 滅菌 1 の 250 ml 広口瓶の中にアンピシリンを追加 M 塩化ナトリウム 90 μ g/mL の最終的な集中。舌と攪拌棒をボトルに移動します。残りのボトル外縫合部とボトル キャップを締めます。無菌状態でこの操作を実行します。
- マグネチックスターラー 24 h のためにボトルを置きます。
- セル換散によってトリトン X-100: 滅菌の 2% の 250 ml 広口瓶の中に 90 μ g/mL の最終的な集中にアンピシリンを追加 PBS でトリトン X-100。舌と攪拌棒をボトルに移動します。残りのボトル外縫合部とボトル キャップを締めます。無菌状態でこの操作を実行します。
- マグネチックスターラー 48 h のためにボトルを置きます。
- CaCl2/MgCl2舌を洗う: 90 μ g/mL の最終的な集中に滅菌 5 mM CaCl2/MgCl2の 250 ml 広口瓶の中にアンピシリンを追加。舌と攪拌棒をボトルに移動します。残りのボトル外縫合部とボトル キャップを締めます。無菌状態でこの操作を実行します。
- マグネチックスターラー 24 h のためにボトルを置きます。
- DNase によって消化: ハンクの 1 mL 平衡塩類溶液 (HBSS) 各 EP 管を追加。300 の最終的な集中にそれぞれ HBSS に DNase を追加 μ m 各 EP 管、管の外側の縫合部にそれぞれの舌を移動します。無菌状態でこの操作を実行します。
注: は前の手順でボトル内に残る縫合部がこのステップで EP チューブ内も残ることを確認し、前の手順でボトルの外に残る縫合部がこの手順で EP 管の外側もままかどうかを確認します。 - 24 h の 37 ° C で EP チューブで舌を孵化させなさい。
- PBS で舌を洗う: 90 μ g/mL の最終的な集中に滅菌 PBS の 250 ml 広口瓶の中にアンピシリンを追加。舌と攪拌棒をボトルに移動します。残りのボトル外縫合部とボトル キャップを締めます。無菌状態でこの操作を実行します。
- マグネチックスターラー 24 h のためにボトルを置きます。
- 使用するまで 4 ° C で滅菌 PBS に準備された TEM を格納します。
2 TSCC の次元 (3 D) 再構成
-
静的 TSCC モデルの構築
- 種子 1.0 x 106 TSCC 単細胞 (Cal27) 3.5 cm 培養皿に。ダルベッコの 3 mL は、イーグルの中/F12 (DF12) 含む 10% 牛胎児血清 (FBS)、90 μ g/mL アンピシリン 90 μ g/mL カナマイシンを変更を追加します。
- 2 〜 3 日の 37 ° C で Cal27 細胞を培養します。セルが少なくとも 60% をカバーすることを確認してください、皿の底のエリア。
- Cal27 単層培養皿の上に TEM をロードします。
- 28 日の 37 ° C で CO2インキュベーターに皿を置きます。
- 毎日、細胞培養プロセスの中に培養液を更新します。インキュベーターの CO2濃度は 5% です。
-
攪拌 TSCC モデルの構築
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自作攪拌 minibioreactor の作製
- 10 mL シリンジのプランジャーを取り出してください。
- ロッドのより低いターミナルのそば (直径 1 cm) 穴を掘り、穴に攪拌棒を読み込みます。
- 広口ペットボトルのボトル キャップの中心に穴 (直径 0.5 cm) を掘るし、キャップを介してピストン棒を置きます。
- 50 mL の遠心管の半分にカット、ボトル キャップの外側に溶接します。
- 釣糸、釣針を結びつけたとロッドをラップすることによって、釣針をロッドに接続します。
注: をロッドで 4 釣針までを接続できます。 - オートクレーブ使用前に、自作の複合体。
注: は、プラスチック製の広口ボトル オートクレーブ滅菌を行います。細胞を培養しながら新しい滅菌プラスチック製の広口ボトルを使用します。
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自作攪拌 minibioreactor の作製
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動的な細胞培養
- 種子 1.0 x 106 Cal27 単細胞自作 minibioreactor で。10 %fbs、90 μ g/mL アンピシリンと 90 μ g/mL カナマイシンを含む DF12 媒体の 150 mL を追加します。
- TEM をロッドに接続されている釣針を使用して minibioreactor に乗せます。
- ボトル キャップを締めるし、磁性攪拌器に minibioreactor を置きます。7 〜 14 日 37 ° C で CO2インキュベーターで 200 rpm で minibioreactor をアクティブにします。
注: CO2インキュベーターで CO2の濃度は 5% です。
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Representative Results
TEM の準備のためこのプロトコルは効率的かつ適切なをことが判明します。TEM は、母国語の組織と比較して完璧な decellularization を示した。ヘマトキシリン ・ エオジン (HE) 染色 (図 1A B) によって decellularization の有効性を確認した.染色の結果彼は、TEM (図 1B) の染色性が核の完全な消失を明らかにしました。また、以前の作品から DNA コンテンツの定量化は、DNA が TEM3からほぼ完全に削除されたことを示した。このプロトコルはまた細胞成分 (図 1B) を除去しながら組織の整合性にまれな損傷を示した。
TSCC TEM と自作 minibioreactor (図 2A B) を使用しての 3 D 再構成は、満足のいく結果を達成しました。HE 染色を示した典型的な TSCC 病理学的特性 (図 2C D) を TEM の Cal27 細胞に提示します。攪拌培養条件のセル単一セル移行 (図 2C) 集団の移行 (図 2D) の異なる病変領域を提示しました。静置培養条件、Cal27 細胞はまた、TEM で侵襲的構造を形成が (図 2E) 長い時間がかかった。さらに、ひと骨肉腫細胞株 U2OS は同じ攪拌培養システムにも導入されました。U2OS 細胞培養培地に住むことができる、しかし、tem (図 2F) 彼らは見つかりません。TEM は、異なる腫瘍細胞が繁栄する異なる微小を必要があることを示唆しているがん細胞の種類ごとに異なる生体親和性を示した。
図 1: TEM の準備。(A) 彼のマウスから母国語の染色します。スケールバー = 100 μ m。 (B) 彼のマウスから脱 TEM の染色。スケールバー = 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: TEM による TSCC の再構成します。(自作 minibioreactor の A) の概要。(B) 自作 minibioreactor の TEM の読み込み位置の表示します。(C) 彼は、TEM と 14 日間攪拌培養 TSCC の染色。単一のセルの侵入現象は、黒の矢印で示されます。スケールバー = 50 μ m。 (D) 彼 TEM で 14 日間攪拌培養 TSCC の染色。集団の侵入現象は、黒の矢印で示されます。スケールバー = 50 μ m. (E) 彼 tem TSCC を培養 28 日静の染色します。単一のセルの侵入現象は、黒の矢印で示されます。スケールバー = 100 μ m. (F) 彼 TEM で 14 日間攪拌培養 U2OS 細胞の染色します。スケールバー = 50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
脱 ECM 作製の十分に確立されたプロトコル組織で細胞成分を除去しながらネイティブの ECM 成分を保つべきほぼ完全に21。現在報告されている decellularization プロトコル対流輸送によって細胞を除去する血管を介して血流を必要とする、にもかかわらず機械的攪拌ここで採用した、22の伝統的なシンプルで安価な方法として知られています。,23,24,25,26します。 また、舌 lingualis が豊富です、いくつかの扱いにくい血管を持っているので、このプロトコルは上で説明したその他のプロトコルよりも舌組織に適しています。
さらに、TEM 用この議定書は実施適切な中等度強度 decellularization、破壊又はナトリウム dodecyl 硫酸塩 (のように高強度 decellularization によって引き起こされることがありますベースの膜の分解を避けるSDS) 治療3。ラットとブタ (データは示されていない)、舌で効果的に勤務するプロトコルを加えて、また様々 な種3から舌にメソッドを一般的使用可能性が示唆しています。
それはいくつかの重要なステップまたは結果に直接影響を与えることができるこのプロトコルの詳細があることは注目に値するです。1 つの重要なステップは、DNase によって舌の細胞の消化です。消化時間が十分ではない場合、DNase は効率的に動作しませんが、ほとんど舌の decellularization を達成します。気づいた必要がありますもう一つは、バイオリアクターの回転速度が速すぎる、TEM に損傷を考慮したはずです。また、この操作で滅菌環境はプロトコルでは非常に重要であります。
上記の厳格なルールにもかかわらず TEM 準備のためのプロトコルはある程度調整できます。プロトコルは、TEM の作製には明らかに影響しません示唆している時間よりも数時間以上の純水または PBS で舌を洗浄します。ただし、プロトコルは、TEM の準備に約 1 週間を必要とするのでそれは TEM の即時の要求を満たすことができません。
TEM は、TSCC モデル構築で大きな値を示します。自作 minibioreactor と共に中断された Cal27 細胞は人間 TSCC 病理3に似た TEM およびフォームの類似した浸潤構造にアタッチできます。監視と浸潤・転移 TSCCの生体外の調査のための理想的なモデルと考えられます。モデルは、TSCC に薬物検査の仕事も助かります。これらのすべてを考慮したここで提示されたプロトコルは、TSCC 研究の大きな可能性を有するかもしれない。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者は、国家自然科学基金、中国の (31371390)、状態のハイテク開発プロジェクト (2014AA020702) のプログラムおよび広東省科学技術 (2016B030231001) のプログラムからの研究助成金のサポートを認めます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57-BL/6J mice | Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center | ||
| Ethanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory | HB15-GR-2.5L | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A501218 | |
| Potassium chloride | Sangon Biotech | A100395 | |
| Dibasic Sodium Phosphate | Guangzhou Chemical Reagent Factory | BE14-GR-500G | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sangon Biotech | A501211 | |
| 1.5 mL EP tube | Axygen | MCT-150-A | |
| Ultra-low temperature freezer | Thermo Fisher Scientific | ||
| 3.5 cm cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 153066 | |
| 6 cm cell culture dish | Greiner | 628160 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | V900502 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 746495 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 449164 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Magnesium sulphate | Sangon Biotech | A601988 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 158968 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | PHR1487 | |
| Surgical suture | Shanghai Jinhuan | ||
| 250 mL wide-mouth bottle | SHUNIU | 1407 | |
| Magnetic stirrer | AS ONE | 1-4602-32 | |
| CO2 incubator | SHEL LAB | SCO5A | |
| 10 mL syringe | Hunan Pingan | ||
| 50 mL centrifuge tube | Greiner | 227270 | |
| Cal27 cell | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Tongue squamous cell carcinoma cell line | |
| U2OS cell | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Human osteosarcoma cell line | |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D0547 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Hepes free acid | BBI | A600264 | |
| FBS | Hyclone | SH30084.03 | |
| 4 °C fridge | Haier | ||
| Water purifier | ELGA | ||
| Hemocytometer | BLAU | 717805 |
References
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