Summary
I denna studie beskriver vi ett i-ovo system som ett lovande verktyg för att testa insulin-liknande föreningar i en levande organism. De främsta fördelarna inkluderar tillräcklig genomströmning priser och godtagbara kostnader, som möjliggör identifiering av fytokemikalier med insulin-liknande egenskaper.
Abstract
Förhöjda blodsockernivåer i typ 2-diabetes mellitus (T2DM), en komplex och multifaktoriell metabolisk sjukdom, orsakas av insulin resistens och β-cellen misslyckande. Olika strategier, inklusive injektion av insulin eller användning av insulin-allergiframkallande läkemedel, förföldes att behandla T2DM eller åtminstone minska symptomen. Dessutom har tillämpningen av växtbaserade föreningar rönt allt större uppmärksamhet. Således är det nödvändigt att hitta effektiva testsystem till identifiera och karaktärisera insulin-liknande föreningar. Här utvecklade vi en modifierad chick embryo modell, som möjliggör provning av syntetiska föreningar och örtextrakt med insulin-liknande egenskaper. Använda en fluorescence mikroskopi-baserade primära skärm, som kvantifierar på flyttning av glukostransportör 4 (Glut4) till plasmamembranet, har vi kunnat identifiera föreningar, främst örtextrakt, som leder till en ökning av intracellulära glukos koncentrationer i adipocyter. Effekten av dessa ämnen kräver dock ytterligare verifiering i en levande organism. Således, vi använde i-ovo tillvägagångssätt för att identifiera deras blod glukos-reducerande egenskaper. Godkännande av en etikkommitté behövs inte eftersom användningen av kyckling embryon under de första två tredjedelarna av embryonal utveckling inte anses ett djurförsök. Här, beskrivs tillämpningen av denna modell i detalj.
Introduction
Diabetes är en ämnesomsättningssjukdom som kännetecknas av hyperglykemi och orsakas av defekter i insulinutsöndringen eller insulin åtgärd1. Nittio procent av all diabetes är kategori typ 2-diabetes mellitus (T2DM), där individer visar insulinresistens och mestadels insulin brist2. Flera faktorer är kända för att öka den globala förekomsten av T2DM, inklusive förändringar i livsstil, särskilt de som rör Övernäring, åldrande och fysisk inaktivitet. Ungefär 400 miljoner människor har diabetes mellitus i hela världen enligt International Diabetes Federation (IDF). Detta nummer förväntas nå 600 miljoner inom de nästa 20 år3.
Diabetiska komplikationer orsakade av hyperglykemi och insulinresistens, såsom hypertoni, dyslipidemi, glukosintolerans, koronar hjärtsjukdom och cerebral vaskulär sjukdom, leda till en kraftigt minskad förväntad livslängd och kvalitet4. Drabbade individer kräver glukossänkande läkemedelsbehandling; användningen av läkemedel, såsom metformin5 är dock ofta associerade med dramatiska biverkningar6,7,8. Därför ytterligare är antidiabetiska metoder som är säkra, allmänt tillgängliga och billiga nödvändiga.
Olika växtbaserade föreningar, extrakt, växter och nutraceuticals har tillskrivits funktionen insulin-liknande egenskaper genom att modulera olika cellulära funktioner. Ett viktigt inslag är stimulering av på flyttning av glukostransportör 4 (GLUT4) till plasmamembranet från intracellulära förvaringsutrymmen, vilket resulterar i ett ökat upptag av glukos i muskler och fettvävnad i avsaknad av insulin, känd som insulin-liknande egenskaper9. Tidigare har genomfört vi en fluorescence mikroskopi-baserade metod för att kvantifiera translokation processen GLUT410. Analys av många växtextrakt från ett extrakt bibliotek11 använda denna analys ledde till identifiering av lovande kandidater. Det krävs dock ytterligare tester i levande organismer. Metoden beskrivs i detalj i detta papper, en modifierad chick embryo modell, har visat sig vara en lovande modell för att identifiera ämnen med insulin-liknande egenskaper. Det representerar ett attraktivt verktyg som fyller den stora klyftan mellan in vitro- och in vivo - studier och erbjuder flera fördelar jämfört med befintliga system som godtagbara kostnader, enkel hantering och tillräcklig genomströmning priser. Dessutom krävs inte tillstånd av en etisk kommitté.
