Summary
En metode er vist her til forberedelse af tungen ekstracellulære matrix (TEM) med effektiv decellularization. TEM kan bruges som funktionelle stilladser til genopbygningen af et tungen planocellulært karcinom (TSCC) model statisk eller omrørt kultur betingelser.
Abstract
For at konstruere en effektiv og realistisk model for tunge planocellulært karcinom (TSCC) in vitro-blev metoder skabt til at producere decellularized tungen ekstracellulære matrix (TEM) der giver funktionelle stilladser for TSCC byggeri. TEM giver en in vitro- niche for cellevækst, differentiering og celle migration. Mikrostrukturer indfødte ekstracellulære matrix (ECM) og biokemiske kompositioner bevaret i matrixen decellularized indeholder væv-specifikke nicher for forankring celler. Fabrikation af TEM kan realiseres af deoxyribonuclease (DNase) fordøjelsen ledsaget med en alvorlig af organiske eller uorganiske forbehandling. Denne protokol er nem at betjene og sikrer høj effektivitet for decellularization. TEM viste positiv cytocompatibility for TSCC celler under statisk eller omrørt dyrkningsbetingelser, som giver mulighed for opførelse af TSCC model. En self-made bioreaktor blev også brugt til den vedvarende stirred betingelse for cellekultur. Rekonstrueret TSCC bruge TEM viste egenskaber der minder om kliniske TSCC histopatologi, tyder på potentialet i TSCC forskning.
Introduction
Tungen har forskellige vigtige funktioner, såsom deglutition, artikulation og smagning. Således har værdiforringelse af tungen funktion stor indvirkning på patienternes livskvalitet1. Den mest almindelige malignitet i mundhulen er tungen pladecellekræft (TSCC), som normalt forekommer i mennesker, der drikker alkohol eller ryge tobak2.
I de seneste år er der sket små fremskridt i grundforskning på TSCC. Manglen på effektive in vitro- forskning modeller er fortsat at være en af de største problemer. Således, den ekstracellulære matrix (ECM) viser sig for at være en mulig løsning. Eftersom ECM er et komplekst netværk ramme sammensat af velorganiseret matrix komponenter, være stillads materialer med en ECM-lignende struktur og sammensætning kompetente til kræftforskning. Decellularized ECM kan perfekt niche celler fra samme oprindelse i vitro, som viser sig for at være den mest markante fordel af ECM.
ECM kan opbevares med cellulære komponenter fjernes fra væv gennem decellularization ved hjælp af vaske-og rengøringsmidler og enzymer. Forskellige ECM komponenter, herunder kollagen, fibronektin, og laminin i decellularized matrix giver en indfødt-væv-lignende mikromiljø for dyrkede celler, fremmer overlevelse, spredning og differentiering af celler3. Derudover kan immunogenicitet til transplantation blive reduceret til et minimalt niveau med manglen på cellulære komponenter i ECM.
Hidtil, har fabrikation metoder for decellularized ECM været prøvet i forskellige væv og organer, såsom hjerte4,5,6,7, leveren8,9,10 ,11, lunge12,13,14,15,16,17, og nyre18,19 , 20. imidlertid ingen relevant forskning konstateret på lignende arbejde i tungen til bedste af vores viden.
I denne undersøgelse, blev decellularized tunge ekstracellulære matrix (TEM) fremstillet både effektivt og billigt af en række fysiske, kemiske og enzymatisk behandling. Derefter blev TEM brugt til at sammenfatte TSCC i vitro, viser en passende simulation for TSCC adfærd og udvikling. TEM har god biokompatibilitet samt evnen til at guide cellerne til væv-specifik niche, som angiver, at TEM kan have stort potentiale i TSCC forskning3. Den protokol, der er vist her giver et valg for forskere studerer på enten patogenese eller kliniske behandlinger af TSCC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr arbejde blev udført i overensstemmelse med animal welfare act af institutionelle retningslinjer og godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalget, Sun Yat-sen Universitet.
1. forberedelse af TEM
- Udføre mus af cervikal dislokation og fjerne tunger ved hjælp af steril kirurgiske saks og pincet.
- Fordyb tunger i 75% ethanol i 3 min og derefter sætte hver tungen i en 1,5 mL Eppendorf (EP) rør med 1 mL af 10 mM sterile phosphat bufferet løsning (PBS).
