Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Görüntüleme [11C] DPA-713 iskemik inme bir fare Model kullanma Neuroinflammation evde beslenen hayvan

Published: June 14, 2018 doi: 10.3791/57243
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Radiology, Stanford University, 2Department of Neurology and Neurological Sciences, Stanford University

Summary

Pozitron emisyon tomografisi (PET) görüntü yerleştirici protein 18 kDa (TSPO), beyin hastalıkları ilerleme ve Kalkınma neuroinflammation dinamik rolü görselleştirmek için non-invaziv bir araç sağlar. Bu iletişim kuralı bir iskemik inme fare modelinde neuroinflammation algılamaya TSPO-evde beslenen hayvan ve ex vivo autoradiography açıklar.

Abstract

Neuroinflammation iskemik inme sonrasında patolojik cascade için merkezi bir noktada bulunuyor. Non-invaziv moleküler görüntüleme yöntemleri zamansal dinamiği ve rol İnmede belirli neuroimmune etkileşimlerin önemli anlayışlar sağlamak potansiyeline sahip. Özellikle, ışınlama protein 18 kDa (TSPO), bir işaretleyici aktif microglia ve periferik lineage myeloid hücre, pozitron emisyon tomografisi (PET) görüntüleme algılamak ve neuroinflammation içinde vivoizlemek için bir yol sağlar. Burada, doğru bir şekilde neuroinflammation kullanarak ölçmek için bir yöntem mevcut [11C]N,N-Diethyl-2-[2-(4-methoxyphenyl)-5,7-dimethylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]acetamide ([11C] DPA-713), bir gelecek vaat eden ikinci nesil TSPO-evde beslenen hayvan radiotracer, sham çalışan fareler için karşılaştırıldığında distal orta serebral arter tıkanıklığı (dMCAO) içinde. MRI kontur onaylamak ve hacmi ve enfarktüsü konumunu tanımlamak için gerçekleştirilen 2 gün sonrası-dMCAO ameliyat oldu. Evde beslenen hayvan/Computed tomografi (CT) görüntüleme 6 gün post-dMCAO kontur takip TSPO düzeyleri en yüksek artış yakalamak için yapılmıştır. Evde beslenen hayvan görüntülerin Nefelometri [11C] alımını değerlendirmek için gerçekleştirilmiştir DPA-713 beyin ve dalak dMCAO ve sham farelerin merkezi ve periferik inflamasyon düzeylerini değerlendirmek için. Vivo [11C] DPA-713 beyin alımını ex vivo autoradiography kullanılarak doğrulandı.

Introduction

İnme ölüm beşinci önde gelen nedenidir ve önemli bir nedeni, Amerika Birleşik Devletleri1özürlü olduğunu. İskemik inme (Örneğin, bir kan pıhtısı veya yağlı mevduat) beyin kan akımında yerelleştirilmiş bozulma olduğunda meydana gelen büyük bir çoğunluğu bu gibi durumlarda (~ %87), temsil eder. Oksijen ve besin kaynakları etkilenen alanlara daha sonra azalır ve karmaşık bir patolojik çağlayan çevresinde yanı sıra inme çekirdek (enfarktüsü) uzaktan nöronal ölüm sonuçlanan başlatılır. Neuroinflammation her iki yerleşik beyin bağışıklık hücreleri (microglia) ile bu zarar için önde gelen yolu çok önemli bir bileşenidir ve periferik bağışıklık hücreleri (nötrofil, T hücreleri, B hücreleri ve monosit/makrofajlar) sızmak için katkıda düşünülen yıkıcı art arda2,3. Aktif microglia ve makrofajlar Merkezi raporları iskemik inme2takip yararlı ve zararlı etkileri ile bu neuroinflammatory yanıt için. Böylece, bu hücrelerin kontur takip vivo içinde katkısını değerlendirmek için zorunludur.

Vivo içinde belirli molekülleri radyonükleidler 11C, 13N, gibi yayan pozitron (β +) ile etiketli aracılığıyla biyolojik görselleştirme sağlar bir güçlü 3 boyutlu moleküler görüntüleme teknik işler evde beslenen hayvan olduğunu 15O ve 18F. O yaşam olduğu gibi konularda, gerçek zamanlı olarak moleküler bilgi edinme izin verir ve boyuna soruşturma için izin verir bu non-invaziv yöntem ex vivo Yöntemler (Örneğin, immünhistokimya) üzerinde pek çok avantajı vardır. TSPO, bir işaretleyici aktif microglia ve periferik lineage myeloid hücre, evde beslenen hayvan görüntü bünyesinde doğuştan gelen bağışıklık hücre yanıt-e doğru izlemek ve ölçmek için bir yol sağlar ve kontur ve yanıt-e doğru tedavi sonra iltihap değerlendirmek için kullanılması gereken müdahaleler. TSPO, eski periferik tipi benzodiazepin reseptör bilinen kolesterol taşıma ve nörosteroidler4sentezi bir rol oynamak için inanılır bir 18 kDa proteindir. Ayrıca, TSPO neuroinflammation ve nöronal hayatta kalma5,6, iltihap kontur7de dahil olmak üzere ilgili birçok nörolojik hastalıklarda artış ifade raporlarla ilgili kanıtlar gösteriyor, demans8, Parkinson hastalığı9 ve multipl skleroz10. TSPO dış mitokondrial membranlar üzerinde bulunur ve son derece çevre, özellikle steroid ilişkili dokuları (Örneğin, bezleri) ve ara düzeyleri kalp, böbrekler ve akciğerler10' seen ile ifade edilir. Ancak sağlıklı beyin ve TSPO seviyeleri düşük ve esas olarak glia6,11sınırlı vardır. Darbede, gözlemlenen gibi nöronal yaralanma üzerine merkezi sinir sistemi (MSS) TSPO düzeyleri önemli ölçüde artırır. TSPO gözlenen bu upregulation görüntü neuroinflammation içinde vivo için iltihap önem doğru bir gösterge sağlayan ifade düzeyleriyle yararlanılabilir. Bu nedenle, bu yöntemin doğru bir şekilde neuroinflammation TSPO-Pet kullanarak iskemik inme, bir fare modelivivo içinde katkısını ölçmek için hedeftir

Birden çok TSPO izleyicileri geliştirilen neuroinflammation evde beslenen hayvan görüntüleme için. Burada, TSPO-evde beslenen hayvan görüntüleme [11C] DPA-71312, kullanılarak açıklanmıştır bir gelecek vaat eden ikinci nesil gelişmiş sinyal gürültü ve non-spesifik bağlama daha tarihsel olarak kullanılan [11C] daha düşük için göstermiştir TSPO izleyici PK11195 13 . Örneğin, bu yöntemi14için kontur dMCAO fare modeli seçildi. Bu model zamansal kranyotomi ve somatosensor korteksin odak iskemi sonucu distal orta serebral arter, kalıcı ligasyonu içerir. Bu önceden klinik kontur araştırma iskemik hasar ve bu modeli ile ilişkili düşük mortalite oranları yüksek tekrarlanabilirlik nedeniyle avantajlıdır. Bugüne kadar TSPO-evde beslenen hayvan görüntüleme çalışmaları henüz dMCAO kemirgen modelinde bildirilmesi gerekir. Ancak, önceki evde beslenen hayvan görüntüleme çalışmaları, Orta serebral arter tıkanıklığı (MCAO) modelini kullanarak bir daha şiddetli ve değişken kontur modelinde, fare ve sıçanlar, bildirdin 3 gün ve 7 gün inme sonrası15çevresinde en yüksek artırmak için TSPO ifade, 16,17,18. Bu nedenle, 6 gün post-dMCAO görüntüleme PET yükseltilmiş TSPO ifade ile aynı tarihte gerçekleştirilen. [11C] DPA-713 alımını beyinde değerlendirildi içinde Ipsilateral (hazır) ve kontralateral hemisferlerin. TSPO-evde beslenen hayvan enfarktüsü kesin tarif ve ilgi (ROIs) kontralateral bölgeler için izin yapısal MRG ile kombine edildi. Burada bir atlas tabanlı ve [11C] DPA-713 alımını hesaplamak için bir MRI tahrik ROI yaklaşım açıklar. Dalak radiotracer Anlamazdın aynı zamanda iltihabı gruplar arasında çevresel düzeyde araştırmak için değerlendirildi. Bu yöntem kronolojik zamanmekansal dinamikleri ve rol kontur ve diğer nörolojik hastalıkların belirli neuroimmune etkileşimlerin önemli anlayışlar sağlamak potansiyeline sahiptir.

Protocol

Tüm hayvan çalışmaları İdari Panel üzerinde Laboratuvar hayvan bakım (APLAC), Stanford Üniversitesi, değerlendirme ve akreditasyon laboratuvar hayvan bakım Derneği tarafından akredite edilmiş bir program uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Daha önce bu yordamı, üç aylık C57BL/6 dişi fareler standart prosedür ve steril koşullar14aşağıdaki dMCAO ameliyat oldu.

1. yapısal MRI (2 gün sonrası-dMCAO cerrahisi)

  1. Açık çalışma bilgisayar yazılımı ( Tablo malzemelerigörmek) ve kurulum yeni bir sınav oluşturarak edinme. Localizer ve turborare T2 dizileri paleti Explorer'da seçin ve sınav penceresine sürükleyin.
  2. Solunum güvenli ve yumuşak bant kullanarak fare yatağa sonda ısı ve koruyucu emici steril bir ortam oluşturmak için her ikisi de üzerinde doldurma bir şerit yerleştirin.
  3. Bir hava ısıtıcı hayvan yatağa bağlamak ve böylece sıcak hava üzerinde fan açmak ve ısıtmalı fare tutmak. Vücut sıcaklığı ve solunum hızı Tarama süresi için uygun düzeyde korunur emin olmak için otomatik izleme sistemi kullanın.
  4. Fareyi kullanarak 3 Isoflurane başlangıçta, sonra korumak % 1-%2 (2 L/dak, %100 O2) bir indüksiyon odasında anestezi. Bir ısı yastık altında fare indüksiyon sırasında sıcak tutmak için indüksiyon odası açık olduğundan emin olun. Anestezi sonra göz yağ kurutma ve korneal ülser oluşumunu önlemek için fareyi uygulanır.
    1. MRI tarayıcıya bağlı anestezi sistemi (Isoflurane % 1-2, 2 L/dk % 100 O2) açın ve hayvan fare yatağa aktarın.
    2. Pozisyonda fare kafa eğilimli üstüne belgili tanımlık ısırık bar ve kulak barlar düzeltme yer, yatak çapı dışında çıkıntı değil emin olmak istedim.
    3. RF bobin fare başına slayt ve bobin ve yatak için özellikle isocenter yerleştirerek delik içine itin.
    4. Fare konumuna tüm 3 boyutlu görüntülemek ve T2 turborare için birim tanımlamak için bu görüntü kullanmak için localizer elde (TE: 33 ms, TR: 2.500 ms, 2 ortalamalar, 17 dilimleri, 0.083 x 0.92 mm çözünürlük, 2 dk 40 sn toplam süre) edinme. dMCAO ameliyat somatosensor korteks14bir enfarktüsü sonuçlarında; Bu nedenle, bu bölgede T2 ağırlıklı görüntüde kaplıdır emin olun.
    5. Fareler tarayıcıdan çıkarın ve ısıtmalı bir odası farelerde kurtarmak.

2. PET/BT Kalibrasyonlar ve iş akışı Kur (6 gün Post-dMCAO cerrahisi)

  1. Bir CT zayıflama edinme, 60 dakika C-11 dinamik evde beslenen hayvan edinme (350-650 keV düzey ayrımcılık, 3.438 ns tesadüf pencere), çubuk grafik eklemek için tarayıcı işletim yazılım içinde görüntüleme bir iş akışı oluşturun (20 kare: 5 x 15 sn, 4 x 1 dk, 11 x 5 dk ile; ölü düzeltme zaman) ve 3DOSEM-OP yeniden yapılanma (2 yinelemeler, 18 alt kümeleri) 128 x 128 x 159 oluşturmak için resim 0.776 x 0.776 x 0,96 mm Voksel boyutu ile.
  2. X-ışını kaynağı arabiriminin sol üst köşesinde yer alan CT kalibrasyon paneli yoluyla Klima gerçekleştirin. Eğer sistem son 48 saat içinde kullanılmamış olan bu kalibrasyon haftalık veya tarama önce yapılmalıdır.
  3. Karanlık/ışık (D/L) ve Merkez uzaklığı (c/o) Kalibrasyonlar gerçekleştirin.
    1. Basın CT kalibrasyon düğmesini (X) üst arabiriminin yaptı.
    2. D/L seçin ve c/o sen-ecek var olmak koşma CT dosya için yatağın makas köprüsü kaldırıp D/L kalibrasyon çalıştırın.
    3. Kalibrasyon Aracı yatak tarayıcıya yerleştirin ve "70 mm Palet" yerine "ayarlama aracı" seçilen arabirimde geçmek emin C/O kalibrasyon çalıştırın.
  4. Ayarlama aracı kaldırmak ve seçimi arabirim üzerinde 70 mm Palet geri"için" değiştirmek emin standart evde beslenen hayvan yatak dönün.
  5. 4-fare görüntüleme yatak bant kullanarak tarayıcı platformu üzerine güvenli ve anestezi boru (Şekil 1A) ekleyebilirsiniz. O isoflurane tüpler ve orada olan hiç kinks akıyor emin olun.
  6. İleri görüş alanı (FOV) ortasında CT kapıyı kapat ve yatağa doğru konumda olduğundan emin olmak için CT bir izci görünümünü elde etmek bu yüzden yatakta itin.
  7. C-11 çözüm radyasyon kaynağı olarak bilinen bir doz içeren bir şirket içinde imal edilmiş hayalet kullanarak PET/CT inceden inceye gözden geçirmek "standart" bir kalibrasyon gerçekleştirin.
    1. Bir fare (~ 250-350 µCi/9 - 13 MBq C-11 izleyici salin seyreltilmiş) için yönetilen eşdeğer izleyici doz ile dolu bir 20 mL şırınga hazırla.
    2. Bir doz Kalibratör kullanarak standart etkinliklerini kaydetmek ve ölçüm zaman unutmayın.
    3. Görüntü fareler için (yukarıda açıklandığı gibi) kullanılacaktır tam aynı parametreleri kullanarak standart bir PET/CT taraması gerçekleştirin. Evde beslenen hayvan tarayıcı görüntüleme verilere uygulamak için bir düzeltme faktörü oluşturmak için bu haftalık yapmak.

3. çalışma alanı Kur için PET/BT görüntüleme

  1. Virüsit ile bir dezenfektan steril bir ortam oluşturmak ( Tablo malzemelerigörmek) ve tüm yüzeylerde koruyucu emici doldurma yerleştirerek.
  2. İsoflurane ve oksijen tankları yeterince dolu olun.
  3. Kuyruk ven kateterler (27,5 G iğne ucu ile donatılmış) 1 mL şırınga % 0,9 sodyum klorür (steril serum fizyolojik) Dolum ve 27,5 G, 24 cm kelebek kateter kızarma hazırlayın. Kateterin kanatlarını kuyruk damar görünümünü engellemeyin sağlamak ve kateter yerinden olmadan tarayıcıya doğru fareyi hareket kolaylığı ile yardım için cannulating önce kesilmiş.
  4. Tüm gerekli ekipmanları (steril serum dolu) yedek "floş" şırınga da dahil olmak üzere iş istasyonunda düzenlendiği göz yağ, etanol temizleme bezi, ısı abajur, hazırlanan (serum önceden doldurulmuş) kateter, cerrahi bant, doku yapıştırıcı, 0.5 mL doz şırınga sağlamak, makas ve kuyruk ven (Şekil 1B) başarılı yerleşim sonra kateter imzalamaya bir çakmak.

4. hayvan hazırlık ve Cannulation

  1. Fareler her fare (Yani, izleyici hacmi ve serum fizyolojik herhangi bir yönetilen gerekir vücut ağırlığı yüzde 10'u aşamaz) enjekte edilir izin verilen maksimum ses belirlemek için tartmak.
  2. Fareler % 3 kullanarak bir indüksiyon odasında anestezi Isoflurane ve 1-%2 (2 L/dk %100 O2) korumak.
  3. Göz yağ her fare için geçerlidir ve anesthetization pedal refleks (ayak tutam) ile onaylayın. Anestezi düzeyleri ayarlayın.
  4. 1-%2 (2 L/dk %100 O2) isoflurane sunmak için bir burun konisi ile donatılmış bir ısıtmalı yatak üzerine fareyi getirin.
  5. Fare anestezi iken, kuyruk damar cannulation aşağıdaki iletişim kuralını kullanarak gerçekleştirin:
    1. Fare bir burun konisi baş kalır iken lateral damar ortaya çıkarmak için kendi tarafında yer.
    2. Ven dilate ve enjeksiyon yeri sterilize ısınmak veya kuyruk yakmak ve bir alkol silme ile DNA örneği için dikkatli olmak a ısı lamba kullanarak kuyruk sıcak.
    3. İğne eğimi ile tutun ve akut açılı ven ile hizalayın.
    4. Hafif deri ponksiyon ve ven paralel olarak bu yüzden iğne seviye basınç uygulayın.
    5. İğneyi damardan girer böylece yavaşça ileri eğimi geçmiş birkaç milimetre itin.
    6. Kateter küçük (10-20 µL) floş salin yönetmek olarak mevcuttur onaylamak. Serum şırınga sorunsuz terk etmeli ve damar temizlemelisiniz. Herhangi bir direnç veya arka baskı gözlem yapılırsa, kateter ven değildir ve cannulation yeniden denemeden tavsiye edilir olasıdır. Pıhtılaşma görülmektedir, heparin (mL serum fizyolojik başına 1000 adet heparin) cannulation kurulumu ve kızarma için kullanın.
      Not: Cannulation ve heparin içinde faiz fare suşu olmadan değerlendirildi var ve hiçbir pıhtılaşma gözlenmiştir beri serum yalnız cannulations için kullanıldı.
    7. Kateter kateter fareler tarayıcıya aktarırken hareketsiz kalmasını sağlamak için küçük bir damla doku yapıştırıcısı, cerrahi bant tarafından takip kullanarak kuyruk için güvenli.
    8. Floş şırınga kateter ucundan kaldır ve sonuna çakmağı ile kapatın, araştırmacı sağlanması herhangi bir isoflurane veya etanol yakınında değil.
    9. Taranacak tüm 4 fare cannulated ve hazırlanan 3 ek fareler için yineleyin.
  6. PET/BT ve dikkatli konum kateterler sağlanması tarayıcı yatakta yüzükoyun fareler yerinde kalması bağlı anestezi akışı (%2.5 Isoflurane, 2 L/dakika %100 O2) açın ve her fare kafa düz ve burun konisi içinde güvenli. Kafa teyp ve nefes sağlanması yumuşak cerrahi bant ile yatağa her fare gövdesini teybi yerleştirme tarafından sınırlı değildir. Doğru konumu ve görüntü analizi için Grup tahsis için izin vermek için her fare konumunu kaydeder.
  7. Yordam (fareler aşırı ısınma olmadan sıcak tutulur emin olmak için bir ısı lamba veya sıcak hava pompası sistemi kullanarakÖrneğin, ) boyunca ısıtmalı fareler tutun. Görsel olarak açık bir makas köprüsü kullanıyorsanız veya solunum pedleri kullanarak uzaktan izleme sistemi aracılığıyla tüm fareler, solunum hızı izlemek ve anestezi düzeyleri gerektiği şekilde değiştirebilirler.

5. CT satın alma

  1. Bir kez yatakta güvenli hayvanlardır ve solunum stabil, lazer çapraz kıllar ve tarama yatak ile tüm dört fareler beyin hizalanmalarını hareket açın. Tarayıcı yatak FOV mümkün olduğunca ortasına yakın farelerin beynini (pozisyon 3) edinme pozisyon için taşıyın.
  2. Bir izci görünümü resim konumlarını (kullanım 200 mm FOV) doğrulamak ve gerekirse arabirimde FOV kutusunu sürükleyerek konumunu ayarlamak için fare satın almak. "İş akışı Başlat" CT taraması, PET taraması el ile izleyici enjeksiyon önce başlamış olabilir bu yüzden "Etkileşimli kullanıcı istemleri göster" seçmek emin başlamak için tarayıcı yazılımı tıklatın.

6. [11C] DPA-713 doz hazırlık

  1. [11C] sentez DPA-713 daha önce açıklandığı gibi12, radyoaktivite, önlük, eldiven ve kişisel parmak ve vücut dosimeters gibi işlemek için uygun PPE (kişisel koruyucu donanım) giyiyorsun sağlanması. Düzenli olarak radyoaktif kirlenme önlemek için eldiven değiştirmek ve radyoaktif kaynak mümkün olduğunda uzak artış sağlamak.
  2. Forseps dikkatle radiotracer şişe bir kurşun kalkan arkasında aktarmak için kullanın.
  3. Yaklaşık 250-350 µCi/9-13 MBq bir doz 60 dakika dinamik PET taraması için yeterli emin olmak için 100-200 µL birimindeki içeren her fare 0.5 mL doz şırınga hazırlamak (yönetilen doz kararlı izotop ve zaman-içini kaplamak half-life dikkate alınarak çalışma tasarımına, birimin bağlı olarak fare ağırlık ile).
  4. Bir doz Kalibratör kullanarak etkinliğini C-11, cannulation sitesi, yakın bir mesafede yer alan ayarlayın ve ölçüm ve çürüme düzeltmeyi etkinleştirmek için enjeksiyon kez kayıt ölçü birimi. Sadece çürüme sınırlamak ve radyoaktivite istenen düzeyde sağlamak için CT biter her fare zerk edilecek önce kadar doz çizmek.
  5. Etkinlik ölçme ve her fare enjekte önce doz şırıngada hava hava kabarcığı yok bulunduğunu doğrulayın.

7. evde beslenen hayvan edinme

  1. Fareler otomatik olarak CT dan evde beslenen hayvan için ilerlemek. sonra arkadaki tarayıcının [11C] DPA-713 enjeksiyon (Şekil 1C) için ayarlayın. Koruyucu emici doldurma bir kenarında koyun ve yandan makas ve daha açık olduğundan emin olun.
  2. Mühürlü kateter boru makas ile makasla kesme, kateter satırları herhangi bir baloncuklar net ve kanül hala ven içinde 10-20 µL serum fizyolojik floş gerçekleştirerek onaylamak kontrol et. Ölçülen doz şırınga adım 6.4 her hangi doz her fare için verildi takip 4 kateterler içine yükleyin.
  3. PET taraması aynı anda 10 ikinci zamanlayıcıya başlatırken başlamak için hazır olduğunda "Tamam" düğmesini tıklatın. Doz şırınga ile tarayıcı arkasında iki araştırmacı elinde, tüm 4 fareler aynı anda sıfır ulaşan çekim üzerine enjekte etmek için var. Her sonda ile 50-100 µL serum sifonu (kateter boru uzunluğuna bağlı olarak — Yani, ölü cilt) tam doz girer kuyruk ven emin olun ve bir kez daha bir çakmak kullanarak boru yeniden mühürlemek için.
  4. Bir doz Kalibratör kalan radyoaktivite değer (herhangi bir izleyici şırınganın içinde) elde etmek için kullanarak doz şırınga ölçmek. Değerleri ve bunların kaydedilme zaman dikkat edin.
  5. Tarama tamamlandıktan sonra ev evde beslenen hayvan yatak hareket içinde yatay "ev" düğmesini kullanarak özgün konuma Denetim Masası. Fareler tarayıcıdan çıkarın ve kateter dikkatli bir şekilde çıkarın. Hafifçe basınç aşırı kanama önlemek için cannulation sitesine uygulanır.
  6. Daha önce açıklandığı gibi bir doz Kalibratör kullanarak kateter kalan etkinliğinde ölçmek.
  7. Böyle sıcak bir ortamda (Örneğin, bir kutusunda altında ısıtmalı bir yastık veya sıcak su ile dolu bir eldiven içeren) fareler olmak yeniden elde etmek istiyorsak sağlamak kurtarma kolaylaştırmak için. Fareler ötenazi planlama, fareler ötenazi perfüzyon ile önce anaesthetized olarak kaldıkları isoflurane içeren bir indüksiyon odasına koyun.
  8. Verileri yeniden oluşturmak için son işlem yazılımları yönetme açın ( Tablo malzemelerigörmek, hangi-otomatik olarak yeniden oluşturmak lst dosyasından oluşturulan çubuk grafik verileri kullanarak her tarama).

