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Medicine

애완 동물 Neuroinflammation [11C] DPA-713을 사용 하 여 허 혈 성 뇌졸중의 마우스 모델에서의 영상

Published: June 14, 2018 doi: 10.3791/57243
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Radiology, Stanford University, 2Department of Neurology and Neurological Sciences, Stanford University

Summary

양전자 방출 단층 촬영 (PET) 이미징 translocator 단백질 18 kDa (TSPO)의 개발에 neuroinflammation의 동적 역할 및 뇌 질환의 진행을 시각화 하 비-침략 적 수단을 제공 합니다. 이 프로토콜에는 허 혈 성 뇌졸중의 마우스 모델에서 neuroinflammation를 검색 하기 위해 TSPO-애완 동물 및 비보 전 autoradiography를 설명 합니다.

Abstract

Neuroinflammation은 뇌경색을 다음과 같은 병 적인 캐스케이드에 중앙 이다. 비-침략 적 분자 이미징 방법 임시 역학과 뇌졸중에 특정 neuroimmune 상호 작용의 역할에 대 한 중요 한 통찰력을 제공 하기 위해 가능성이 있다. 특히, 양전자 방출 단층 촬영 (PET) 이미징 translocator 단백질 18 (TSPO), kDa 활성화 microglia 및 주변 혈통 골수성 세포의 감 적의를 감지 하 여 neuroinflammation 비보를 추적 수단을 제공 합니다. 여기, 선물이 neuroinflammation를 사용 하 여 정확 하 게 계량 하는 방법 [11C]N,N-Diethyl-2-[2-(4-methoxyphenyl)-5,7-dimethylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]acetamide ([11C] DPA-713), 유망한 2 세대 TSPO-애완 동물 radiotracer, 원심 중간 대뇌 동맥 폐색 (dMCAO) 운영 하는 가짜 쥐에 비해. MRI는 뇌졸중을 확인 하 고 경색 위치와 볼륨 정의 수행된 2 일 포스트 dMCAO 수술을 했다. 애완 동물/계산 단층 촬영 (CT) 영상 캡처 다음 스트로크 TSPO 수준에서 피크 증가 6 일 포스트 dMCAO 실행 되었다. 애완 동물 이미지의 정량 [11C]의 통풍 관을 평가 하기 위해 실시 되었다 두뇌와 중앙과 주변 염증의 수준을 평가 하기 위해 dMCAO와 가짜 쥐의 비장에 DPA-713. Vivo에서 [11C] DPA 713 뇌 이해 autoradiography 비보 전 을 사용 하 여 확인 되었다.

Introduction

뇌졸중 사망의 다섯 번째 주요 원인이 고 미국1에 장애의 주요 원인입니다. 허 혈 성 뇌졸중 발생 하는 경우 (예: 혈액 응고 또는 지방 예금) 뇌에 혈액의 흐름에 지역화 된 중단의이 경우 (~ 87%), 압도적인 다를 나타냅니다. 영향을 받는 지역에 산소와 영양소 공급 감소 이후 하 고 복잡 한 pathologic 폭포 주변 지역 외에 선 코어 (경색) 내 신경 죽음의 결과로 시작 됩니다. Neuroinflammation 두 주민 두뇌 면역 세포 (microglia)이이 손상으로 이어지는 통로에 중요 한 구성 요소 이며이에 기여할 생각 주변 면역 세포 (호 중구, T 세포, B 세포, 및 monocytes/대 식 세포) 침투 파괴적인 캐스케이드2,3. 활성화 된 microglia 및 대 식 세포는 뇌경색2다음과 같은 해로운과 유익한 효과의 보고서와 함께이 neuroinflammatory 응답을 중앙. 따라서, 뇌졸중 다음이 셀의 비보에 기여를 평가 하는 것이 필수적 이다.

애완 동물 이다 vivo에서 11C, 13N, 방사성을 방출 하는 양전자 (β +)으로 표시 하는 특정 분자의 사용을 통해 처리 하는 생물학의 시각화를 가능 하 게 강력한 3 차원 분자 이미징 기술 15O와 18f. 이 비-침략 적 방법 생활 그대로 과목, 실시간으로, 분자 정보 수집을 허용 하 고 경도 조사 허용 전 비보 방법 (예: immunohistochemistry)에 비해 많은 이점이 있다. 애완 동물 TSPO, 활성화 microglia 및 주변 혈통 골수성 세포의 표식의 계량 및 신체 내에서, 타고 난 면역 세포 응답을 추적 하는 수단을 제공 합니다 영상과 선과 응답 치료 후 염증을 평가 하기 위해 이용 될 수 있다 개입입니다. TSPO, 이전 주변 장치 형 다이아 수용 체로 알려진 콜레스테롤 수송 및 neurosteroids4의 합성에 역할으로 18 kDa 단백질 이다. 또한, 증거 TSPO neuroinflammation에 신경 생존5,6, 염증 선7를 포함 하 여 관련 된 많은 신경 성 질환의 증가 식의 보고서와 관련 되어 제안 8치 매, 파 킨 슨 병9 그리고 다 발성 경화 증10. TSPO는 외부 미토 콘 드리 아 막에 있으며 매우 주변, 특히 스테로이드 관련된 조직 (예: 분 비)와 심장, 신장, 그리고 폐10에서 중간 수준에에서 표시 됩니다. 그러나 건강 한 뇌, TSPO 레벨은 낮고 명과6,11주로 제한. 시 신경 손상, 뇌졸중, 관찰 등 중앙 신경 시스템 (CNS)에 TSPO 수준을 크게 증가. TSPO의 관찰된이 upregulation 식 수준의 염증의 심각도의 정확한 표시기를 제공 하 이미지 neuroinflammation vivo에서 에 악용 될 수 있습니다. 따라서,이 방법의 목표는 정확 하 게 계량 neuroinflammation TSPO-애완 동물을 사용 하 여 허 혈 성 뇌졸중의 마우스 모델에서의비보에 기여

여러 TSPO 추적기 개발 된 neuroinflammation의 애완 동물 화상 진 찰에 대 한. 여기, TSPO-애완 동물 영상 설명 [11C] DPA-71312를 사용 하 여 유망한 2 세대 TSPO 추적, 향상 된 신호 소음 및 일반적인 바인딩 보다 더 역사적으로 사용된 [11C]를 표시 한 PK11195 13 . 예를 들어, 뇌졸중의 dMCAO 마우스 모델이 방법14에 대 한 선정 되었습니다. 이 모델에는 일시적인 craniotomy somatosensory 피 초점 국 소 빈 혈 결과 원심 중간 대뇌 동맥의 영구 결 찰 포함 됩니다. 이 전 임상 선 연구의 허 혈 성 손상 및이 모델과 관련 된 낮은 사망률 높은 재현성 때문에 유리 하다. 날짜 하려면, TSPO-애완 동물 이미징 연구는 아직 dMCAO 설치류 모델에 보고 됩니다. 그러나, 이전 애완 동물 이미징 연구 중간 대뇌 동맥 폐색 (MCAO) 모델을 사용 하 여, 쥐와 쥐, 더 심각 하 고 가변 스트로크 모델 보고 3 일 및 7 일 후 스트로크15, 주위 피크 증가 TSPO 식 16,,1718. 따라서, 우리는 높은 TSPO 식에 맞춰 6 일 포스트-dMCAO 이미징 애완 동물을 수행. [11C] 뇌의 DPA 713 이해 (infarcted) 동측에 평가 되었다 고 contralateral 반구. TSPO 애완 동물 구조 MRI, 경색의 정확한 묘사와 관심사 (ROIs)의 contralateral 지역 수와 결합 되었다. 여기 우리 아틀라스 기반 및 [11C] DPA-713 이해를 계산 하는 MRI 기반 ROI 접근을 설명 합니다. 비장에 radiotracer 이해 그룹 간의 염증의 주변 수준 조사를 평가 했다. 이 방법은 spatiotemporal 역학과 뇌졸중 및 기타 신경학 상 질병에 특정 neuroimmune 상호 작용의 역할에 대 한 중요 한 통찰력을 제공 하는.

Protocol

모든 동물 연구는 행정 패널에 실험실 동물 케어 (APLAC) 스탠포드 대학, 평가 및 실험 동물 관리 인증 협회에 의해 신임 된 프로그램에 따라 실시 했다. 이 절차를 하기 전에 3 개월 C57BL/6 여성 쥐 표준 절차 및 살 균 조건14dMCAO 수술을 받았다.

1. 구조 MRI (2 일 포스트 dMCAO 수술)

  1. 오픈 운영 소프트웨어 ( 재료의 표참조) 및 설정 새로운 시험을 작성 하 여 수집. 팔레트 탐색기에서 지역화 및 turborare T2 시퀀스를 선택 하 고 시험 창으로 끕니다.
  2. 호흡기는 보안 소프트 테이프를 사용 하 여 마우스 침대에 프로브를 열 및 무 균 환경을 만들기 위해 둘 다에 패딩 보호 흡수의 스트립을 배치.
  3. 동물 침대에 공기 히터를 연결 및 팬은 따뜻한 공기에 설정 하 고가 열 하는 마우스를 유지. 신체 온도 호흡 속도 스캔 하는 동안 적절 한 수준에서 유지 되도록 자동된 모니터링 시스템을 사용 합니다.
  4. (2 L/min, 100% O2) 1-2%에서 3 %Isoflurane 처음, 다음 유지를 사용 하 여 유도 실에서 마우스 anesthetize 열 패드 마우스를 유도 하는 동안 따뜻하게 유지를 유도 챔버 아래 설정 되어 있는지 확인 합니다. 일단 마 취, 건조 하 고 각 막 궤 양 형성을 피하기 위해 마우스를 눈 윤 활 유를 적용.
    1. MRI 스캐너에 연결 된 마 취 시스템 (Isoflurane 1-2%, 2 L/분 100% o 2)를 켜고 마우스 침대에 동물을 전송.
    2. 위치 마우스 머리-경향이 물린 바 귀 바 수정에 장소, 그들은 침대의 지름 밖에 내 다 할 다는 것을 확인.
    3. 마우스 머리 RF 코일을 코일 침대 isocenter에 맞게 배치 구멍에 밀어.
    4. 모든 3 차원에서 마우스 위치를 확인 하 고이 이미지를 사용 하 여 t 2 turborare에 대 한 볼륨 정의에 지역화를 취득 (테: 33 ms, TR: 2500 ms, 2 평균, 17 조각, 0.083 x 0.92 m m 해상도, 총 시간을 2 분 40 초) 인수. dMCAO 수술 결과 somatosensory 피14; 경색에 따라서,이 지역 t 2가 중 이미지에 적용 확인 합니다.
    5. 스캐너에서 쥐를 제거 하 고 온수 챔버에 쥐를 복구.

2. PET/CT 교정 및 워크플로 설정 (6 일 포스트 dMCAO 수술)

  1. CT 감쇠 인수, 60 분 C-11 동적 애완 동물 수집 (350-650 keV 레벨 차별, 3.438 ns 우연 창), 히스토그램을 포함 하도록 스캐너 작동 소프트웨어에서 이미징 작업 흐름 만들기 (20 프레임: 5 15 초, 4 x 1 분, 11 x 5 분 x;와 죽은 시간 수정) x 0.96 m m 복 크기 0.776 x 0.776 3DOSEM OP 재건 (2 반복, 18 하위 집합)를 128 x 128 x 159 만드는 이미지와.
  2. 인터페이스의 왼쪽된 위 모퉁이에 있는 코네티컷 보정 패널을 통해 컨디셔닝 x-ray 소스를 수행 합니다. 이 교정 한다 실시 또는 검사 하기 전에 시스템 지난 48 h에 사용 되지 않은 경우.
  3. 어둠/빛 (d /) 및 (c/O)의 교정 센터 오프셋을 수행 합니다.
    1. 상단에 있는 보도 CT 보정 버튼 (X)는 인터페이스의 왼쪽.
    2. 선택 d / c/O를 실행 될 것입니다 코네티컷 파일 제거 침대는 미사일 구조물에서 하 고 d / 보정을 실행.
    3. 스캐너에 교정 도구 침대를 삽입 하 고 실행 "70mm 팔레트" 대신 "교정 도구" 인터페이스 선택 스위치를 C/O 교정.
  4. 교정 도구를 제거 하 고 다시 "70mm 팔레트" 인터페이스에서 선택으로 변경 하는 표준 애완 동물 침대를 반환 합니다.
  5. 테이프를 사용 하 여 스캐너 플랫폼에 4 마우스 이미징 침대를 확보 하 고 마 취 튜브 (그림 1A)를 연결 합니다. 그 isoflurane이 흐르는 튜브 그리고 거기에 아무 꼬임 확인 합니다.
  6. 시야 (FOV)의 중심에 CT 문을 닫고 침대는 올바른 위치에 있도록 CT의 스카우트 보기 얻을 그래서 앞으로 침대를 밀어.
  7. 방사선 소스로 C-11 솔루션의 알려진된 복용량을 포함 하는 사내 제조 팬텀을 사용 하 여 PET/CT 스캐너의 "표준" 보정을 수행 합니다.
    1. 20 mL 주사기에 해당 추적기 복용량으로 가득 한 마우스 (~ 250-350 µCi/9-식 염 수에 희석 C-11 추적 프로그램의 13 MBq) 관리를 준비 합니다.
    2. 표준 복용량 교정기를 사용 하 여 활동을 기록 하 고 측정의 시간 합니다.
    3. (위에서 설명한) 대로 이미지 마우스 사용 될 정확한 동일한 매개 변수를 사용 하 여 표준의 PET/CT 검사를 실시 합니다. 이미지 데이터에 적용 하는 애완 동물 스캐너에 대 한 수정 계수를 만들이 주간 할.

3. PET/CT 영상에 대 한 작업 영역 설정

  1. Virucide 살 균 제를 사용 하 여 살 균 환경 만들기 ( 재료의 표참조) 모든 표면에 흡수 성 패딩 보호를 배치 하 고.
  2. Isoflurane 및 산소 탱크 가득 적절 하 게 확인 하십시오.
  3. 0.9% 염화 나트륨 (멸 균 식 염 수)와 함께 1 mL 주사기 (27.5 G 바늘 팁 장착)를 작성 하 고 27.5 G, 24 cm 나비 카 테 터를 통해 홍 조 하 여 꼬리 정 맥 카 테 터를 준비 합니다. Cannulating 꼬리 정 맥의 보기를 차단 하지 않습니다 수 있도록 고 쉽게 테를 전치 하지 않고 스캐너에 쥐를 이동 하기 전에 카 테 터의 날개를 잘라.
  4. 모든 필수 장비는 배치 예비 "플러시" 주사기 (메 마른 염 분 가득)를 포함 하 여 워크스테이션에서 눈 윤 활 유, 에탄올 면봉, 열 램프, 카 테 터 (전 염 분 가득), 외과 테이프, 조직 접착제, 0.5 mL 복용량 주사기를 준비 확인 가 위, 그리고 꼬리 정 맥 (그림 1B) 성공적인 배치 후 카 테 터를 밀봉 하는 라이터.

4. 동물 준비 및 Cannulation

  1. 무게 (즉, 추적의 볼륨과 체중의 10%를 초과 하지 모든 염 분 관리 해야 합니다) 각 마우스에 주입 수 최대 볼륨을 결정 하는 마우스.
  2. 3%를 사용 하 여 유도 실에서 쥐 anesthetize Isoflurane 고 1-2% (2 L/분 100% O2) 유지.
  3. 각 마우스를 눈 윤 활 유를 적용 하 고 anesthetization 페달 반사 (발가락 꼬 집 음)를 통해 확인 합니다. 필요한 경우 마 취 레벨을 조정 합니다.
  4. 1-2% (2 L/분 100% O2)에서 isoflurane를 배달 하는 원뿔 장착 온수 침대 위에 마우스를 놓습니다.
  5. 마우스 마 취 동안 꼬리 정 맥 cannulation 다음 프로토콜을 사용 하 여 수행.
    1. 코 콘에서 머리 유지 하면서 측면 혈관 중 하나를 노출 하는 쪽에 마우스를 놓습니다.
    2. 따뜻한 꼬리 정 맥을 팽창 하 고 사출 사이트 소독을 과열 또는 꼬리를 굽기 알코올 닦아와 면봉 주의 열 램프를 사용 하 여.
    3. 경사와 바늘을 잡고와 예 각에서 정 맥으로 맞춥니다.
    4. 가볍게 피부를 찌르는 정 맥 라인은 바늘에 밖으로 레벨을 압력을 적용 됩니다.
    5. 부드럽게 밀어 앞으로 경사 과거 몇 밀리미터 그래서 바늘 들어가는 정 맥.
    6. 확인 테에서 염 분의 작은 (10-20 µ L) 플러시를 관리 합니다. 식 염 수 주사기를 원활 하 게 떠나야 한다 고 지워야 정 맥. 어떤 저항 또는 뒤로 압력 관찰 되는 경우 높습니다 카 테 터는 정 맥에서 이며 cannulation 다시 시도 하는 것이 좋습니다. 응고, 관찰 cannulation 설치 및 홍 조에 대 한 헤 파 린 (mL 염 분 당 1000 단위 덤플링을)를 사용 합니다.
      참고: 우리와 관심, 마우스 스트레인에 헤 파 린 없이 cannulation 평가 고 염 분 혼자 cannulations를 위해 사용 되었다 아무 응고 관찰 했다 때문.
    7. 스캐너에 쥐를 전송할 때 테 움직이기 힘 드는 유지 되도록 조직 접착제, 외과 테이프, 다음의 작은 방울을 사용 하 여 꼬리를 카 테 터를 보호 합니다.
    8. 카 테 터의 끝에서 플러시 주사기를 제거 및 라이터와 끝 인감, 모든 isoflurane 또는 에탄올은 연구원을 보장.
    9. 검사할 모든 4 쥐 cannulated 준비 3 추가 마우스를 반복 합니다.
  6. 마 취 흐름 (2.5 %Isoflurane, 2 L/분 100% O2)는 PET/CT와 신중 하 게 위치 마우스 보장 카 스캐너 평판에서 발생 하기 쉬운 장소에 남아에 연결 설정 하 고 각 마우스의 머리는 직선과 원뿔 내 보안. 테이프 머리 하 고 호흡을 보장 하는 부드러운 외과 테이프와 침대를 각 마우스의 시체는 테이프의 배치에 의해 제한 되지 않습니다. 정확한 위치 및 이미지 분석에 대 한 그룹 할당에 대 한 허용 하도록 각 마우스의 위치를 기록 합니다.
  7. 마우스 (예를 들어, 마우스 과열 없이 따뜻한 유지 되도록 열 램프 또는 뜨거운 공기 펌프 시스템을 사용 하 여) 절차를 통해가 열 유지 합니다. 오픈 갠트리를 사용 하는 경우에 시각적으로 또는 호흡기 패드를 사용 하 여 원격 모니터링 시스템을 통해 모든 생쥐의 호흡 속도 모니터링 하 고 필요에 따라 마 취 레벨을 변경.

5. CT 수집

  1. 일단 동물 침대에서 안전 하 고 호흡이 안정, 머리카락 그리고 그들은 모든 4 개의 쥐의 두뇌와 정렬 있도록 침대 스캔 이동 레이저를 켭니다. 스캐너 평판 가능한 FOV의 옆으로 쥐의 두뇌와 수집 위치 (위치 3)로 이동 합니다.
  2. (200mm FOV 사용), 그들의 위치를 확인 하 고 필요한 경우 인터페이스에서 FOV 상자를 드래그 하 여 위치를 조정 하려면 마우스의 스카우트 보기 이미지를 취득 합니다. 애완 동물 검사 추적 프로그램 삽입 전에 수동으로 시작 될 수 있도록 "대화형 사용자 프롬프트 표시"를 선택 하는 CT 스캔 하려면 스캐너 소프트웨어에서 "워크플로 시작"을 클릭 합니다.

6. [11C] DPA-713 복용량 준비

  1. [11C] 합성 DPA-713 이전 실험실 외 투, 장갑, 그리고 개인 몸과 손가락 않습니까를 포함 하 여 방사능을 처리 하기 위한 적절 한 PPE (개인 보호 장비)를 입고 보장12, 설명. 장갑 방사성 오염을 방지 하기 위해 정기적으로 변경 하 고 가능 하면 방사성 근원에서 거리 증가 확인 합니다.
  2. 집게를 사용 하 여 신중 하 게 리드 방패 뒤에 radiotracer 유리병을 전송.
  3. 0.5 mL 복용량 주사기 약 250-350 µCi/9-13 MBq 60 분 동적 PET 스캔에 대 한 적절 한 복용량을 위해 100-200 µ L 볼륨에 포함 된 각 마우스에 대 한 준비 (복용량 관리 결정 되어야 한다 동위 원소와 타임 라인의 반감기를 고려 연구 디자인, 마우스 무게에 따라 볼륨).
  4. 측정 복용량 교정기를 사용 하 여 활동 cannulation 사이트에 가까운 근접에 있는 C-11로 설정 하 고 측정 및 부패 교정 활성화를 주입 시간을 기록 합니다. 감퇴를 제한 하 여 방사능의 원하는 수준의 CT 끝 각 마우스에 주입 됩니다 직전 복용량을 그립니다.
  5. 없는 기포 복용량 주사기에는 활동을 측정 하 고 각 마우스에 주입 하기 전에 확인 합니다.

7. 애완 동물 수집

  1. 일단 쥐는 자동으로 애완 동물에 코네티컷에서 사전, [11C] DPA-713 주입 (그림 1C)에 대 한 스캐너의 뒤를 설정 합니다. 난 간에 보호 흡수 성 패딩을 놓고가 위, 라이터는 손에 다는 것을 확인 합니다.
  2. 밀봉된 카 테 테 르 튜브가 위로 싹 둑, 카 테 터 라인 모든 거품의 명확 하 고 확인는 정 정 맥에서 10-20 µ L 염 플러시를 수행 하 여 확인 합니다. 6.4 어떤 복용량 주어진 각 마우스의 트랙 4 카 테 터의 각 단계에서 측정 된 복용량 주사기를 로드 합니다.
  3. 애완 동물 검사 동시에 10 초 타이머를 시작 하는 동안 시작 준비가 되 면 "확인"을 클릭 합니다. 있다 복용량 주사기와 스캐너 뒷면 두 연구원 손에, 타이머가 0에 도달 시 동시에 모든 4 쥐를 주입. 염 분의 50-100 µ L 각 카 테 터를 플러시 (카 테 테 르 튜브의 길이 따라- 즉, 죽은 볼륨) 전체 복용량 입력 꼬리 정 맥, 다는 것을 확인 하 고 다시 봉인 라이터를 사용 하 여 다시 한 번 튜브를.
  4. 복용량 주사기 복용량 교정기를 사용 하 여 잔여 방사능 값 (모든 추적기는 주사기에 남아)를 측정 합니다. 기록 시간과 값의 기록해 둡니다.
  5. 검사가 완료 되 면 홈 모션 내 수평 "홈" 버튼을 사용 하 여 원래 위치에 애완 동물 침대 제어 패널. 스캐너에서 쥐를 제거 하 고 카 테 터를 조심 스럽게 제거 합니다. 부드럽게 과도 한 출혈을 방지 하기 위해 cannulation 사이트에 압력을 적용 됩니다.
  6. 앞에서 설명한 복용량 캘 리브레이 터를 사용 하 여 카 테 터에 잔여 활동을 측정 합니다.
  7. 마우스를 복구 해야 하는 경우 (예를 들어, 아래가 열된 패드 또는 따뜻한 물으로 채워진 장갑을 포함 하는 상자에서) 따뜻한 환경에서 이렇게 확인 복구 쉽게 하기 위해. 쥐를 안락사 계획, 쥐를 관류를 통해 안락사 전에 anaesthetized 남아 있도록 isoflurane 포함 된 유도 챔버를 넣으십시오.
  8. 데이터를 재구성 하 오픈 후 처리 관리 소프트웨어 (참조 테이블의 자료)는 자동으로 lst 파일에서 생성 된 히스토그램 데이터를 사용 하 여 각 스캔을 재구성 합니다.

8. 뇌 Autoradiography

  1. 실험 전에 10-15 분에 대 한 빛을 흰색 사용까지 방사능 없는 지역에서 계속 하 그것을 노출 하 여 디지털 autoradiography 영화를 지웁니다.
  2. 약 1.0-1.5 mCi/37-56 MBq autoradiography에 대 한 적절 한 복용량을 위해를 포함 하는 각 마우스에 대 한 0.5 mL 복용량 주사기를 준비 합니다.
  3. 활동의 정확한 결과 얻기 위해 주입 이전 복용량 교정기를 사용 하 여 복용량 주사기에 방사능을 측정 합니다.
  4. 앞에서 설명한 대로 cannulate와 방사능에 대 한 적당 한 지역에서 즉시 쥐를 주입.
  5. 주입 후 카 테 터를 제거 하 고 잔여 방사능을 측정 한다.
  6. 그들은 계속 이전에 관류와 안락사 anaesthetized 쥐 온수 유도 챔버에 둡니다.
  7. 동안 마우스 anaesthetized 깊이 안락사를 수행 (4%의 지속적인 흡입 Isoflurane, 2 L/분 100% O2) PBS 관류 및 양자 thoracotomy 30 분 후 [11C] DPA-713 사출을 통해.
    1. 복 부 구멍을 열고 마음을 노출 하는 격 막 통과.
    2. 심장의 좌 심 실에 나비 카 테 테 르 주입 바늘을 삽입 하 고 오른쪽 아 트리 움 및 열 등 한 베 나 정 맥을 싹 둑.
    3. 천천히 PBS를 가진 perfuse (~ 20-30 mL) 20 mL 주사기를 사용 하 여.
  8. 집게와가 위를 사용 하 여 두개골에서 뇌를 조심 스럽게 제거 합니다.
  9. 장소 냉동 형에서 뇌 가득한 최적의 절삭 온도 (10 월) 액체, 후 각 전구 (제공 랜드마크와 방향을 한 번 뇌를 금형에 계단 쪽으로 지향 인지 두뇌 수준 및 금형, 내 중심으로 만들기 에서 제거 됩니다 금형).
  10. 10 대 한 드라이 아이스에 장소 형-15 분 또는 OCT 불투명 될 때까지.
  11. 즉시 각 몰드-18 ° C로 cryostat 톰 설정에 놓고 장착 전에 10 분 동안 equilibrate.
  12. 벗 겨 냉동 형 고 두뇌 "접착제"로 신선한 10 월의 작은 금액을 사용 하 여 톰 플랫폼에 탑재.
  13. 2 분 동안 동결 톰에 탑재 된 뇌를 남겨 주세요.
  14. 뇌를 통해 슬라이스 스트로크 위치 될 때까지 노출 (즉, 투자 수익). 미스터 이미지를 사용 하 여 각 동물의 두뇌 내의 경색을 찾습니다. DMCAO,이 일관 되 게에 있어야 somatosensory 피 질; 그러나, 선의 길이 약간 달라질 수 있습니다.
  15. 경색, 적절 한 마우스 번호로 표시 된 유리 현미경 슬라이드 20 µ m 두께 섹션 배치를 확장 하는 두뇌의 섹션 지역.
  16. Autoradiography 카세트 열고 한 장의 포장지와 카세트의 바닥을 일렬로 세우십시오. 슬라이드 섹션 카세트에 비닐 랩 위에 쪽 하 고 각 슬라이드의 위치를 기록해 드립니다. 필요한 경우 나중에 분석을 지원 하기 위해 슬라이드 배치의 사진을 찍을.
  17. 부드럽게 포장지의 또 다른 레이어 위에 (다음 마지막 뇌 섹션-건조 하 고 슬라이드에 준수 허용의 컬렉션 ~ 2 분 후) 놓고 신중 하 게 슬라이드 위에 디지털 autoradiography 필름 (흰색 면이 아래로)를 배치 합니다.
  18. 카세트를 단단히 닫고 수 있도록 적절 한 노출 시간 (~ 5-10 반감기)에 대 한 영화에 부패 섹션-20 ° C 냉동 고에 두고.
  19. 이후 분석에 대 한 디지털 이미지를 생성 하는 인광 체 영상을 사용 하 여 노출 시간 후 영화를 검색 합니다.

9. 동적 애완 동물 이미지 분석

  1. 오픈 이미지 분석 소프트웨어 ( 재료의 표참조) 고 CT 이미지 (원본)으로 로드 "데이터 열기" 아이콘을 (참조)로 동적 애완 동물 로드 "데이터 추가" 아이콘을 클릭 합니다.
  2. 드롭 다운 메뉴에서 시계열 연산자를 통해 데이터의 시각적 품질 관리 수행: 참조 ("ref") 및 "세계"를 선택 하 고 적용 한 적절 한 최소 및 최대 색 눈금에 대 한. 프레임별으로, 방사능 이해 확인 동적 애완 동물 데이터를 시각화 하 고 스캔 내 혼동 한다 어떤 동작에 대 한 확인.
  3. "산술 연산자"를 사용 하 여 평균 애완 동물 이미지를 만듭니다.
    1. "평균 선택" 선택, "ref"의 선택을 취소 하 고 입력된 1 ("Inp1"), 입력된 2 ("Inp2") 및 입력된 스타 ("Inp *"-스캔에서 애완 동물 프레임의 나머지를 포함) 모든 애완 동물 프레임의 평균을 만드는 선택.
    2. "데이터 매니저" 탭 (DM)에 고 평균 이미지 시각화 목적 "input1" 위치까지 끕니다. "최소-최대" 도구에서 자동 계산을 클릭 하 여 색 눈금을 다시 배포 합니다.
  4. "다시 orientation/등록" 메뉴에서 "자동 3D" 기능을 사용 하 여 평균 애완 동물 파일에 CT를 등록 합니다.
    1. "Ref"와 "Inp1"를 선택 하 고 "엄밀한", "빠른", "Inp1 Ref" 등록을 선택 하십시오. 시각적으로 모든 3 차원에서 등록을 확인 하 고 수동으로 조정 하는 "번역"과 "회전" 기능을 사용 하 여 "수동 3D" 탭에 필요한 경우.
    2. 등록으로 만족 하는 경우 "Inp2"와 "Inp *"를 선택 하 고 체크 표시를 클릭 하 여 모든 애완 동물 프레임에 적용. DM에서 CT와 애완 동물 파일을 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 raw로 저장.
  5. 뇌 분석 가이드로 CT를 사용 하 여 한 번에 한 마우스의 뇌를 자르기: "자르기" 드롭 다운 메뉴에서 선택 하 고 brainstem 아래 마우스의 머리를 자르기 이미지 경계를 끕니다. 다시는 두개골 모든 차원에서 바로 위에서 설명한 대로 "수동 3D 재교육" 기능을 사용 하 여 애완 동물 및 CT 이미지를 찾으시는.
  6. 인터페이스의 왼쪽 상단에 "데이터 추가" 버튼을 사용 하 여 (DICOM 형식)에 마우스를 그 이미지에서 로드 합니다. "수동 3D 재교육"를 사용 하 여 씨를 이동 하 고 CT 이미지 내의 두개골에 적합 (모든 형식 같은 방향 있는지 확인).
  7. "3D ROI 도구"를 사용 하 여 씨 이미지에 ROI 스트로크를 그립니다.
    1. 애완 동물 시각화 시각적 컨트롤러 탭 (VC) 선택을 취소 하 여 끄고만 MR과 CT를 사용 하 여 투자 수익을 그립니다.
    2. 새로운 투자 수익을 만들고 이름을 "경색"에 "투자 수익"추가 버튼을 클릭 합니다. "스플라인 도구", 왼쪽 ROI 테두리를 그리는 하 고 그것을 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 여 선택 합니다.
    3. 캡처하는 투자 수익에서 두개골의 두개골 테두리와 선 투자 수익 사이의 복 간격을 두고 하는 것이 좋습니다 하지 않도록 만드는 획을 포괄 하는 모든 분할 영역을 통해 반복 합니다.
  8. 경색 볼륨을 사용 하 여 contralateral 투자 수익을 생성 합니다.
    1. 새로운 투자 수익 만들고 "contralateral" 레이블을 지정 합니다. 경색 ROI를 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 "내보내기"를 선택 합니다. 위치 2 ("Inp1")를 투자 수익을 끕니다.
    2. 유일한 "Inp1" 선택와 왼쪽된 오른쪽 플립 "재교육/등록" 메뉴 내 "연산자" 기능을 사용 하 여 적용 합니다. "투자 수익" 상자를 체크 "보기 전용", 선택 하 고 수동으로 contralateral 측면에 동일한 지역에 새로운 투자 수익을 이동. "산술" 연산자를 선택 하 고 2의 스칼라 곱셈 ROIs의 독립적인 정량화를 허용 하는 새로운 투자 수익에 적용.
    3. 3D ROI 도구를 반환 합니다. "전문가 및 실험" 탭에가 고 "투자 수익 가져오기" 버튼을 클릭 합니다. Contralateral ROI와 새로운 볼륨을 로드 대화 상자에서 Inp1를 선택 합니다.
  9. 평균 애완 동물 이미지를 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 그것을 언로 드 하 고 애완 동물 다시 켭니다. 3D ROI 도구 내에서 "결과 내보내기" 아이콘을 사용 하 여 양적 이해 결과 생성 합니다.
  10. (즉, 자동 오른쪽 왼쪽된 두뇌 반구 지역 Vivoquant 소프트웨어에 대 한 3 차원 마우스 뇌 아틀라스 플러그인 모듈을 사용 하 여 대의 투자 수익 발생)을 원하는 경우 추가 분할 뇌 분석을 수행 합니다.
    1. 다시 등록 된 PET/CT 이미지를 로드 합니다.
    2. "고급 모듈" 메뉴를 클릭 하 고 3D 뇌 아틀라스 도구를 선택 하 여 마우스 뇌 아틀라스를 가져옵니다. "모든 지역 왼쪽/오른쪽"에서 "고급 설정"을 선택 하 고 3 차원 아틀라스를 가져오려면 "실행"을 클릭 합니다.
    3. 수동으로 국경으로 두개골을 사용 하 여 뇌 내 아틀라스를 맞는.
    4. 다시 실행 하 여 모든 14 왼쪽과 오른쪽 반구 ROIs (수 질, 소 뇌, midbrain, 폰, 피 질, 해 마, 시상, 시상 하 부가, 마, 후 각 전구에 대 한 결과의 스프레드시트를 생성 하기 위해 "3D 투자 수익 가져오기" 선택 되어 있는지 확인 하 고 아틀라스 신체 callosum 그리고 백색 질)입니다.
  11. 운영 소프트웨어 스캐너를 사용 하 여 비장 통풍 관 추적 프로그램을 계량 (재료의 표 참조).
    1. 데이터베이스에 그들을 강조 하 고 "일반 분석"을 클릭 하 여 애완 동물 및 CT 이미지 파일을 로드 합니다.
    2. 등록 탭에서 클릭 하 고 공동 "엄밀한 등록" 아이콘을 클릭 하는 애완 동물 및 CT 이미지를 등록.
    3. 투자 수익 정량화 탭에서 클릭 합니다, 그리고 "투자 수익 만들기" 아이콘을 클릭 하 고 비장 이름을.
    4. 그리는 비장 ROIs 참조에 대 한 CT 파일을 사용 하 여 신장 통풍 관 (애완 동물 이미지를 사용 하 고 신장에서 다른 일을 피하기 위해 신호)와 아무 중복 보장 "구체" 도구를 선택 합니다.
    5. 동물 사이 일관 된 투자 수익 볼륨을 유지 하기 위해 ROIs를 편집 합니다.
  12. 글귀 정규화에 대 한 표준 보정 값을 계산 합니다.
    1. 표준 검사에서 PET/CT 데이터를 로드 하 고 실린더 "수동 3D ROI" 도구를 사용 하 여 20 mL 주사기를 포괄 하는 투자 수익을 만듭니다.
    2. 스프레드시트 아이콘을 사용 하 여 표준에 포함 된 방사능의 수준을 가져옵니다.
    3. NCi/cc 결과이 고 원래 기록 된 방사능 표준 (즉, nCi/cc에서 표준의 복용량 보정 측정)에 대 한 애완 동물 통풍 관 값에 대 한 수정 계수를 사용. 즉, 표준의 애완 동물 이미지에서 계산 하는 방사능에 의해 복용량 캘 리브레이 터에 의해 기록 된 표준의 방사능을 나눕니다.
  13. 감퇴 애완 동물 수집의 시간에 정확한 측정 시간과 복용량 활동을 사용 하 여 모든 마우스 (즉, 계산 애완 동물 검사의 시작 복용량 활동).
  14. 잔여 분에 대 한 반복 하 고 각 동물 받은 계산 하는 정확한 활동을 감퇴 수정된 복용량에서 뺍니다.
  15. 이 감퇴 보정을 적용 한 후 데이터 오른쪽 활동 수준에 있는지 확인 표준 보정도 적용 됩니다. 이러한 수정을 수동으로 그려진된 ROI 결과 및 dMCAO 위치 (즉, 피 질, 해 마가)에 대 한 뇌 아틀라스 투자 수익 데이터 관련 뇌 영역에 적용 됩니다 확인 하십시오.
  16. 다음 수식을 사용 하 여 모든 ROIs는 %ID/g 계산: %ID/g = (nCi/cc에서 ROI 방사능 / 부패 nCi/cc에 접수 하는 수정 된 복용량) x 100. 그래픽 소프트웨어를 사용 하 여 각 투자 수익에 대 한 시간 활동 곡선을 생성 하는 시간의 기능으로 %ID/g을 플롯 합니다.
  17. 스캐너 소프트웨어를 사용 하 여 최종 이미지 시각화 및 그림 생성에 대 한. 이미지 검색 시 각 마우스 받은 부패 교정된 복용량에 따라 정상화, 동일한 %ID/g 규모는 모든 이미지를 보장.
    참고: 이것은 다른 마우스에서 이미지 및/또는 다른 일에 수행 하는 연구에서 이미지의 정확한 비교를 사용 하도록 설정 하는 데 필요한

10. autoradiography 이미지 분석

  1. ImageJ 소프트웨어에서 디지털 이미지 (.gel 파일)를 엽니다. 시각적으로 임계값 이미지 명암과 밝기를 조정 하 고 적절 한 색 "조회 테이블"를 적용.
    참고: 로얄 가장 정확 하 게 유사한 애완 동물에 사용 하는 색 눈금
  2. 투자 수익 관리자를 사용 하 여 수동으로 경색 및 해당 contralateral 지역 ROIs를 그릴.
  3. 측정 함수를 사용 하 여 각 ROI의 평균 픽셀 강도 측정 하 고 결과 내보낼. 통계 소프트웨어를 사용 하 여 플롯 합니다.

Representative Results

마우스 수술 성공 선과 [11C] 확인 MRI DPA-713 애완 동물 4 마우스를 동시에 검색 하 여 실행 되었다. 애완 동물, CT 및 MR 이미지 공동 등록 이전에 수동으로 뇌 ROIs를 드로잉 하 고 반자동된 분할 뇌 아틀라스 분석 동측 contralateral 지역 (그림 2) 통풍 관 추적 조사를 했다.

PET/CT 이미지 및 시간 활동 곡선 (시간의 기능으로 공군 radiotracer 활동) 동측 contralateral 반구 (그림 3A) 대에서 증가 [11C] DPA-713 통풍 관을 표시합니다. 50-60 분에서 표현 하는 사용 하 여 동적 애완 동물 뇌 이미지의 정량화 데이터 공개 추적 통풍 관 (%ID / g)는 동측에 (infarcted) 사용 하 여 수동으로 그려진 가짜 쥐에만 dMCAO, contralateral 반구에 비해 크게 증가 투자 수익 접근 방식 (그림 3B). 증가 된 통풍 관 또한 dMCAO 및 가짜 쥐 사이 동측 반구에서 관찰 되었다. 동측 contralateral 반구 사이의 중요 한 차이가 아틀라스 ROIs (보통 somatosensory 피 질 제한) 경색의 크기 보다 더 크게 되 고 따라서 diluting 인해 가능성이 아틀라스 방식을 사용 하 여 관찰 했다는 신호입니다. 그러나, dMCAO 가짜에 비해 전반적인 증가 된 통풍 관은 관찰 모든 ROIs 경색19외부 지역에 있는 증가 TSPO 식 시연 MCAO 모델 마우스를 사용 하 여 이전 보고서 정렬 하. 동측 contralateral 비율; 두 가지 방법을 사용 하 여 가짜 쥐 대 dMCAO에서 증가 했다 그러나,이 다름은만 투자 수익 접근 방식에 큰 차이 때문 뇌 아틀라스 접근을 사용 하는 피 질에서 중요 한 이었다. 이 각 그룹에 있는 쥐의 수를 증가 하 여 극복할 수 있습니다. [11C] DPA-713 글귀 비장에의 부 량 그룹 (그림 4) 사이 상당한 차이가 나타났다.

뇌 dMCAO 마우스 애완 동물 화상 진 찰 결과 ex vivo 높은 해상도 디지털 autoradiography (그림 5)에 의해 확인 되었다. 증가 [11C] DPA-713 통풍 관은 건강 한 뇌 조직 주변에 무시할 수 신호 infarcted 조직에서 관찰 되었다. 이러한 이미지의 정량 동측 1.4에서 2.09 dMCAO 마우스에 이르기까지 contralateral 비율을 밝혔다.

Figure 1
그림 1: 애완 동물 스캐너 및 작업 영역 설정. 모든 작업은 무 균 환경을 만들기 위해 보호 흡수 성 패딩에 덮여 있었다. (A) 교정, 후 4 마우스를 동시에 이미징 위해 3D 인쇄 마우스 침대 스캐너 및 마 취에 연결 된 모든 4 쥐 코 콘에서 확보 했다. (B) 애완 동물 화상 진 찰에 대 한 필요한 장비 준비 되었다 사전에 식 염 수 채워진 27.5 G 카 눈 윤 활 유, 에탄올 면봉, 열 램프, 외과 테이프, 조직 접착제, 0.5 mL 복용량 주사기가 위, 라이터를 포함 하 여. (C) radiotracer 주입, 식 염 수-플러시 주사기와 스캐너 뒤가 위 장소. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 동측 Contralateral 수익과 오른쪽/왼쪽-분할 반구 뇌 아틀라스 애완 동물 이미지 분석 과정. 이미지 분석 소프트웨어는 수동으로 사용 하 여 관심사 (ROIs)의 동측 contralateral 지역에 추적 프로그램 도입을 결정 하는 데 사용 되었다 그려진 ROIs 및 반자동된 3D 분할 아틀라스 접근. 자동 3D PET/CT 등록은 CT 이미지에 정의 된 해당 마우스 두개골 내에서 뇌 MRI의 수동 등록 뒤 실시 됐다. 3D ROI 도구를 수동으로 동측 (빨간색)을 그리는 데 사용 및 contralateral (녹색) ROIs MRI에는 경색을 사용 하 여 참조로. 분할 방법에 대 한 3D 왼쪽/오른쪽-분할 마우스 뇌 아틀라스 로드 되었고 CT 이미지에서 정의 된 두개골 안에 장착. 뇌 ROIs이 3D 마우스 뇌 아틀라스에서 정량화에 대 한 사용 포함 왼쪽 피 질 (어두운 회색), 왼쪽 해 마 (수레 국화 파란색), 왼쪽이 (딥 핑크), 오른쪽 피 질 (토마토 레드), 오른쪽 해 마 (녹색), 그리고 오른쪽 Striatium (청록색). [11C]의 통풍 관 각 지역에서 DPA 713 nCi/cc에서 얻은 고 각 마우스에 대 한 검색의 시간에서 부패 수정 복용량을 정상화 하 여 그 후에 %ID/g 변환 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 : DMCAO에 가짜 쥐 DPA-713 뇌 이해 대표 Vivo에서 [11C]. (A) 동적 PET/CT 이미지와 공군 입증 받았다 DMCAO 쥐의 동측 외피에 증가 [11C] DPA-713 글귀 (n = 3) 가짜에 대 한 약간의 증가 (n = 3) 운영 하는 상당히 큰 시연 DMCAO 쥐와 쥐 경색과 뇌 (%ID/g)의 contralateral 측 사이 비율 주입 된 복용량에 대비. (B) 애완 동물 정량화 (50-60 분 요약) 동측 ROI ROI 접근을 사용 하 여 그리고 분할 아틀라스 접근을 사용 하 여 피 질 (Ctx)에 크게 증가 된 통풍 관을 밝혔다. 상당한 차이가 마 (HC) 또는 (Str)에서 발견 됐다. 분석 모두를 사용 하 여 접근 했지만 뇌 아틀라스 방식을 사용 하 여 Ctx에 통계적으로 유의 한 증가를 contralateral 동측 비율 보였다. * (p < 0.05), * * * (p < 0.001) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: DMCAO에 대표 비보 [11C] DPA-713 비장 글귀와 가짜 쥐. (A) [11C] DPA 713 동적 PET/CT 이미지를 보여주는 비장 ROIs dMCAO에서 (n = 3)와 가짜 (n = 3) 쥐. (B) 양적 결과 dMCAO 및 가짜 쥐 사이 비장 이해에 중요 한 결과 보여 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5 : 대표 Autoradiography 결과. 디지털 autoradiography 이미지 contralateral 반구에 비해 증가 [11C] DPA-713 통풍 관은 동측에서 보여 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

제시 프로토콜 [11C]를 사용 하 여 dMCAO와 가짜 쥐에서 neuroinflammation의 정량화 하는 방법에 설명 합니다 DPA-713-애완 동물 TSPO 애완 동물 시각화 및 neuroinflammation에서 비보에 날짜에 대 한 가장 널리 조사 이미징 바이오 마커 이다. TSPO 식 비-침략 적 탐지와 정량화 neuroinflammation의 염증 동안 뇌에서 명과에 upregulated입니다. 또한, 그것은 매우 번역 기술, 임상 및 전 임상 연구에 귀중 한 도구를 만드는입니다. 이 프로토콜 및 대표 결과 강조 [11C]를 사용 하 여의 적 부를 감지 하 여 획 및 다른 신경 성 질환에 vivo에서에서 neuroinflammatory 변경 모니터링 DPA-713 애완 동물.

이 연구에서는 dMCAO 수술 실시 되었다 3 개월 C57BL/6 여성 쥐를 사용 하 여. 상승 제한 선 (예: 중간 대뇌 동맥의 다른 모델에 비해 낮은 가변성 영구적인 초점 허 혈의 모델을 제공 하는 somatosensory 피 질 높은 재현성 경색을 준다이 모델 선정 되었다 폐색 (MCAO) 필 라 멘 트 방법)14. 뇌졸중 모델의 애완 동물 이미징 contralateral 반구 내의 ROIs를 사용 하 여 각 동물에 대 한 뇌의 내부 참조 영역을 포함 하의 이점이 있다. 이후 혼자 수술 결과, 수술 가짜 연구 설계에 의하여 쥐 craniotomy를 포함 하는 것이 중요 하다 고 동맥 폐색 없이 meninges의 조작을 수행한 일부 염증이 있을 것입니다. 혼자 craniotomy 기본 신경 조직과 면역 응답 선20의 독립에 지도 하는 병원 체의 도입 중단 될 수 있습니다. 위장 수술 후 염증 일부는 따라서와 신호 때문에 혼자 수술의 가능성을 제외 하려면 dMCAO 동시에 평가 합니다. DMCAO 코 호트 분석에 선 없이 수술에서 발생 하는 염증 등을 피하기 위해, 미스터 이미징 성공적인 뇌졸중 수술 및 경색 개발 확인을 실시 해야 합니다. MRI는 또한 정확 하 게 경색 contralateral ROIs를 그리는 데 필수적 이다 구조 참조 프레임을 제공 합니다. 또한, 정확한 이미지 처리 이미지 등록 및 투자 수익의 정의 포함 하 여 신뢰할 수 있는 정량화를 위해 필요 하다.

C-11 애완 동물 및 autoradiography 연구 radiotracers 분류 작업 시 추가 제한 마음에 지켜져야 한다. 일반적으로 연구 기관 현지 싸이 클 로트 론 액세스 제한 사용 C-11, 짧은 반감기 (20.33 분)를 고려 하는 것이 필수적입니다. 적절 한 방사능 운송 경로, 복용량 관리 및 수집 시간-포인트 결정 되어야 합니다 사전에 실험의 워크플로의 미리 준비 된 자세한 계획 팀은 신속 하 고 효율적으로 일할 수 있도록. 디자인과이 연구의 C-11 추적 프로그램을 사용 하 여 데이터 출력을 얻을 수를 증가 하는 동시에 4 쥐의 이미지에 맞게 설명 되어 있다. 가능 하면, 그것은 모든 마우스 cannulated 권장 고 C-11 추적 프로그램 주입 전에 최소 radiotracer 감퇴 되도록 이미징 시설에 도착 하는 때 그들의 CT 검사 중간. 이 단계별 프로토콜은 또한 가장 빠른 cannulation, 복용량 측정, 추적 프로그램 삽입, 애완 동물 스캐닝 및 중요 한 방사성 붕괴 이전 뇌 단면 수 있도록 적어도 3 연구자를 포함 하는 팀에 의해 수행 됩니다. 애완 동물 검사의 시작 및 모든 4 쥐의 주입을 동시에 수행 하는 두 사람이 필요 합니다. 사출 직전 애완 동물 수집 시작 이유 약 동학 및 혈액에서 추적 프로그램 배포의 역학 및 관심 영역 정확 하 고 완전 하 게 캡처 되도록. 활발 한 교육 및 실험의 원활한 실행을 보장 하는 것 많은 단계가 필요할 수 있습니다. 특히,이 프로토콜은 그들의 꼬리에 검은 머리 때문에 어려울 수 있으며 뇌졸중 발생 한 후 또는 여러 시간-포인트에 동일한 마우스를 이미징 하는 경우 더 많은 도전 될 수 있습니다 C57BL/6 쥐의 성공적인 꼬리 정 맥 cannulation에 의존 .

애완 동물 화상 진 찰에 대 한 또 다른 고려 사항은 radiotracer 복용량 및 잔여 활동 측정, 측정의 정확한 시간을 포함 하 여의 주의 기록 포함 되어 있습니다. 이 검사의 때에 주입 된 복용량의 정확한 부패 정정 필수적 이며 각 투자 수익에 대 한 추적 프로그램 이해 (즉, %ID / g)의 정확 하 게 측정을 얻는 데 사용 됩니다. 정확한 이미지 분석을 보장 하기 위해 스캔의 시간에 각 마우스에 존재 하는 방사능의 정확한 금액을 알고 필수적입니다. 따라서, 그것은 복용량 교정기 C-11 같은 수명이 짧은 동위 원소를 사용 하 여 오류를 방지 하려면 스캐너 컴퓨터에 시계를 동기화 하는 것이 좋습니다.

정확한 애완 동물 이미지 정량화 또한 스캐너와 설치의 정확성에 의해 제한 될 수 있습니다. 따라서 PET/CT 이미지의 정확한 정량화를 위해, 그것은 스캐너의 CT와 애완 동물 구성 요소에 대 한 품질 관리 검사를 수행 하는 것이 중요. CT 품질 관리 검사 x-레이 소스 컨디셔닝, 다크/라이트, 및 설정된 교정 떨어져 센터 포함 됩니다. 이러한 교정 측정 되며 시스템 잡음과 해야 합니다에 대 한 올바른 인수 수행된 전에 스캐너 제조업체에서 권장 하는 대로. 교정은 또한 애완 동물 스캐너에 대 한 수행 되어야 한다. 이 일반적으로 알려진된 농도의 방사능을 포함 하는 "표준 / 애완 동물 팬텀" 스캔 스캔 포함 됩니다. 준비할 때 표준, 연구, 동물 영상으로 매개 변수는 마우스와 같은 수집의 본문에 비슷한 볼륨에서 단일 마우스를 관리에 비해 복용량에에서 사용 된 동일한 방사성 동위 원소를 사용 하 여 최상 이다. 물에 희석 radiotracer 가득 20 mL 주사기가 프로토콜에서 표준 교정 감지기에 의해 측정 된 실제 복용량에 따라 수정 계수를 계산 하는 데 사용 이후 애완 동물 이미징 결과 함께 사용 됩니다. 수정 비율 애완 동물 이미지에 대 한 관심의 영역에서 추적 통풍의 정확한 정량화를 위해 실험에서 얻은 영상 데이터에 적용할 수 있습니다. 이 검사의 날에 모든 백그라운드 작업을 고려 이외에 방사성 핵 종 양전자 범위에 대 한 계정. 복용량 교정기가 수정 계수의 세대의 필수적인 부분으로,이 장비 제조업체 지침에 따라 정기적으로 보정도 필수적입니다.

Ex vivo autoradiography 할 때 그것은 높은 신호-에-배경 관심의 지구에 되도록 주입 후 안락사에 대 한 최적의 시간 포인트를 선택 하는 것이 중요. 30 분 포스트 주입에는 vivo에서 [11C] DPA-713 autoradiography 동적 애완 동물 이미지-즉, 하는 동안 수집 된 데이터를 사용 하 여에 대 한 선정 가이드로, 또한 시간과 C-11의 짧은 반감기를 고려 하는 동안 동적 공군 섹션을 추출 후 뇌 조직의 노출 관련. 이것을 고려 하면 [11C] DPA-713 autoradiography 높은 [11C] DPA-713 복용량과 30 분의 주입을 위해 수 있도록 마우스의 별도 코 호트에서 수행 되어야 합니다 관류와 마 취 안락사에 대 한 시간-포인트. 작은 vivo에서 수행 autoradiography 비보 전 을 실시 하기 전에 3-4 쥐와 함께 애완 동물 파일럿 연구 autoradiography에 대 한 최적의 시간 포인트를 결정 하기 위한 도움이 될 것입니다. Ex vivo autoradiography에 대 한 추가 고려 생쥐 주입 후 복구 하거나 안락사까지 마 취 유지 여부입니다. 마 취 유지 스캔의 조건을 모방 하 고 radiotracer 배포 또는 배설 속도 론 복구에 의해 변경 되지 않습니다. 또한,이 복구 및 후속 유도 방지 하 여 쥐에 추가적인 스트레스를 방지 합니다. 마지막으로, ex vivo 프로토콜에 대 한 유용한 추가 immunohistochemical 경색 위치의 고해상도 이미지를 생성 하 (방사능 감쇄) 후 얼룩 통해 autoradiography 사용 두뇌 조각에서 지역 피해를 평가 하는 것과 볼륨입니다.

C-11 기반 추적 프로그램의 사용 제한으로,이 프로토콜은 더 현지 싸이 클 로트 론 없이 위치에 적용 될 수 있는 기반 F-18 (109.77 분의 반감기)와 함께 사용 TSPO 추적기에 대 한 쉽게 수정할 수 있습니다. 또한,이 프로토콜 4 마우스 이미지 설정의 사용을 설명합니다. 비록이 높은 처리량 방법 최적의 C-11 추적 프로그램을 사용 하는 경우,이 프로토콜은 침대를 이미징 한 마우스를 사용 하 여 그 또한 수정할 수 있습니다. 신중 하 게 계획 하 고이 프로토콜에 설명 된 기술 일관 된 훈련 [11C]를 사용 하 여 데이터의 생성으로 이어질 것입니다 DPA-713, neuroinflammation 질병 징후에의 역할을 쉽게 적용할 수 있는 고 신경 장애의 다른 설치류 모델에서의 진행 또한,이 기술은 immunomodulatory 치료 대상으로 microglia/세포 vivo에서 응답을 평가 하기 위해 사용 될 수 있습니다.

Disclosures

저자 관심 없음 충돌 선언합니다.

Acknowledgments

저자는 마우스 모델을 제공 하 고 dMCAO와 가짜 수술을 수행할 Buckwalter 연구소 (특히 박사 토 드 피터슨) 감사 하 고 싶습니다. 또한, 우리 Invicro에서 토마스 Liguori VivoQuant 이미지 분석 소프트웨어, 박사 팀도 일, 닥터로 라 피사, 스탠포드 대학에서 그들의 조언에 대 한 시설 이미징 SCi3 작은 동물에서 박사 Frezghi Habte와 그의 기술 지원에 대 한 감사 하 고 싶습니다, 이 이미징 프로토콜 및 Radiochemistry 시설 (특히 박사 6 월 공원) 그들의 도움 [11C]의 합성 개발에 지원 DPA-713.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Inveon PET/CT scanner Siemens Version 4.2
MRI scanner Varian 7 Telsa
ParaVision software Bruker Version 6.0.1 MRI operating software
VivoQuant software InVicro Version 2.5 Image analysis software
Inveon Research Workspace software Siemens Version 4.2 Scanner operating software. Includes microQView, the post-processing managing software
Dose calibrator Capintech CRC-15 PET
Typhoon phosphor imager 9410 GE Healthcare 8149-30-9410
Butterfly catheters SAI Infusion Technologies BFL-24 27.5 G needle
1 mL syringes BD
Insulin syringes BD 329461 0.5 mL insulin syringes with needle
20 mL syringe  VWR BD302831 BD Syringe Slip Tip Graduated
Tissue glue Santa Cruz Animal Health sc-361931 3 mL
Heat lamp Fluker 27002 5.5" reptile heat lamp with clamp and switch
0.9% sterile saline Pfizer 00409-4888-10 0.9% sodium chloride for injection, 10 mL
Eye lubricant Watson Rugby PV926977 Artificial Tears Lubricant Eye Ointment, 1/8 oz
Chux absorbent sheets ThermoFisher Scientific 1420662 Disposable absorbent padding
Iris scissors World Precision Instruments 503708-12 11.5 cm, Straight, 12-pack
Surgical tape 3M Durapore 1538-0 1/2" x 10 yard roll, silk, hypoallergenic
Mouse PET bed In house 4 mouse PET bed
Lighter Bic UDP2WMDC
Isoflurane Henry Schein NDC 11695-6776-2 Isothesia, inhalation anesthetic, 250 mL
Oxygen Praxiar UN1072 Compressed gas
Autoradiography cassette Cole Palmer EW-21700-34 Aluminum, 8" x 10"
Autoradiography film GE Life Sciences 28-9564-78 Storage Phosphor Screen BAS-IP SR 2025 E Super Resolution, 20 × 25 cm, screen only
Microtome blades ThermoFisher Scientific 30-508-35 MB35 Premier Disposable, 34° cutting angle
Microtome Microm HM 550
Microscope slides Fisher Scientific 12-550-15 Superfrost™ Plus Microscope Slides
OCT liquid VWR 25608-930 Formulation of water-soluble glycols and resins for cryostat sectioning at temperatures of -10°C (14°F) and below
Freezing molds Poly sciences 18646A-1 Disposable paraffin molds
Saran wrap Saran 25700001300
Disinfectant Virkon S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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의학 문제 136 Neuroinflammation translocator 단백질 18 kDa (TSPO) 양전자 방출 단층 촬영 (PET) 자기 공명 영상 (MRI) neuroimaging 스트로크 마우스.
애완 동물 Neuroinflammation [<sup>11</sup>C] DPA-713을 사용 하 여 허 혈 성 뇌졸중의 마우스 모델에서의 영상
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Chaney, A. M., Johnson, E. M.,… More

Chaney, A. M., Johnson, E. M., Cropper, H. C., James, M. L. PET Imaging of Neuroinflammation Using [11C]DPA-713 in a Mouse Model of Ischemic Stroke. J. Vis. Exp. (136), e57243, doi:10.3791/57243 (2018).

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