Bemærk: Koncentrationen af PBS i alle de følgende trin er den samme som koncentrationen i dette trin. - Celle lysering af fryse tø: fryse tunger i EP rør ved-80 ° C i 1 time, og derefter tø tunger ved stuetemperatur i 45 min. til 3 cykler.
- Indlæse hver tungen på et stykke af kirurgisk sutur ved hjælp af en kirurgisk nål og wrap i slutningen af sutur med et lille stykke af sterile stanniol. Udføre handlingen i en 3,5 cm eller 6 cm kultur parabol der indeholder 75% ethanol i sterile forhold.
Bemærk: I passende længde af hvert stykke af kirurgisk sutur er ca 20 cm, og en passende størrelse af hvert stykke stanniol handler om 0,3 cm2 (1 cm × 0,3 cm). Tungen skal indlæses tæt i stanniol. - Skyl hver tungen med 3 mL steril PBS i en 3,5 cm eller 6 cm kultur fad til 30 s. udføre denne operation i sterile forhold.
- Vaske tunger med ultrarent vand: tilføje ampicilin i en bred mund flaske med 250 mL sterilt ultrarent vand til en endelig koncentration på 90 µg/mL. Sætte tunger i flasken indeholder en røre bar. Stramme flaske cap med en del af sutur forbliver uden for flasken. Denne handling udføres under sterile forhold.
Bemærk: Op til 5 tunger kan sættes i den samme flaske betragtning slyngende af sutur. Stanniol ligger for enden af sutur i flasken til at forhindre, at tungen glide ud. Tunger skal placeres 2 cm høj fra bunden af flasken ved at justere længden af sutur resterende inde i flasken. Dette notat er også for trin 1.8, 1,10, 1.12 og 1.16. - Sætte flasken på en magnetomrører i 12 timer.
- Vaske tunger med NaCl: tilføje ampicilin i en bred mund flaske med 250 mL sterilt 1 M NaCl til en endelig koncentration på 90 µg/mL. Flytte tunger og røre bar i flasken. Stramme flaske cap med en del af sutur forbliver uden for flasken. Denne handling udføres under sterile forhold.
- Sætte flasken på en magnetomrører i 24 timer.
- Celle lysering af Triton X-100: føje ampicilin til en endelig koncentration på 90 µg/mL i en bred mund flaske med 250 mL sterilt 2% Triton X-100 i PBS. Flytte tunger og røre bar i flasken. Stramme flaske cap med en del af sutur forbliver uden for flasken. Denne handling udføres under sterile forhold.
- Sætte flasken på en magnetomrører for 48 h.
- Vaske tunger med CaCl2/MgCl2: føje ampicilin til en bred mund flaske med 250 mL sterilt 5 mM CaCl2/MgCl2 til en endelig koncentration på 90 µg/mL. Flytte tunger og røre bar i flasken. Stramme flaske cap med en del af sutur forbliver uden for flasken. Denne handling udføres under sterile forhold.
- Sætte flasken på en magnetomrører i 24 timer.
- Fordøjelsen af DNase: tilføje 1 mL af Hanks afbalanceret saltopløsning (HBSS) til hver EP tube. Tilføje DNase i HBSS henholdsvis til en endelig koncentration på 300 µM. flytte hver tungen ind i hver EP rør, med en del af sutur uden for røret. Denne handling udføres under sterile forhold.
Bemærk: Sørg for, at del af sutur, som stadig er inde i flasker i forrige trin også forbliver inde i EP røret i dette trin, og sørg for, at del af sutur, som forbliver uden for flasker i forrige trin også forbliver uden for EP røret i dette trin. - Inkuber tunger i EP rør ved 37 ° C i 24 timer.
- Vaske tunger med PBS: tilføje ampicilin i en bred mund flaske med 250 mL steril PBS til en endelig koncentration på 90 µg/mL. Flytte tunger og røre bar i flasken. Stramme flaske cap med en del af sutur forbliver uden for flasken. Denne handling udføres under sterile forhold.
- Sætte flasken på en magnetomrører i 24 timer.
- Gemme den forberedte TEM i steril PBS ved 4 ° C indtil brug.
