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PET-Bildgebung des Neuroinflammation mit [11C] DPA-713 in einem Mausmodell des ischämischen Schlaganfalls

Published: June 14, 2018 doi: 10.3791/57243
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Radiology, Stanford University, 2Department of Neurology and Neurological Sciences, Stanford University

Summary

Positronen-Emissions-Tomographie (PET) Bildgebung der Nyrianer Protein 18 kDa (bestreiten) bietet eine nicht-invasive Möglichkeit, die dynamische Rolle der Neuroinflammation in die Entwicklung und das Fortschreiten von Gehirnerkrankungen zu visualisieren. Dieses Protokoll beschreibt bestreiten-PET und ex-Vivo Autoradiographie um Neuroinflammation in einem Mausmodell der ischämischen Schlaganfall zu erkennen.

Abstract

Neuroinflammation ist zentral für die pathologischen Kaskade nach ischämischen Schlaganfall. Nicht-invasive molekularen bildgebende Verfahren haben das Potenzial, kritische Einblicke in die zeitliche Dynamik und die Rolle von bestimmten Neuroimmune Interaktionen im Takt. Insbesondere stellt die Positronen-Emissions-Tomographie (PET) Bildgebung der Nyrianer Protein 18 kDa (bestreiten), ein Marker für aktivierte Mikroglia und peripheren myeloid Abstammung Zellen Mittel zum erkennen und verfolgen Neuroinflammation in Vivo. Hier präsentieren wir eine Methode, um genau quantifizieren Neuroinflammation mit [11C]N,N-Diethyl-2-[2-(4-methoxyphenyl)-5,7-dimethylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]acetamide ([11C] DPA-713), eine viel versprechende zweite Generation bestreiten-PET Radiotracer distale mittlere zerebrale Arterie Okklusion (dMCAO) im Vergleich zum Schein betrieben Mäuse. MRI wurde durchgeführt 2 Tage Post-dMCAO Chirurgie bestätigen Schlaganfall und Infarkt Lage und Volumen zu definieren. PET/Computertomographie Computertomographie (CT) Bildgebung erfolgte 6 Tage Post-dMCAO, die Spitze Anstieg bestreiten nach Schlaganfall zu erfassen. Quantifizierung der PET-Bildern wurde durchgeführt, um die Aufnahme von [11C] bewerten DPA-713 in Gehirn und Milz von Mäusen, dMCAO und Sham, zentrale und periphere Ebenen der Entzündung zu beurteilen. In vivo [11C] DPA-713 Gehirn Aufnahme wurde mit ex-Vivo Autoradiographie bestätigt.

Introduction

Der Schlaganfall ist die fünfthäufigste Todesursache und eine der Hauptursachen der Behinderung in die Vereinigten Staaten1. Ischämischen Schlaganfall stellt eine überwältigende Mehrheit dieser Fälle (~ 87 %), auftritt, wenn lokalisierte des Blutflusses zum Gehirn (z. B. durch ein Blutgerinnsel oder fetthaltige Ablagerung Störung). Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoff in die betroffenen Gebiete sind gekürzt und eine komplexe Kaskade pathologische neuronale Todesfolge innerhalb des Kerns der Schlaganfall (Hirninfarkt) zusätzlich zu den umliegenden Gebieten eingeleitet. Neuroinflammation ist eine entscheidende Komponente in den Weg zu dieser führen, mit beiden resident Gehirn Immunzellen (Mikroglia) und peripheren Immunzellen (Neutrophile, T-Zellen, B-Zellen und Monozyten/Makrophagen) zu infiltrieren soll dazu beitragen zerstörerische Kaskade2,3. Aktivierte Mikroglia und Makrophagen stehen im Mittelpunkt dieses schwere Reaktion mit Berichte über schädliche und vorteilhafte Wirkungen nach ischämischen Schlaganfall2. Daher ist es unerlässlich, den in-Vivo -Beitrag dieser Zellen nach Schlaganfall zu bewerten.

PET ist eine leistungsstarke 3-dimensionale Molekulare bildgebende Verfahren, die ermöglicht die Visualisierung der biologischen Prozesse in Vivo durch den Einsatz von bestimmten Molekülen, beschriftet mit Positronen (β +) emittierende Radionuklide wie 11C, 13N, 15O und 18F. Diese nicht-invasive Methode hat viele Vorteile gegenüber Ex-Vivo -Methoden (z. B. Immunohistochemistry) wie es den Erwerb von molekularen Informationen in Echtzeit in lebendigen intakten Subjekten ermöglicht und longitudinalen Untersuchung ermöglicht. Haustier Bildgebung bestreiten, ein Marker für aktivierte Mikroglia und peripheren myeloid Abstammung Zellen stellt ein Mittel zur Quantifizierung und angeborene immun-Zell-Reaktionen innerhalb des Körpers zu verfolgen und kann genutzt werden, um Entzündungen nach Schlaganfall und Reaktion auf therapeutische bewerten Interventionen. Bestreiten, früher bekannt als die peripheren Typ Benzodiazepin-Rezeptor ist ein 18 kDa-Protein, die geglaubt wird, um eine Rolle in Cholesterin-Transport und die Synthese von neurosteroiden4. Darüber hinaus Anhaltspunkte dafür, dass Neuroinflammation und neuronale überleben5,6, mit Berichten über erhöhte Ausdruck in vielen neurologischen Erkrankungen mit Entzündungen einschließlich Schlaganfall7bestreiten beteiligt ist, Demenz-8, der Parkinson-Krankheit9 und Multiple Sklerose10. Bestreiten befindet sich im äußeren mitochondrialen Membranen und drückt sich besonders in der Peripherie, insbesondere Steroid zugehörigen Gewebe (z. B. Drüsen) und mit Zwischenebenen in Herz, Nieren und Lunge10gesehen. Aber im gesunden Gehirn, bestreiten Niveaus sind niedrig und beschränkt sich hauptsächlich auf Glia6,11. Bei der neuronalen Verletzung, wie im Takt bestreiten Ebenen in das zentrale Nervensystem (ZNS) deutlich erhöhen. Diese beobachteten Hochregulation der bestreiten kann Bild Neuroinflammation in vivo mit Ausdruck Ebenen bietet eine genaue Anzeige der Entzündung schwere genutzt werden. Daher ist das Ziel dieser Methode genau Quantifizierung derin Vivo -Beitrags von Neuroinflammation in einem Mausmodell des ischämischen Schlaganfalls mit bestreiten-PET.

Mehreren bestreiten Tracer wurden entwickelt für die PET-Bildgebung des Neuroinflammation. Hier bestreiten-PET-Bildgebung wird beschrieben mit [11C] DPA-71312, eine viel versprechende zweite Generation bestreiten Tracer, die gezeigt hat, dass verstärkte Signal gegenüber Rauschen und unspezifischen Bindung als die historisch verwendet [11C] zu senken PK11195 13 . Als Beispiel wurde die dMCAO-Maus-Modell der Schlaganfall für diese Methode14gewählt. Dieses Modell beinhaltet zeitliche Kraniotomie und dauerhafte Unterbindung der distale mittlere zerebrale Arterie, wodurch fokale Ischämie des somatosensorischen Kortex. Dies ist vorteilhaft in der präklinischen Schlaganfall-Forschung durch die hohe Reproduzierbarkeit der ischämischen Schäden und niedrige Sterblichkeitsraten verbunden mit diesem Modell. Bis heute haben bestreiten-PET bildgebende Studien noch im dMCAO Nagetier Modell gemeldet werden. Jedoch frühere PET bildgebenden Studien mit dem mittleren zerebralen Arterie Okklusion (MCAO)-Modell, eine schwerer und Variable Schlaganfall-Modell bei Mäusen und Ratten, berichtet bestreiten Ausdruck, von Tag 3 und Peak ca. 7. Tag nach Schlaganfall15zu erhöhen, 16,17,18. Daher führten wir PET imaging 6 Tage Post-dMCAO mit erhöhten bestreiten Ausdruck zusammenfallen. [11C] DPA-713-Aufnahme im Gehirn wurde in ipsilateral (infarzierte) bewertet und kontralateralen Hemisphäre. Bestreiten-PET wurde mit strukturellen MRT ermöglicht präzise Abgrenzung der Infarkt und kontralateralen Regionen von Interesse (ROIs) kombiniert. Hier beschreiben wir eine Atlas-basierte und ein MRT-gesteuerte ROI-Ansatz [11C] DPA-713 Aufnahme berechnen. Radiotracer Aufnahme in Milz wurde auch bewertet, um periphere Ebenen der Entzündung zwischen Gruppen zu untersuchen. Diese Methode hat das Potenzial, kritische Einblicke in die raumzeitliche Dynamik und die Rolle der spezifischen Neuroimmune Interaktionen in Schlaganfall und anderen neurologischen Erkrankungen.

Protocol

Alle Tierversuche wurden gemäß der Verwaltungs-Panel auf Laboratory Animal Care (APLAC) an der Stanford University, akkreditiert von der Vereinigung für die Begutachtung und Akkreditierung of Laboratory Animal Care Programm durchgeführt. Vor diesem Verfahren operiert drei-Monat-alte C57BL/6 weibliche Mäusen dMCAO nach Standardverfahren und sterilen Bedingungen14.

(1) strukturellen MRT (2 Tage Post-dMCAO Chirurgie)

  1. Die Betriebs-Software zu öffnen (siehe Tabelle der Materialien) und die Übernahme durch die Schaffung einer neuen Prüfung. Wählen Sie den Localizer Turborare T2-Sequenzen in der Palette-Explorer und ziehen Sie in die Prüfung-Fenster.
  2. Sichern Sie der Atemwege und Erhitzen Sie Sonden, um die Maus-Bett mit weichen Klebeband und Streifen Sie einen schützende absorbierende Polsterung über beide eine sterile Umgebung zu schaffen.
  3. Das Tier Bett ein Lufterhitzer beimessen und den Ventilator einschalten, so dass die warme Luft auf und halten die Maus beheizt. Verwenden Sie ein automatisiertes Überwachungssystem, um Körpertemperatur zu gewährleisten und Atemfrequenz sind für die Dauer des Scans auf den geeigneten Ebenen gepflegt.
  4. Die Maus in eine Induktion-Kammer mit 3 % Isofluran zunächst, dann pflegen bei 1-2 % (2 L/min, 100 % O2) zu betäuben. Stellen Sie sicher, dass ein Wärmekissen unter die Induktion Kammer die Maus warm zu halten während der Induktion eingeschaltet ist. Sobald betäubt, gelten Sie Auge Schmiermittel für die Maus, um zu vermeiden, Trocknen und die Bildung von hornhautgeschwüren.
    1. Schalten Sie das Anästhesiesystem (Isofluran 1-2 %, 2 L/min 100 % O2) verbunden mit dem MRI-Scanner und übertragen Sie das Tier auf das Maus-Bett.
    2. Die Maus Kopf-anfällig Position auf der Snack-Bar und befestigen Sie das Ohr bars im Ort, dafür, dass sie nicht außerhalb der Durchmesser des Bettes überstehen.
    3. Schieben Sie HF-Spule über den Kopf der Maus und drücken Sie die Spule und Bett in die Bohrung, indem es speziell für Isozentrum.
    4. Erwerben der Localizer zum Anzeigen der Position des Mauszeigers in allen 3 Dimensionen und dieses Bild verwenden, um die Lautstärke für T2 Turborare definieren (TE: 33 ms, TR: 2.500 ms, 2 Mittelwerte, 17 Scheiben, 0.083 x 0,92 mm Auflösung, 2 min. 40 Sek. Gesamtzeit) Erwerb. dMCAO Operation ergibt ein Infarkt im somatosensorischen Cortex-14; daher sicherstellen Sie, dass diese Region im T2-gewichteten Bild bedeckt ist.
    5. Entfernen Sie die Mäuse aus der Scanner und erholen Sie die Mäuse in einer beheizten Kammer zu.

2. PET/CT Kalibrierungen und Workflow Setup (6 Tage Post-dMCAO Chirurgie)

  1. Erstellen Sie einen imaging Workflow in der Scanner-Betrieb Software auf einem CT Dämpfung Erwerb, 60-minütige c 11 dynamische PET Erwerb (350-650 keV Ebene Diskriminierung, 3.438 ns Zufall Fenster), Histogramm (20 Bilder: 5 x 15 Sek., 4 x 1 min, 11 x 5 min; Tote Zeit Korrektur) und eine 3DOSEM-OP-Rekonstruktion (2 Iterationen, 18 Untergruppen), 128 x 128 x 159 schaffen Bilder mit 0.776 x 0.776 x 0,96 mm Voxel Größe.
  2. Führen Sie Röntgenquelle Konditionierung über die CT-Kalibrierung-Panel befindet sich in der oberen linken Ecke der Benutzeroberfläche aus. Diese Kalibrierung muss durchgeführt werden, wöchentlich oder vor dem Scan Wenn das System in den letzten 48 Stunden nicht benutzt wurde.
  3. Durchführen Sie hell/dunkel (d/l) und Zentrum Offset (C/O) Kalibrierungen.
    1. Der CT Kalibrierung drücken (X) in der oberen linken die Schnittstelle.
    2. Wählen Sie D/L und c/o für die CT-Datei, die Sie ausgeführt werden, entfernen Sie das Bett aus der Gantry und führen Sie die D/L-Kalibrierung.
    3. Legen Sie die Kalibrierung Werkzeug Bett in den Scanner und führen Sie die c/o-Kalibrierung, und achten Sie auf die Auswahl an der Schnittstelle zu "Kalibrierungs-Tool" anstelle von "70 mm-Palette" zu wechseln.
  4. Entfernen Sie die Kalibrierungs-Tool und wieder die PET Standardbett, sicherstellen, dass die Auswahl auf die Schnittstelle wieder auf "70 mm Palette" ändern.
  5. Sichern Sie ein 4-Maus bildgebenden Bett auf die Scanner-Plattform mit Klebeband zu und befestigen Sie den Anästhesie-Schläuche (Abb. 1A). Sicherzustellen Sie, dass diese Isofluran fließt durch die Röhren und gibt es keine Knicke.
  6. Schieben Sie das Bett nach vorne, so es ist in der Mitte des das Sichtfeld (FOV), schließen Sie die CT-Tür und erhalten einen Scout-Blick auf den CT um sicherzustellen, dass das Bett in der richtigen Position ist.
  7. Führen Sie eine "standard" Kalibrierung für die PET/CT-Scanner mit einer Inhouse hergestellten Phantom, eine bekannte Dosis von c-11-Lösung als eine Strahlenquelle enthält.
    1. Bereiten Sie eine 20 mL Spritze gefüllt mit der Tracer-Dosis entspricht, die zu einem einzigen Mausklick (~ 250-350 µCi/9 - 13 MBq c-11 Tracer in Kochsalzlösung verdünnt) verabreicht.
    2. Aufzeichnen der Aktivität in der Norm mit einem dosiseichgerät und notieren Sie die Zeit der Messung.
    3. Führen Sie eine PET/CT-Untersuchung des Standards mit den exakten gleichen Parametern, die Bild-Mäusen verwendet werden (wie oben beschrieben). Tun Sie diese Woche um einen Korrekturfaktor für die PET-Scanner auf die Bilddaten angewendet zu erstellen.

3. Arbeitsbereich Setup für die PET/CT-Bildgebung

  1. Mithilfe eine sterile Umgebung eines Desinfektionsmittels mit viruzid (siehe Tabelle der Materialien) und absorbierende Schutzpolster auf allen Oberflächen.
  2. Sicherstellen Sie, dass Isoflurane und Sauerstoff-Tanks ausreichend gefüllt sind.
  3. Bereiten Sie Heck Vene Katheter eine 1 mL Spritze (ausgestattet mit einer Nadelspitze 27,5 G) mit 0,9 % Natriumchlorid (sterile Kochsalzlösung) füllen und Spülung durch eine 27,5 G, 24 cm Schmetterling Katheter. Schneiden Sie die Flügel des Katheters vor Metallspirale, um sicherzustellen, dass sie nicht die Sicht auf die Rute Vene blockieren und mit Leichtigkeit bewegen die Mäuse in den Scanner ohne Verschieben des Katheters zu helfen.
  4. Sicherzustellen Sie, dass alle wesentlichen Geräte am Arbeitsplatz einschließlich Ersatzteile "flush" Spritzen (gefüllt mit steriler Kochsalzlösung), angelegt ist, Auge Schmiermittel, Ethanol Tupfer, Wärmelampen, vorbereitet von Kathetern (vorausgefüllt mit Kochsalzlösung), chirurgische Band, Gewebekleber, 0,5 mL Dosis Spritzen, Schere und ein Feuerzeug, Katheter nach der erfolgreichen Platzierung im Heck Vene (Abbildung 1B) zu versiegeln.

(4) tierische Vorbereitung und Kanülierung

  1. Wiegen Sie Mäuse um festzustellen, die maximale Lautstärke erlaubt in jeder Maus (d. h. Volumen Tracer und Kochsalzlösung verabreicht muss nicht mehr als 10 % des Körpergewichts) injiziert werden.
  2. Mäuse in einer Induktion Kammer mit 3 % zu betäuben Isoflurane und auf 1 bis 2 % (2 L/min 100 % O2) zu halten.
  3. Jede Maus Auge Schmiermittel zuweisen und Anesthetization per Pedal Reflex (Zehe Prise) bestätigen. Nachstellen Sie Anästhesie-Ebenen ggf..
  4. Platzieren Sie den Mauszeiger auf ein beheiztes Bett, ausgestattet mit einem Prüfkopf Isofluran zu 1-2 % (2 L/min 100 % O2) zu liefern.
  5. Während die Maus betäubt ist, führen Sie Heck Vene Kanülierung verwenden das folgende Protokoll:
    1. Platzieren Sie die Maus auf die Seite einer der seitlichen Venen, während der Kopf bleibt in der Rumpfspitze aussetzen.
    2. Wärmen Sie die Rute mit einer Wärmelampe, wobei Sie darauf achten, nicht zu überhitzen oder brennen die Rute und Tupfer mit Alkohol zu erweitern die Vene und Sterilisieren Sie die Injektionsstelle.
    3. Halten Sie die Nadel mit der Abschrägung und die Vene in einem spitzen Winkel ausrichten.
    4. Drücken Sie leicht an, durchbohren die Haut und die Nadel ausgleichen, so ist es im Einklang mit der Vene.
    5. Schieben Sie nach vorne wenige Millimeter hinter der Abschrägung so dass die Nadel in die Vene betritt.
    6. Bestätigen Sie der Katheter in durch die Gabe von ein klein (10-20 µL) Spülung mit Kochsalzlösung. Die Kochsalzlösung sollte die Spritze reibungslos verlassen und die Vene sollte klar. Wenn keinen Widerstand oder Rückseite Druck beobachtet wird, ist es wahrscheinlich der Katheter ist nicht in die Vene und erneut versuchen Kanülierung ist ratsam. Wenn Blutgerinnung beobachtet wird, verwenden Sie Heparin (1.000 Einheiten Heparin pro mL Kochsalzlösung) für Kanülierung Setup und Spülung.
      Hinweis: Beurteilten wir Kanülierung mit und ohne Heparin in der Maus-Belastung von Interesse, und da keine Blutgerinnung beobachtet wurde, diente Kochsalzlösung allein für Hohlräumen.
    7. Sichern Sie den Katheter am Schwanz mit einem kleinen Tropfen Gewebekleber, gefolgt von chirurgischen Klebeband, um sicherzustellen, dass der Katheter unbeweglich bleibt, wenn die Mäuse auf den Scanner übertragen.
    8. Entfernen Sie die bündige Spritze am Ende des Katheters und Ende mit Feuerzeug versiegeln, Sicherstellung des Forschers ist nicht in der Nähe von jedem Isoflurane oder Ethanol.
    9. Wiederholen Sie für 3 zusätzliche Mäuse, so dass alle 4 Mäuse zu scannenden kanülierte und vorbereitet sind.
  6. Schalten Sie den Anästhesie-Fluss (2,5 % Isofluran, 2 L/min 100 % O2) verbunden, die PET/CT und sorgfältig Position beibehalten werden die Mäuse anfällig in der Scanner-Bett, Katheter zu gewährleisten und jede Maus Kopf ist gerade und sicher in der Rumpfspitze. Kleben Sie den Kopf und der Körper von jeder Maus ans Bett mit weichen chirurgische Band, Atmung zu gewährleisten ist nicht durch die Platzierung des Bandes beschränkt. Zeichnen Sie die Position jeder Maus, um richtigen Speicherort und Gruppe-Zuweisung für die Bildanalyse zu ermöglichen.
  7. Halten Sie Mäuse während des Verfahrens (z. B. mit einer Wärmelampe oder Heißluft-Pump-System um sicherzustellen, dass Mäuse ohne Überhitzung warmgehalten werden) beheizt. Überwachen Sie Atemfrequenz alle Mäuse zu, visuell, wenn eine offene Säulenhalle verwenden oder durch ein Fernüberwachungssystem mit respiratorischen Pads und ändern Sie Anästhesie-Ebenen nach Bedarf zu.

(5) CT-Übernahme

  1. Haben Sie Tiere sind sicher im Bett und Atmung ist stabil, schalten Sie das Laserkreuz Haare und bewegen das Scannen ins Bett, so dass sie mit dem Gehirn von allen vier Mäusen ausrichten. Das Scanner-Bett, die Übernahme Position (Position 3) mit den Gehirnen der Mäuse als nah an der Mitte der FOV wie möglich einziehen.
  2. Ein Scout View-Bild der Mäuse zu überprüfen ihre Position (verwenden Sie ein 200 mm FOV), und passen die Position durch Ziehen der FOV-Box auf der Oberfläche, bei Bedarf zu erwerben. Klicken Sie auf "Start Workflow" in der Scanner-Software zu beginnen, der CT-Scan, und achten Sie auf "Interaktive Benutzerführung anzeigen" auswählen, so dass der PET-Scan manuell vor der Tracer Injektion begonnen werden kann.

6. [11C] DPA-713 Dosis Vorbereitung

  1. Synthetisieren [11C] DPA-713 wie oben beschrieben12, tragen Sie geeignete PSA (persönliche Schutzausrüstung) für den Umgang mit Radioaktivität, einschließlich einen Kittel, Handschuhe und persönlichen Finger und Körper Dosimeter zu gewährleisten. Stellen Sie sicher Sie ändern Handschuhe regelmäßig um radioaktive Kontamination zu verhindern und Ihre Entfernung von der radioaktiven Quelle wenn möglich zu erhöhen.
  2. Verwenden Sie Zange um sorgfältig die Radiotracer Durchstechflasche hinter eine bleiabschirmung übertragen.
  3. Vorbereiten von 0,5 mL Dosis Spritzen für jede Maus mit ca. 250-350 µCi/9-13 MBq in 100-200 µL Volumen um eine Dosis ausreichend für eine 60-minütige dynamische PET-Scan zu gewährleisten (Dosis verabreicht festgelegt werden unter Berücksichtigung der Halbwertszeit des Isotops und Zeit-Linie das Studiendesign, mit dem Volumen abhängig von dem Gewicht der Maus).
  4. Maßnahme, die Aktivität mit einem dosiseichgerät auf c-11, befindet sich in unmittelbarer Nähe zum Ortsbild Kanülierung und erfassen die Zeit der Messung und Injektion Verfall Korrektur zu aktivieren. Erarbeiten Sie die Dosen, kurz bevor die CT enden Verfall zu begrenzen und sorgen für das gewünschte Maß an Radioaktivität in jeder Maus injiziert werden.
  5. Stellen Sie sicher, dass gibt es keine Luftblasen in der Spritze Dosis vor der Messung der Aktivität und Einspritzen in jeder Maus.

7. PET Erwerb

  1. Sobald die Mäuse automatisch aus CT, PET voraus, richten Sie die Rückseite des Scanners Injektionslösung [11C] DPA-713 (Abbildung 1C). Platzieren Sie absorbierende Schutzpolster auf einem Felsvorsprung zu und sicherstellen Sie, dass die Schere und Feuerzeug vorrätig sind.
  2. Snip der versiegelten Katheter Schlauch mit einer Schere, Check Katheter Linien sind frei von Bläschen, und bestätigen Sie die Kanüle ist noch in der Vene durch einen 10-20 µL saline Flush durchführen. Laden Sie die gemessene Dosis Spritzen vom Schritt 6.4 in jeder der 4 Katheter, Überblick zu behalten welche Dosis jede Maus geschenkt wurde.
  3. Klicken Sie auf "OK", wenn die PET-Scan starten, während gleichzeitig ein 10-Sekunden-Timer starten kann. Müssen Sie zwei Forscher auf der Rückseite des Scanners mit der Dosis Spritzen in der hand, alle 4 Mäuse gleichzeitig auf den Timer Null erreichen zu injizieren. Jeder Katheter mit 50-100 µL Kochsalzlösung spülen (abhängig von der Länge der Katheter Schlauch – d. h. das Totvolumen) um sicherzustellen, dass die volle Dosis tritt die Rute Vene, und verschließen den Schlauch wieder einmal mit einem Feuerzeug.
  4. Messen Sie die Dosis Spritzen mit einem dosiseichgerät um eine verbleibende Radioaktivität Wert (Tracer Links in der Spritze) zu erhalten. Notieren Sie die Werte und die Zeit, die sie aufgezeichnet werden.
  5. Sobald der Scan abgeschlossen ist, nach Hause die Haustier Beet in die ursprüngliche Position der horizontalen "home"-Button in der Bewegung mit Bedienfeld. Entfernen Sie die Mäuse aus dem Scanner und entfernen Sie den Katheter vorsichtig. Sanft Druck auf die Kanülierung-Website, um übermäßige Blutungen zu verhindern.
  6. Messen Sie die Restaktivität in den Katheter mit einem dosiseichgerät wie oben beschrieben.
  7. Wenn Mäuse wiederhergestellt werden dafür sorgen, dies geschieht in einer warmen Umgebung (z. B. in einer Box mit einem beheizten Pad unter oder mit einem Handschuh mit warmem Wasser gefüllt), Erholung zu erleichtern. Falls die Mäuse einschläfern, setzen Sie die Mäuse in eine Induktion-Kammer mit Isofluran, so dass sie betäubt vor Euthanasie über Perfusion bleiben.
  8. Um die Daten zu rekonstruieren, die Nachbearbeitung managing Software öffnen (siehe Tabelle der Materialien), die wird automatisch jedem Scan mit der Histogramm-Daten, die über die Lst-Datei generiert wurde zu rekonstruieren.

(8) Gehirn Autoradiographie

  1. Löschen Sie vor dem Experiment digitale Autoradiographie Film indem man es um weißes Licht für 10-15 min und bis zur Verwendung in einer Umgebung frei von Radioaktivität halten.
  2. Jede Maus mit ca. 1,0-1,5 mCi/37-56 MBq Sicherstellung eine Dosis ausreichend für Autoradiographie bereiten Sie 0,5 mL Dosis Spritzen vor.
  3. Messung der Radioaktivität in der Dosis-Spritze, die mit einem dosiseichgerät vor der Injektion, eine genaue Messung der Aktivität zu erhalten.
  4. Cannulate wie zuvor beschrieben und Mäuse sofort in eine Gegend, geeignet für Radioaktivität zu injizieren.
  5. Den Katheter nach der Injektion zu entfernen und die verbleibenden Radioaktivität zu messen.
  6. Lassen Sie die Mäuse in einer beheizten Induktion Kammer, so dass sie betäubt vor Perfusion und Euthanasie bleiben.
  7. Euthanasie durchzuführen, während Mäuse tief betäubt werden (kontinuierliche Inhalation von 4 % Isofluran, 2 L/min 100 % O2) über PBS Perfusion und bilateralen Thorakotomie 30 min nach dem [11C] DPA-713 Injektion.
    1. Öffnen der Bauchhöhle und Schnitt durch das Zwerchfell, das Herz aussetzen.
    2. Nadel Schmetterling Katheter Infusion in den linken Ventrikel des Herzens und Schnipp den rechten Vorhof und minderwertige Vena Cava.
    3. Langsam mit PBS perfundieren (~ 20-30 mL) mit einer 20 mL Spritze.
  8. Entfernen Sie vorsichtig das Gehirn aus dem Schädel mit Zange und Schere.
  9. Ort des Gehirns in einer eisigen Form voller optimale Arbeitstemperatur (OCT) Flüssigkeit, machen Sie sicher, dass das Gehirn ist und zentriert innerhalb der Form mit den olfaktorischen Birnen orientiert die Kerben in der Form (Bereitstellung von Sehenswürdigkeiten und Orientierung einmal das Gehirn wird aus der Form entfernt).
  10. Statt Schimmel auf Trockeneis für 10-15 Minuten oder bis das Office-Anpassungstool undurchsichtig wird.
  11. Sofort jede Form in den Kryostaten Mikrotom Satz bis-18 ° C und equilibrate für 10 min vor der Montage.
  12. Ziehen Sie den Einfrieren Schimmel und montieren Sie das Gehirn auf die Mikrotom-Plattform mit einem kleinen Betrag frische Oktober als "Kleber".
  13. Lassen Sie montierten Gehirn im Mikrotom für 2 min einfrieren.
  14. Schneiden Sie durch das Gehirn, bis die Schlaganfall-Lage ausgesetzt (z.B. ROI) ist. Verwenden Sie das MRT-Bild, um der Infarkt im Gehirn eines jeden Tieres zu finden. Dies sollte für dMCAO konsequent im somatosensorischen Cortex; die Länge des Pinselstrichs ist jedoch leicht variieren.
  15. Abschnitt der Region des Gehirns der Infarkt, Glas-Objektträger, beschriftet mit der entsprechenden Maus-Nummer 20 µm Dicke Abschnitte Inverkehrbringen überspannt.
  16. Öffnen Sie die Autoradiographie Kassette und Boden Sie den der Kassette mit einem Blatt Frischhaltefolie. Ordnen Sie die Folien Abschnitt Seite nach oben auf die Frischhaltefolie in der Kassette und beachten Sie die Position der einzelnen Folien. Gegebenenfalls nehmen Sie ein Bild der Folie Platzierung, mit späteren Analyse zu unterstützen.
  17. Legen Sie sanft eine weitere Schicht Frischhaltefolie oben (nach einer Wartezeit von ~ 2 min nach Sammlung der letzte Abschnitt der Gehirn - so dass es zu trocknen und halten uns an die Folie) und legen Sie vorsichtig die digitale Autoradiographie Film (weiße Seite nach unten) auf die Folien.
  18. Die Kassette dicht schließen und im Gefrierschrank-20 ° C, so dass die Abschnitte über den Film für eine ausreichende Belichtungszeit (~ 5-10 Halbwertszeiten) Verfall überlassen.
  19. Scannen Sie den Film nach der Einwirkzeit mit einem Phosphor Imager, um ein digitales Bild für spätere Analysen zu generieren.

9. dynamische PET Bildanalyse

  1. Bildanalyse-Software zu öffnen (siehe Tabelle der Materialien) und klicken Sie auf das Symbol "open Data", um das CT-Bild (als Quelle) zu laden und die "Daten anhängen"-Symbol, um die dynamische PET (als Referenz) zu laden.
  2. Führen Sie eine visuelle Qualitätskontrolle der Daten über den Zeitreihen Operator in der Drop-Down-Menü: Wählen Sie Referenz ("Ref") und "global" und wenden eine entsprechende min und Max für die Farbskala. Die dynamische PET Daten Frame für Frame, Überprüfung der Radioaktivität Aufnahme visualisieren und Prüfung für jede Bewegung innerhalb des Scans verwirrt.
  3. Erstellen Sie eine durchschnittliche PET-Bild mit dem "arithmetischen Operator".
    1. Wählen Sie "Durchschnitt ausgewählt" unselect "Ref" und sorgen für Eingang 1 ("Inp1"), Eingang 2 ("Inp2") und Eingang Stern ("Inp *"-enthält den Rest der den PET-Bildern im Scan) werden ausgewählt, um einen Durchschnitt von allen PET-Bildern erstellen.
    2. Wechseln Sie zur Registerkarte "Data Manager" (DM) und ziehen Sie das durchschnittliche Bild bis zum "input1" Position für Visualisierung. Verteilen Sie die Farbskala durch Klicken auf die automatische Berechnung in der "min-Max"-Tool.
  4. Die CT auf die durchschnittliche PET-Datei mithilfe der Funktion "automatische 3D" in der "re-Orientierung/Registrierung" Dropdown-Menü zu registrieren.
    1. Wählen Sie "Ref" und "Inp1" und "starr", "schnell", "Inp1, Ref"-Registrierung. Visuell überprüfen Sie die Registrierung in allen 3 Dimensionen und ggf. im Register "manuelle 3D" mit den Funktionen "Übersetzung" und "Rotation" manuell einstellen.
    2. Wenn Sie zufrieden sind mit der Anmeldung, wählen Sie "Inp2" und "Inp *" und gelten für alle PET-Frames, indem Sie auf das Häkchen. Klicken Sie rechts auf die CT und PET-Dateien in der DM und speichern Sie als raw.
  5. Das Gehirn einer Maus zu einem Zeitpunkt für Gehirn-Analyse mit der CT als Leitfaden zu beschneiden: Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü "Zuschneiden" und ziehen Sie die Bild Grenzen um den Kopf der Maus unter dem Hirnstamm zu beschneiden. Neu orientieren Sie die PET- und CT-Bilder mithilfe der Funktion "manuelle 3D Neuausrichtung", wie oben beschrieben, so dass der Schädel direkt in allen Dimensionen ist.
  6. Laden Sie das MRT-Bild bei dieser Maus (im DICOM-Format) mit den "Daten anhängen" Knopf auf der Oberseite der Schnittstelle hinterlassen. Der Herr über die "manuelle 3D Neuausrichtung" bewegen und passen an den Schädel innerhalb der CT-Bild (stellen Sie sicher, alle Modalitäten sind in der gleichen Ausrichtung).
  7. Zeichnen Sie den Strich ROI auf das MRT-Bild mit dem "3D ROI-Tool".
    1. Schalten Sie die PET-Visualisierung von deaktivieren sie auf der Registerkarte visuelle Controller (VC) und verwenden Sie nur der Herr und der CT um den ROI zu zeichnen.
    2. Klicken Sie auf "ROI hinzufügen" um einen neuen ROI erstellen und benennen es "Infarkt". Wählen Sie die "Spline-Tool" Linksklick um ROI Rahmenlinie zeichnen und Rechte Maustaste, um es zu schließen.
    3. Wiederholen Sie, bis alle Scheiben umfasst den Strich, und achten Sie nicht auf eines der Schädel in der ROI mit best Practice zu verlassen, eine Voxel-Lücke zwischen den Schädel Grenze und Schlaganfall ROI zu erfassen.
  8. Generieren Sie einen kontralateralen ROI mit der Infarkt-Volume.
    1. Erstellen Sie einen neuen ROI und kennzeichnen Sie "kontralateralen" zu. Rechtsklick auf den Infarkt ROI und wählen Sie "Exportieren". Ziehen Sie den ROI auf Position 2 ("Inp1").
    2. Mit nur "Inp1" ausgewählt gilt einen links rechts Flip über die Funktion "Operator" im Menü "Neuorientierung/Registrierung". Aktivieren Sie das Kontrollkästchen "ROI", wählen Sie "view only" und manuell verschieben Sie den neuen ROI in der gleichen Region auf der kontralateralen Seite. Wählen Sie die "Arithmetik" Operator und eine skalare Multiplikation von 2 auf der neuen ROI, schönem unabhängige Quantifizierung des ROIs.
    3. Zurück zu dem 3D-Werkzeug ROI. Wechseln Sie zur Registerkarte "Experten" und experimentellen"und klicken Sie auf die Schaltfläche"import ROI". Wählen Sie Inp1 aus dem Dialogfeld, das neue Volume als die kontralateralen ROI zu laden.
  9. Rechtsklick auf das durchschnittliche PET-Bild und entladen und die PET wieder einzuschalten. Die quantitativen Aufnahme Ergebnisse mithilfe des Symbols "Ergebnisse exportieren" in dem 3D-Werkzeug ROI zu generieren.
  10. Durchführen Sie zusätzliche Split Brain Analyse, falls gewünscht (z. B. automatisierte ROI Generierung von Rechten gegenüber der linken Hemisphäre Hirnregionen mit einer 3D-Maus Gehirn Atlas Plugin-Modul für Vivoquant Software).
    1. Neu laden Sie die registrierten PET/CT-Bilder.
    2. Importieren Sie die Maus-Gehirn-Atlas durch Klicken im Menü "Erweiterte Module" und Auswahl des 3D Gehirn-Atlas-Tools. Wählen Sie "alle Regionen Links/Rechts" in den "erweiterten Einstellungen" und klicken Sie auf "ausführen", um die 3D Atlas importieren.
    3. Passen Sie manuell die Atlas innerhalb des Gehirns mit den Schädel als Grenze.
    4. Re-run des Atlas, die dafür sorgen, dass "3D ROI importieren" aktiviert ist, um eine Tabelle der Ergebnisse für alle 14 linke und rechte Hemisphäre ROIs (Medulla, Kleinhirn, Mittelhirn, Pons, Kortex, Hippocampus, Thalamus, Hypothalamus, Striatum, troponema, olfaktorischen Birnen zu generieren Corpus callosum (Balken) und weißen Substanz).
  11. Tracer-Aufnahme in der Milz, die mit dem Scanner Betriebssoftware zu quantifizieren (siehe Tabelle der Materialien).
    1. PET und CT-Image-Dateien zu laden, markieren sie in der Datenbank, und klicken Sie auf "allgemeine Analyse".
    2. Klicken Sie auf die Registerkarte "Registrierung" und Co registrieren Sie PET- und CT-Bilder anklicken des Symbols "rigide Registrierung".
    3. Klicken Sie auf die Registerkarte "Quantifizierung ROI", klicken Sie auf das Symbol "erstellen ROI" und nennen Sie Milz zu.
    4. Wählen Sie die "Kugel" Werkzeug zum Zeichnen Milz ROIs mit Hilfe der CT-Datei als Referenz, sicherzustellen, dass keine Überschneidungen mit Nieren-Aufnahme (mit dem PET-Bild und signalisieren Spillover aus Nieren zu vermeiden).
    5. Bearbeiten der ROIs um konsistente ROI Volumen zwischen den Tieren pflegen.
  12. Einen standard Korrekturwert für die Aufnahme Normalisierung zu berechnen.
    1. Laden Sie die PET/CT-Daten aus der standard-Scan, und erstellen Sie einen Zylinder ROI umfasst die 20 mL Spritze mit dem Werkzeug "manuelle 3D ROI".
    2. Erhalten Sie den Gehalt an Radioaktivität enthalten innerhalb der Norm mit dem Arbeitsblatt-Symbol.
    3. Verwenden Sie dieses nCi/cc-Ergebnis und die ursprüngliche aufgenommenen Radioaktivität für den Standard (d.h., die Dosis Kalibrator Messung des Standards im nCi/cc), um einen Korrekturfaktor für PET-Aufnahme-Werte zu erstellen. Das heißt, teilen Sie die Radioaktivität des Standards von der Dosis-Kalibrator aufgenommen durch die Radioaktivität aus dem PET-Bild der Norm berechnet.
  13. Verwenden Sie die Dosis Aktivitäten und Zeit der Messungen zum Verfall korrekt zum Zeitpunkt des Erwerbs der PET für alle Mäuse (dh berechnen die Dosis-Aktivität zu Beginn des PET-Scan).
  14. Wiederholen Sie für die Restwerte und Abziehen der Verfall korrigierte Dosis berechnen die genaue Tätigkeit jedes Tier erhalten.
  15. Nach dem Auftragen dieser Verfall Korrektur, auch gelten Sie die standard-Korrektur um sicherzustellen, dass die Daten auf die richtige Aktivitätsebene sind. Stellen Sie sicher, dass diese Korrekturen auf die manuell gezeichneten ROI Ergebnisse und Gehirn Atlas ROI Daten zuständigen Hirnregionen für dMCAO Lage (d. h. Kortex, Hippocampus und Striatum) angewendet werden.
  16. Die %ID/g für alle ROIs unter Verwendung der folgenden Gleichung berechnen: %ID/g = (ROI Radioaktivität im nCi/cc / Verfall korrigierte Dosis erhielt im nCi/cc) X 100. Grundstück %ID/g als Funktion der Zeit mit Grafik-Software Zeitkurven Aktivität für jede ROI zu generieren.
  17. Verwenden Sie Scanner-Software zur Visualisierung und Abbildung Endbild. Bilder nach der Verfall korrigierte Dosis erhalten durch jede Maus zum Zeitpunkt des Scannens zu normalisieren, alle Bilder sind auf der gleichen Skala %ID/g.
    Hinweis: Dies ist notwendig, um genauen Vergleich von Bildern aus verschiedenen Mäuse und/oder Bilder von Studien an verschiedenen Tagen zu ermöglichen

10. Autoradiographie Bildanalyse

  1. Öffnen Sie das digitale Bild (.gel Datei) in ImageJ-Software. Passen Sie die Helligkeit und Kontrast zu visuell Schwelle das Bild und tragen Sie eine geeignete Farbe "Lookup-Tabelle".
    Hinweis: Royal ähnelt am genauesten die Farbskala verwendet in PET.
  2. Verwenden Sie den ROI-Manager manuell ROIs Infarkt und entsprechenden kontralateralen Regionen ziehen.
  3. Verwenden Sie die Messfunktion zu quantifizieren die mittlere Pixel Intensität der einzelnen ROI und Ergebnisse exportieren. Grundstück mit Statistiksoftware.

Representative Results

Mäuse wurden MRT um zu überprüfen, erfolgreiche Schlaganfall und [11C] DPA-713 PET erfolgte durch 4 Mäuse gleichzeitig scannen. PET, CT und MRT-Bilder waren Co registrierte vor manuell Zeichnung Gehirn ROIs und durchführen der halbautomatischen Split Gehirn Atlas Analyse untersuchen Tracer Aufnahme in ipsilateralen und kontralateralen Regionen (Abbildung 2).

PET/CT Bilder und Aktivität Zeitkurven (TAC-Radiotracer Tätigkeit als Funktion der Zeit) zeigen erhöhte [11C] DPA-713-Aufnahme in der ipsilateralen versus kontralateralen Hemisphäre(Abbildung 3). Quantifizierung der dynamischen PET Gehirn Bilder, mit summiert Daten von 50-60 min, zeigten eine signifikante Zunahme der Tracer Aufnahme (% ID/g) in der ipsilateralen (infarzierte) im Vergleich zu der kontralateralen Hemisphäre in dMCAO, aber nicht im Schein Mäuse mit dem manuell gezeichneten ROI-Ansatz (Abbildung 3B). Erhöhte Aufnahme wurde auch in der ipsilateralen Hemisphäre zwischen dMCAO und Sham Mäusen beobachtet. Keine signifikanten Unterschiede zwischen ipsilateral und kontralateralen Hemisphäre wurden beobachtet mit dem Atlas-Ansatz, wahrscheinlich aufgrund der Atlas ROIs ist größer als die Größe der Infarkt (in der Regel beschränkt auf somatosensorischen Cortex), daher Verdünnen der Signal. Jedoch wurde insgesamt erhöhte Aufnahme in dMCAO im Vergleich zum Schein für alle ROIs beobachtet, die deckt sich mit früheren Berichten mit MCAO modellmäusen zeigen erhöhte bestreiten Ausdruck in Regionen außerhalb der Infarkt-19. Ipsilateral/kontralateralen Verhältnisse wurden in der dMCAO versus Schein Mäuse mit beiden Ansätzen erhöht; Allerdings war dieser Unterschied nur signifikant in der Hirnrinde, die mit dem Gehirn-Atlas-Ansatz durch größere Varianz in der ROI-Ansatz. Dies kann durch Erhöhen der Anzahl von Mäusen in jeder Gruppe überwunden werden. Quantifizierung der [11C] DPA-713-Aufnahme in Milz zeigte keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen (Abbildung 4).

Gehirn dMCAO Maus PET imaging Ergebnisse wurden von ex-Vivo hochauflösende digitale Autoradiographie (Abbildung 5) bestätigt. Erhöhte [11C] DPA-713 Aufnahme verzeichneten infarzierte Gewebe mit vernachlässigbar Signal im umgebenden gesunden Hirngewebe. Quantifizierung von diesen Bildern offenbart ipsilateral kontralateralen Verhältnis von 1,4 bis hin zu 2,09 bei dMCAO Mäusen.

Figure 1
Abbildung 1: PET-Scanner und Arbeitsbereich einrichten. Alle Arbeitsbereiche wurden in absorbierende Schutzpolster erstelle ich eine sterile Umgebung abgedeckt. (A) nach Kalibrierungen sicherte sich ein 3D-gedruckten Maus Bett, ausgestattet für imaging-4 Mäuse gleichzeitig in den Scanner und Nase Kegel für alle 4 Mäuse, die mit der Narkose verbunden. (B) notwendige Ausrüstung für PET-Bildgebung wurden im Voraus vorbereitet, einschließlich Kochsalzlösung gefüllten 27,5 G Katheter, Auge Schmiermittel, Ethanol Tupfer, Wärmelampen, chirurgische Band, Gewebekleber, 0,5 mL Dosis Spritzen, Schere und ein Feuerzeug. (C) Platz für Radiotracer Injektion, Saline Flush Spritzen und Scheren auf der Rückseite des Scanners. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Ipsilateral/kontralateralen ROI und rechts/links-Split Hemisphäre des Gehirns Atlas PET Bild Analyseprozess. Bildanalyse, dass Software verwendet wurde, um festzustellen, die Tracer-Aufnahme in Regionen von Interesse (ROIs) manuell mit ipsilateral und kontralateralen gezeichnet ROIs und eine halbautomatische 3D Brain Atlas-Ansatz. Automatische 3D PET/CT-Registrierung wurde durchgeführt, gefolgt von manuellen Registrierung des Gehirns MRI innerhalb der entsprechenden Maus-Schädel in der CT-Bild definiert. Die 3D ROI-Tool wurde verwendet, um manuell zeichnen ipsilateral (rot) und kontralateralen (grün) ROIs der Infarkt auf die MRT als Referenz verwenden. Für den Split-Brain-Ansatz war die 3D-Maus links/rechts-Split Brain Atlas geladen und innerhalb des Schädels ausgestattet, definiert durch das CT-Bild. Gehirn-ROIs zur Quantifizierung in diesem 3D Maus-Gehirn-Atlas enthalten Links Cortex (dunkelgrau), linken Hippocampus (Kornblume blau) Links Striatum (Deep Pink), rechts Cortex (Tomatenrot), rechten Hippocampus (grün) und rechts Striatium (Cyan). Die Aufnahme von [11C] DPA-713 in jeder Region wurde im nCi/cc erhalten und wurde anschließend durch die Normalisierung der Verfall korrigiert Dosis Zeitpunkt des Scannens für jede Maus zu %ID/g umgewandelt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Repräsentative In Vivo [11C] DPA-713 Gehirn Aufnahme in DMCAO und Sham Mäuse. (A) dynamische PET/CT Bilder und TAC zeigen erhöhte [11C] DPA-713-Aufnahme in der ipsilateralen Kortex von Mäusen, die DMCAO unterzogen (n = 3) und einen leichten Anstieg für Sham (n = 3) betrieben Mäuse mit DMCAO Mäuse zeigen deutlich größer Kontrast in Prozentsatz injizierte Dosis zwischen dem Infarkt und kontralateralen Seite des Gehirns (%ID/g). (B) PET Quantifizierung (50-60 min summiert) ergab signifikant erhöhte Aufnahme in der ipsilateralen ROI mit dem ROI-Ansatz und im Kortex (Ctx) mit dem Split-Brain Atlas-Ansatz. Im Hippocampus (HC) oder im Striatum (Str) wurden keine signifikanten Unterschiede gefunden. Erhöhte ipsilateral zur kontralateralen Verhältnisse galten sowohl Analyse nähert sich aber war nur statistisch signifikant in der Ctx mit dem Gehirn-Atlas-Ansatz. * (p < 0,05), *** (p < 0,001) Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Vertreter In Vivo [11C] DPA-713 Milz Aufnahme in dMCAO und Sham Mäuse. (A) [11C] DPA-713 dynamische PET/CT Bilder zeigt Milz ROIs in dMCAO (n = 3) und Sham (n = 3) Mäuse. (B) Quantitative Ergebnisse zeigen keine signifikanten Ergebnisse Milz Aufnahme zwischen dMCAO und Sham Mäusen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5 : Vertreter Autoradiographie Ergebnisse. Digitale Autoradiographie Bilder zeigen erhöhte [11C] DPA-713-Aufnahme in der ipsilateralen im Vergleich zur kontralateralen Hemisphäre. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Die vorgestellte Protokoll beschreibt eine Methode zur Quantifizierung von Neuroinflammation in dMCAO und Sham Mäuse mit [11C] DPA-713-PET. Bestreiten-PET ist der am häufigsten untersuchten bildgebenden Biomarker zur Visualisierung und Neuroinflammation in Vivo bis heute messen. Bestreiten Ausdruck ist hochreguliert auf Gliazellen im Gehirn während einer Entzündung der nicht invasiven Erkennung und Quantifizierung von Neuroinflammation bei schönem. Darüber hinaus ist es eine höchst übersetzbar Technik, so dass es ein wertvolles Werkzeug in der klinischen und präklinischen Forschung. Dieses Protokoll und repräsentative Ergebnisse unterstreichen die Eignung mit [11C] DPA-713 PET zu erkennen und zu überwachen, schwere Veränderungen bei Schlaganfall und anderen neurologischen Störungen in Vivo.

In dieser Studie wurde die dMCAO Operation mit 3-Monate-alten C57BL/6 weiblichen Mäusen durchgeführt. Dieses Modell wurde gewählt, da es ein hoch reproduzierbare Infarkt beschränkt auf somatosensorischen Cortex, die Modellcharakter für die permanente fokale Ischämie mit geringer Variabilität im Vergleich zu anderen Modellen des Schlaganfalls (z. B. mittlere zerebrale arterielle hervorruft Okklusion (MCAO)-Filament-Methode)14. PET-Bildgebung der Schlaganfall-Modelle hat den Vorteil, die eine interne Referenz-Region im Gehirn für jedes Tier mit ROIs innerhalb der kontralateralen Hemisphäre enthalten. Da gibt es einige Entzündungen, dass Ergebnisse aus der Chirurgie allein, es wichtig ist, gehören Mäuse, die Farce in das Design der Studie, wobei operiert Kraniotomie und Manipulation der Hirnhaut ohne Arterie Okklusion durchgeführt wurde. Kraniotomie allein führt zu Störungen an der zugrunde liegenden neuronalen Gewebe und Krankheitserreger zu Immunreaktionen unabhängig vom Takt20. Einige Entzündungen nach Schein Chirurgie auszugehen ist und parallel zur dMCAO des Signals durch Operation allein auszuschließen bewertet werden sollen. Um zu vermeiden, einschließlich Entzündung infolge der Operation ohne Schlaganfall in dMCAO Kohortenanalyse, muss MR-Tomographie durchgeführt werden, um erfolgreiche Schlaganfall Chirurgie und Infarkt Entwicklung bestätigen. MRI bietet auch einen strukturellen Bezugsrahmen, der genaue zeichnen den Infarkt und kontralateralen ROIs unerlässlich ist. Darüber hinaus genaue Bildverarbeitung einschließlich Bild-Registrierung und ROI Definition sind erforderlich, um zuverlässige Quantifizierung zu gewährleisten.

Zusätzliche Einschränkungen müssen im Auge behalten werden bei der Arbeit mit c-11 mit der Bezeichnung Radiotracer für PET und Autoradiographie Studien. Es ist zwingend notwendig, um die kurze Halbwertszeit (20,33 min) von c-11, mit seiner Verwendung in der Regel beschränkt auf Forschungsinstitute mit vor-Ort-Zyklotron Zugang zu betrachten. Entsprechenden Radioaktivität Transportroute, Dosis Verwaltung und Akquisition Zeitpunkten müssen vorab mit einem vorbereiteten ausführlichen Plan des Workflows des Experiments ermittelt werden, so dass das Team schnell und effizient arbeiten kann. Die Gestaltung und Einrichtung dieser Studie worden angepasst Bildgebung 4 Mäuse gleichzeitig, die Datenausgabe erhältlich zu erhöhen, wenn ein c-11-Tracer mit umrissen. Wenn möglich, es empfiehlt sich, alle Mäuse kanülierte haben und in der Mitte ihrer CT-Scan mit der Zeit kommt die c-11-Tracer in der bildgebenden Einrichtung um minimale Radiotracer Verfall vor der Injektion zu gewährleisten. Dieses schrittweise Protokoll erfolgt auch am besten durch ein Team mit mindestens 3 Forscher, um schnelle Kanülierung, Dosis-Messung, Tracer Einspritzung, PET-Scanning und Gehirn-Schnitt vor erheblichen radioaktiven Zerfall zu ermöglichen. Es erfordert zwei Menschen, die Einleitung der PET-Scan und Injektion von alle 4 Mäuse gleichzeitig durchzuführen. Der Grund für den Beginn der PET-Übernahme kurz vor Injektion besteht darin, dass die Pharmakokinetik und die Dynamik der tracerverteilung im Blut und Regionen von Interesse genau und vollständig erfasst werden. Viele Schritte erfordern energische Ausbildung und Praxis zum reibungslosen Ablauf des Experiments zu gewährleisten. Dieses Protokoll ist insbesondere abhängig von erfolgreichen Schweif Vene Kanülierung der C57BL/6 Mäusen, die durch dunkle Haare auf ihren Schwänzen schwierig sein kann, und möglicherweise schwieriger geworden, nach Schlaganfall aufgetreten ist oder wenn die gleichen Mäuse zu mehreren Zeitpunkten imaging .

Ein weiterer Aspekt für PET-Bildgebung beinhaltet sorgfältige Erfassung der Radiotracer Dosis und Restmüll Aktivität Messungen, einschließlich den genauen Zeitpunkt der Messung. Dies ist wichtig für die genaue Verfall Korrektur der injizierten Dosis zum Zeitpunkt des Scans und wird verwendet, um eine genaue Messung der Tracer-Aufnahme (z. B. % ID/g) für jede ROI zu erzielen. Es ist zwingend notwendig, um die genaue Menge an Radioaktivität kennen, die zum Zeitpunkt des Scannens um genaue Bildanalyse zu gewährleisten in jeder Maus vorhanden war. Daher ist es ratsam, die Uhren auf dem Scanner Computer und dosiseichgerät um Fehler zu vermeiden, bei Verwendung von kurzlebigen Isotopen wie c-11 zu synchronisieren.

Genaue Quantifizierung der PET-Bild kann auch durch die Genauigkeit des Scanners und Set-up beschränkt werden. Daher um genaue Quantifizierung der PET/CT Bilder zu gewährleisten, ist es wichtig, die Durchführung von Qualitätskontrollen für die CT und PET-Komponenten des Scanners. CT Qualitätskontrollen gehören x-ray Source Klimaanlage, hell/dunkel und Center off Set Kalibrierungen. Diese Kalibrierungen Messen und für Systemgeräusche und muss korrekt durchgeführt vor dem Erwerb durch den Scannerhersteller empfohlen. Kalibrierungen sollte auch für die PET-Scanner durchgeführt werden. Dies umfasst in der Regel Scannen einen "standard / PET Phantom" Scan, mit einer bekannten Konzentration von Radioaktivität. Wenn Sie den Standard vorbereiten, empfiehlt es sich, verwenden die gleichen Radioisotopen verwendet in der Studie, eine vergleichbare, die Dosis an, die zu einem einzigen Mausklick in einem Volumen ähnlich wie der Körper eine Maus, und der gleichen Parameter als tierische Bildgebung verabreicht. Eine 20 mL Spritze mit Wasser verdünnt Radiotracer gefüllt ist mit die daraus resultierenden PET imaging Ergebnisse zur Berechnung eines Korrekturfaktors basierend auf die tatsächliche Dosis gemessen an der Kalibrierung-Detektor für den Standard in diesem Protokoll verwendet. Das Korrektur-Verhältnis kann auf die Bilddaten erwarb das Experiment dazu genaue Quantifizierung der Tracer-Aufnahme in Regionen von Interesse in PET-Bildern angewendet werden. Diese Konten für die Positronen-Palette des Radionuklids zusätzlich unter Berücksichtigung jeder Hintergrundaktivität auf den Tag des Scannens. Als die dosiseichgerät fester Bestandteil der Generation dieser Korrekturfaktor ist, ist es unerlässlich, dass dieses Gerät auch regelmäßig nach den Herstellerrichtlinien kalibriert ist.

Bei der Durchführung von ex-Vivo Autoradiographie ist es wichtig, wählen Sie einen optimalen Zeitpunkt für Euthanasie nach Injektion, hohe Signal-zu-Hintergrund in Region(en) von Interesse. Dreißig Minuten nach der Injektion gewählt [11C] DPA-713 Autoradiographie mit Daten, die während der dynamischen PET-Bildgebung -d. h. die in Vivo dynamische TAC als Leitfaden, auch unter Berücksichtigung der kurzen Halbwertszeit von c-11 und der Zeit beteiligt, Abschnitt und setzen das Hirngewebe nach der Extraktion. Vor diesem Hintergrund [11C] DPA-713 Autoradiographie muss durchgeführt werden, auf eine separate Kohorte von Mäusen erlauben für die Injektion von einer höheren [11C] DPA-713-Dosis und eine 30-minütige Zeit-Punkt für Durchblutung und Euthanasie in Narkose. Durchführung einer kleinen in Vivo wird PET Pilotstudie mit einer 3-4-Mäuse vor der Durchführung von ex-Vivo Autoradiographie zur Bestimmung des optimalen Zeitpunkt für Autoradiographie hilfreich sein. Eine weitere Überlegung für ex-Vivo Autoradiographie ist ob die Mäuse nach der Injektion zu erholen oder halten sie betäubt bis Euthanasie. Halten sie betäubt imitiert die Bedingungen des Scans und sorgt für die Radiotracer Verteilung oder Ausscheidung Kinetik sind durch Wiederherstellung nicht verändert. Darüber hinaus verhindert dies zusätzlichen Druck auf die Mäuse durch die Vermeidung von Erholung und nachfolgende Induktion. Schließlich wäre eine sinnvolle Ergänzung des ex-Vivo -Protokolls in den Gehirnscheiben für Autoradiographie über immunhistochemische Färbung (nach radioaktiven Zerfall) um ein hochauflösendes Bild der Infarkt Lage zu erzeugen verwendet regionale Schadensbewertung und Volumen.

Gibt es Einschränkungen bei der Verwendung eines Tracers c 11 basiert, kann dieses Protokoll leicht für die Verwendung mit einer f-18 (Halbwertszeit von 109,77 min) basierte bestreiten Tracer für Standorte ohne eine vor-Ort-Zyklotron möglicherweise geändert werden. Dieses Protokoll beschreibt darüber hinaus die Verwendung einer 4-Maus-imaging-Aufstellung. Obwohl diese Hochdurchsatz-Methode optimal ist, wenn eine c-11-Tracer verwenden, kann dieses Protokoll auch für diejenigen mit Mausklick imaging Betten geändert werden. Sorgfältige Planung und konsequente Erziehung in die in diesem Protokoll beschriebenen Techniken führt zu der Generation von einer Fülle von Daten mit [11C] DPA-713, die leicht angewendet werden können, die Rolle des Neuroinflammation in der Manifestation der Krankheit zu untersuchen und Progression in andere Nager-Modelle von neurologischen Erkrankungen. Darüber hinaus könnte diese Technik verwendet werden, die in Vivo -Reaktion auf immunmodulatorische Therapie richtet sich an Mikroglia/Makrophagen zu beurteilen.

Disclosures

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Die Autoren möchte Buckwalter Labor (vor allem Dr. Todd Peterson) für die Bereitstellung der Maus-Modell und die dMCAO und Schein-Operationen durchführen. Darüber hinaus möchten wir danken Thomas Liguori aus Invicro für technische Unterstützung mit VivoQuant Bildanalyse-Software, Dr. Tim Doyle, Dr. Laura Pisani, Dr. Frezghi Habte aus das SCi3 Tier imaging-Anlage an der Stanford University für ihre Ratschläge und Unterstützung bei der Entwicklung dieses bildgebenden Protokoll und die Radiochemie-Anlage (vor allem Dr. Jun Park) für ihre Hilfe mit der Synthese von [11C] DPA-713.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Inveon PET/CT scanner Siemens Version 4.2
MRI scanner Varian 7 Telsa
ParaVision software Bruker Version 6.0.1 MRI operating software
VivoQuant software InVicro Version 2.5 Image analysis software
Inveon Research Workspace software Siemens Version 4.2 Scanner operating software. Includes microQView, the post-processing managing software
Dose calibrator Capintech CRC-15 PET
Typhoon phosphor imager 9410 GE Healthcare 8149-30-9410
Butterfly catheters SAI Infusion Technologies BFL-24 27.5 G needle
1 mL syringes BD
Insulin syringes BD 329461 0.5 mL insulin syringes with needle
20 mL syringe  VWR BD302831 BD Syringe Slip Tip Graduated
Tissue glue Santa Cruz Animal Health sc-361931 3 mL
Heat lamp Fluker 27002 5.5" reptile heat lamp with clamp and switch
0.9% sterile saline Pfizer 00409-4888-10 0.9% sodium chloride for injection, 10 mL
Eye lubricant Watson Rugby PV926977 Artificial Tears Lubricant Eye Ointment, 1/8 oz
Chux absorbent sheets ThermoFisher Scientific 1420662 Disposable absorbent padding
Iris scissors World Precision Instruments 503708-12 11.5 cm, Straight, 12-pack
Surgical tape 3M Durapore 1538-0 1/2" x 10 yard roll, silk, hypoallergenic
Mouse PET bed In house 4 mouse PET bed
Lighter Bic UDP2WMDC
Isoflurane Henry Schein NDC 11695-6776-2 Isothesia, inhalation anesthetic, 250 mL
Oxygen Praxiar UN1072 Compressed gas
Autoradiography cassette Cole Palmer EW-21700-34 Aluminum, 8" x 10"
Autoradiography film GE Life Sciences 28-9564-78 Storage Phosphor Screen BAS-IP SR 2025 E Super Resolution, 20 × 25 cm, screen only
Microtome blades ThermoFisher Scientific 30-508-35 MB35 Premier Disposable, 34° cutting angle
Microtome Microm HM 550
Microscope slides Fisher Scientific 12-550-15 Superfrost™ Plus Microscope Slides
OCT liquid VWR 25608-930 Formulation of water-soluble glycols and resins for cryostat sectioning at temperatures of -10°C (14°F) and below
Freezing molds Poly sciences 18646A-1 Disposable paraffin molds
Saran wrap Saran 25700001300
Disinfectant Virkon S

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Medizin Ausgabe 136 Neuroinflammation Nyrianer Protein 18 kDa (bestreiten) Positronen-Emissions-Tomographie (PET) Magnetresonanztomographie (MRT) Neuroimaging Schlaganfall Mäuse.
PET-Bildgebung des Neuroinflammation mit [<sup>11</sup>C] DPA-713 in einem Mausmodell des ischämischen Schlaganfalls
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Chaney, A. M., Johnson, E. M., Cropper, H. C., James, M. L. PET Imaging of Neuroinflammation Using [11C]DPA-713 in a Mouse Model of Ischemic Stroke. J. Vis. Exp. (136), e57243, doi:10.3791/57243 (2018).

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