Protocol
Enligt de direktiv 2010/63/EU behöver experiment med icke-hatched aviär embryon under de första två tredjedelarna av embryonal utveckling inte tillstånd av en etisk kommitté.
1. förvaring och avel av äggen
- Få befruktade hönsägg (Tabell av material) från lokala uppfödare.
Obs: Ägg kan förvaras vid 14 ° C i en fuktad atmosfär för upp till 10 dagar efter värpdagen före användning för experiment. - Ruva äggen vid 38 ° C med en genomsnittlig fuktighet på 40-60% för 10 eller 11 dagar i en inkubator som vänder ständigt äggen.
2. Val av äggen
- Kolla äggen för gödsling efter inkubation av upp till 11 dagar. Använda en Öronljus ljus för detta steg. Doppa i utkanten av Öronljus lampan i en stämpeldynan och ljus den spetsiga sidan av ägget.
- För att identifiera blåsan, kontrollera för skillnader i ljusstyrka på toppen av ägget.
Obs: Blåsan visas som en runda, mer transparent region, medan äggvita är mörkare när ägget är candled. - Efter upptäckt av blåsan, markera platsen genom att trycka på lampan något mot ägget med tidigare tillämpade bläck.
- Utesluta icke-befruktade ägg vid detta steg, som inte uppvisar en skillnad i ljusstyrka mellan äggvita och blåsan.
3. injektion av ämnen
- Förbereda ämnet av intresse (t.ex., örtextrakt eller insulin) genom att späda ut ämnet i önskad koncentration i Hanks balanserad saltlösning (HBSS) buffert. Till exempel 3.3 U/mL ett kommersiellt tillgängliga insulin analog i HBSS.
- För tillämpningen av den valda föreningen, noggrant picka äggskalet med en spetsig pincett i det markerade området av blåsan. Utgör inte ett hål större än diametern på nålen på sprutan. Injicera buffertlösningen (300 µL) som innehåller ämnet av intresse i området pecked via en spruta.
Obs: Använd steril, 1 ml engångsbruk sprutor, pipettspetsar och fartyg. Använd skyddshandskar och en labbrock för experiment. - För att avgöra den blod glukos-sänkande effekten av ett ämne, placera äggen tillbaka i inkubatorn för 60, 120 och 180 min, respektive. För att avgöra basal blodsockernivå, innehålla minst 10-15 icke behandlat kontroll ägg.
4. toxicitetstester
- Efter tillämpning av den valda föreningen för 24 h, temperera äggskal membranet med buffrad saltlösning (PBS) fosfatbuffert (tillräckligt för att täcka hela äggskal membranet) i minst 30 s.
- Ta bort överflödigt PBS-bufferten genom att hälla det bort.
- Dra av äggskal membranet noga med en spetsig pincett.
- Kontrollera blodkärl för lesioner och bekräfta vitalitet (t.ex., rörelse) av chick embryot.
Obs: Se figur 1 för jämförelse av vitala kontra icke-vitala embryon efter applicering av en giftig örtextrakt.
5. mätning av glukosvärdet
- Den respektive tidpunkt, försiktigt bort äggskalet ovanför blåsan och temperera äggskal membranet med PBS-bufferten (tillräckligt för att täcka hela äggskal membranet).
- Ta bort överflödigt PBS-bufferten genom att hälla det bort.
- Dra försiktigt bort äggskal membranet med en spetsig pincett.
- Skär och ta bort chorioallantoic membranet med en mikro-sax, att möjliggöra bra tillgång till lämpliga blodkärl. Skär membranet minst 2-3 cm. Skär inte några stora fartyg i membranet själv att undvika oönskade blodförlust av embryot.
- Hitta de stora fartyg med ursprung från buken av embryot. Lyft detta fartyg ur äggvita med en sluten mikro-sax och placera den på en plast pH-remsa. Flytta den pH-remsan under fartyget, som hålls med den mikro-sax, och dra tillbaka de mikro-scissor bort noggrant.
- Ta bort 1-2 mL av vätskan under chorioallantoic membranet med en pipett för att undvika utspädning av blodet i nästa steg. Torka fartyget samt pH-remsa med filterpapper, innan fartyget skärs.
- Skär blodkärlen noggrant med en mikro-sax på ena sidan. Skär inte genom kärlet helt.
Obs: Fartyget är ca 1 mm tjock. Skär inte mer än hälften av fartyget att undvika skärning genom kärlet helt, som det kan glida bort remsan och ingen blodinsamling är möjligt. - Samla det läckande blodet på pH-strip med pipett. Tio mikroliter blod är skyldiga att fastställa glukosnivåer med hjälp av en blodsockermätare.
6. statistisk utvärdering
- Beräkna medelvärdet av minst 10 enskilda ägg per tidpunkt och normalisera dessa värden till en av kontroll äggen (ej eller buffert-behandlade ägg).
- Därefter bestämma procentandelen av minskningen. Dessutom använda insulin som positiv kontroll.
Anm: Upprepa varje experiment minst tre gånger.
Representative Results
Beskrivning av metoden ansamlas-HET:
Efter inkubation med ämnen av intresse, de befruktade äggen öppnas och förberett för blodinsamling av avlägsnande av äggskalet (figur 2). Ytterligare förberedelser inbegriper Jämviktstiden och borttagning av äggskal membranet att få tillgång till det chorioallantoic membranet. Detta membran klipps sedan noggrant för att ge tillgång till en lämplig blodkärl för blodinsamling. Helst, stora fartyget med ursprung från buken av embryot placeras på en plast pH-remsa. För att undvika utspädning av blodet under samling, är fartyget samt pH-remsor klappade torrt med filterpapper. Blodkärl är klipp och blod läcker på pH-remsan samlas in för analys med hjälp av en pipett.
Effekter av utvalda örtextrakt på blodsockernivåer:
Med en nyligen etablerade GLUT4-translokation kvantitering-baserade primära skärm kan vi identifiera ämnen med en insulin-liknande karakteristiska10. Screening av hundratals vattenlösliga örtextrakt resulterade i identifiering av flera träffar. Dessa utdrag prövades i vår in -ovo modell. För dessa experiment användes extrakt beredd från Combretum indicum (Rangoon creeper) och en icke-avslöjas extrakt (kallas extrakt 0845). Vi upplöst extrakten i HBSS buffert vid 300 mg/L, en koncentration som visade sig vara lämpliga i tidigare studier12,13. Ämnen tillämpades på de embryon som inkuberas i 11 dagar. Som anges i figur 3, resulterade extrakt från Rangoon creeper inte i en betydande blod glukos minskning i-ovo. Dock reducerades blodglukoskoncentration framgångsrikt med extrakt 0845, med en mindre minskning efter 60 min, vilket är jämförbart med att effekten som observerats med hjälp av ett kommersiellt tillgängliga insulin analog. En signifikant effekt observerades när inkubationstiden äggen förlängdes.
Figur 1: påverkan av giftiga föreningar på embryo vitalitet. Ägg var inkuberas i 11 dagar (A och C) eller behandlats med ett giftigt örtextrakt dag 10 för en annan 24 h (B och D). Tillämpningen av extraktet lett till allvarliga skador i blodkärlen i det chorioallantoic membranet (D) och embryot (B).
Figur 2: Beskrivning av modellen, i-ovo . Från vänster till höger: öppning och borttagning av äggskalet (1 - 2); Jämviktstiden och borttagning av äggskal membranet med chorioallantoic membran utsatt (3). förberedda fartyget på en pH-remsa (4); insamling av blod och mätning av glukos koncentration använder en glukos mätare (5). Anpassad från Haselgruebler et al., 201712. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: effekt av örtextrakt på blodsockernivåerna jämfört med obehandlade eller behandlade med insulin ägg. Ägg inkuberas i 11 dagar och behandlas med de angivna ämnena (kommersiellt tillgängliga insulin analog: 3.3 U/mL; extrakt: 300 mg/L) upplöst i HBSS buffert (300 µL volym) för upp till 3 h. blod glucose nivån bestämdes med hjälp av en blodsockermätare. Resultaten redovisas utan effekten av bufferten. Felstaplar baseras på standardavvikelsen för medelvärdet. * P < 0,05 och *** P < 0,0001, betydande minskning när det gäller HBSS-behandlade ägg av samma inkubationstiden. Anpassad från Haselgruebler et al., 201712. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
HET-CAM analysen är en allmänt Använd alternativa testsystem till djurförsök i branschen12. I-ovo systemet beskrivs här representerar en modifierad version av HET-CAM analysen. Medan i dess ursprungliga form, HET-CAM experiment utförs för att studera irriterande egenskaper föreningar och formulering eller analys av angiogenes14,15,16, vi har anpassat metoden att testa föreningar med förmodad insulin-liknande egenskaper12. Enligt de direktiv 2010/63/EU behöver experiment med icke-hatched aviär embryon under de första två tredjedelarna av embryonal utveckling inte tillstånd av en etikkommitté eftersom dessa experiment inte anses djurförsök. Nyligen genomförda studier har visat lämplighet i-ovo systemet att karakterisera effekten av utvalda örtextrakt, som har identifierats i en GLUT4-flyttning-baserade primära skärmen10, för att minska blodsockernivåerna i den avsaknad av insulin12,13. Kritiska punkter för ett bra resultat av i-ovo systemet inkluderar: första, en pålitlig uppfödare att leverera de befruktade äggen. Den klassiska bruna Lohmann-kycklingen är ett bra val av ras. För det andra genomförandet av toxicitet tester för att utesluta toxiska effekter av undersökta förening behöver göras. Utarbetandet av en lämplig blodkärl för blodinsamling är dessutom viktigt. Det är viktigt att undvika skärning av stora fartyg i chorioallantoic membran själv, eftersom detta kan leda till en icke-föredra förlust av blod. Dessutom innan fartyget skärs på pH remsan, det måste vara klappade torrt med filterpapper för att förhindra utspädning av insamlade blodet. Slutligen, ett tillräckligt antal experiment tycks vara viktigt. Vi rekommenderar att du använder minst 10 ägg för varje tidpunkt och en trefaldig upprepning av respektive experimentet.
Naturligtvis finns det vissa begränsningar av arbetssättet i-ovo . Eftersom det tar upp till 30 minuter tills ämnen absorberas genom äggskal membranet och komma i nära kontakt med den chorioallantoic membranen, är det inte möjligt att kvantifiera en snabb reaktion av embryot till tillämpad föreningen. Dessutom kan vissa föreningar vara giftiga i tillämpad koncentrationen, vilket ofta resulterar i skador på blodkärlen i chorioallantoic membran. Således verkar det rimligt att cytotoxicitet testning baserat på långsiktiga inkubation av föreningar i ca 24 timmar. Slutligen fann vi att det buffertsystem som används för tillämpningen av föreningarna som har en betydande inverkan på prestanda för analysen. 12 för närvarande HBSS buffert används eftersom det resulterar i den minsta effekten på blodglukosnivån av embryot.
För framtida tillämpningar, extra buffertsystem som ett alternativ till HBSS kan testas. Påverkan av örtextrakt på ytterligare blod parametrar såsom kolesterol, triglycerider eller lipoproteiner kan dessutom vara en attraktiv fråga.
Våra nya i-ovo -system är ett lovande och viktiga verktyg för att testa ämnen med insulin-liknande egenskaper i en levande organism utan behov av ett djurförsök. Därför, det fyller gapet mellan in vitro- och in vivo - metoder. I jämförelse med befintliga i-ovo modell system17 finns det inget behov att inducera diabetes av streptozotocin (STZ) behandling, som vi använder embryon på dag 10 eller 11 inkubation. I detta skede insulinproduktion inte har startat, men embryona är redan insulin känsliga. Tillstånd av en etikkommitté kan dessutom krävas om embryon i åldern 14-17 dagar är begagnad17. Jämfört med alternativa strategier18, är sammansatta programmet som beskrivs här dessutom mindre skadliga och mödosam, ökande experimentellt genom-sätta priser.
Sammantaget denna i-ovo är strategi ett attraktivt system om en blod-minskande effekt av en insulin-liknande substans måste testas i en levande organism.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av den österrikiska forskning Promotion Agency (FFG, projektnummer 850681), University of Applied Sciences övre Österrike grundläggande finansiering initiativ (projektet GlucoSTAR) och centrum för teknisk Innovation inom medicin (TIMed Center) som får grundläggande finansiering av att provinsen övre Österrike.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Biochrom | L1825 | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Thermo Scientific | SH30268.02 | |
| NovoRapid | Novo Nordisk | 8-0905-82-304-6 | |
| Hens eggs (Lohmann classic brown chicken) | Local Breeder | ||
| Accu-check performa | Roche | 6454011 | |
| Accu-check Inform II Teststreifen | Roche | 5942861 | |
| Incubator HEKA- Turbo 288 | HEKA Brutgeräte | ||
| Syringe Omnican F 1 mL | Braun | 09161502S | |
| Extracts | PEKISH extract library | ||
| Lamp Tempo Nr. 119 | ORBAN |
References
- Defronzo, R. A. Banting Lecture. From the triumvirate to the ominous octet: a new paradigm for the treatment of type 2 diabetes mellitus. Diabetes. 58 (4), 773-795 (2009).
- American_Diabetes_Association. Diagnosis and classification of diabetes mellitus. Diabetes Care. 37, S81-S90 (2014).
- Han Cho, N., et al. IDF Diabetes Atlas. Cavan, D. 7, International Diabetes Federation. (2015).
- Bailey, C. J., et al. Individualized glycaemic targets and pharmacotherapy in type 2 diabetes. Diabetes & vascular disease research. 10 (5), 397-409 (2013).
- Maruthur, N. M., et al. Diabetes Medications as Monotherapy or Metformin-Based Combination Therapy for Type 2 Diabetes: A Systematic Review and Meta-analysis. Annals of internal medicine. 164 (11), 740-751 (2016).
- Aleman-Gonzalez-Duhart, D., Tamay-Cach, F., Alvarez-Almazan, S., Mendieta-Wejebe, J. E. Current Advances in the Biochemical and Physiological Aspects of the Treatment of Type 2 Diabetes Mellitus with Thiazolidinediones. PPAR research. , 7614270 (2016).
- Cohen, F. J., Neslusan, C. A., Conklin, J. E., Song, X. Recent antihyperglycemic prescribing trends for US privately insured patients with type 2 diabetes. Diabetes care. 26 (6), 1847-1851 (2003).
- Desai, N. R., et al. Patterns of medication initiation in newly diagnosed diabetes mellitus: quality and cost implications. The American journal of medicine. 125 (3), e301-e307 (2012).
- Martel, J., et al. Anti-obesogenic and antidiabetic effects of plants and mushrooms. Nature reviews. Endocrinology. , (2016).
- Lanzerstorfer, P., et al. Identification of novel insulin mimetic drugs by quantitative total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. British journal of pharmacology. 171 (23), 5237-5251 (2014).
- Onur, S., Stöckmann, H., Zenthoefer, M., Piker, L., Döring, F. The Plant Extract Collection Kiel in Schleswig-Holstein (PECKISH) Is an Open Access Screening Library. Journal of Food Research. 2 (4), (2013).
- Haselgrubler, R., et al. Gluc-HET, a complementary chick embryo model for the characterization of antidiabetic compounds. PloS one. 12 (8), e0182788 (2017).
- Stadlbauer, V., et al. Biomolecular Characterization of Putative Antidiabetic Herbal Extracts. PloS one. 11 (1), e0148109 (2016).
- Greywe, D., et al. Applicability and robustness of the hen's egg test for analysis of micronucleus induction (HET-MN): results from an inter-laboratory trial. Mutation research. 747 (1), 118-134 (2012).
- Manakova, E., Hubickova, L., Kostalova, J., Zemanova, Z. Embryotoxicity of mirtazapine: a study using Chick Embryotoxicity Screening Test. Neuro endocrinology letters. 31, Suppl 2. 8-10 (2010).
- Ribatti, D. Chick embryo chorioallantoic membrane as a useful tool to study angiogenesis. International review of cell and molecular biology. 270, 181-224 (2008).
- Yoshiyama, Y., Sugiyama, T., Kanke, M. Experimental diabetes model in chick embryos treated with streptozotocin. Biological & pharmaceutical bulletin. 28 (10), 1986-1988 (2005).
- Wolf, T., Niehaus-Rolf, C., Luepke, N. P. Some new methodological aspects of the hen's egg test for micronucleus induction (HET-MN). Mutation research. 514 (1-2), 59-76 (2002).