2. tre-dimensionelle (3D) rekonstituering af TSCC
-
Statisk TSCC model konstruktion
- Frø 1,0 x 106 enkelt TSCC celler (Cal27) i en 3,5 cm kultur skål. Tilføj 3 mL af Dulbeccos modificerede Eagle's medium/F12 (DF12) der indeholder 10% føtal bovint serum (FBS), 90 µg/mL ampicilin og 90 µg/mL kanamycin.
- Kultur Cal27 celler ved 37 ° C i 2 til 3 dage. Sørg for, at cellerne dækker mindst 60% inden for parabol bunden.
- Indlæse TEM på Cal27 éncellelag i kultur parabol.
- Sætte skålen i en CO2 inkubator ved 37 ° C i 28 dage.
- Opdater næringssubstratet hver dag i løbet af celle kultur processen. CO2 -koncentration i rugemaskine er 5%.
-
Omrøres TSCC model konstruktion
-
Forberedelse af en self-made stirred minibioreactor
- Tegne stemplet fra en 10 mL sprøjte.
- Grave et hul (diameter 1 cm) i nærheden af den nedre terminal af stangen og indlæse en røre bar i hullet.
- Grave et hul (diameter på 0,5 cm) midt på låget af en bred mund plastflaske og sætte stempelstangen gennem fælles landbrugspolitik.
- Skære halvdelen af et 50 mL centrifugeglas og svejse det på den udvendige side af flaske cap.
- Fastgør fishhooks til stangen af indpakning stang med fiskeliner, som er bundet til fishhooks.
Bemærk: Op til 4 fishhooks kan knyttes til en stang. - Autoklave self-made komplekset inden brug.
Bemærk: Må ikke autoklave bred mund plastflaske. Brug en ny steril bred mund plastflaske mens dyrkning af celler.
-
Forberedelse af en self-made stirred minibioreactor
-
Dynamisk cellekultur
- Frø 1,0 x 106 enkelt Cal27 celler i den self-made minibioreactor. Tilføj 150 mL af DF12 medium, der indeholder 10% FBS, 90 µg/mL ampicilin og 90 µg/mL kanamycin.
- Indlæse TEM på minibioreactor ved hjælp af fishhooks fastgjort til stangen.
- Stramme flaske cap og sætte minibioreactor på en magnetomrører. Aktivere minibioreactor på 200 rpm i en CO2 inkubator ved 37 ° C i 7-14 dage.
Bemærk: Koncentrationen af CO2 i CO2 rugemaskine er 5%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol for forberedelse af TEM viser sig for at være effektive og hensigtsmæssige. TEM viste perfekt decellularization sammenlignet med modersmål væv. Effekten af decellularization blev bekræftet af hæmatoxylin-eosin (han) farvning (figur 1A-B). HAN farvning resultaterne viste fuldstændig forsvundet nukleart farvning i TEM (figur 1B). DNA indhold kvantificering fra tidligere arbejde viste desuden, at DNA blev næsten helt fjernet fra TEM3. Denne protokol viste også sjældne skader på væv integritet mens du fjerner celle komponenter (figur 1B).
3D rekonstituering af TSCC bruge TEM og en self-made minibioreactor (figur 2A-B) opnået tilfredsstillende resultater. HAN farvning viste, at Cal27 celler i TEM præsenteret typiske TSCC patologisk kendetegn (figur 2C-D). Cellerne i stirred dyrkningsbetingelser præsenteret én celle migration (figur 2C) eller kollektive migration (figur 2D) i forskellige læsion områder. I statisk dyrkningsbetingelser, Cal27 celler også dannet invasive strukturer i TEM, men det tog længere tid (figur 2E). Derudover blev en menneskelig osteosarkom cellelinie U2OS også introduceret til samme stirred kultur-systemet. Selvom U2OS celler kunne leve i substratet, blev de ikke fundet i TEM (figur 2F). TEM viste forskellige biokompatibilitet for forskellige typer af kræftceller, tyder på, at forskellige tumorceller muligvis forskellige microenvironments at blomstre.
