Summary
In deze studie beschrijven we een in-ovo -systeem als een veelbelovend instrument voor het testen van insuline-mimetische verbindingen in een levend organisme. De belangrijkste voordelen omvatten voldoende doorvoersnelheden en aanvaardbare kosten, die het mogelijk de identificatie van fytochemicaliën met insuline-mimetische eigenschappen maken.
Abstract
Verhoogde bloedsuikerspiegel in diabetes mellitus type 2 (T2DM), een complexe en multifactoriële stofwisselingsziekte, zijn veroorzaakt door insuline resistentie en β-cel storing. Verschillende strategieën, met inbegrip van de injectie van insuline of het gebruik van insuline-sensibiliserende drugs, werden voortgezet om te behandelen T2DM of op zijn minst verminderen de symptomen. Daarnaast heeft de toepassing van plantaardige stoffen steeds meer aandacht aangetrokken. Het is dus noodzakelijk om te vinden van efficiënte testsystemen te identificeren en te karakteriseren insuline-mimetische verbindingen. Hier ontwikkelde we een gemodificeerde chick embryo model, waarmee het testen van synthetische verbindingen en kruidenextracten met insuline-mimetische eigenschappen. Met behulp van een fluorescentie microscopie gebaseerde primaire scherm, dat de translocatie van Glucose transporter 4 (Glut4) aan het plasma-membraan kwantificeert, konden we identificeren van verbindingen, voornamelijk kruidenextracten, die tot een verhoging van de intracellulaire glucose leiden concentraties in adipocytes. Echter, de werkzaamheid van deze stoffen verder is verificatie vereist in een levend organisme. Dus, we een in-ovo -aanpak gebruikt ter identificatie van hun bloed glucose-reducerende eigenschappen. De goedkeuring door een ethisch comité is niet nodig omdat het gebruik van kip embryo's tijdens de eerste twee-derde van de embryonale ontwikkeling wordt niet beschouwd als een dier experiment. Hier, wordt de toepassing van dit model in detail beschreven.
Introduction
Diabetes mellitus is een metabole ziekte gekenmerkt door hyperglycemie en wordt veroorzaakt door gebreken in de insuline secretie of insuline actie1. Negentig procent van alle gevallen van diabetes zijn diabetes mellitus type 2 categorie (T2DM), waar particulieren aantonen insulineresistentie en meestal insuline tekort2. Verschillende factoren staan bekend om de wereldwijde incidentie van T2DM, met inbegrip van veranderingen in levensstijl, met name die met betrekking tot overnutrition, veroudering, en lichamelijke inactiviteit. Ongeveer 400 miljoen mensen hebben diabetes mellitus wereldwijd volgens de internationale Diabetes Federatie (IDF). Dit nummer is geraamd op 600 miljoen binnen de komende 20 jaar3.
Diabetische complicaties veroorzaakt door hyperglycemie en insuline-resistentie, zoals hypertensie, dyslipidemia, glucose-intolerantie, coronaire hart-en vaatziekten en cerebrale vaatziekten, leiden tot een aanzienlijk verlaagde levensverwachting en kwaliteit4. Beïnvloede individuen vereisen glucose-verlagende farmacotherapie; echter, het gebruik van drugs, zoals metformine5 wordt vaak geassocieerd met dramatische neveneffecten6,7,8. Dus verdere zijn antidiabetica benaderingen die veilig, algemeen beschikbaar en goedkoop zijn nodig.
Verschillende plantaardige stoffen, extracten van planten en nutraceuticals hebben toegekend aan functie insuline-mimetische eigenschappen door het moduleren van de verschillende cellulaire functies. Een belangrijk kenmerk is stimulatie van de translocatie van glucose transporter 4 (GLUT4) aan het plasma-membraan van intracellulaire opbergvakken, resulterend in een verhoogde opname van glucose in spieren en vetweefsel bij gebrek aan insuline, bekend als insuline-mimetische eigenschappen9. Eerder wij uitgevoerd een fluorescentie microscopie gebaseerde aanpak om te kwantificeren van het proces van de translocatie van GLUT410. Analyse van talrijke plantenextracten van een uittreksel bibliotheek11 met behulp van deze bepaling resulteerde in de identificatie van veelbelovende kandidaten. Verdere tests in levende organismen zijn echter vereist. De aanpak in detail beschreven in dit document, een gemodificeerde chick embryo model, heeft bewezen een veelbelovende model voor het identificeren van stoffen met insuline-mimetische eigenschappen. Het is een aantrekkelijk instrument vullen de brede kloof tussen in-vitro en in vivo studies en biedt een aantal voordelen in vergelijking met bestaande systemen zoals aanvaardbare kosten, eenvoudige hantering en voldoende doorvoersnelheden. Daarnaast is toestemming van een ethisch comité is niet vereist.
Protocol
Volgens de richtlijn 2010/63/EU hoeft experimenten met niet-gearceerde aviaire embryo's tijdens de eerste twee-derde van embryonale ontwikkeling niet toestemming door een ethische commissie.
1. bewaring en fokken van de eieren
- Bevruchte kippeneieren (Tabel of Materials) verkrijgen bij een plaatselijke kweker.
Opmerking: Eieren kunnen bij 14 ° C in een bevochtigde sfeer voor maximaal 10 dagen na de legdatum vóór gebruik voor experimenten worden bewaard. - Incubeer de eieren bij 38 ° C met een gemiddelde vochtigheidsgraad van 40-60% voor 10 of 11 dagen in een broedmachine die voortdurend verandert de eieren.
2. selectie van de eieren
- Controleer de eieren voor bevruchting na een incubatieperiode van tot 11 dagen. Gebruik een candling licht voor deze stap. Dompel de rand van de schouwlamp in een inktpad en kaars de puntige kant van het ei.
- Ter identificatie van de lucht blaas, controleren op verschillen in helderheid op de bovenkant van het ei.
Opmerking: De lucht blaas verschijnt als een ronde, transparanter regio, terwijl het eiwit donkerder is als het ei is geschouwd. - Na detectie van de lucht blaas, Markeer de locatie door te drukken op de lamp iets tegen het ei met de eerder toegepaste inkt.
- Het uitsluiten van niet-bevruchte eieren bij deze stap die een verschil in helderheid tussen het eiwit en de lucht blaas niet weergeven.
3. injectie van stoffen
- De stof van belang (b.v., de kruiden-extract of insuline) bereid door verdunning van de stof in de gewenste concentratie in Henks evenwichtige zoutoplossing (HBSS) buffer. Bijvoorbeeld 3.3 U/mL van een analoge in HBSS verkrijgbare insuline.
- Voor de toepassing van de geselecteerde compound, pikken zorgvuldig de "eggshell" met een puntige pincet in het gemarkeerde gebied van de lucht blaas. Vormen geen een gat groter zijn dan de diameter van de naald van de spuit. Bufferoplossing (300 µL) met de stof van belang in het gepikte gebied via een spuit te injecteren.
Opmerking: Gebruik steriele, 1 ml spuiten voor eenmalig gebruik, Pipetteer tips en vaartuigen. Draag handschoenen en een laboratoriumjas voor de experimenten. - Om te bepalen het bloed glucose-reducerende effect van een stof, plaats de eieren terug in de incubator voor 60, 120 en 180 min, respectievelijk. Om te bepalen van de niveaus van de glucose van de basale bloed, omvatten ten minste 10-15 controle niet-behandelde eieren.
4. de toxiciteitstesten
- Na toepassing van de geselecteerde compound voor 24u, equilibreer de eierschaal membraan met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) buffer (genoeg ter dekking van het hele eierschaal membraan) gedurende ten minste 30 s.
- Verwijder overtollige PBS buffer door het weg te gieten.
- Trek de eierschaal membraan zorgvuldig met een puntige pincet.
- Controleer van bloedvaten voor laesies en bevestig vitaliteit (b.v., verkeer) van het kuiken embryo.
Opmerking: Zie Figuur 1 ter vergelijking van vitaal belang versus niet-vitale embryo's na toepassing van een giftige kruiden-extract.
5. de meting van de bloed Glucose waarde
- Op de respectieve tijdstip, zorgvuldig verwijderen van de "eggshell" boven de lucht blaas en equilibreer de eierschaal membraan met PBS buffer (genoeg ter dekking van het hele eierschaal membraan).
- Verwijder overtollige PBS buffer door het weg te gieten.
- Trek voorzichtig uit de eierschaal membraan met een puntige pincet.
- Snij en verwijder het chorion membraan met een micro-schaar, om goede toegang tot geschikte bloedvaten. Snijd het membraan ten minste 2-3 cm. Dus knip, wordt geen grote schepen in het membraan van zichzelf om te voorkomen dat ongewenste bloedverlies van het embryo niet af.
- Zoek het grote schip, van oorsprong uit de buik van het embryo. Til dit schip uit het eiwit met een gesloten micro-schaar en plaats deze op een kunststof pH-strip. Verplaatsen van de pH-strook onder het schip, die is gehouden met de micro-schaar, en trek terug de micro-schaar weg zorgvuldig.
- Verwijderen van 1-2 mL van de vloeistof onder het chorion membraan met een pipet om te voorkomen dat de verdunning van het bloed in de volgende stap. Droog het vaartuig en de pH-strip met filtreerpapier, alvorens het schip wordt geknipt.
- Snijd het bloedvat zorgvuldig met een micro-schaar aan de ene kant. Niet doorsnijden het schip volledig.
Opmerking: Het schip is ongeveer 1 mm dik. Niet knippen meer dan de helft van het schip om te voorkomen dat snijden door middel van het schip volledig, als het de strip glijden kan en geen bloed collectie mogelijk is. - Het verzamelen van de lekkende bloed op de pH-strip met behulp van een precisiepipet. Tien microliters van bloed zijn vereist om te bepalen met behulp van de bloedglucosemeter van de niveaus van de bloedglucose.
6. statistische evaluatie
- Berekent de gemiddelde waarde van ten minste 10 individuele eieren per tijdstip en normaliseren deze waarden naar één van de controle eieren (niet - of buffer-behandelde).
- Vervolgens bepaalt het percentage van de daling. Daarnaast gebruiken insuline als positieve controle.
Let op: Herhaal elk experiment ten minste driemaal.
Representative Results
Beschrijving van de Gluc-HET aanpak:
Na incubatie met de stoffen van belang, zijn de bevruchte eieren geopend en bloedinzameling voorbereid door verwijdering van de "eggshell" (Figuur 2). Verdere voorbereiding omvat evenwichtsinstelling en verwijdering van de eierschaal membraan toegang te krijgen tot het chorion membraan. Dit membraan is vervolgens zorgvuldig gesneden te bieden toegang tot een geschikt bloedvat voor bloedinzameling. Bij voorkeur, het grote schip, van oorsprong uit de buik van het embryo wordt geplaatst op een kunststof pH-strip. Om te voorkomen dat de verdunning van het bloed tijdens collectie, is het schip en een pH-strip klopte droog met filtreerpapier. Het bloedvat wordt vervolgens gesneden en bloed lekt op de pH-strip is verzameld voor analyse met behulp van een pipet.