8. beyin Autoradiography

  1. Deney öncesinde dijital autoradiography film 10-15 dk için ışık beyaz ve radyoaktivite içermeyen bir alanda tutun kadar kullanmak için teşhir ederek silmek.
  2. 0.5 mL doz şırınga yaklaşık 1.0-1.5 MCI/37-56 autoradiography için yeterli bir doz emin olmak için MBq içeren her fare için hazır olun.
  3. Enjeksiyon aktivitesinin doğru okunması elde etmek için önce bir doz Kalibratör kullanarak doz şırınga radyoaktivite ölçmek.
  4. Daha önce açıklandığı gibi cannulate ve fareler radyoaktivite için uygun bir bir alanda hemen enjekte.
  5. Kateter enjeksiyon sonra kaldırmak ve kalan radyoaktivite ölçün.
  6. Onlar, perfüzyon ve ötenazi önce anaesthetized kadın fareler bir ısıtmalı indüksiyon odasında bırakın.
  7. Fareler derinden anaesthetized iken ötenazi gerçekleştirmek (% 4'lük sürekli inhalasyon Isoflurane, 2 L/dk %100 O2) PBS perfüzyon ve ikili torakotomi 30 dk sonrası [11C] DPA-713 enjeksiyon yoluyla.
    1. Karın boşluğu açın ve kalp ortaya çıkarmak için diyafram ile kesti.
    2. Bir kelebek kateter infüzyon iğne kalbin sol ventrikül yerleştirin ve sağ kulakçık ve inferior vena kava makasla kesme.
    3. PBS ile yavaş yavaş sıvı (~ 20-30 mL) 20 mL şırınga kullanarak.
  8. Dikkatli bir şekilde beyin kafatasından forseps ve makas kullanarak çıkarın.
  9. Yer dondurucu bir kalıp beyinde en uygun kesme sıcaklık ile (OCT) sıvı, çentik (bir kez beyin yerler ve yönlendirmesini sağlamak için kalıp doğru odaklı Olfaktör ampuller ile emin beyin düzeyidir ve kalıp içinde ortalanmış yapım dolu kalıp kaldırılır).
  10. Yer kalıp Kuru buz için 10-15 dk ya da OKT opak hale gelene kadar.
  11. Hemen her kalıp-18 ° c cryostat microtome kümesindeki yerleştirin ve montaj öncesinde 10 dk equilibrate.
  12. Peel Away dondurucu kalıp ve beyin, taze Ekim "yapıştırıcı" olarak küçük bir miktar kullanarak microtome platformu için mount.
  13. Bağlı beyin için 2 dk dondurmak için microtome içinde bırakın.
  14. Kontur yer maruz kalan (Yani, yatırım getirisi) kadar beyin ile dilim. Bay görüntü içinde her hayvan beyin enfarktüsü bulmak için kullanın. DMCAO için bu tutarlı bir şekilde somatosensor korteks olmalıdır; Ancak, kontur uzunluğu biraz farklı olabilir.
  15. Beyin enfarktüsü uygun fare numarasıyla etiketli cam mikroskop slaytlar 20 µm kalınlığında kesitler yerleştirerek, kapsayan bölge bölümünü.
  16. Autoradiography kaset açın ve kaset alt Saran Wrap bir levha ile satır. Düzenlemek slaytları tarafı yukarı üzerine streç kaset içinde bölüm ve her slayt konumunu not alın. İsteğe bağlı olarak, daha sonraki analizler ile yardımcı olmak için slayt yerleştirme bir resmini çek.
  17. Yavaşça streç bir katmanı (~ 2 son beyin bölümü - kuru ve slayt için uygun izin verilmesi topluluğu takip dk bekledikten sonra) üstüne yerleştirin ve dikkatlice slaytlar üzerine dijital autoradiography film (beyaz yüzü aşağı bakacak şekilde) koyun.
  18. Kaset sıkıca kapatın ve bölümleri bir yeterli pozlama süresi (~ 5-10 yarı-hayat) filmi çürümeye bırakmak bir-20 ° C dondurucuya bırak.
  19. Film daha sonraki analiz için dijital bir görüntü oluşturmak için bir fosfor Imager kullanarak çekim hızı sonra inceden inceye gözden geçirmek.

9. dinamik evde beslenen hayvan görüntü analizi

  1. Görüntü analiz yazılımı açın (bkz. Tablo reçetesi) ve (kaynak) olarak CT resim yüklemek için "veri açık" simgesini ve dinamik Evcil hayvan (başvuru) olarak yüklemek için "veri Ekle" simgesini tıklatın.
  2. Bir görsel kalite kontrol zaman serileri operatör üzerinden veri aþaðý açýlan menüde gerçekleştirmek: başvuru ("ref") ve "küresel" seçin ve uygun min ve max renk ölçeği için geçerlidir. Dinamik evde beslenen hayvan veri kare kare, radyoaktivite alımını doğrulama görselleştirin ve kontrol için herhangi bir hareket içinde tarama zihnimi karıştıran.
  3. "Aritmetik işleç" kullanarak ortalama evde beslenen hayvan görüntü oluşturun.
    1. "Ortalama seçili" seçin "ref" seçimini kaldırın ve giriş 1 ("Inp1"), giriş 2 ("Inp2") ve giriş star olun ("Inp *"-diğer evde beslenen hayvan kare içinde tarama içerir) an ortalama-in evde beslenen hayvan çerçeve oluşturmak için seçilir.
    2. (DM) "veri Yöneticisi" sekmesine gidin ve görselleştirme amaçlar için "input1" konuma kadar ortalama görüntüyü sürükleyin. Renk ölçeği yanında tıkırtı üstünde "min-max" aracı otomatik hesaplamaya yeniden dağıtın.
  4. CT "Otomatik 3D" işlev "yeniden orientation/kayıt" açılır menüsünü kullanarak ortalama evde beslenen hayvan dosyaya kaydedin.
    1. "Ref" ve "Inp1" seçin ve "katı", "hızlı", "Inp1 için Ref" kaydı seçin. Kayıt tüm 3 boyutlu görsel olarak kontrol edin ve gerekirse "el ile 3D" sekmesinde "Çeviri" ve "dönüş" işlevini kullanarak el ile ayarlayın.
    2. Ne zaman kayıt ile memnun, "Inp2" ve "Inp *" seçin ve tüm evde beslenen hayvan çerçeveleri için onay işaretini tıklatarak uygulayın. Doğru tıkırtı üstünde DM CT ve evde beslenen hayvan dosyalarında ve ham olarak kaydedin.
  5. CT bir kılavuz olarak kullanarak beyin analiz için bir defada tek bir fare beyni kırpma: "açılır menüsünden kırpma" seçin ve fare beyin aşağıda Başkanı kırpmak için görüntü sınırlarını sürükleyin. Böylece kafatası düz tüm boyutlarda yukarıda açıklandığı gibi "el ile 3D hale gelmesini" işlevini kullanarak evde beslenen hayvan ve CT görüntüleri yeniden yönlendirmek.
  6. Sol üstte "veri Ekle" düğmesini kullanarak bu fare (DICOM formatında) arayüzü için Bay resim yükleyin. "El ile 3D reorientation" kullanarak Bay taşımak ve kafatası CT görüntü içinde uygun (tüm yöntemleri aynı yönde olduğundan emin olun).
  7. Kontur yatırım getirisi "3D ROI" aracıyla Bay imaj çizmek.
    1. Evde beslenen hayvan görselleştirme visual denetleyicisi sekmeyi (VC) seçimini kaldırarak ve sadece MR ve BT yatırım getirisi çizmek için kullanın.
    2. Yeni bir yatırım getirisi oluşturursanız ve onu "enfarktüsü" için üzerinde "ROI" düğme'yi tıklatın. "Yaptı YG kenarlık çizme ve doğru tıkırtı kapatmak için tıklatarak eğri aracını", seçin.
    3. Herhangi bir yatırım getirisi, kafatasında kafatası sınırı ve kontur yatırım getirisi bir Voksel boşluk bırakmak için olmanın en iyi yöntemi ile yakalamak değil emin inme, kapsayan tüm dilimleri ile arasındaki yineleyin.
  8. Enfarktüsü birimi kullanan kontralateral bir yatırım getirisi elde.
    1. Yeni bir yatırım getirisi oluşturmak ve "kontralateral" etiket. Enfarktüsü yatırım getirisi üzerinde sağ tıklayın ve "ver"'i seçin. ROI 2 ("Inp1") konuma sürükleyin.
    2. "Seçili tek Inp1 ile", "hale gelmesini/kayıt" menüsündeki "operatör" işlevini kullanarak bir sol sağ flip uygulanır. Tıkırtı belgili tanımlık "ROI" kutu, "yalnızca görüntüleme" seçin ve el ile yeni yatırım getirisi kontralateral tarafında aynı bölgeye taşımak. "Aritmetik'ın" işleci seçin ve 2 skaler bir çarpma ROIs bağımsız miktar izin yeni yatırım getirisi için uygulayın.
    3. 3D ROI araca dönmek. "Uzman ve deneysel" sekmesine gidin ve "Yatırım getirisi al" butonuna tıklayın. Inp1 yeni birim kontralateral YG olarak yüklemek için iletişim kutusundan seçin.
  9. Ortalama evde beslenen hayvan resmin üzerine sağ tıklayın ve elden ve evde beslenen hayvan yeniden açın. 3D ROI aracında "sonuçlarını aktarın" simgesini kullanarak nicel alımı sonuçları oluşturma.
  10. (OtomatikYani, yatırım getirisi nesil sağ sol beyin yarıküre bölgeler Vivoquant yazılım için bir 3D fare beyin atlas eklenti modülünü kullanarak karşı) istenirse ek bölünmüş beyin çözümlemesi gerçekleştirin.
    1. Kayıtlı PET/CT resimler yeniden yükleyin.
    2. Fare beyin atlas on "Gelişmiş modülleri" menüsünü ve seçme 3D beyin atlas aracı alın. "Tüm bölgeler sol/sağ" "Gelişmiş ayarlar" seçin ve "3D atlas almak için Çalıştır" ı tıklatın.
    3. El ile kafatası bir sınır kullanarak beyin atlas sığması.
    4. Tüm 14 sol ve sağ Yarımküre ROIs için (medulla, beyincik, orta, pons, korteks, hipokampus, talamus, hipotalamus, striatum, yarayan, Olfaktör ampuller, sonuçlarının bir elektronik tablo oluşturmak için "3D ROI al" denetlenir emin atlas yeniden çalıştırın Corpus callosum ve beyaz madde).
  11. Yazılımı çalışan tarayıcı kullanarak dalak izleyici Anlamazdın ölçmek (tablo malzemeleri görmek).
    1. Evde beslenen hayvan ve CT görüntü dosyaları ve bunları veritabanında vurgulayarak "genel analizine"'ı tıklatarak yükleyin.
    2. Kayıt sekmesini tıklatın ve "katı kayıt" ikonuna tıklayarak evde beslenen hayvan ve CT görüntüleri ortak kayıt.
    3. Yatırım getirisi miktar sekmesinde tıklatın, "Yatırım getirisi oluşturmak" simgesine tıklayın ve dalak adlandırın.
    4. Dalak CT dosya başvurusu için kullanma ROIs hiçbir çakışma (evde beslenen hayvan görüntü kullanarak ve yayılma böbrekler üzerinden önlemek sinyal) böbrek alımı ile sağlanması çizmek için "küre" aracını seçin.
    5. Hayvanlar arasında tutarlı yatırım getirisi cilt korumak için ROIs düzenleyin.
  12. Alımı normalleştirme için bir standart düzeltme değeri hesaplamak.
    1. PET/CT verileri standart taramasından yüklemek ve bir silindir ROI "el ile 3D ROI" aracını kullanarak 20 mL şırınga kapsayan oluşturmak.
    2. Elektronik tablo simgesini kullanarak standart içinde bulunan radyoaktivite düzeyi elde edilir.
    3. Bu ncı/cc sonuç ve orijinal kaydedilen radyoaktivite evde beslenen hayvan alımı değerleri için bir düzeltme faktörü oluşturmak için standart (yani, ncı/cc Standart doz Kalibratör ölçümü) kullanın. Diğer bir deyişle, doz Kalibratör tarafından kaydedilen standart radyoaktivite standart evde beslenen hayvan görüntü hesaplanan radyoaktivite tarafından bölün.
  13. Doz faaliyetleri ve çürüme doğru evde beslenen hayvan alım zamanından için ölçümlerin zaman tüm fareler (i.e hesaplamak PET taraması başlangıcında doz etkinlik) için kullanın.
  14. Kalan değerleri için yineleyin ve çürüme düzeltilmiş doz tam aktivite hesaplamak için alınan her hayvan çıkarın.
  15. Bu çürüme düzeltme uygulandıktan sonra verileri doğru faaliyet düzeyinde olduğundan emin olmak için standart düzeltme uygulayın. Bu düzeltmeler için el ile çizilmiş yatırım getirisi sonuçları ve beyin atlas yatırım getirisi veri ilgili beyin bölgeleri dMCAO yeri (Yani, korteks, hipokampus ve striatum) için geçerli olduğundan olun.
  16. %ID/g tüm ROIs için aşağıdaki eşitliği kullanarak hesaplar: %ID/g = (ROI radyoaktivite ncı/cc / ncı/cc alınan düzeltilmiş doz çürüme) x 100. Her yatırım getirisi için zaman etkinliği eğriler oluşturmak için grafik yazılımı kullanarak zaman bir fonksiyonu olarak %ID/g arsa.
  17. Tarayıcı yazılımının son görüntü görselleştirme ve şekil oluşturmak için kullanın. Görüntüleri tarama sırasında her fare tarafından alınan çürüme düzeltilmiş doz göre normalize, tüm görüntüleri sağlamak aynı %ID/g ölçekte.
    Not: Bu görüntülerden farklı fare ve/veya görüntülerden farklı günlerde gerçekleştirilen çalışmalar doğru karşılaştırma etkinleştirmek gereklidir

10. autoradiography görüntü analizi

  1. ImageJ yazılımında dijital görüntü (.gel dosyası) açın. Parlaklık ve kontrast için görsel olarak eşik görüntü ve uygun bir renk "arama tablosu" uygulayın.
    Not: Royal en doğru benzer Pet içinde kullanılan renk ölçeği
  2. ROI Yöneticisi manuel ROIs enfarktüsü ve karşılık gelen kontralateral bölgeler etrafında çizmek için kullanın.
  3. Her yatırım getirisi ortalama piksel yoğunluğunu ölçmek ve sonuçlar vermek için ölçü işlevini kullanın. İstatistiksel yazılım kullanarak çizmek.

Representative Results

Fareler uygulandı MRI başarılı kontur ve [11C] doğrulamak için DPA-713 PET 4 fareler aynı anda tarama tarafından gerçekleştirildi. Evde beslenen hayvan, CT ve Bay görüntüleri önce el ile beyin ROIs çizim ve izleyici alımı Ipsilateral ve kontralateral bölgelerinde (Şekil 2) araştırmak için yarı otomatik bölünmüş beyin atlas analizi, performans Co kayıtlı.