Figur 1 : Forberedelse af TEM. (A) HE farvning af native tongues fra mus. Skalalinjen = 100 µm. (B) han farvning af decellularized TEM fra mus. Skalalinjen = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Rekonstituering af TSCC af TEM. (A) en oversigt over en self-made minibioreactor. (B) opfattelse af en self-made minibioreactor TEM-loading stilling. (C) han farvning af 14-dages rørte kulturperler TSCC med TEM. Enkelt celle invasion fænomener er angivet med sorte pile. Skalalinjen = 50 µm. (D) han farvning af 14-dages stirred kulturperler TSCC med TEM. Kollektive invasion fænomener er angivet med sorte pile. Skalalinjen = 50 µm. (E), han farvning af 28-dages statisk kulturperler TSCC med TEM. Enkelt celle invasion fænomener er angivet med sorte pile. Skalalinjen = 100 µm. (F) han farvning af 14-dages stirred kulturperler U2OS celler med TEM. Skalalinjen = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En veletableret protokol for decellularized ECM fabrikation bør bevare de indfødte ECM sammensætning mens fjernelse af cellulære komponenter i væv næsten helt21. Trods i øjeblikket rapporteret decellularization protokoller, som kræver perfusion gennem Vaskulaturen fjerne materialer ved Konvektiv transport, blev mekanisk agitation vedtaget her, kendt som en traditionel enkel og billig metode22 , 23 , 24 , 25 , 26. Endvidere, da tungen er rig på lingualis og har nogle voluminøse vaskulære fartøjer, denne protokol er mere velegnet til tunge væv end andre protokoller er beskrevet ovenfor.
Desuden, denne protokol for TEM produktion udfører en passende moderat-styrke decellularization, undgå ødelæggelse eller opløsning af den base membran, som kan være forårsaget af højstyrke decellularization som sodium dodecyl sulfat) SDS) behandling3. Derudover protokollen også arbejdede effektivt i tungen af rotte og gris (data ikke vist), hvilket tyder på, at metoden kunne være almindeligt anvendt ved tunger fra forskellige arter3.
Det er værd at bemærke, at der er nogle kritiske trin eller detaljer i denne protokol, som direkte kan påvirke resultaterne. Et vigtigt skridt er fordøjelsen af tungen celler af DNase. Hvis fordøjelsestid er ikke nok eller DNase virker effektivt, ville decellularization af tungen næppe kunne nås. En anden ting, som bør blive bemærket er, at den roterende hastighed for bioreaktor ikke bør være for hurtigt, i betragtning af skader, TEM. Et sterilt miljø for denne handling er desuden meget vigtigt i protokollen.
På trods af de ovenstående strenge regler kan i protokollen for TEM præparat justeres til en vis grad. Vask tunger med ultrarent vand eller PBS for et par flere timer end den tid, som protokollen foreslår naturligvis ikke vil påvirke fabrikation af TEM. Men da protokollen skal næsten en uge at forberede TEM, det kan ikke opfylde umiddelbare krav for TEM.
TEM viser stor værdi i TSCC model konstruktion. Sammen med en self-made minibioreactor, kan suspenderede Cal27 celler vedhæfte i TEM og form lignende infiltrativ struktur ligner menneskelige TSCC histopatologi3. Dette kunne være en ideel model for overvågning og efterforskning af invasionen og metastase af TSCC in vitro. Modellen kunne også gavne arbejde på dopingtest på TSCC. I betragtning af alle disse, kan protokollen præsenteres her har stort potentiale i TSCC forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender støtten fra forskningstilskud fra National Natural Science Foundation of China (31371390), programmet for staten High-Tech Development Project (2014AA020702) og programmet for Guangdong videnskab og teknologi (2016B030231001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57-BL/6J mice | Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center | ||
| Ethanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory | HB15-GR-2.5L | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A501218 | |
| Potassium chloride | Sangon Biotech | A100395 | |
| Dibasic Sodium Phosphate | Guangzhou Chemical Reagent Factory | BE14-GR-500G | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sangon Biotech | A501211 | |
| 1.5 mL EP tube | Axygen | MCT-150-A | |
| Ultra-low temperature freezer | Thermo Fisher Scientific | ||
| 3.5 cm cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 153066 | |
| 6 cm cell culture dish | Greiner | 628160 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | V900502 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 746495 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 449164 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Magnesium sulphate | Sangon Biotech | A601988 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 158968 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | PHR1487 | |
| Surgical suture | Shanghai Jinhuan | ||
| 250 mL wide-mouth bottle | SHUNIU | 1407 | |
| Magnetic stirrer | AS ONE | 1-4602-32 | |
| CO2 incubator | SHEL LAB | SCO5A | |
| 10 mL syringe | Hunan Pingan | ||
| 50 mL centrifuge tube | Greiner | 227270 | |
| Cal27 cell | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Tongue squamous cell carcinoma cell line | |
| U2OS cell | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Human osteosarcoma cell line | |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D0547 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Hepes free acid | BBI | A600264 | |
| FBS | Hyclone | SH30084.03 | |
| 4 °C fridge | Haier | ||
| Water purifier | ELGA | ||
| Hemocytometer | BLAU | 717805 |
References
- Elfring, T., Boliek, C. A., Winget, M., Paulsen, C., Seikaly, H., Rieger, J. M. The relationship between lingual and hypoglossal nerve function and quality of life in head and neck cancer. J. Oral Rehabil. 41, 133-140 (2014).
- Patel, S. C., et al. Increasing incidence of oral tongue squamous cell carcinoma in young white women, Age 18 to 44 Years. J. Clin. Oncol. 29, 1488-1494 (2011).
- Zhao, L., Huang, L., Yu, S., Zheng, J., Wang, H., Zhang, Y. Decellularized tongue tissue as an in vitro. model for studying tongue cancer and tongue regeneration. Acta Biomaterialia. 58, 122-135 (2017).
- Ng, S. L., Narayanan, K., Gao, S., Wan, A. C. Lineage restricted progenitors for the repopulation of decellularized heart. Biomaterials. 32, 7571-7580 (2011).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. 14, 213-221 (2008).
- Remlinger, N. T., Wearden, P. D., Gilbert, T. W. Procedure for decellularization of porcine heart by retrograde coronary perfusion. J. Vis. Exp. (6), e50059 (2012).
- Wainwright, J. M., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng. Part C-ME. 16, 525-532 (2010).
- Baptista, P. M., Siddiqui, M. M., Lozier, G., Rodriguez, S. R., Atala, A., Soker, S. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53, 604-617 (2011).
- Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. Method for the decellularization of intact rat liver. Organogenesis. 6, 134-136 (2010).
- Soto-Gutierrez, A., et al. A whole-organ regenerative medicine approach for liver replacement. Tissue Eng. Part C-ME. 17, 677-686 (2011).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. 16, 814-820 (2010).
- Bonvillain, R. W., et al. A nonhuman primate model of lung regeneration: detergent-mediated decellularization and initial in vitro recellularization with mesenchymal stem cells. Tissue Eng. Pt A. 18, 2437-2452 (2012).
- Daly, A. B., et al. Initial binding and recellularization of decellularized mouse lung scaffolds with bone marrow-derived mesenchymal stromal cells. Tissue Eng. Pt A. 18, 1-16 (2012).
- Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 16, 927-933 (2010).
- Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329, 538-541 (2010).
- Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded. Tissue Eng. Pt A. 16, 2581-2591 (2010).
- Wallis, J. M., et al. Comparative assessment of detergent-based protocols for mouse lung de-cellularization and re-cellularization. Tissue Eng. Part C-ME. 18, 420-432 (2012).
- Ross, E. A., et al. Embryonic stem cells proliferate and differentiate when seeded into kidney scaffolds. J. Am. Soc. Nephrol. 20, 2338-2347 (2009).
- Song, J. J., Guyette, J. P., Gilpin, S., Gonzalez, G., Vacanti, J. P., Ott, H. C. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nat. Med. 19, 646-651 (2013).
- Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33, 7756-7764 (2012).
- Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand. J. Clin. Invest. 122, 3817-3823 (2012).
- Song, J. J., Ott, H. C. Organ engineering based on decellularized matrix scaffolds. Trends Mol. Med. 17, 424-432 (2011).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).
- Shamis, Y., et al. Organ-specific scaffolds for in vitro expansion, differentiation, and organization of primary lung cells. Tissue Eng. Part C-ME. 17, 861-870 (2011).
- Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering. Tissue Eng. Pt A. 16, 2207-2216 (2010).
- Cortiella, J., et al. Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation. Tissue Eng. Pt A. 16, 2565-2580 (2010).