Effecten van geselecteerde kruidenextracten op niveaus van de glucose van het bloed:
Met een onlangs opgerichte GLUT4-translocatie kwantificatie gebaseerde primaire scherm zijn we kunnen identificeren van stoffen met een insuline-mimetische karakteristiek10. Screening van honderden wateroplosbare kruidenextracten resulteerde in de identificatie van verschillende hits. Deze uittreksels werden getest in ons in -ovo model. Extracten, bereid uit Combretum indicum (Rangoon creeper) en een niet-vermeld extract (zogenaamde extract 0845) werden gebruikt voor deze experimenten. Wij ontbonden de extracten in HBSS buffer bij 300 mg/L, een concentratie die bleek te zijn passende in eerdere studies12,13. Stoffen werden toegepast op de embryo's gedurende 11 dagen geïncubeerd. Zoals aangegeven in Figuur 3, het extract van Rangoon klimplant niet leiden tot een aanzienlijke bloed glucose vermindering in-ovo. Echter, de concentratie van bloed glucose werd met succes verminderd met extract 0845, met een lichte daling na 60 min, die vergelijkbaar is met het effect waargenomen met behulp van een analoge verkrijgbare insuline. Een aanzienlijk effect werd waargenomen wanneer de incubatie van de eieren werd verlengd.
Figuur 1: invloed van toxische verbindingen op embryo vitaliteit. Eieren werden geïncubeerd voor 11 dagen (A en C) of behandeld met een giftige kruiden extract op dag 10 voor een andere 24 h (B en D). Toepassing van het extract geleid tot ernstige letsels van bloedvaten in het chorion membraan (D) en het embryo (B).
Figuur 2: Beschrijving van het model in-ovo . Van links naar rechts: Opening en verwijdering van de "eggshell" (1 - 2); evenwichtsinstelling en verwijdering van de eierschaal membraan met chorion membraan blootgesteld (3); bereid vaartuig op een pH-strip (4); de inzameling van bloed en meting van de concentratie van de glucose met behulp van een glucose meter (5). Aangepast van Haselgruebler et al.., 201712. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Effect van kruidenextracten op de bloedsuikerspiegel in vergelijking met onbehandelde of insuline behandelde eieren. Eieren werden geïncubeerd voor 11 dagen en behandeld met de aangegeven stoffen (verkrijgbare insuline analoge: 3.3 U/mL; uittreksels: 300 mg/L) opgelost in HBSS buffer (300 µL volume) voor maximaal 3 h. bloed glucoseniveaus waren bepaald met behulp van een bloedglucosemeter. Resultaten worden weergegeven zonder het effect van de buffer. Foutbalken zijn gebaseerd op de standaardfout van het gemiddelde. * P < 0,05 en *** P < 0,0001, aanzienlijke daling ten opzichte van HBSS behandelde eieren van de dezelfde incubatietijd. Aangepast van Haselgruebler et al.., 201712. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
De HET-CAM test is een veelgebruikte alternatieve test system voor dierproeven in de industrie-12. De hier beschreven in-ovo -systeem vertegenwoordigt een gewijzigde versie van de HET-CAM test. Terwijl in zijn oorspronkelijke vorm, HET-CAM experimenten worden uitgevoerd om te studeren de irriterende eigenschappen van verbindingen en formulering of de analyse van angiogenese14,15,16, hebben we de aanpak van de test aangepast verbindingen met vermeende insuline-mimetische kenmerken12. Volgens de richtlijn 2010/63/EU hoeft experimenten met niet-gearceerde aviaire embryo's tijdens de eerste twee-derde van embryonale ontwikkeling niet toestemming door een Comité ethiek aangezien deze experimenten niet beschouwd worden als op dierproeven. Recente studies hebben bewezen de geschiktheid van het systeem in-ovo te karakteriseren van de werkzaamheid van geselecteerde kruidenextracten, die zijn vastgesteld in een GLUT4 translocatie-gebaseerde primaire scherm10, om de niveaus van de glucose van het bloed in de gebrek aan insuline12,13. Kritische punten voor een goede prestatie van het systeem in-ovo omvatten: ten eerste, een betrouwbare Fokker leveren de bevruchte eieren. De klassieke bruine kip Lohmann is een goede keuze van het RAS. Ten tweede, de uitvoeringvan toxiciteit test uit te sluiten van de toxische effecten van de onderzochte samengestelde moet worden gedaan. Bovendien, is de voorbereiding van een geschikt bloedvat voor bloedinzameling belangrijk. Het is belangrijk om te voorkomen dat het snijden van grote schepen in het chorion membraan zelf, omdat dit tot een niet-voorkeur verlies van bloed leiden kan. Bovendien, voordat het vaartuig wordt gekort op de pH-strip, moet worden klopte droog filterpapier gebruiken om te voorkomen dat de verdunning van het verzamelde bloed. Tot slot, een voldoende aantal experimenten lijkt te zijn belangrijk. Het is raadzaam om met behulp van ten minste 10 eieren voor elk punt van tijd, en een drievoudige herhaling van de respectieve experiment.
Natuurlijk, er zijn enkele beperkingen van deze in-ovo -aanpak. Aangezien het duurt tot 30 minuten totdat de stoffen opgevangen door de eierschaal membraan zijn en in nauw contact met het chorion membraan komen, is het niet mogelijk te kwantificeren van een snelle respons van het embryo naar de toegepaste compound. Bovendien kunnen sommige verbindingen zijn giftig in de toegepaste concentratie, wat vaak in laesies van de bloedvaten in het membraan van het chorion resulteert. Dus, lijkt het redelijk cytotoxiciteit testen op basis van langdurige incubatie van de verbindingen voor ongeveer 24 uur. Tot slot, we vonden dat de buffersysteem dat gebruikt wordt voor de toepassing van de verbindingen een significant effect op de prestaties van de test heeft. 12 momenteel HBSS buffer wordt gebruikt omdat het resulteert in het kleinste effect op de niveaus van de glucose van het bloed van het embryo.
Voor toekomstige toepassingen, kunnen extra buffer systemen als alternatief voor de HBSS getest worden. Bovendien zou de invloed van kruidenextracten op extra bloedparameters zoals cholesterol, triglyceriden of lipoproteins een aantrekkelijke vraag.
Onze nieuwe in-ovo -systeem is een veelbelovende en belangrijke tool voor het testen van stoffen met insuline-mimetische kenmerken in een levend organisme zonder de noodzaak van een dierlijke experiment. Dus vult het het gat tussen de benaderingen van in vitro en in vivo . In vergelijking met de bestaande in-ovo model systemen17 is er niet nodig voor het opwekken van diabetes met streptozotocin (STZ) behandeling, zoals we gebruik van embryo's op dag 10 of 11 van incubatie. In dit stadium insulineproductie is niet begonnen, maar de embryo's zijn al insuline gevoelig. Toestemming van een ethisch comité worden bovendien gevraagd als embryo's leeftijd 14-17 dagen gebruikte17. Bovendien is vergeleken met alternatieve strategieën18, de samengestelde toepassing zoals hier beschreven minder schadelijk en moeizaam, verhoging van experimentele via-put tarieven.
Samen genomen, deze in-ovo is aanpak een aantrekkelijke systeem als een bloed-minderen effect van een insuline-mimetische stof moet worden getest in een levend organisme.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door het Oostenrijkse Research Promotion Agency (FFG; projectnummer 850681), het initiatief van de Universiteit voor toegepaste wetenschappen Opper Oostenrijk Basic financiering (project GlucoSTAR) en het centrum voor technologische innovatie in de geneeskunde (TIMed Center) ontvangt dat fundamentele financiering door de provincie van Opper-Oostenrijk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Biochrom | L1825 | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Thermo Scientific | SH30268.02 | |
| NovoRapid | Novo Nordisk | 8-0905-82-304-6 | |
| Hens eggs (Lohmann classic brown chicken) | Local Breeder | ||
| Accu-check performa | Roche | 6454011 | |
| Accu-check Inform II Teststreifen | Roche | 5942861 | |
| Incubator HEKA- Turbo 288 | HEKA Brutgeräte | ||
| Syringe Omnican F 1 mL | Braun | 09161502S | |
| Extracts | PEKISH extract library | ||
| Lamp Tempo Nr. 119 | ORBAN |
References
- Defronzo, R. A. Banting Lecture. From the triumvirate to the ominous octet: a new paradigm for the treatment of type 2 diabetes mellitus. Diabetes. 58 (4), 773-795 (2009).
- American_Diabetes_Association. Diagnosis and classification of diabetes mellitus. Diabetes Care. 37, S81-S90 (2014).
- Han Cho, N., et al. IDF Diabetes Atlas. Cavan, D. 7, International Diabetes Federation. (2015).
- Bailey, C. J., et al. Individualized glycaemic targets and pharmacotherapy in type 2 diabetes. Diabetes & vascular disease research. 10 (5), 397-409 (2013).
- Maruthur, N. M., et al. Diabetes Medications as Monotherapy or Metformin-Based Combination Therapy for Type 2 Diabetes: A Systematic Review and Meta-analysis. Annals of internal medicine. 164 (11), 740-751 (2016).
- Aleman-Gonzalez-Duhart, D., Tamay-Cach, F., Alvarez-Almazan, S., Mendieta-Wejebe, J. E. Current Advances in the Biochemical and Physiological Aspects of the Treatment of Type 2 Diabetes Mellitus with Thiazolidinediones. PPAR research. , 7614270 (2016).
- Cohen, F. J., Neslusan, C. A., Conklin, J. E., Song, X. Recent antihyperglycemic prescribing trends for US privately insured patients with type 2 diabetes. Diabetes care. 26 (6), 1847-1851 (2003).
- Desai, N. R., et al. Patterns of medication initiation in newly diagnosed diabetes mellitus: quality and cost implications. The American journal of medicine. 125 (3), e301-e307 (2012).
- Martel, J., et al. Anti-obesogenic and antidiabetic effects of plants and mushrooms. Nature reviews. Endocrinology. , (2016).
- Lanzerstorfer, P., et al. Identification of novel insulin mimetic drugs by quantitative total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. British journal of pharmacology. 171 (23), 5237-5251 (2014).
- Onur, S., Stöckmann, H., Zenthoefer, M., Piker, L., Döring, F. The Plant Extract Collection Kiel in Schleswig-Holstein (PECKISH) Is an Open Access Screening Library. Journal of Food Research. 2 (4), (2013).
- Haselgrubler, R., et al. Gluc-HET, a complementary chick embryo model for the characterization of antidiabetic compounds. PloS one. 12 (8), e0182788 (2017).
- Stadlbauer, V., et al. Biomolecular Characterization of Putative Antidiabetic Herbal Extracts. PloS one. 11 (1), e0148109 (2016).
- Greywe, D., et al. Applicability and robustness of the hen's egg test for analysis of micronucleus induction (HET-MN): results from an inter-laboratory trial. Mutation research. 747 (1), 118-134 (2012).
- Manakova, E., Hubickova, L., Kostalova, J., Zemanova, Z. Embryotoxicity of mirtazapine: a study using Chick Embryotoxicity Screening Test. Neuro endocrinology letters. 31, Suppl 2. 8-10 (2010).
- Ribatti, D. Chick embryo chorioallantoic membrane as a useful tool to study angiogenesis. International review of cell and molecular biology. 270, 181-224 (2008).
- Yoshiyama, Y., Sugiyama, T., Kanke, M. Experimental diabetes model in chick embryos treated with streptozotocin. Biological & pharmaceutical bulletin. 28 (10), 1986-1988 (2005).
- Wolf, T., Niehaus-Rolf, C., Luepke, N. P. Some new methodological aspects of the hen's egg test for micronucleus induction (HET-MN). Mutation research. 514 (1-2), 59-76 (2002).