PET/CT görüntüler ve saat etkinlik eğrileri (şeker-radiotracer etkinlik zaman bir fonksiyonu olarak) artan [11C] DPA-713 alımı Ipsilateral karşı kontralateral hemisferlerin (Şekil 3A) görüntüler. 50-60 dk, verilerden toplanır miktar kullanarak dinamik evde beslenen hayvan beyin görüntüleri ortaya kontralateral Yarımküre dMCAO ama değil el ile çizilmiş kullanarak sahte fareler karşılaştırıldığında izleyici Anlamazdın (% kimliği/g) Ipsilateral (hazır) önemli bir artış Yatırım getirisi yaklaşım (Şekil 3B). Artan alımını da dMCAO ve sham fareler arasında Ipsilateral yarımkürede gözlendi. Ipsilateral ve kontralateral hemisferlerin arasında önemli bir fark yoktur büyük olasılıkla nedeniyle bu nedenle sulandrarak (genellikle sınırlı somatosensor korteks) enfarktüsü boyutundan büyük varlık ROIs atlas atlas yaklaşımı kullanarak tespit edildi sinyal. Ancak, sahte için karşılaştırıldığında dMCAO genel artan Anlamazdın tüm ROIs için hangi enfarktüsü19dışındaki bölgelerde artan TSPO ifade gösteren MCAO model fare kullanarak önceki raporları ile hizalar gözlendi. Ipsilateral/kontralateral oranları her iki yaklaşımın kullanarak sahte fareler karşı dMCAO artış; Ancak, bu fark sadece beyin atlas yaklaşım daha büyük farkı nedeniyle yatırım getirisi yaklaşımı kullanarak kortekste önemliydi. Bu fareler her grup sayısını artırarak üstesinden. Miktar [11C] DPA-713 Alım dalak içinde gruplar (Şekil 4) arasında önemli bir fark yoktur gösterdi.

Beyin dMCAO fare evde beslenen hayvan görüntüleme sonuçları ex vivo yüksek çözünürlüklü dijital autoradiography (Şekil 5) tarafından teyit edildi. Artan [11C] DPA-713 alımı hazır dokusunda çevreleyen sağlıklı beyin dokusu içinde ihmal edilebilir sinyal ile gözlenmiştir. Bu görüntülerin Nefelometri kontralateral oranları 1.4 2,09 dMCAO farelerde arasında değişen Ipsilateral ortaya koydu.

Figure 1
Şekil 1: Evde beslenen hayvan inceden inceye gözden geçirmek ve çalışma alanı Set-up. Tüm çalışma alanlarını steril bir ortam oluşturmak için koruyucu emici doldurma kaplıydı. (A) Kalibrasyonlar sonra inceden inceye gözden geçirmek ve burun koni anesteziye bağlı tüm 4 fareler için 4 fareler aynı anda görüntüleme için donatılmış bir fare 3D basılı yatak ulaşamadılar. (B) evde beslenen hayvan görüntüleme için gerekli ekipman hazırlanan önceden, serum dolu 27,5 G kateterler, göz yağ, etanol temizleme bezi, ısı abajur, cerrahi bant, doku yapıştırıcı, 0.5 mL doz şırınga, makas ve çakmak gibi. (C) radiotracer enjeksiyon için serum-flush şırıngalar ve tarayıcının arka makas yerleştirin. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: Ipsilateral/kontralateral yatırım getirisi ve sağ/sol-Split Yarımküre beyin Atlas evde beslenen hayvan görüntü analiz süreci. Yazılım kullanarak el ile ilgi (ROIs) Ipsilateral ve kontralateral bölgelerde Izleyici alımını belirlemek için kullanılan görüntü analizi ROIs ve yarı otomatik 3D split-brain atlas yaklaşım çizilmiş. Beyin MRI CT görüntüde tanımlanan karşılık gelen fare kafatası içinde el ile kayıt ve ardından otomatik 3D PET/BT kayıt gerçekleştirilmiştir. 3D ROI Aracı el ile Ipsilateral (kırmızı) çizmek için kullanılan ve kontralateral (yeşil) ROIs enfarktüsü MRI üzerinde bir referans olarak kullanarak. Split-brain yaklaşım için 3D sol/sağ-split fare beyin atlas yüklü ve kafatası içinde CT görüntü tarafından tanımlandığı şekilde donatılmış. Bu 3D fare beyin atlas miktar için kullanılan beyin ROIs sol korteks (koyu gri), sol Hippocampus (peygamber çiçeği mavi), sol Striatum (derin pembe), sağ korteks (kırmızı domates), sağ Hippocampus (yeşil) ve sağ Striatium (mavi) dahil. [11C] alımını DPA-713 her bölgedeki ncı/cc elde edildi ve daha sonra %ID/g için her fare için tarama anda çürüme düzeltilmiş doz normalleştirme tarafından dönüştürüldü. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : DMCAO ve Sham fareler temsilcisi Vivo içinde [11C] DPA-713 beyin anlamazdın. (A) dinamik PET/BT görüntüleri ve TACs göstermek artan [11C] DPA-713 alımı DMCAO uygulanan farelerin Ipsilateral korteks (n = 3) ve sham için hafif bir artış (n = 3) fare, önemli ölçüde daha fazla gösteren DMCAO fareler ile işletilen enfarktüsü ve beyin (%ID/g) kontralateral tarafı arasında kontrast yüzde enjekte dozda. (B) evde beslenen hayvan miktar (50-60 dakika özetlenebilir) önemli ölçüde artmış alımı ROI yaklaşımı kullanarak Ipsilateral yatırım getirisi ve split-brain atlas yaklaşımı kullanarak korteks (Ctx) saptandı. Hiçbir önemli farklılıklar hippocampus (HC) veya striatum (Str) bulundu. Artan Ipsilateral için kontralateral oranları her iki analiz kullanarak yaklaşıyor ama sadece beyin atlas yaklaşımı kullanarak Ctx istatistiksel olarak anlamlı görüldü. * (p < 0,05), *** (p < 0.001) Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: Temsilcisi In Vivo [11C] DPA-713 dalak Anlamazdın dMCAO ve Sham fareler. (A) dalak ROIs dMCAO içinde gösterilen [11C] DPA-713 dinamik PET/BT görüntüleri (n = 3) ve sham (n = 3) fareler. (B) kantitatif sonuçlar dalak alımı dMCAO ve sham fareler arasında hiçbir önemli sonuçlar gösterilmektedir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5 : Temsilcisi Autoradiography sonuçları. Dijital autoradiography görüntüleri için kontralateral Yarımküre göre artan [11C] DPA-713 Anlamazdın Ipsilateral göstermektedir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

Sunulan Protokolü [11C] kullanarak dMCAO ve sham farelerde neuroinflammation miktar için bir yöntemi açıklar DPA-713-Pet TSPO-evde beslenen hayvan görselleştirme ve neuroinflammation in vivo bugüne ölçme için en çok incelenen görüntüleme biyomarker olduğunu. TSPO ifade upregulated glia beyin üzerinde non-invaziv algılama ve neuroinflammation miktar erişimine izin verme sırasında iltihabıdır. Ayrıca, yapım o değerli bir araç hem klinik hem de önceden klinik araştırma son derece çevrilebilir bir teknik olduğunu. Bu iletişim kuralı ve temsilcisi sonuçları [11C] kullanarak uygunluğu vurgulamak DPA-713 algılamak ve kontur ve diğer nörolojik bozukluklar içinde vivoneuroinflammatory değişiklikler izlemek için evde beslenen hayvan.

Bu çalışmada, dMCAO cerrahi 3 aylık C57BL/6 dişi fareler kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Somatosensor korteks düşük değişkenlik kontur (Örneğin, orta serebral arter diğer modellerle karşılaştırıldığında ile kalıcı odak iskemi bir model sağlar, sınırlı bir son derece tekrarlanabilir enfarktüsü artış sağlar gibi bu model seçildi tıkanıklığı (MCAO) filaman yöntemi)14. Kontur modelleri evde beslenen hayvan görüntüleme beyin içinde kontralateral Yarımküre ROIs kullanarak her hayvan için bir iç başvuru bölgesinde içeren avantajına sahiptir. Yalnız cerrahi sonuçlarından, bu sayede sham ameliyat çalışma tasarım fareler kranyotomi dahil etmek önemlidir ve manipülasyon meninkslerde arter tıkanıklığı olmadan gerçekleştirildi iltihap olacağından. Kranyotomi yalnız bozulma temel nöronal doku ve giriş bağışıklık yanıtlarını kontur20bağımsız lider patojenlerin neden olabilir. Sham ameliyattan sonra iltihap ve bu nedenle bekleniyor paralel sinyal nedeniyle ameliyat tek başına olasılığını dışlamak için dMCAO olarak değerlendirilmesi. DMCAO kohort Analizi darbede ameliyatsız kaynaklanan iltihaplanma eklememek için Imaging Bay başarılı vuruş cerrahi ve enfarktüsü geliştirme onaylamak için yürütülmelidir. MRI da doğru bir şekilde enfarktüsü ve kontralateral ROIs çizmek için gerekli olan bir yapısal referans çerçevesi sağlar. Ayrıca, doğru görüntü işleme görüntü kayıt ve yatırım getirisi tanımı da dahil olmak üzere güvenilir miktar sağlamak için gerekli.

Ek sınırlamalar radiotracers evde beslenen hayvan ve autoradiography çalışmaları için etiketli C-11 ile çalışırken göz önünde tutulmalıdır. Genellikle araştırma enstitüleri bünyesinde cyclotron erişimi olan sınırlı kullanımı ile C-11, kısa yarılanma (20.33 min) düşünün zorunludur. Takım hızlı ve verimli bir şekilde çalışmak üzere uygun radyoaktivite ulaşım yolu, doz yönetim ve satın alma zaman-puan önceden önceden hazırlanmış ayrıntılı bir plan deneme iş akışı ile belirlenmelidir. Tasarım ve bu çalışmanın set-up özetlenen görüntüleme aynı anda veri çıkışı elde edilebilecek C-11 izleme aygıtı kullanırken artırmak için 4 farelerin karşılamak için. Mümkünse, tüm fareler cannulated için tavsiye edilir ve onların CT inceden inceye gözden geçirmek zaman ortasında C-11 izleyici görüntüleme tesiste en az radiotracer çürüme enjeksiyon önce emin olmak için geldi. Adım adım bu iletişim kuralı da en iyi hızlı cannulation, doz ölçüm, izleme enjeksiyon, evde beslenen hayvan tarama ve beyin önce önemli radyoaktif bozunma kesit için izin vermek için en az 3 araştırmacılar içeren bir ekip tarafından yürütülmektedir. PET taraması inisiyasyon ve enjeksiyon tüm 4 farelerin aynı anda yapmak iki kişi gerekir. Evde beslenen hayvan edinme enjeksiyon hemen önce başlayan nedeni farmakokinetik ve izleyici dağıtım kan dinamikleri ve bölgeler ilgi doğru bir şekilde ve tamamen yakalanır emin olmaktır. Birçok adım güçlü eğitim ve uygulama denemenin düzgün çalışmasını sağlamak için gerekebilir. Özellikle, bu protokolü başarılı kuyruk ven cannulation koyu saç kuyrukları üzerinde mevcut nedeniyle zor olabilir ve kontur ortaya çıktıktan sonra ya da birden çok kez noktalarda aynı fare Imaging daha zorlu hale gelebilir C57BL/6 fare bağlıdır .

Evde beslenen hayvan görüntüleme için diğer bir faktör ölçümlerin Ölçüm saati tam olarak dahil olmak üzere radiotracer doz ve kalan etkinlik, dikkatli kayıt içerir. Bu tarama anda enjekte doz doğru çürüme düzeltilmesi için gerekli olduğunu ve izleyici Alım (Yani, kimliği/g %) doğru bir ölçüm için her yatırım getirisi elde etmek için kullanılır. Her fare mevcut doğru görüntü analizi sağlamak için tarama sırasında radyoaktivite miktarı bilmek zorunludur. Bu nedenle, inceden inceye gözden geçirmek bilgisayar ve C-11 gibi kısa ömürlü izotoplar kullanırken hata önlemek için doz Kalibratör eşitleneceği tavsiye edilir.

Doğru evde beslenen hayvan görüntü miktar da inceden inceye gözden geçirmek ve set-up doğruluğunu tarafından sınırlı olabilir. Bu nedenle PET/CT görüntülerin doğru miktar emin olmak için evde beslenen hayvan ve BT tarayıcı bileşenleri için kalite kontrol denetimleri gerçekleştirmek önemlidir. X-ışını kaynağı Klima, karanlık/ışık ve merkezi kapalı set Kalibrasyonlar CT kalite kontrol denetimler içerir. Bu Kalibrasyonlar ölçmek ve gerçekleştirilen önceden satın alma için tarayıcı üreticisi tarafından önerilen sistem gürültü ve mutlaka doğru. Kalibrasyonlar için evde beslenen hayvan tarayıcı yapılmalıdır. Bu genellikle bilinen bir toplama radyoaktivite içeren bir "standart / PET hayalet" tarama tarama içerir. Standart hazırlanırken, buna benzer bir doz bir birimdeki bir fare ve aynı satın alma vücuda benzer tek bir fare için parametreleri olarak hayvan görüntüleme yönetilen çalışmada kullanılan aynı radyoizotop kullanmak en iyisidir. Suda seyreltilmiş radiotracer dolu bir 20 mL şırınga kalibrasyon dedektörü tarafından ölçülen gerçek doz dayalı bir düzeltme faktörü hesaplamak için kullanılan sonraki evde beslenen hayvan görüntüleme sonuçları ile bu iletişim kuralı, standart kullanılır. Evde beslenen hayvan görüntüleri ilgi bölgelerde Izleyici Alım doğru miktar sağlamak için deneyinde elde görüntüleme veri düzeltme oranı uygulanabilir. Bu ek olarak tarama gününde mevcut herhangi bir arka plan etkinliği dikkate alınarak radyonüklid pozitron aralığı için hesaplar. Doz Kalibratör Bu düzeltme faktörü nesil ayrılmaz bir parçası olduğu için bu cihaz aynı zamanda düzenli olarak üretici yönergelerine göre kalibre edilmiş olduğunu zorunludur.

Ex vivo autoradiography iletken zaman enjeksiyon yüksek sinyal-için-arka planda ilgi region(s) emin olmak için sonra ötenazi için uygun bir zaman noktası almak önemlidir. Otuz dakika sonrası enjeksiyon vivo içinde dinamik evde beslenen hayvan görüntüleme sırasında -Yani, alınan verileri kullanarak [11C] DPA-713 autoradiography için seçildi da C-11 ve zaman kısa yarılanma düşünüyor ise bir rehber olarak, dinamik TACs Bölüm ve beyin dokusu çıkarma sonra maruz dahil. Bu göz önüne alındığında [11C] DPA-713 autoradiography gerçekleştirilmesi gerekir üzerinde daha yüksek bir [11C] DPA-713 doz ve bir 30 dakika enjeksiyon için izin vermek için ayrı bir kohort farelerin perfüzyon ve ötenazi anestezi altında zaman noktası. Küçük vivo içinde performans ex vivo autoradiography iletken önce 3-4 fareler ile evde beslenen hayvan pilot çalışma autoradiography için uygun zaman noktası belirlemek için yardımcı olabilir. Ex vivo autoradiography için ek bir dikkate olup enjeksiyon sonra fareyi kurtarmak veya onları ötenazi kadar anestezi devam etmektir. Koruma onları anestezi tarama koşullarını taklit eder ve radiotracer dağıtım veya atılımı kinetik değil kurtarma tarafından değiştirilmiş sağlar. Ayrıca, bu fareler üzerinde ek yük kurtarma ve sonraki indüksiyon kaçınarak engeller. Son olarak, ex vivo protokolü için yararlı bir ek autoradiography immunohistokimyasal enfarktüsü konum yüksek çözünürlüklü bir görüntü oluşturmak için (sonra radyoaktif bozunma) boyama yoluyla için kullanılan Beyin dilimleri içinde bölgesel zarar değerlendirmek için olurdu ve birim.

Dayalı C-11 izleyici ile belgili tanımlık kullanma sınırlamaları gibi bu iletişim kuralı daha uygun konumlara yerinde bir cyclotron olmadan olabilir dayalı bir F-18 (109.77 min half-life) ile kullanmak TSPO izleyici için kolayca değiştirilebilir. Ayrıca, bu iletişim kuralı bir 4-fare görüntüleme tuzak açıklar. Bu yüksek aktarım yöntemi C-11 izleme aygıtı kullanırken en iyi olmasına rağmen bu iletişim kuralını da bu yataklar Imaging tek fare kullanarak değiştirilebilir. Dikkatli planlama ve sürekli eğitim bu protokol için özetlenen teknikleri [11C] kullanarak verileri bir zenginlik nesil sağlayacaktır DPA-713, neuroinflammation hastalığı tezahürü olarak rolünü araştırmak için kolayca uygulanabilen ve diğer kemirgen modelleri nörolojik bozukluklar, ilerlemesinde. Ayrıca, bu teknik vivo içinde yanıt-e doğru immunomodulatory tedavi microglia/makrofajlar hedef değerlendirmek için kullanılabilir.

Disclosures

Yazarlar çakışma çıkarlarının bildirin.

Acknowledgments

Yazarlar fare modeli sağlayan ve dMCAO ve sahte ameliyatları gerçekleştirmek için Buckwalter Laboratuarı (özellikle Dr. Todd Peterson) teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca, Thomas Liguori Invicro dan VivoQuant görüntü analiz yazılımı, Dr Tim Doyle, Dr Laura Pisani, Dr Frezghi Habte Stanford tesisinde onların tavsiye için Imaging SCi3 küçük hayvan ile onun teknik destek için teşekkür etmek istiyorum ve Bu görüntüleme Protokolü ve Radiochemistry tesis (özellikle Dr. Jun Park) onların yardım için [11C] sentezi ile gelişmekte olan yardım DPA-713.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Inveon PET/CT scanner Siemens Version 4.2
MRI scanner Varian 7 Telsa
ParaVision software Bruker Version 6.0.1 MRI operating software
VivoQuant software InVicro Version 2.5 Image analysis software
Inveon Research Workspace software Siemens Version 4.2 Scanner operating software. Includes microQView, the post-processing managing software
Dose calibrator Capintech CRC-15 PET
Typhoon phosphor imager 9410 GE Healthcare 8149-30-9410
Butterfly catheters SAI Infusion Technologies BFL-24 27.5 G needle
1 mL syringes BD
Insulin syringes BD 329461 0.5 mL insulin syringes with needle
20 mL syringe  VWR BD302831 BD Syringe Slip Tip Graduated
Tissue glue Santa Cruz Animal Health sc-361931 3 mL
Heat lamp Fluker 27002 5.5" reptile heat lamp with clamp and switch
0.9% sterile saline Pfizer 00409-4888-10 0.9% sodium chloride for injection, 10 mL
Eye lubricant Watson Rugby PV926977 Artificial Tears Lubricant Eye Ointment, 1/8 oz
Chux absorbent sheets ThermoFisher Scientific 1420662 Disposable absorbent padding
Iris scissors World Precision Instruments 503708-12 11.5 cm, Straight, 12-pack
Surgical tape 3M Durapore 1538-0 1/2" x 10 yard roll, silk, hypoallergenic
Mouse PET bed In house 4 mouse PET bed
Lighter Bic UDP2WMDC
Isoflurane Henry Schein NDC 11695-6776-2 Isothesia, inhalation anesthetic, 250 mL
Oxygen Praxiar UN1072 Compressed gas
Autoradiography cassette Cole Palmer EW-21700-34 Aluminum, 8" x 10"
Autoradiography film GE Life Sciences 28-9564-78 Storage Phosphor Screen BAS-IP SR 2025 E Super Resolution, 20 × 25 cm, screen only
Microtome blades ThermoFisher Scientific 30-508-35 MB35 Premier Disposable, 34° cutting angle
Microtome Microm HM 550
Microscope slides Fisher Scientific 12-550-15 Superfrost™ Plus Microscope Slides
OCT liquid VWR 25608-930 Formulation of water-soluble glycols and resins for cryostat sectioning at temperatures of -10°C (14°F) and below
Freezing molds Poly sciences 18646A-1 Disposable paraffin molds
Saran wrap Saran 25700001300
Disinfectant Virkon S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Benjamin, E. J., et al. Heart disease and stroke statistics-2017 update: A report from the american heart association. Circulation. 135 (10), 146-603 (2017).
  2. Jin, R., Yang, G., Li, G. Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells. J Leukoc Biol. 87 (5), 779-789 (2010).
  3. Wang, Q., Tang, X. N., Yenari, M. A. The inflammatory response in stroke. J Neuroimmunol. 184 (1-2), 53-68 (2007).
  4. Brown, R. C., Papadopoulos, V. Role of the peripheral-type benzodiazepine receptor in adrenal and brain steroidogenesis. Int Rev Neurobiol. 46, 117-143 (2001).
  5. Papadopoulos, V., Lecanu, L., Brown, R. C., Han, Z., Yao, Z. X. Peripheral-type benzodiazepine receptor in neurosteroid biosynthesis, neuropathology and neurological disorders. Neuroscience. 138 (3), 749-756 (2006).
  6. Scarf, A. M., Kassiou, M. The translocator protein. J Nucl Med. 52 (5), 677-680 (2011).
  7. Cerami, C., Perani, D. Imaging neuroinflammation in ischemic stroke and in the atherosclerotic vascular disease. Curr Vasc Pharmacol. 13 (2), 218-222 (2015).
  8. Stefaniak, J., O'Brien, J. Imaging of neuroinflammation in dementia: a review. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 87 (1), 21-28 (2016).
  9. Gerhard, A. TSPO imaging in parkinsonian disorders. Clin Transl Imaging. 4, 183-190 (2016).
  10. Airas, L., Rissanen, E., Rinne, J. O. Imaging neuroinflammation in multiple sclerosis using TSPO-PET. Clin Transl Imaging. 3, 461-473 (2015).
  11. Fan, J., Lindemann, P., Feuilloley, M. G., Papadopoulos, V. Structural and functional evolution of the translocator protein (18 kDa). Curr Mol Med. 12 (4), 369-386 (2012).
  12. James, M. L., et al. Synthesis and in vivo evaluation of a novel peripheral benzodiazepine receptor PET radioligand. Bioorg Med Chem. 13 (22), 6188-6194 (2005).
  13. Boutin, H., et al. 11C-DPA-713: A novel peripheral benzodiazepine receptor PET ligand for in vivo imaging of neuroinflammation. J Nucl Med. 48 (4), 573-581 (2007).
  14. Doyle, K. P., Buckwalter, M. S. A mouse model of permanent focal ischemia: distal middle cerebral artery occlusion. Methods Mol Biol. 1135, 103-110 (2014).
  15. Wang, Y., et al. [(18)F]DPA-714 PET imaging of AMD3100 treatment in a mouse model of stroke. Mol Pharm. 11 (18), 3463-3470 (2014).
  16. Domercq, M., et al. PET Imaging with [(18)F]FSPG evidences the role of system xc(-) on brain inflammation following cerebral ischemia in rats. Theranostics. 6 (11), 1753-1767 (2016).
  17. Toth, M., et al. Acute neuroinflammation in a clinically relevant focal cortical ischemic stroke model in rat: longitudinal positron emission tomography and immunofluorescent tracking. Brain Struct Funct. 221 (3), 1279-1290 (2016).
  18. Walter, H. L., et al. In vivo analysis of neuroinflammation in the late chronic phase after experimental stroke. Neuroscience. 292, 71-80 (2015).
  19. Rojas, S., et al. Imaging brain inflammation with [(11)C]PK11195 by PET and induction of the peripheral-type benzodiazepine receptor after transient focal ischemia in rats. J Cereb Blood Flow Metab. 27 (12), 1975-1986 (2007).
  20. Glazier, S. S., O'Rourke, D. M., Graham, D. I., Welsh, F. A. Induction of ischemic tolerance following brief focal ischemia in rat brain. J Cereb Blood Flow Metab. 14 (4), 545-553 (1994).

Tags

Tıp sayı 136 Neuroinflammation ışınlama protein 18 kDa (TSPO) pozitron emisyon tomografisi (PET) manyetik rezonans görüntüleme (MRG) beyin görüntüleme inme fareler.
Görüntüleme [<sup>11</sup>C] DPA-713 iskemik inme bir fare Model kullanma Neuroinflammation evde beslenen hayvan
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chaney, A. M., Johnson, E. M.,… More

Chaney, A. M., Johnson, E. M., Cropper, H. C., James, M. L. PET Imaging of Neuroinflammation Using [11C]DPA-713 in a Mouse Model of Ischemic Stroke. J. Vis. Exp. (136), e57243, doi:10.3791/57243 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter