Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

ללטף הדמיה של Neuroinflammation באמצעות [11ג] DPA-713 במודל של עכברים של שבץ איסכמי

Published: June 14, 2018 doi: 10.3791/57243
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Radiology, Stanford University, 2Department of Neurology and Neurological Sciences, Stanford University

Summary

טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET) הדמיה של kDa חלבון 18 translocator (TSPO) מספק אמצעים לא פולשנית להמחיש את התפקיד דינמי של neuroinflammation בהתפתחות והתקדמות של מחלות המוח. פרוטוקול זה מתאר autoradiography TSPO-PET ו- ex-vivo כדי לזהות neuroinflammation במודל של עכברים של שבץ איסכמי.

Abstract

Neuroinflammation הוא מרכזי המפל פתולוגיים בעקבות שבץ איסכמי. פולשני שיטות הדמיה מולקולרית יש פוטנציאל לספק תובנות קריטי הדינמיקה טמפורלית ואת התפקיד של אינטראקציות מסוימות neuroimmune המוחי. באופן ספציפי, טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET) הדמיה של translocator חלבון 18 kDa (TSPO), סמן של מיקרוגלייה מופעל ותאים מיאלואידית שושלת היוחסין היקפיים, מספק אמצעים כדי לזהות ולעקוב אחר neuroinflammation vivo בתוך. כאן, אנו מציגים שיטה לכמת במדויק את neuroinflammation באמצעות [11C]N,N-Diethyl-2-[2-(4-methoxyphenyl)-5,7-dimethylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]acetamide ([11ג] DPA-713), מבטיח דור TSPO-PET . radiotracer, ב סגר דיסטלי עורק המוח התיכון (dMCAO) לעומת עכברים המופעלים באמצעות העמדת פנים. MRI היה יומיים בביצוע ניתוח פוסט-dMCAO לאשר שבץ ולהגדיר את המיקום לאוטם ואת אמצעי האחסון. דימות PET/Computed טומוגרפיה ממוחשבת (CT) בוצע 6 ימים פוסט-dMCAO ללכוד את העלייה שיא ברמות TSPO בעקבות שבץ. כימות של חיית המחמד תמונות נערך על מנת להעריך את ספיגת [11ג] DPA-713 במוח ובחוט הטחול של עכברים dMCAO, דמה כדי להעריך את רמות מרכזי והיקפי של דלקת. אין ויוו [11ג] ספיגת DPA-713 המוח אושר באמצעות שמחוץ autoradiography.

Introduction

שבץ מוחי הוא הגורם המוביל החמישי של המוות, הגורם העיקרי לנכות ארצות הברית1. שבץ איסכמי מייצג את הרוב המכריע של המקרים (~ 87%), המתרחשים כאשר יש לשפות אחרות הפרעה בזרימת הדם למוח (למשל, על ידי קריש דם או פיקדון שומניים). לאחר מכן מופחתים אספקת חמצן, מזין האזורים הנגועים, מפל פיפטות מורכבים מאותחלת והתוצאה מוות עצביים בתוך תוכו שבץ מוחי (אירוע) בנוסף האזורים הסמוכים. Neuroinflammation היא רכיב קריטי השביל המוביל אל הנזק הזה, עם שני תאים חיסוניים המוח תושב (מיקרוגלייה) וחשבתי שחדר תאים חיסוניים היקפיים (נויטרופילים, תאי T, תאים B ו ומונוציטים/macrophages) לתרום זה אשד הרסני2,3. מיקרוגלייה מופעל ו מקרופאגים הן גורם מרכזי זה תגובה neuroinflammatory, עם דיווחים על תופעות מזיקות וגם מועיל בעקבות שבץ איסכמי2. לכן, זה הכרחי כדי להעריך את התרומה ויוו של תאים אלה בעקבות שבץ.

חיית המחמד הוא עוצמה תלת-ממדי מולקולרית הדמיה טכניקה המאפשרת ויזואליזציה של הביולוגיה תהליכים ויוו באמצעות מולקולות ספציפיות המסומנת פוזיטרון (β +) פולטות radionuclides 11ג, 13N, 15O ו- 18פ שיטה לא פולשנית זו יש יתרונות רבים על פני שיטות vivo לשעבר (למשל, אימונוהיסטוכימיה) הוא מאפשר רכישת מידע מולקולרי בזמן אמת, המחיה שלם נושאים, ומאפשר לחקירה האורך. הדמיית לחיות מחמד של TSPO, סמן של מיקרוגלייה מופעל ותאים מיאלואידית שושלת היוחסין היקפיים, מספק אמצעים כדי לכמת ולנהל מעקב אחר התגובות תא החיסון מולדים בתוך הגוף, יכול להיות מנוצל כדי להעריך דלקת לאחר שבץ מוחי, תגובה טיפולית התערבויות. TSPO, שנקראה הקולטן ההיקפית מסוג בנזודיאזפינים, הוא חלבון 18 kDa זה הוא האמין לשחק תפקיד תעבורה כולסטרול הסינתזה של neurosteroids4. יתר על כן, הראיות עולה כי TSPO מעורב neuroinflammation ו עצביים הישרדות5,6, עם דיווחים על ביטוי מוגבר בהפרעות נוירולוגיות רבות מעורבים דלקת כולל קו7, דמנציה8, מחלת פרקינסון9 וטרשת נפוצה10. TSPO ממוקם על ממברנות מיטוכונדריאלי החיצוני, מתבטאת במיוחד בפריפריה, בעיקר ברקמות סטרואידים המשויך (למשל, בלוטות) ועם רמות ביניים ראיתי את הלב, הכליות והריאות10. עם זאת במוח בריא, רמות TSPO הן נמוך, מוגבל בעיקר עכשיו, דונלד6,11. על פגיעה עצביים, כמו זו נצפתה שבץ, רמות TSPO במערכת העצבים המרכזית (CNS) להגביר באופן משמעותי. זו נצפתה קולטנים upregulation של TSPO אפשר לנצל את התמונה neuroinflammation ויוו, עם רמות הביטוי מתן אינדיקטור מדוייק של חומרת דלקת לפיכך, מטרת שיטה זו היא לכמת במדויק את התרומהויוו של neuroinflammation במודל של עכברים של שבץ איסכמי באמצעות TSPO-פט

המשדרים TSPO מרובים פותחו עבור חיית המחמד הדמיה של neuroinflammation. . הנה, TSPO-PET הדמיה מתואר באמצעות [11ג] DPA-71312, מבטיח דור TSPO מעקב, אשר הראו משופרת אות רעש, תנמיך לא ספציפית מחייב מאשר בשימוש יותר מבחינה היסטורית [11ג] PK11195 13 . לדוגמה, נבחר המודל העכבר dMCAO של שבץ זו השיטה14. מודל זה כרוך זמני ואז קבע מצדו של דיסטלי עורק המוח התיכון, והתוצאה היא מוקד איסכמיה של קליפת המגע. זהו יתרון במחקר קליניים שבץ בשל הפארמצבטית גבוהה של נזק איסכמי ושיעורי תמותה נמוך הקשורים עם מודל זה. עד כה, מחקרי הדמיה TSPO-PET טרם דיווח במודל מכרסמים dMCAO. עם זאת, חיית המחמד הדמיה מחקרים קודמים באמצעות מודל סגר (MCAO) בעורק האמצעי, מודל שבץ חמור יותר ומשתנה, עכברים, חולדות, דיווחו TSPO ביטוי להגדיל יום 3, שיא סביב יום 7 קו שלאחר15, 16,17,18. לפיכך, אנו לבצע PET הדמיה 6 ימים פוסט-dMCAO יעלה בקנה אחד עם הביטוי TSPO גבוהות. [11ג] ספיגת DPA-713 במוח נאמד בחולשת (infarcted), contralateral ההמיספרות. TSPO-PET היה בשילוב עם MRI מבניים, המאפשר תיחום מדויק של לאוטם ואזורים contralateral עניין (ROIs). כאן נתאר הן מבוססת על אטלס והן בגישה מונחית MRI רועי לחישוב ספיגת DPA-713 [11ג]. ספיגת radiotracer ב הטחול הוערכה גם לחקור את רמות היקפיים של דלקת בין קבוצות. בשיטה זו יש פוטנציאל לספק תובנות קריטי הדינמיקה ייתכן ואת התפקיד של האינטראקציות ספציפי neuroimmune שבץ ומחלות נוירולוגיות אחרות.

Protocol

מחקרים שנעשו בבעלי חיים כל בוצעו על פי לוח ניהול על מעבדה חיה על עצמך (APLAC) באוניברסיטת סטנפורד, תוכנית מוכרת על ידי האגודה הערכת ולדאוג הסמכה של מעבדה חיה. לפני הליך זה, עכברים הנשי C57BL/6 בת שלושה חודשים עבר ניתוח dMCAO בעקבות הליך סטנדרטי, בתנאים סטריליים14.

1. מבנית MRI (ניתוח פוסט-dMCAO 2 ימים)

  1. פתח את תוכנת ההפעלה (ראה טבלה של חומרים) והתקנה הרכישה על ידי יצירת מבחן חדש. בחר מאתר turborare T2 רצפים בסייר לוח הצבעים וגרור לחלון המבחן.
  2. לאבטח את הנשימה ואת חום הגששים אל המיטה העכבר באמצעות הקלטת רך, ולמקם רצועת מגן סופג ריפוד מעל שניכם ליצור סביבה סטרילית.
  3. לצרף חימום אוויר של המיטה בעלי חיים, תדליק את המאוורר כך אויר חם על ולשמור העכבר מחומם. השתמש במערכת ניטור אוטומטית כדי להבטיח את טמפרטורת הגוף, קצב הנשימה מתוחזקים ברמה המתאימה משך זמן הסריקה.
  4. עזים ומתנגד העכבר תא אינדוקציה באמצעות 3% איזופלוריין בתחילה, ואז לשמור על 1-2% (2 ל'/min, 100% O2). ודא שכרית החימום מופעל תחת התא אינדוקציה כדי לחמם את העכבר במהלך אינדוקציה. ברגע מרדימים, חלות העכבר כדי למנוע ייבוש ואת היווצרות כיב קרנית העין סיכה.
    1. הפעלת המערכת הרדמה (איזופלוריין 1-2%, 2 ל'/min 100% O2) מחוברת לסורק MRI ולהעביר את החיה אל המיטה העכבר.
    2. מיקום העכבר הראש הנוטה לנשוך בר ועל תיקון האוזן ברים במקום, מוודא שהם אינן בולטות מחוץ לקוטר של המיטה.
    3. להחליק את הגליל RF מעל הראש העכבר, דחפו את הגליל ואת המיטה נשא, הצבתו במיוחד עבור isocenter.
    4. לרכוש את מאתר כדי להציג את מיקום העכבר כל מימד 3 להשתמש בתמונה זו כדי להגדיר את עוצמת הקול עבור T2 turborare (TE: ms 33, ת ר: 2,500 ms, 2 ממוצעים, פרוסות 17, מ מ 0.083 x 0.92 רזולוציה, הזמן הכולל 2 דקות 40 שניות) רכישה. dMCAO מניתוח לאוטם קליפה המגע14; לכן, ודא שהאזור מכוסה בתמונה משוקלל T2.
    5. להסיר את העכברים מהסורק ולשחזר את העכברים בחדר מחומם.

2. PET/CT ולידציות וההתקנה זרימת עבודה (ניתוח פוסט-dMCAO 6 ימים)

  1. ליצור זרימת עבודה הדמיה בתוכנה סורק-בפעולה כדי לכלול CT הנחתה רכישה, 60 דקות C-11 דינמי חיית המחמד רכישה (350-650 קוו רמת אפליה, חלון מקרים ns 3.438), היסטוגרמה (20 מסגרות: 5 x 15 שניות, דקות 4 x 1, 11 x 5 דקות; עם מת זמן תיקון) שחזור 3DOSEM-OP (2 חזרות, 18 קבוצות משנה) כדי ליצור 128 x 128 x 159 ותמונות עם 0.776 x 0.776 x מ מ 0.96 voxel בגודל.
  2. ביצוע מקור רנטגן מיזוג באמצעות לוח כיול CT ממוקם בפינה השמאלית העליונה של הממשק. כיול זה צריך להתבצע אחת לשבוע, או לפני הסריקה, אם לא נעשה שימוש במערכת 48 שעות האחרונות.
  3. מבצעים כהה/אור (D/L) מרכז היסט (אצל) הכיול.
    1. לחץ על ה-CT כיול כפתור (X) בפינה העליונה השמאלית של הממשק.
    2. בחר D/L, אצל עבור קובץ ה-CT כי בכוונתך להפעיל, להסיר את המיטה gantry ולהפעיל את הכיול D/L.
    3. הכנס את המיטה כלי כיול לתוך הסורק ולהפעיל את הכיול C/O, מקפיד להחליף את הבחירה על הממשק "כיול כלי" במקום "70 מ"מ palette".
  4. להסיר את הכלי כיול ולחזור המיטה רגיל לחיות מחמד, מקפיד לשנות את הבחירה על הממשק בחזרה "70 מ"מ palette".
  5. לאבטח מיטה הדמיה 4-עכבר על הפלטפורמה סורק באמצעות הקלטת ולצרף את הצנרור הרדמה (איור 1א'). ודא שאיזופלוריין הזה הוא זורם דרך הצינורות וכי יש אין סטיות.
  6. לדחוף את המיטה קדימה אז זה במרכז שדה הראייה (FOV), סגור את הדלת CT ולקבל תצוגה סקאוט של ה-CT כדי להבטיח המיטה בתנוחה הנכונה.
  7. לבצע כיול "רגילה" של סורק PET/CT של שימוש של פנטום מיוצרים ללא צורך במיקור חוץ המכיל מנה הידוע של C-11 פתרון כמו מקור קרינה.
    1. להכין מזרק 20 מ"ל מלא המינון מעקב מקביל המנוהלות על עכבר אחד (~ 250-350 µCi/9 - 13 MBq של מעקב C-11 מעורבבת עם תמיסת מלח).
    2. להקליט את הפעילות את רמת השימוש של מיגון ושים לב בזמן המדידה.
    3. לנהל את סריקת PET/CT של תקן באמצעות בדיוק אותם פרמטרים אשר ישמשו לעכברים תמונה (כמתואר לעיל). זה שבועי כדי ליצור פקטור התיקון עבור הסורק מחמד להחיל על נתונים הדמיה.

3. סביבת התקנה עבור הדמיה PET/CT

  1. ליצור סביבה סטרילית באמצעות חיטוי עם virucide (ראה טבלה של חומרים) והצבת ריפוד סופג מגן על כל המשטחים.
  2. ודא איזופלוריין וחמצן טנקים מלאים במידה מספקת.
  3. הכן קטטרים וריד הזנב על ידי מילוי מזרק 1 מ"ל (מצויד טיפ המחט 27.5 G) עם 0.9% נתרן כלורי (מלח סטרילית) ולאחר שטיפה באמצעות G 27.5, קטטר פרפר 24 ס מ. חתוך את הכנפיים של הקטטר לפני cannulating כדי להבטיח שהם אינם חוסמים את התצוגה של הווריד הזנב של וכדי לעזור להקל על העברת העכברים לתוך הסורק ללא ועקרו מבתיהם הצנתר.
  4. להבטיח שכל ציוד חיוני נפרס על תחנת העבודה כולל מזרקים "סומק" חילוף (מלא מלח סטרילית), עין סיכה, מטליות אתנול, מנורות חימום, מוכן קטטרים (מלא מראש עם תמיסת מלח), הדבקה, דבק רקמות, מזרקים במינון 0.5 mL, מספריים, מצית כדי לאטום את הקטטר לאחר השמה מוצלחת וריד הזנב (איור 1B).

4. בעלי חיים והכנה תעלות

  1. שוקלים עכברים כדי לקבוע את עוצמת קול גבוהה רשאית להיות מוזרק כל עכבר (קרי, נפח של מעקב, כל חובה בניהול מלוחים לא יעלה על 10% ממשקל הגוף).
  2. עזים ומתנגד עכברים בתוך תא אינדוקציה באמצעות 3% איזופלוריין ולשמור על 1-2% (100% O 2 L/דקה2).
  3. חלות סיכה העין העכבר כל ואשר ההרדמה דרך רפלקס פדלים (הבוהן צביטה). להתאים את רמות הרדמה במידת הצורך.
  4. הנח את העכבר על גבי מיטה מחוממת מצויד קונוס האף כדי לספק איזופלוריין 1-2% (100% O 2 L/דקה2).
  5. בעוד העכבר הוא מורדם, לבצע תעלות וריד הזנב באמצעות פרוטוקול הבאים:
    1. הנח את העכבר בצד שלה לחשוף את אחד העורקים. לרוחב, בעוד הראש נשאר בתוך אצטרובל האף.
    2. חממו את הזנב באמצעות מנורת חימום, נזהר שלא להתחמם יתר על המידה או לצרוב את הזנב, דגימה עם המחיקה אלכוהול וריתקו את תקחי אותו לעקר את ההזרקה.
    3. לעכב את המחט עם שפוע, ליישר אותו עם הווריד בזווית חדה.
    4. בקלילות ללחוץ כדי לנקב את העור ורמת החוצה את המחט אז זה עולה בקנה אחד עם הווריד.
    5. בעדינות לדחוף קדימה כמה מילימטרים בעבר השיקוע אז המחט מזין את הווריד.
    6. לאשר שהצנתר הוא על-ידי ניהול רצף קטנים (10-20 µL) של תמיסת מלח. תמיסת המלח צריכים לעזוב את המזרק בצורה חלקה, תסלול הווריד. אם לחץ התנגדות או חזרה נצפית, סביר להניח הצנתר אינה בווריד, מנסה שוב תעלות מומלץ. אם קרישת נצפית, השתמש הפרין (הפארין אלף יחידות לכל מ ל תמיסת מלח) עבור התקנת תעלות וריקון.
      הערה: אנחנו שהערכת תעלות עם ובלי הפרין בתוך המתח העכבר עניין, שכן אין קרישה נצפתה, תמיסת מלח לבד שימשו cannulations.
    7. מאובטחים הצנתר ועד הזנב באמצעות טיפה קטנה של דבק רקמות, ואחריה הדבקה, כדי להבטיח הצנתר יישאר משותק בעת העברת העכבר הסורק.
    8. הסר את המזרק סומק מהקצה של קטטר לאטום את הקצה עם המצית, הבטחת החוקרת אינה קרובה כל איזופלוריין או אתנול.
    9. חזור על 3 עכברים נוספים כך כל 4 עכברים שיסרק לצינוריות ומוכנים.
  6. הפעל זרימת הרדמה (2.5% איזופלוריין, 100% O 2 L לדקה2) מחובר את PET/CT והמיקום בקפידה העכברים שכיבה במיטה סורק, הבטחת קטטרים להישאר במקומו והוא הראש של העכבר בכל ישר ומאובטחת בתוך אצטרובל האף. קלטת את הראש, הגוף של כל עכבר על המיטה עם הדבקה רך, הבטחת הנשימה אינה מוגבלת על-ידי הצבת הקלטת. להקליט את המיקום של כל עכבר כדי לאפשר את המיקום הנכון והקצאת קבוצה לניתוח תמונה.
  7. לשמור על עכברים מחומם לאורך כל ההליך (למשל, באמצעות מנורת החימום או מערכת משאבת אוויר חם כדי להבטיח עכברים נשמרים חמים ללא התחממות יתר). לעקוב אחר קצב נשימה של עכברים כל, באופן חזותי אם משתמש על gantry פתוח או באמצעות מערכת ניטור מרחוק באמצעות רפידות בדרכי הנשימה, ולשנות את רמות הרדמה לפי הצורך.

5. CT רכישה

  1. לאחר חיות מאובטחים במיטה, נשימה יציב, להפעיל את הלייזר צלב שערות ולעבור סריקה למיטה כך שהם יתיישרו עם המוח של כל ארבעה עכברים. להזיז את המיטה סורק למיקום רכישה (מיקום 3) עם המוח של העכברים כמו קרוב למרכז FOV ככל האפשר.
  2. רוכשים את תמונת נוף הצופים של העכברים כדי לוודא את עמדתם (שימוש 200 מ מ FOV), ולהתאים את המיקום על-ידי גרירת תיבת FOV בממשק במידת הצורך. לחץ על "הפעל זרימת עבודה" שתוכנת הסורק כדי להתחיל את סריקת סי. טי, מקפיד לבחור "להציג בקשות המשתמש האינטראקטיבי" אז סריקת PET ניתן להפעילו באופן ידני לפני הזרקת מעקב.

6. [11ג] מנה DPA-713 הכנה

  1. לסנתז [11ג] DPA-713 תיאר כאמור12, המבטיח את לובשת את עיקרון השוויון הפוליטי המתאים (ציוד מגן אישי) לטיפול רדיואקטיביות, כולל חלוק מעבדה, כפפות dosimeters האצבע וגוף אישיים. ודא תשנה את כפפות באופן קבוע כדי למנוע זיהום רדיואקטיבי, ולא להגדיל את המרחק שלך מקור רדיואקטיבי כאשר הדבר אפשרי.
  2. להשתמש מלקחיים להעביר בזהירות את המבחנה radiotracer מאחורי מגן עופרת.
  3. להתכונן מזרקים במינון 0.5 מ ל כל עכבר המכיל כ 250-350 µCi/9-13 MBq בכרך µL 100-200 כדי להבטיח מנה נאותה טומוגרפית דינמי 60 דקות (מינון מנוהל ייקבע בהתחשב זמן מחצית החיים של איזוטופ, קו-הזמן של תכנון המחקר, עם נפח תלוי משקל העכבר).
  4. מדד הפעילות באמצעות של מיגון מוגדר C-11, הממוקמים בסמיכות לאתר תעלות, ולהקליט את הזמנים של מדידה, הזרקת כדי לאפשר תיקון דעיכה. לצייר את המנות לפני הקצוות CT כדי להגביל את הריקבון ולהבטיח את הרמה הרצויה של רדיואקטיביות להיות מוזרק כל עכבר.
  5. ודא כי ישנם אין בועות אוויר במזרק מנה לפני מדידת הפעילות, הזרקת לתוך כל עכבר.

7. מחמד רכישה

  1. ברגע העכברים עולה באופן אוטומטי מ- CT PET, להגדיר האחורי של הסורק להזרקה DPA-713 [11ג] (איור 1C). במקום ריפוד סופג מגן על מדף וודא מספריים וקלים יותר נמצאים בהישג יד.
  2. חיתוך הקטטר אטום אבובים עם מספריים, הסימון קטטר קווים ברורים של בועות, ולאשר את הצינורית הוא עדיין בתוך הווריד של-ידי ביצוע רצף מלוחים µL 10-20. לטעון את מינון מדוד? המזרקים מהשלב 6.4 לתוך כל אחד קטטרים 4, שמירה על מסלול של איזה מינון נגבתה כל עכבר.
  3. לחץ על "אישור" כאשר הסריקה חיית המחמד הוא מוכן להפעיל בעת הפעלת טיימר השני 10 בו זמנית. יש שני חוקרים בתוך הסורק עם מזרקים מנה ביד, להזריק כל 4 עכברים בו זמנית על טיימר מאפס להגיע. ריקון כל קטטר עם 50-100 µL של תמיסת מלח (בהתאם לתקופת קטטר אבובים – קרי, האחסון מת) לוודא המינון המלא מזין את הווריד הזנב, ואת לאטום מחדש את הצנרור שוב בעזרת מצית.
  4. למדוד את מינון? המזרקים באמצעות של מיגון כדי לקבל ערך רדיואקטיביות שיורית (כל חיצי מעקב עזב במזרק). שימו את הערכים ואת הזמן שהם נרשמים.
  5. לאחר שהסריקה תושלם, הביתה המיטה חיית המחמד למיקום המקורי באמצעות לחצן "הביתה" אופקית בתוך התנועה ' לוח הבקרה '. להסיר את העכברים הסורק, הסר בזהירות את הקטטר. בעדינות הפעילו לחץ לאתר תעלות כדי למנוע דימום יתר.
  6. מודדים את הפעילות שיורית הקטטר באמצעות של מיגון כאמור תיאר.
  7. אם עכברים כדי להיות התאושש להבטיח פעולה זו מתבצעת בסביבה חמה (למשל, בתוך קופסה עם כרית מחוממת מתחת או המכיל כפפה מלא במים חמים) כדי להקל על שחזור. אם מתכנן לבצע המתת חסד העכברים, למקם העכברים תא אינדוקציה שמכילה איזופלוריין כך הם נשארים anaesthetized לפני המתת חסד באמצעות זלוף.
  8. כדי לשחזר את הנתונים, פתח את תוכנת ניהול עיבוד דפוס (ראה טבלה של חומרים), אשר לשחזר באופן אוטומטי כל סריקה באמצעות הנתונים היסטוגרמה שנוצר מקובץ lst.

8. המוח Autoradiography

  1. לפני הניסוי, למחוק את הסרט autoradiography דיגיטלית על ידי לחשוף אותה לבן אור למשך 10-15 דקות ולשמור באזור נטול רדיואקטיביות עד השימוש.
  2. היכונו מזרקים במינון 0.5 מ ל כל עכבר המכיל כ 1.0-1.5 mCi/37-56 MBq כדי להבטיח מנה נאותה autoradiography.
  3. למדוד את הרדיואקטיביות במזרק במינון, שימוש של מיגון, לפני הזרקת להשיג קריאת מדויק של הפעילות.
  4. נקרר כפי שתואר קודם לכן, להזריק עכברים מיד בשטח מתאים הרדיואקטיביות.
  5. להסיר את הצנתר לאחר ההזרקה ולמדוד את שאריות רדיואקטיביות.
  6. יוצאים העכברים בחדר מחומם אינדוקציה כך שיישארו anaesthetized לפני זלוף, המתת חסד.
  7. לבצע המתת חסד בזמן עכברים ובהשגחת עמוקות (שאיפה מתמדת של 4% איזופלוריין, 100% O 2 L/דקה2) באמצעות PBS זלוף, ניקור חזה הדו-צדדיים 30 דקות שלאחר [11ג] DPA-713 הזרקה.
    1. פתיחת חלל הבטן, לחתוך דרך הסרעפת לחשוף את הלב.
    2. הכנס מחט עירוי פרפר קטטר לתוך החדר השמאלי של הלב, לגזור את העלייה הימנית ואת הכלילי.
    3. לאט לאט perfuse עם PBS (~ 20-30 מ ל) בעזרת מזרק 20 מ ל.
  8. הסר בזהירות את המוח של הגולגולת באמצעות מלקחיים ומספריים.
  9. המקום במוח בתבנית הקפאה מלא עם טמפרטורה אופטימלית חיתוך נוזלי (אוקטובר), שהופך בטוח שהמוח הוא רמת ממורכזת בתוך כייר, עם נורות הריח המכוון כלפי החריצים ב כייר (כדי לספק ציוני דרך וכיוון פעם המוח היא להסיר את התבנית).
  10. המקום עובש על קרח יבש 10-15 דקות או עד OCT הופכת אטומה.
  11. מיד למקם כל עובש בערכת מיקרוטום cryostat ל-18 ° C, equilibrate 10 דקות לפני הרכבה.
  12. הקילוף כייר מקפיא והר המוח פלטפורמת מיקרוטום באמצעות כמות קטנה של OCT טריים כמו "הדבק".
  13. השאר המוח שנטענה ב האזמל הקטן להקפיא למשך 2 דקות.
  14. לחתוך דרך המוח עד המיקום שבץ הוא חשוף (קרי, ROI). להשתמש בתמונה מר כדי לאתר את לאוטם בתוך המוח של כל בעל חיים. עבור dMCAO, זה יהיה עקבי בתוך קליפת המגע; עם זאת, אורך הקו עשוי להשתנות מעט.
  15. מדור האזור של המוח פורש את לאוטם, הצבת מקטעים מיקרומטר בעובי 20 על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית עם המספר המתאים העכבר תוויות.
  16. פתח את הקלטת autoradiography, קו בתחתית הקלטת עם גיליון אחד של הניילון הנצמד. לארגן השקופיות סעיף בצד למעלה על גבי הניילון הנצמד בקלטת, שימו לב המיקום של כל שקופית. באופן אופציונלי, לצלם מיקום השקופיות כדי לסייע עם ניתוח מאוחר יותר.
  17. הנח בעדינות שכבה נוספת של הניילון הנצמד למעלה (לאחר המתנה ~ 2 דקות בעקבות אוסף של המוח בקטע האחרון - ומאפשרת יבש וציות אל השקופית) ומניחים בזהירות את הסרט autoradiography דיגיטלי (לבן פונה כלפי מטה) על השקופיות.
  18. סגור/י היטב את הקלטת ולהשאיר במקפיא-20 ° C, ומאפשר הסעיפים להירקב על הסרט לזמן חשיפה נאותה (~ 5-10 מחצית החיים).
  19. סרוק את הסרט לאחר זמן החשיפה באמצעות imager פוספור ליצירת תמונה דיגיטלית לצורך ניתוח מאוחר יותר.

9. ניתוח דינמי תמונות חיות מחמד

  1. לפתוח את התמונה ניתוח תוכנה (ראה טבלה של חומרים) ולחץ על הסמל "לפתוח את הנתונים" כדי לטעון את תמונת CT (כמקור) ואת הסמל "צרף נתונים" כדי לטעון את חיית המחמד דינמי (בתור ההפניה).
  2. ביצוע של בקרת איכות חזותית של הנתונים באמצעות האופרטור זמן-סדרת בתפריט הנפתח: בחר הפניה ("ref"), "גלובל" והחל הולם min ו- max על הסולם צבע. באופן חזותי בנתונים הדינמיים חיית המחמד תמונה אחר תמונה, אימות ספיגת קרינה רדיואקטיבית, בדיקת כל תנועה מבלבל בתוך הסריקה.
  3. ליצור תמונה חיית המחמד הממוצע שימוש באופרטור"אריתמטיקה".
    1. לבחור "ממוצע נבחר", בטל בחירת "ref", ולוודא קלט 1 ("Inp1"), 2 קלט ("Inp2") וכוכב קלט ("Inp *"-כוללת את שאר המסגרות חיית המחמד הסריקה) נבחרו כדי ליצור ממוצע של כל המסגרות חיית המחמד.
    2. . גש ללשונית "נתוני מנהל" (DM) וגרור את התמונה הממוצע עד המיקום "input1" למטרות הדמיה. להפיץ מחדש את קנה המידה של צבע על ידי לחיצה על חישוב אוטומטי הכלי "min-max".
  4. רישום ה-CT לקובץ ה PET הממוצע באמצעות הפונקציה "אוטומטי 3D" בתפריט הנפתח "מחדש-orientation/רישום".
    1. בחר "ref" ו- "Inp1" ובחרו "נוקשה", "מהיר", "Inp1 כדי Ref" רישום. בדיקה חזותית של רישום כל 3 מידות ולהתאים באופן ידני במידת הצורך בכרטיסיה "ידנית 3D" שימוש בפונקציות "תרגום" ו- "רוטציה".
    2. כאשר מרוצה הרישום, בחר "Inp2" ואת "Inp *", חלים על כל המסגרות PET על-ידי לחיצה עליו. לחץ לחיצה ימנית על הקבצים CT ו- PET מיט ולשמור כמו raw.
  5. לחתוך המוח של עכבר אחד בכל פעם על ניתוח המוח באמצעות ה-CT כמדריך: בחר "חיתוך" מתוך התפריט הנפתח וגרור את גבולות התמונה כדי לחתוך את הראש של העכבר מתחת לגזע המוח. מחדש להתמצא הדימויים PET ו- CT באמצעות הפונקציה "ולהתפכחות 3D ידנית" כמתואר לעיל כך הגולגולת הוא ישר פנימה כל הממדים.
  6. לטעון בתמונה מר עבור שהשאיר את העכבר (בתבנית DICOM) באמצעות לחצן "צרף נתונים" בחלק העליון של הממשק. להעביר את מר באמצעות "ולהתפכחות 3D ידנית" ובכושר בגולגולת בתוך התמונה CT (ודא כל שיטות נמצאים באותו הכיוון).
  7. לצייר את הקו רועי על התמונה מר באמצעות "הכלי תלת-ממד ROI".
    1. לבטל את הפריט החזותי מחמד ע י ביטול זה בתוך הכרטיסייה בקר חזותי (VC) ולהשתמש רק את מר ו- CT כדי לצייר את רועי.
    2. לחץ על "הוסף ROI" כפתור כדי ליצור ROI חדש ולכנותו "אירוע". בחר "הכלי בליטת חיבור", לחיצה שמאלה כדי לצייר את הגבול רועי ולחץ לחיצה ימנית כדי לסגור אותה.
    3. חזור על דרך כל הפרוסות המקיף את השבץ, מקפיד לא ללכוד כל הגולגולת של רועי, עם מומלצת כדי להשאיר פער voxel בין הגולגולת גבול וקו ROI.
  8. מפיקים של רועי contralateral שימוש באמצעי האחסון לאוטם.
    1. ליצור רועי חדש עם מדבקה "contralateral". לחץ לחיצה ימנית על רועי לאוטם ובחר "לייצא". גרור את רועי למיקום 2 ("Inp1").
    2. עם היחידה "Inp1" נבחר, להחיל היפוך ימינה שמאלה באמצעות הפונקציה "מפעיל" בתוך התפריט "ולהתפכחות/רישום". סמן את התיבה "רועי", בחר 'תצוגה בלבד' ולאחר להעביר באופן ידני את רועי חדש באזור זהה בצד contralateral. בחר "האריתמטיקה של" האופרטור ולהחיל כפל וקטור בסקלר 2 על רועי חדש, המתיר עצמאית כימות ROIs.
    3. חזור אל הכלי רועי תלת-ממד. . גש ללשונית "מומחה, ניסיוני" ולחץ על כפתור "יבא רועי". בחר Inp1 מתוך תיבת הדו-שיח כדי לטעון את אמצעי האחסון החדש כמו רועי contralateral.
  9. לחץ לחיצה ימנית על התמונה חיית המחמד הממוצע ו חזיר. להדליק את חיית המחמד. להפיק את התוצאות תפיסה כמותית באמצעות הסמל "לייצא את התוצאות" בתוך הכלי רועי תלת-ממד.
  10. לבצע ניתוח מוח פיצול נוסף במידת הצורך (קרי, אוטומטית רועי דור של ימין לעומת אזורים באונה הצד השמאלי של המוח באמצעות מודול תוסף 3D העכבר אטלס המוח לתוכנה Vivoquant).
    1. לטעון מחדש את התמונות PET/CT רשומים.
    2. ייבוא בהרי האטלס מוח העכבר על-ידי לחיצה על בתפריט "מודולים מתקדמים" ובחירת הכלי אטלס המוח 3D. בחר "כל האזורים שמאלה/ימינה" "הגדרות מתקדמות" ולחץ על "הפעל" לייבא את אטלס תלת-ממד.
    3. להתאים ידנית בהרי האטלס בתוך המוח באמצעות הגולגולת כגבול.
    4. הפעל מחדש את אטלס מוודא כי "יבא רועי 3D" נבדק כדי ליצור גיליון אלקטרוני של תוצאות עבור כל ROIs בחצי הכדור ימינה ושמאלה 14 (לשד, המוח הקטן, המוח האמצעי, פונס, קליפת המוח, ההיפוקמפוס, תלמוס, היפותלמוס, סטריאטום, pallidum, הריח נורות, כפיס המוח והחומר הלבן).
  11. לכמת מעקב ספיגת ב הטחול באמצעות הסורק ההפעלה תוכנה (ראה טבלה של חומרים).
    1. לטעון קבצי תמונה PET ו- CT על-ידי סימונם מסד נתונים ולחיצה על "כללי ניתוח".
    2. לחץ על הכרטיסייה הרישום ולרשום שיתוף תמונות PET ו- CT לחיצה על סמל "רישום נוקשה".
    3. לחץ על הכרטיסייה כימות רועי, לחץ על הסמל "צור רועי" ותנו שם זה הטחול.
    4. בחרו בכלי "sphere" כדי לצייר את הטחול ROIs באמצעות הקובץ CT התייחסות, המבטיח אין חפיפה עם ספיגת כליות (באמצעות התמונה PET ו אות להימנע והתאמת מן הכליות).
    5. ערוך את ROIs כדי לשמור על אחסון רועי עקבית בין בעלי חיים.
  12. חישוב ערך תיקון סטנדרטי עבור ספיגת נורמליזציה.
    1. לטעון את הנתונים PET/CT מהסריקה רגיל וליצור גליל רועי המקיף את המזרק בפטרת באמצעות הכלי "רועי 3D ידנית".
    2. להשיג את רמת הרדיואקטיביות הנכלל תקן באמצעות הסמל של גיליון אלקטרוני.
    3. השתמש תוצאה זו nCi/cc ו רדיואקטיביות מוקלטות המקורי עבור התקן (כלומר, המידה כיל במינון של התקן ב- nCi/cc) כדי ליצור פקטור התיקון עבור חיית המחמד ספיגת ערכים. זאת אומרת, חילוק הרדיואקטיביות של תקן שהוקלט על ידי מיגון נגועי מחושב מתוך התמונה חיית המחמד של התקן.
  13. להשתמש את המינון פעילויות והשעה של המידות כדי ריקבון הנכונה לזמן של חיית המחמד רכישה עבור כל העכברים (כלומר חישוב הפעילות המינון בתחילת סריקת PET).
  14. חזור עבור הערכים שיורית, מהמסיכה המנה מתוקנת דעיכה כדי לחשב את הפעילות המדוייק כל חיה התקבל.
  15. לאחר החלת תיקון זה ריקבון, גם להחיל את התיקון הסטנדרטי כדי לוודא שהנתונים נמצאים באותה רמת הפעילות. ודא שאת התיקונים הללו חלות על תוצאות ROI מצוירות באופן ידני ולאחר אזורי המוח הרלוונטיים נתונים רועי אטלס המוח עבור מיקום dMCAO (קרי, קליפה, ההיפוקמפוס, סטריאטום).
  16. לחשב את %ID/g עבור כל ROIs באמצעות המשוואה הבאה: %ID/g = (רועי רדיואקטיביות של nCi/cc / ריקבון במינון המתוקן התקבל ב- nCi/cc) x 100. מגרש %ID/g כפונקציה של זמן באמצעות תוכנה graphing כדי ליצור עקומות פעילות זמן עבור כל רואי.
  17. השתמש תוכנת הסורק לדור ויזואליזציה ודמות התמונה הסופית. לנרמל תמונות לפי המינון דעיכה המתוקן התקבל על ידי העכבר כל ביצוע סריקה, הבטחת כל התמונות הן בסולם %ID/g אותו.
    הערה: זה נחוץ לאפשר השוואה מדויקת של תמונות מעכברים שונים ו/או תמונות מתוך מחקרים שבוצעו בימים שונים

10. autoradiography וניתוח תמונות

  1. פתחו את התמונה הדיגיטלית (קובץ. הג'ל) בתוכנת ImageJ. להתאים את הבהירות והניגודיות לסף באופן חזותי התמונה ולהחיל צבע המתאים "טבלת בדיקת מידע".
    הערה: רויאל דומה באופן המדויק ביותר בסולם הצבעים המשמשים פט
  2. השתמש במנהל רועי לשרטט ידנית ROIs סביב לאוטם ואזורים contralateral המתאימים.
  3. השתמש בפונקציה מידה כדי לכמת את עוצמת פיקסל מרושע כל רועי ולייצא תוצאות. מגרש באמצעות תוכנה סטטיסטית.

Representative Results

עכברים עבר MRI כדי לוודא שבץ מוצלחת, ו [11ג] מחמד DPA-713 בוצע על-ידי סריקת עכברים 4 בו זמנית. PET, CT, מר התמונות היו שיתוף רשום לפני ידנית ציור המוח ROIs וביצוע הניתוח אטלס המוח. פיצול אוטומטי למחצה, לחקור מעקב ספיגת באזורים חולשת ו- contralateral (איור 2).

זמן פעילות עקומות (פעילות טק-radiotracer כפונקציה של הזמן) ותמונות של PET/CT להציג ספיגת DPA-713 מוגברת [11ג] חולשת לעומת ההמיספרות contralateral (איור 3א). כימות של תמונות המוח מחמד דינאמית, באמצעות לסכם נתונים מ 50-60 דקות, התגלה גידול משמעותי מעקב ספיגת (% מזהה/g) ב- חולשת (infarcted) לעומת האונה contralateral dMCAO, אך לא דמה עכברים באמצעות מצוירות באופן ידני רועי גישה (איור 3ב). ספיגה מוגברת נצפתה גם בחצי הכדור חולשת בין עכברים dMCAO ואת דמה. אין הבדלים משמעותיים בין ההמיספרות חולשת ו contralateral נצפו באמצעות הגישה אטלס, ככל הנראה בשל הרי האטלס ROIs להיות גדול יותר מהגודל של לאוטם (בדרך כלל מוגבל ל קליפת המגע), לכן דילול האות. עם זאת, הכוללת ספיגה מוגברת ב dMCAO בהשוואה המזויפים נצפתה עבור כל ROIs, התמרכזו עם דוחות קודמים שימוש MCAO מודל בעכברים, הממחיש את הביטוי TSPO מוגבר באזורים מחוץ לאוטם19. יחסי חולשת/contralateral היו עלה ב dMCAO נגד עכברים המזויפים באמצעות שתי הגישות; עם זאת, ההבדל הזה היה רק משמעותית על קליפת המוח באמצעות גישה אטלס המוח עקב סטיה גדולה יותר בגישה ROI. זה עשוי להיות להתגבר על ידי הגדלת מספר עכברים בכל קבוצה. כימות של ספיגת DPA-713 [11ג] ב הטחול הראה אין הבדלים משמעותיים בין קבוצות (איור 4).

המוח dMCAO עכבר מחמד תוצאות הדמיה שאושרו על-ידי ex-vivo ברזולוציה גבוהה דיגיטלי autoradiography (איור 5). ספיגת DPA-713 מוגברת [11ג] נצפתה רקמה infarcted עם אות זניח ב שמקיף את רקמת המוח בריא. כימות של תמונות אלה חשף חולשת על יחסי contralateral ועד 1.4 2.09 בעכברים dMCAO.

Figure 1
איור 1: סורק PET, הגדרת סביבת עבודה. כל סביבות העבודה היו מכוסים מגן ריפוד סופג כדי ליצור סביבה סטרילית. (א) לאחר ולידציות, מיטה מודפס 3D העכבר, מצוידים הדמיה עכברים 4 בו זמנית היה מאובטח ב והסורק הקונוסים האף עבור כל העכברים 4 המצורפת ההרדמה. (B) הציוד הנדרש עבור הדמיה PET הוכנו מראש, כולל קטטרים 27.5 G מלא מי מלח, חומר סיכה עין, אתנול מטליות, מנורות חימום, הדבקה, רקמות דבק, מזרקים במינון 0.5 mL, מספריים, מצית. (ג) להזרקה radiotracer, מקום תמיסת מלח-סומק מזרקים ומספריים בירכתי הסורק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: רועי חולשת/Contralateral וימין/שמאל-Split האונה במוח אטלס חיית המחמד התמונה ניתוח תהליך. ניתוח תמונות כדי לקבוע את ספיגת מעקב באזורים חולשת ו contralateral עניין (ROIs) באמצעות באופן ידני, נעשה שימוש בתוכנות נמשך ROIs וגישה אוטומטית למחצה 3D אטלס מוח חצוי. רישוי אוטומטי PET/CT תלת-ממד בוצע ואחריו רישום ידני של המוח MRI בתוך הגולגולת העכבר המתאים שהוגדר בתמונה CT. הכלי רועי תלת-ממד שימש לשרטט ידנית חולשת (אדום) ו- contralateral ROIs (ירוק) באמצעות לאוטם של וניחש כהפניה. עבור הגישה מוח חצוי, הרי האטלס המוח 3D העכבר שמאלה/ימינה-split היה טעון, מצויד בתוך הגולגולת, כפי שהוגדרו על ידי תמונת CT. המוח ROIs בשימוש על כימות של אטלס המוח 3D העכבר הזה כלול קליפת שמאל (אפור כהה), ההיפוקמפוס השמאלי (דרדר כחול), שמאלה סטריאטום (עמוק ורוד), ימינה (עגבניה אדומה), ההיפוקמפוס הימני (ירוק), ואת קליפת Striatium ימין (ציאן). ספיגת [11ג] DPA-713 בכל אזור הושג ב- nCi/cc, הוסב לאחר מכן %ID/g על ידי נרמול כדי המנה מתוקנת דעיכה בזמן סריקה עבור כל עכבר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : נציג In Vivo [11ג] המוח DPA-713 ספיגת DMCAO ועכברים המזויפים. (א) תמונות דינאמית PET/CT וטק להדגים מוגברת [11ג] ספיגת DPA-713 בקליפת חולשת של עכברים שעברו DMCAO (n = 3), עלייה קלה עבור דמה (n = 3) פעלו עכברים, עם עכברים DMCAO הוכחת גדול משמעותית לעומת זאת במינון מוזרק באחוזים בין לאוטם לצד contralateral של המוח (%ID/g). (B) מחמד כמת (50-60 דקות מסוכם) חשף ספיגת מוגבר באופן משמעותי את רועי חולשת באמצעות גישה רועי, קליפת המוח (אקס) באמצעות גישה אטלס מוח חצוי. אין הבדלים משמעותיים נמצאו בהיפוקמפוס (HC) או סטריאטום (Str). יחסי חולשת כדי contralateral מוגברת נראו באמצעות ניתוח שתי גישות אבל היה רק משמעותי סטטיסטית ב אקס באמצעות גישה אטלס המוח. * (p < 0.05), * * * (p < 0.001) אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: Vivo ב [11ג] נציג DPA-713 ספיגת הטחול ב dMCAO ועכברים המזויפים. (א) [11ג] DPA-713 דינמי PET/CT תמונות מראה הטחול ROIs dMCAO (n = 3) ואת דמה (n = 3) עכברים. (B) תוצאות כמותיות להדגים ללא תוצאות משמעותיות של הטחול ספיגת בין עכברים dMCAO, העמדת פנים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 : נציג Autoradiography תוצאות. Autoradiography דיגיטלי תמונות מדגימות מוגברת [11ג] ספיגת DPA-713 ב חולשת לעומת האונה contralateral. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

פרוטוקול הציג מתאר שיטה כימות של neuroinflammation בעכברים dMCAO ואת דמה באמצעות [11ג] DPA-713-פט TSPO-PET הוא סמן ההדמיה ובדוקים נרחב ביותר בשביל להמחיש ומדידת neuroinflammation ויוו לתאריך. ביטוי TSPO הוא upregulated על עכשיו, דונלד במוח בעת דלקת יאפשר את זיהוי פולשני ו כימות של neuroinflammation. יתר על כן, זאת שיטה מאוד לתרגום, שהופך אותו כלי חשוב במחקר הקליני והן קליניים. פרוטוקול זה ותוצאות נציג לסמן את התאמת השימוש [11ג] DPA-713 מחמד כדי לזהות ולעקוב אחר שינויים neuroinflammatory קו וחוסר אחרים הפרעות נוירולוגיות ויוו.

במחקר זה, dMCAO הניתוח בוצע שימוש בעכברים נקבה בת 3 חודשים C57BL/6. מודל זה נבחר כפי זה מעורר לאוטם לשחזור מאוד מוגבלת קליפת המגע, מתן מודל של איסכמיה מוקד קבוע עם השתנות נמוך לעומת דגמים אחרים של שבץ (למשל, האמצעי מוחית עורקית סגר (MCAO) שיטה פילמנט)14. הדמיה לחיות מחמד של קו הדגמים יש את היתרון של המכיל אזור להפניה פנימית במוח עבור כל חיה באמצעות ROIs בתוך האונה contralateral. מאז יהיו קצת דלקת כי תוצאות הניתוח לבד, חשוב לכלול עכברים שעברו ניתוח דמה עיצוב המחקר, לפיה גולגולת ובוצע מניפולציה של קרומי המוח ללא חסימה בעורק. גולגולת לבד יכול לגרום להפרעה שבבסיס הרקמות עצביים, הקדמה של פתוגנים שמוביל תגובות חיסוניות עצמאית של קו20. קצת דלקת לאחר ניתוח דמה ולכן צפוי, וצריך להעריך במקביל dMCAO כדי לא לכלול את האפשרות של האות עקב ניתוח לבד. כדי להימנע כולל דלקת כתוצאה מהניתוח ללא קו בניתוח עוקבה dMCAO, מר הדמיה להתבצע כדי לאשר ניתוח מוצלח שבץ ופיתוח לאוטם. MRI מספק גם מסגרת התייחסות מבניים, אשר חיוני כדי לשרטט במדויק את לאוטם ואת contralateral ROIs. בנוסף, עיבוד תמונה מדויקת כולל תמונה הרישום והגדרת רועי נחוצים להבטיח כימות אמין.

מגבלות נוספות חייב להישמר בראש בעת עבודה עם C-11 הנקרא radiotracers ללימודי PET ו- autoradiography. זה הכרחי כדי לשקול מחצית החיים הקצר (20.33 דקות) של C-11, עם השימוש שלה בדרך כלל מוגבלת מרצים עם גישה ציקלוטרון באתר. נתיב התחבורה רדיואקטיביות המתאים, ניהול מינון ונקודות רכישת זמן-צריכה להיקבע מראש עם תוכנית מפורטת מוכנה מראש של זרימת העבודה של הניסוי כך הצוות יכול לעבוד במהירות וביעילות. העיצוב ואת הסידור של מחקר זה יש כבר המתוארים לאכלוס הדמיה של עכברים 4 בו-זמנית, כדי להגדיל את פלט נתונים השגה כאשר באמצעות מכשיר מעקב C-11. במידת האפשר, רצוי לאכול עכברים כל לצינוריות ומגיעה באמצע שלהם בדיקת ct בזמן רכיב המעקב של C-11 במתקן הדמיה כדי להבטיח ריקבון radiotracer מינימלי לפני הזרקת. פרוטוקול שלב אחר שלב זה מתבצע גם בצורה הטובה ביותר על ידי צוות המכיל לפחות 3 חוקרים כדי לאפשר תעלות מהירה, מינון מדידה, הזרקת מעקב, חיית המחמד סריקה של המוח חלוקתה לפני דעיכה רדיואקטיבית משמעותית. זה דורש שני אנשים לנהל את החניכה של הסריקה חיית המחמד, הזרקה של עכברים 4 כל בו זמנית. הסיבה לתחילת הרכישה מחמד רק לפני הזרקת נועד להבטיח שפרמקוקינטיקה ואת הדינמיקה של מעקב להפצה בדם ואזורים עניין במדויק, לגמרי נלכדים. שלבים רבים עשויים לדרוש אימונים מפרכים ותרגול כדי להבטיח את ניהולה של הניסוי. בפרט, פרוטוקול זה תלויה תעלות וריד הזנב מוצלחת של עכברים C57BL/6, אשר יכול להיות קשה, בגלל שיער כהה על הזנבות שלהם, והוא יכול להיות מאתגר יותר לאחר שבץ מוחי או אם בהדמיית העכברים באותו זמן מרובים-נקודות .

שיקול נוסף עבור הדמיה PET כולל הקלטה זהיר של radiotracer במינון של ממסר פעילות מידות, כולל את הזמן המדויק של המדידה. זה חיוני עבור תיקון מדויק דעיכה של המינון מוזרק בזמן הסריקה והוא משמש כדי להשיג של מדידה מדויקת של מעקב ספיגת (קרי, % מזהה/g) עבור כל רואי. זה הכרחי לדעת את הכמות המדויקת של רדיואקטיביות שהיו נוכחים בכל עכבר בזמנו של סריקה כדי להבטיח ניתוח תמונות מדויקות. לכן, מומלץ כדי לסנכרן את השעונים על המחשב סורק, מיגון כדי להימנע משגיאה בעת שימוש איזוטופים קצרת ימים כגון C-11.

כימות מדויק של התמונה חיית המחמד יכול גם להיות מוגבל על ידי למידת הדיוק של הגדרת והסורק. לכן כדי להבטיח כימות מדויק של PET/CT תמונות, חשוב לבצע בדיקות בקרת איכות עבור רכיבים CT וגם חיית המחמד של הסורק. בדיקות בקרת איכות CT כוללות מיזוג מקור רנטגן, כהה/אור ומרכז את הכיול קבע. ולידציות אלה וכולן נכונות עבור מערכת רעש וחייבים להיות שבוצעו לפני רכישת כמומלץ על ידי יצרן הסורק. ולידציות צריכה להתבצע גם עבור הסורק את חיית המחמד. פעולה זו בדרך כלל כרוכה סריקה סריקה "פאנטום רגיל / לחיות מחמד", המכילה ריכוז ידוע של רדיואקטיביות. בעת הכנת התקן, עדיף להשתמש באותו והרדיוזוטופ במחקר, מנה דומה לזה מנוהל על עכבר אחת באמצעי אחסון דומה לגוף של עכבר, ורכישת אותו פרמטרים כמו הדמיה בעלי חיים. מזרק 20 מ"ל מלא radiotracer מדולל במים משמש על התקן של פרוטוקול זה, עם חיית המחמד עוקבות הדמיה התוצאות המשמשת לחישוב מקדם תיקון בהתבסס על המינון בפועל נמדדת הגלאי כיול. היחס תיקון ניתן ליישם את הנתונים הדמיה שרכש את הניסוי כדי להבטיח כימות מדויק של מעקב ספיגת אזורים מעניינים בתמונות חיית המחמד. זה חשבונות עבור טווח פוזיטרון רדיונוקלידים בחינת בכל פעילות רקע נוכח ביום של סריקה. כמו מיגון הוא חלק בלתי נפרד של הדור של פקטור התיקון הזה, זה הכרחי כי הציוד הזה הוא גם מכוילים באופן קבוע על פי הנחיות היצרן.

כאשר עורכים שמחוץ autoradiography חשוב לבחור נקודת הזמן האופטימלי עבור המתת חסד לאחר ההזרקה, כדי להבטיח גבוהה אות-על-רקע region(s) של עניין. שלושים דקות לאחר ההזרקה נבחרתי autoradiography DPA-713 [11ג] שימוש בנתונים שנרכש במהלך דינמי חיית המחמד הדמיה -קרי, ה- ויוו טק דינמי כמדריך, תוך כדי לקיחה בחשבון גם זמן מחצית החיים הקצר של C-11, הפעם מעורב סעיף ולחשוף את רקמת המוח לאחר החילוץ. בהתחשב בכך, autoradiography DPA-713 [11ג] חייב להתבצע על קבוצה נפרדת של עכברים כדי לאפשר הזרקת מינון גבוה יותר DPA-713 [11ג] ו- 30 דקות לנקודת הזמן עבור זלוף, המתת חסד תחת הרדמה. ביצוע יישום קטן ויוו חיית המחמד מחקר פיילוט עם עכברים 3-4 לפני ביצוע שמחוץ autoradiography תהיה שימושית לקביעת נקודת הזמן האופטימלי עבור autoradiography. התחשבות שמחוץ autoradiography נוסף הוא לשחזר את העכברים לאחר ההזרקה או לשמור אותם מרדימים עד המתת חסד. לשמור אותם מרדימים מחקה את התנאים של הסריקה ומבטיחה קינטיקה הפצה או הפרשה radiotracer לא ישונה על ידי שחזור. יתר על כן, הדבר מונע סטרס נוספים על העכברים על ידי הימנעות שחזור אינדוקציה עוקבות. לבסוף, תוספת שימושית בפרוטוקול שמחוץ יהיה להעריך את הנזק האזורי פרוסות המוח משמש autoradiography ויה immunohistochemical מכתים (לאחר דעיכה רדיואקטיבית) כדי ליצור תמונה ברזולוציה גבוהה של מיקום לאוטם ו נפח.

שכן, ישנם מגבלות עם השימוש של מכשיר מעקב C-11 מבוסס ניתן לשנות פרוטוקול זה בקלות עבור מעקב TSPO לשימוש עם F-18 (half-life של מין 109.77) מבוסס, אשר עשוי להיות יותר הרלוונטיים מיקומים ללא ציקלוטרון באתר. בנוסף, פרוטוקול זה מתאר את השימוש מלכודת הדמיה 4-עכבר. אמנם שיטה זו תפוקה גבוהה אופטימלית כאשר באמצעות מכשיר מעקב C-11, פרוטוקול זה ניתן לשינוי עבור אלה באמצעות עכבר אחת הדמיה מיטות. תכנון קפדני והכשרה עקבי הטכניקות המתוארות ב פרוטוקול זה יוביל הדור של שפע של נתונים באמצעות [11ג] DPA-713, אשר יכול להיות מיושם בקלות לחקור את התפקיד של neuroinflammation המחלה כביטוי ו התקדמות במודלים מכרסמים אחרים של הפרעות נוירולוגיות. יתר על כן, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי להעריך את התגובה ויוו immunomodulatory הרפוי מכוון מיקרוגלייה/מקרופאגים.

Disclosures

המחברים מצהירים אין קונפליקטים של אינטרסים.

Acknowledgments

המחברים רוצה להודות המעבדה Buckwalter (במיוחד ד ר טוד. פיטרסון) עבור מתן המודל העכבר, ביצוע הניתוחים dMCAO, העמדת פנים. בנוסף, ברצוננו תודה תומס Liguori מן Invicro לסיוע טכני שלו עם VivoQuant התמונה ניתוח תוכנה, ד ר טים דויל, ד ר לורה פיזאני, ד ר Frezghi הבטה מהחיה קטן SCi3 הדמיה מתקן באוניברסיטת סטנפורד לעצה שלהם, סיוע בפיתוח פרוטוקול זה הדמיה, והמוסד Radiochemistry (במיוחד ד ר ג'ון פארק) על עזרתם עם הסינתזה של [11ג] DPA-713.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Inveon PET/CT scanner Siemens Version 4.2
MRI scanner Varian 7 Telsa
ParaVision software Bruker Version 6.0.1 MRI operating software
VivoQuant software InVicro Version 2.5 Image analysis software
Inveon Research Workspace software Siemens Version 4.2 Scanner operating software. Includes microQView, the post-processing managing software
Dose calibrator Capintech CRC-15 PET
Typhoon phosphor imager 9410 GE Healthcare 8149-30-9410
Butterfly catheters SAI Infusion Technologies BFL-24 27.5 G needle
1 mL syringes BD
Insulin syringes BD 329461 0.5 mL insulin syringes with needle
20 mL syringe  VWR BD302831 BD Syringe Slip Tip Graduated
Tissue glue Santa Cruz Animal Health sc-361931 3 mL
Heat lamp Fluker 27002 5.5" reptile heat lamp with clamp and switch
0.9% sterile saline Pfizer 00409-4888-10 0.9% sodium chloride for injection, 10 mL
Eye lubricant Watson Rugby PV926977 Artificial Tears Lubricant Eye Ointment, 1/8 oz
Chux absorbent sheets ThermoFisher Scientific 1420662 Disposable absorbent padding
Iris scissors World Precision Instruments 503708-12 11.5 cm, Straight, 12-pack
Surgical tape 3M Durapore 1538-0 1/2" x 10 yard roll, silk, hypoallergenic
Mouse PET bed In house 4 mouse PET bed
Lighter Bic UDP2WMDC
Isoflurane Henry Schein NDC 11695-6776-2 Isothesia, inhalation anesthetic, 250 mL
Oxygen Praxiar UN1072 Compressed gas
Autoradiography cassette Cole Palmer EW-21700-34 Aluminum, 8" x 10"
Autoradiography film GE Life Sciences 28-9564-78 Storage Phosphor Screen BAS-IP SR 2025 E Super Resolution, 20 × 25 cm, screen only
Microtome blades ThermoFisher Scientific 30-508-35 MB35 Premier Disposable, 34° cutting angle
Microtome Microm HM 550
Microscope slides Fisher Scientific 12-550-15 Superfrost™ Plus Microscope Slides
OCT liquid VWR 25608-930 Formulation of water-soluble glycols and resins for cryostat sectioning at temperatures of -10°C (14°F) and below
Freezing molds Poly sciences 18646A-1 Disposable paraffin molds
Saran wrap Saran 25700001300
Disinfectant Virkon S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Benjamin, E. J., et al. Heart disease and stroke statistics-2017 update: A report from the american heart association. Circulation. 135 (10), 146-603 (2017).
  2. Jin, R., Yang, G., Li, G. Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells. J Leukoc Biol. 87 (5), 779-789 (2010).
  3. Wang, Q., Tang, X. N., Yenari, M. A. The inflammatory response in stroke. J Neuroimmunol. 184 (1-2), 53-68 (2007).
  4. Brown, R. C., Papadopoulos, V. Role of the peripheral-type benzodiazepine receptor in adrenal and brain steroidogenesis. Int Rev Neurobiol. 46, 117-143 (2001).
  5. Papadopoulos, V., Lecanu, L., Brown, R. C., Han, Z., Yao, Z. X. Peripheral-type benzodiazepine receptor in neurosteroid biosynthesis, neuropathology and neurological disorders. Neuroscience. 138 (3), 749-756 (2006).
  6. Scarf, A. M., Kassiou, M. The translocator protein. J Nucl Med. 52 (5), 677-680 (2011).
  7. Cerami, C., Perani, D. Imaging neuroinflammation in ischemic stroke and in the atherosclerotic vascular disease. Curr Vasc Pharmacol. 13 (2), 218-222 (2015).
  8. Stefaniak, J., O'Brien, J. Imaging of neuroinflammation in dementia: a review. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 87 (1), 21-28 (2016).
  9. Gerhard, A. TSPO imaging in parkinsonian disorders. Clin Transl Imaging. 4, 183-190 (2016).
  10. Airas, L., Rissanen, E., Rinne, J. O. Imaging neuroinflammation in multiple sclerosis using TSPO-PET. Clin Transl Imaging. 3, 461-473 (2015).
  11. Fan, J., Lindemann, P., Feuilloley, M. G., Papadopoulos, V. Structural and functional evolution of the translocator protein (18 kDa). Curr Mol Med. 12 (4), 369-386 (2012).
  12. James, M. L., et al. Synthesis and in vivo evaluation of a novel peripheral benzodiazepine receptor PET radioligand. Bioorg Med Chem. 13 (22), 6188-6194 (2005).
  13. Boutin, H., et al. 11C-DPA-713: A novel peripheral benzodiazepine receptor PET ligand for in vivo imaging of neuroinflammation. J Nucl Med. 48 (4), 573-581 (2007).
  14. Doyle, K. P., Buckwalter, M. S. A mouse model of permanent focal ischemia: distal middle cerebral artery occlusion. Methods Mol Biol. 1135, 103-110 (2014).
  15. Wang, Y., et al. [(18)F]DPA-714 PET imaging of AMD3100 treatment in a mouse model of stroke. Mol Pharm. 11 (18), 3463-3470 (2014).
  16. Domercq, M., et al. PET Imaging with [(18)F]FSPG evidences the role of system xc(-) on brain inflammation following cerebral ischemia in rats. Theranostics. 6 (11), 1753-1767 (2016).
  17. Toth, M., et al. Acute neuroinflammation in a clinically relevant focal cortical ischemic stroke model in rat: longitudinal positron emission tomography and immunofluorescent tracking. Brain Struct Funct. 221 (3), 1279-1290 (2016).
  18. Walter, H. L., et al. In vivo analysis of neuroinflammation in the late chronic phase after experimental stroke. Neuroscience. 292, 71-80 (2015).
  19. Rojas, S., et al. Imaging brain inflammation with [(11)C]PK11195 by PET and induction of the peripheral-type benzodiazepine receptor after transient focal ischemia in rats. J Cereb Blood Flow Metab. 27 (12), 1975-1986 (2007).
  20. Glazier, S. S., O'Rourke, D. M., Graham, D. I., Welsh, F. A. Induction of ischemic tolerance following brief focal ischemia in rat brain. J Cereb Blood Flow Metab. 14 (4), 545-553 (1994).

Tags

רפואה גיליון 136 Neuroinflammation translocator חלבון 18 kDa (TSPO) טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET) תהודה מגנטית הדמיה (MRI) דימות מוחי שבץ עכברים.
ללטף הדמיה של Neuroinflammation באמצעות [<sup>11</sup>ג] DPA-713 במודל של עכברים של שבץ איסכמי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chaney, A. M., Johnson, E. M.,… More

Chaney, A. M., Johnson, E. M., Cropper, H. C., James, M. L. PET Imaging of Neuroinflammation Using [11C]DPA-713 in a Mouse Model of Ischemic Stroke. J. Vis. Exp. (136), e57243, doi:10.3791/57243 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter