Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

HUISDIER beeldvorming van Neuroinflammation met behulp van [11C] DPA-713 in een muismodel van ischemische beroerte

Published: June 14, 2018 doi: 10.3791/57243
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Radiology, Stanford University, 2Department of Neurology and Neurological Sciences, Stanford University

Summary

Positron emissie tomografie (PET) beeldvorming van translocator eiwit 18 kDa (TSPO) biedt een niet-invasieve manier te visualiseren van de dynamische rol van neuroinflammation in de ontwikkeling en de vooruitgang van hersenaandoeningen. Dit protocol beschrijft TSPO-PET en ex vivo autoradiografie om neuroinflammation detecteren in een muismodel van ischemische beroerte.

Abstract

Neuroinflammation staat centraal in de pathologische cascade na ischemische beroerte. Niet-invasieve moleculaire beeldvorming methoden hebben het potentieel om een kritisch inzicht verwerven in de temporele dynamiek en de rol van bepaalde neuroimmune interacties in lijn. Specifiek, biedt Positron emissie tomografie (PET) beeldvorming van translocator eiwit 18 kDa (TSPO), een marker van geactiveerde microglia en perifere myeloïde-bloedlijn cellen, een manier om te ontdekken en het bijhouden van neuroinflammation in vivo. Hier presenteren we een methode om te nauwkeurig te kwantificeren met behulp van de neuroinflammation [11C]N,N-Diethyl-2-[2-(4-methoxyphenyl)-5,7-dimethylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]acetamide ([11C] DPA-713), een veelbelovende tweede generatie TSPO-PET radiotracer, in de distale middelste cerebrale slagader occlusie (dMCAO) in vergelijking met muizen sham bediende. MRI werd uitgevoerd 2 dagen post-dMCAO chirurgie te bevestigen beroerte en definiëren van de locatie van het infarct en het volume. PET/Computed Tomography (CT) imaging is 6 dagen post-dMCAO te vangen van de piek toename TSPO na beroerte uitgevoerd. Kwantificatie van PET beelden werd uitgevoerd om het beoordelen van de opname van [11C] DPA-713 in de hersenen en de milt van dMCAO en sham muizen te beoordelen van de centrale en perifere niveaus van ontsteking. In vivo [11C] DPA-713 hersenen opname werd bevestigd met behulp van autoradiografie ex vivo .

Introduction

Beroerte is de vijfde belangrijkste doodsoorzaak en een belangrijke oorzaak van invaliditeit in de Verenigde Staten1. Ischemische beroerte vertegenwoordigt een overweldigende meerderheid van deze gevallen (~ 87%), die zich voordoen wanneer er gelokaliseerde verstoring in de bloedstroom naar de hersenen (bijvoorbeeld door een bloedstolsel of vette storting). Zuurstof en voedingsstoffen levering aan de getroffen gebieden zijn vervolgens verlaagd en een complexe pathologische cascade wordt geïnitieerd resulteert in de neuronale dood binnen de kern van de beroerte (infarct) naast de omliggende gebieden. Neuroinflammation is een essentieel onderdeel in het traject dat leidt tot deze schade, met beide resident hersenen immuuncellen (microglia) en het infiltreren van perifere immuuncellen (neutrofiele granulocyten, T-cellen, B-cellen en monocyten/macrofagen) dacht bij te dragen aan dit destructieve trapsgewijs2,3. Geactiveerde microglia en macrofagen staan centraal in dit neuroinflammatoire antwoord, met verslagen van zowel de gunstig als de schadelijke effecten als gevolg van ischemische beroerte2. Het is dus noodzakelijk om te onderzoeken in welke mate in vivo van deze cellen na beroerte.

Huisdier is een krachtige 3-dimensionale moleculaire beeldvorming techniek waarmee visualisatie van biologische processen in vivo door het gebruik van specifieke moleculen aangeduid met positron (β +) uitstoten van radionucliden zoals 11C, 13N, 15O en 18F. Deze niet-invasieve methode heeft vele voordelen ten opzichte van ex vivo methoden (bijvoorbeeld immunohistochemistry) zoals het toelaat de verwerving van moleculaire informatie in real time, levende intact inspiratiebronnen, en voor het longitudinale onderzoek zorgt. HUISDIER beeldvorming van TSPO, een marker van geactiveerde microglia en perifere myeloïde-bloedlijn cellen, biedt een manier om te kwantificeren en de reacties van het aangeboren immuun cel binnen het lichaam houden, en kan worden gebruikt om te beoordelen van ontsteking na beroerte en reactie op therapeutische interventies. TSPO, voorheen bekend als de perifere-type benzodiazepine receptor, is een 18 kDa proteïne die wordt verondersteld een rol in het vervoer van de cholesterol en de synthese van neurosteroids4. Bovendien blijkt dat TSPO is betrokken bij neuroinflammation en neuronale overleving5,6, met verslagen van verhoogde expressie in veel neurologische aandoeningen waarbij de ontsteking met inbegrip van lijn7, dementie8, ziekte van Parkinson9 en multiple sclerose10. TSPO bevindt zich aan de buitenste mitochondriale membranen en zeer wordt uitgedrukt in de periferie, met name in de steroïde omliggende weefsels (bijvoorbeeld klieren) en met tussenliggende niveaus in het hart, nieren en longen10gezien. Echter in de gezonde hersenen, TSPO niveaus zijn laag en beperkt voornamelijk tot glia6,11. Op de neuronale schade, zoals die is waargenomen in lijn, TSPO niveaus in het centrale zenuwstelsel (CNS) aanzienlijk toeneemt. Deze waargenomen opregulatie van TSPO kan worden misbruikt om beeld neuroinflammation in vivo met expressie niveaus bieden nauwkeurige indicatie van de ernst van de ontsteking. Vandaar, het doel van deze methode is om dein vivo -bijdrage van neuroinflammation in een muismodel van ischemische beroerte met behulp van TSPO-PET. nauwkeurig te kwantificeren

Meerdere TSPO verklikstoffen zijn ontwikkeld voor PET beeldvorming van neuroinflammation. Hier, TSPO-PET imaging wordt beschreven met behulp van [11C] DPA-71312, een veelbelovende tweede generatie TSPO tracer, die door verbeterde signaal kenmerkt zich voor lawaai en lagere niet-specifieke binding dan de meer historisch gebruikte [11C] PK11195 13 . Als voorbeeld, werd de muismodel van dMCAO van de lijn gekozen voor deze methode14. Dit model omvat temporele craniotomy en permanente Afbinding van de distale middelste cerebrale slagader, resulterend in focal ischemie van de Somatosensorische cortex. Dit is voordelig in pre-klinische beroerte onderzoek vanwege de hoge reproduceerbaarheid van ischemische schade en lage sterftecijfers, dit model is gekoppeld. Tot op heden moeten TSPO-PET beeldvormende onderzoeken nog worden gerapporteerd in het dMCAO knaagdier model. Echter vorige PET imaging studies met behulp van de middelste cerebrale slagader occlusie (MCAO) model, een meer ernstige en variabele lijn model, in zowel muizen en ratten, hebben gemeld TSPO expressie toe vanaf dag 3 en piek rond dag 7 na beroerte15, 16,17,18. Vandaar, wij uitgevoerd PET imaging 6 dagen post-dMCAO te laten samenvallen met verhoogde TSPO expressie. [11C] DPA-713 opname in de hersenen in evalueerden ipsilaterale (infarcted) en contralaterale halfrond. TSPO-PET werd gecombineerd met structurele MRI, waardoor nauwkeurige afbakening van infarct en contralaterale regio's van belang (ROIs). Hier beschrijven we zowel een atlas-gebaseerde en een MRI-gedreven ROI benadering berekenen [11C] DPA-713 opname. Radiotracer opname in milt evalueerden ook onderzoek doen naar perifere niveaus van ontsteking tussen groepen. Deze methode heeft de potentie om een kritisch inzicht verwerven in de spatio dynamiek en de rol van specifieke neuroimmune interacties in lijn en andere neurologische ziekten.

Protocol

Alle dierlijke studies werden uitgevoerd volgens de administratieve Panel op Laboratory Animal Care (APLAC) aan de Stanford University, een geaccrediteerd door de vereniging voor de beoordeling en de accreditatie van Laboratory Animal Care programma. Alvorens deze procedure drie-maand-oude C57BL/6 vrouwelijke muizen geopereerd dMCAO na standaardprocedure en steriele omstandigheden14.

1. structurele MRI (2 dagen Post-dMCAO chirurgie)

  1. Open de besturingssysteemsoftware (Zie Tabel van materialen) en set-up de overname door het creëren van een nieuw examen. Selecteer de localizer en turborare T2 sequenties in de Ontdekkingsreiziger van het palet en sleep naar het examen venster.
  2. Veilig de luchtwegen en verhit sondes aan het bed van de muis met behulp van zachte tape, en plaats een strook van beschermende absorberende opvulling over beide een steriele omgeving te creëren.
  3. Een kachel lucht hechten aan het dierlijke bed en zet de ventilator zodat de warme lucht op en het houden van de muis verwarmd. Gebruik van een geautomatiseerd controlesysteem om lichaamstemperatuur en ademhalingsfrequentie worden onderhouden op passende niveaus voor de duur van de scan.
  4. Anesthetize de muis in een zaal van de inductie met behulp van 3% Isofluraan aanvankelijk, daarna onderhoudt op 1-2% (2 L/min, 100% O2). Zorg ervoor dat een warmte pad onder de inductie zaal de muis om warm te houden tijdens de inductie is ingeschakeld. Zodra verdoofd, gelden oog smeermiddel voor de muis om te voorkomen dat het drogen en de vorming van de cornea ulcera.
    1. Hiermee zet u de verdoving system (Isofluraan 1-2%, 2 L/min 100% O2) aangesloten op de MRI-scanner en de overdracht van het dier aan het bed van de muis.
    2. De muis hoofd-naar voren gebogen positie op de beet bar en de moeilijke situatie het oor bars in plaats, ervoor te zorgen dat ze doen niet uitsteken buiten de diameter van het bed.
    3. Schuif de RF-spoel boven de muis hoofd en duw de spoel en bed in de boring, plaatsen van het speciaal voor isocenter.
    4. Verwerven van de localizer om de muispositie in alle 3 dimensies te gebruiken dit beeld om te definiëren van het volume voor T2 turborare (TE: 33 ms, TR: 2.500 ms, 2 gemiddelden, 17 segmenten, 0.083 x 0.92 mm resolutie, de totale tijd 2 min 40 sec) acquisitie. dMCAO chirurgie resulteert in een infarct in de Somatosensorische cortex14; Daarom zorgen dat deze regio vindt u in de afbeelding T2-gewogen.
    5. De muizen uit de scanner te verwijderen en herstellen van de muizen in een verwarmde kamer.

2. PET/CT kalibraties en Setup van de Workflow (6 dagen Post-dMCAO chirurgie)

  1. Een imaging werkstroom te maken in de scanner-besturingssoftware op te nemen een CT demping acquisitie, 60 minuten durende C-11 dynamische PET aankoop (350-650 keV niveau discriminatie, 3.438 ns toeval venster), histogram (20 kaders: 5 x 15 sec, 4 x 1 min, 11 x 5 min; met dode tijd correctie) en een reconstructie van de 3DOSEM-OP (2 iteraties, 18 deelverzamelingen) maken van 128 x 128 x 159 beelden met 0.776 x 0.776 x 0.96 mm voxel grootte.
  2. X-ray bron conditioning via hettoezichtpanel kalibratie CT is gelegen op de hoogste linkerhoek van de interface uit te voeren. Deze kalibratie moet worden uitgevoerd wekelijks of voordat de scan als het systeem niet is gebruikt in de afgelopen 48 uur.
  3. Donker/licht (D/L) en de verschuiving van de center (c/o) kalibraties uitvoeren.
    1. Druk op de CT kalibratie knop (X) in de top links van de interface.
    2. Selecteer D/L C/O voor de CT-bestand dat u uitvoert, het bed te verwijderen uit de gantry en voer de kalibratie D/L.
    3. Het kalibratie tool bed invoegen de scanner en voer de kalibratie C/O, ervoor zorgend om de selectie op de interface overschakelen naar "kalibratie tool" in plaats van '70 mm palet'.
  4. De kalibratie tool verwijderen en de standaard PET bed, ervoor zorgend om de selectie op de interface te veranderen terug naar '70 mm palet' terug te keren.
  5. Zet van een bed 4-muis beeldvorming op het platform van de scanner met behulp van tape en bevestig de anesthesie-buis(Figuur 1). Ervoor zorgen dat Isofluraan stroomt via de buizen en dat er geen knikken.
  6. Duw het bed uit dus het is in het centrum van het gezichtsveld (FOV), sluit de deur van de CT en verkrijgen van een scout uitzicht op de CT om ervoor te zorgen het bed in de juiste positie.
  7. Het uitvoeren van een "standaard" kalibratie van de PET/CT-scanner met behulp van een in-house vervaardigd phantom met een bekende hoeveelheid C-11 oplossing als een stralingsbron.
    1. Bereiden een 20 mL spuit gevuld met de tracer dosis gelijkwaardig zijn aan die toegediend aan één muis (~ 250-350 µCi/9 - 13 MBq van C-11 tracer verdund in een zoutoplossing).
    2. De activiteit in de standaard met behulp van een dosis kalibrator opnemen en Let op het tijdstip van de meting.
    3. Het gedrag van een PET/CT-scan van de norm met behulp van de exacte dezelfde parameters die worden gebruikt voor het beeld muizen (zoals hierboven beschreven). Doen deze week tot een correctiefactor voor de PET-scanner toe te passen op de imaging gegevens.

3. werkruimte Setup voor PET/CT beeldvorming

  1. Een steriele omgeving maken met behulp van een ontsmettingsmiddel met virucide (Zie Tabel van materialen) en het plaatsen van beschermende absorberende opvulling op alle ondergronden.
  2. Zorgen Isofluraan en zuurstof tanks zijn voldoende gevuld.
  3. Staart-veneuze katheters voor te bereiden door een spuit van 1 mL (gemonteerd met een 27.5 G naald tip) vullen met 0,9% natriumchloride (steriele zoutoplossing) en blozen door middel van een 27.5 G, 24 cm vlinder katheter. De vleugels van de katheter afgesneden vóór cannulating om ervoor te zorgen dat zij niet de weergave van de staart ader blokkeren en te helpen met het gemak van de verhuizing van de muizen naar de scanner zonder de katheter.
  4. Zorgen dat alle essentiële apparatuur is aangelegd op de werkplek, met inbegrip van de reserve "flush" spuiten (gevuld met steriele zoutoplossing), eye smeermiddel, ethanol wissers, warmte lampen, katheters (vooraf gevuld met zoutoplossing), chirurgische tape, lijm weefsel, 0,5 mL dosis spuiten, bereid schaar, en een aansteker te verzegelen katheter na succesvolle plaatsing in staart ader (Figuur 1B).

4. dierlijke voorbereiding en Cannulation

  1. Weeg muizen om te bepalen van het maximale volume kunnen worden geïnjecteerd in elke muis (dat wil zeggen, de omvang van de tracer en een zoutoplossing door de overheid gereguleerde moet niet meer dan 10% van het lichaamsgewicht).
  2. Anesthetize muizen in een inductie-kamer met 3% Isofluraan en zorg ervoor dat u 1-2% (2 L/min 100% O2).
  3. Oog smeermiddel van toepassing op elke muis en afstomping via pedaal reflex (Teen snuifje) bevestigen. Anesthesie niveaus aanpassen indien nodig.
  4. Plaats de muis op een verwarmd bed voorzien zijn van een neus kegel Isofluraan leveren op 1-2% (2 L/min 100% O2).
  5. Terwijl de muis is verdoofd, uitvoeren staart veneuze cannulation met behulp van de onderstaande voorschriften:
    1. Plaats de muis op zijn kant bloot een van de laterale aderen, terwijl het hoofd blijft in de neus.
    2. Warm de staart met behulp van een warmte lamp, dat evenwel niet tot oververhitting of branden van de staart, en wisser met een alcohol doekje om de ader te verwijden en steriliseren van de injectieplaats.
    3. Houd de naald met de schuine kant omhoog en lijnen met de ader op een scherpe hoek.
    4. Licht pressiemiddelen niveau de naald uit, dus het is in overeenstemming met de ader te doorprikken van de huid.
    5. Duw voorzichtig vooruit een paar millimeter langs de schuine kant zodat de naald de ader treedt.
    6. Bevestig dat de katheter is in door het toedienen van een kleine (10-20 µL) flush zoutoplossing. De saline laten de spuit soepel en de ader moet uitschakelen. Als enige weerstand of rug druk wordt waargenomen, is het waarschijnlijk de katheter is niet in de ader en opnieuw probeert cannulation is aan te raden. Als de bloedstolling wordt waargenomen, gebruik heparine (heparine 1.000 eenheden per mL zoutoplossing) voor cannulation setup en blozen.
      Opmerking: Wij hebben beoordeeld cannulation met en zonder heparine in de stam van de muis van belang, en omdat geen bloedstolling werd waargenomen, zoutoplossing alleen werd gebruikt voor cannulations.
    7. Beveilig de katheter aan de staart met behulp van een kleine daling van weefsel lijm, gevolgd door chirurgische tape, om ervoor te zorgen dat de katheter onbeweeglijk blijft bij het overbrengen van de muizen naar de scanner.
    8. Verwijder de flush spuit aan het einde van de katheter en zegel het einde met lichtere, zorgen voor de onderzoeker niet in de buurt van Isofluraan of ethanol is.
    9. Herhaal voor 3 extra muizen zodat alle 4 muizen worden gescand worden gecanuleerd en bereid.
  6. Inschakelen van de verdoving stroom (2,5% Isofluraan, 2 L/minuut 100% O2) aangesloten op de PET/CT en zorgvuldig standpunt blijven de muizen liggend in het bed van de scanner, waarborgen van katheters en van elke muis hoofd rechte en veilig binnen de neus. Tape van het hoofd en het lichaam van elke muis aan het bed met zacht chirurgische tape, waarborgen van de ademhaling wordt niet beperkt door de plaatsing van de tape. De positie van elke muis te voorzien van de juiste locatie en de toewijzing van de groep voor beeldanalyse opnemen.
  7. Houden van muizen verwarmd tijdens de gehele procedure (bijvoorbeeld met behulp van een warmte lamp of hete lucht pompsysteem om ervoor te zorgen dat muizen worden warm gehouden zonder oververhitting). Controleren van respiratoire tarief van alle muizen, zowel visueel als met behulp van een open gantry of via een externe controle systeem met respiratoire pads en de verdoving niveaus wijzigen als dit nodig is.

5. CT overname

  1. Zodra dieren veilig in het bed zijn en ademhaling stabiel is, zet de laser Kruis haren en verplaats het scannen bed, zodat ze worden uitgelijnd met de hersenen van alle vier muizen. Het bed van de scanner in verplaatsen naar de overname standpunt (3) met de hersenen van de muizen als dicht bij het centrum van de FOV mogelijk.
  2. Verwerven van een scout view-beeld van de muizen om te verifiëren hun positie (gebruik een 200 mm FOV), en de positie aanpassen door te slepen de FOV vak op de interface indien nodig. Klik op "Werkstroom starten" in de software van de scanner om te beginnen de CT-scan, om ervoor te zorgen om te selecteren op 'interactieve gebruiker prompts weergeven' zodat de PET-scan kan handmatig worden gestart vóór tracer injectie.

6. [11C] DPA-713 dosis voorbereiding

  1. Synthetiseren [11C] DPA-713 zoals eerder beschreven12, ervoor te zorgen u het dragen van geschikte PPE (persoonlijke beschermingsmiddelen) voor de behandeling van radioactiviteit, met inbegrip van een lab-jas, handschoenen en persoonlijke vingers en lichaam dosimeters. Zorg ervoor u veranderen van handschoenen regelmatig om te voorkomen dat de radioactieve besmetting, en verhogen uw afstand van de radioactieve bron, indien mogelijk.
  2. Pincet gebruiken om zorgvuldig de flacon van de radiotracer achter een schild van lood.
  3. 0,5 mL dosis spuiten voorbereiden op elke muis met ongeveer 250-350 µCi/9-13 MBq in 100-200 µL volume om een dosis voldoende voor een 60 minuten durende dynamische PET scan (toegediende dosis dient te worden bepaald gezien de halveringstijd van de isotoop en de tijd-regel van de studie ontwerp, met het volume afhankelijk van het gewicht van de muis).
  4. Maatregel de activiteit met behulp van een dosis kalibrator ingesteld op C-11, gelegen in de nabijheid van de cannulation site, en het opnemen van de tijd van de meting en injectie om verval correctie. Opstellen van de doses net voordat de CT uiteinden verval beperken en ervoor zorgen dat het gewenste niveau van radioactiviteit in elke muis zullen worden ingespoten.
  5. Controleer of er geen luchtbellen in de dosis spuit voor het meten van de activiteit en injecteren in elke muis.

7. PET overname

  1. Zodra de muizen automatisch verder van CT aan huisdier, opgericht aan de achterkant van de scanner voor [11C] DPA-713 injectie (Figuur 1C). Beschermende absorberende opvulling op een richel plaatsen en ervoor zorgen dat schaar en lichter zijn bij de hand.
  2. Knipsel de verzegelde katheter buizen met een schaar, selectievakje katheter lijnen zijn duidelijk van alle bubbels en bevestigen van de canule is nog steeds binnen de ader door het uitvoeren van een 10-20 µL zoute flush. Laad de gemeten dosis spuiten vanuit stap 6.4 in elk van de 4 katheters, het bijhouden van welke dosis werd gegeven aan elke muis.
  3. Klik op "OK" wanneer de PET-scan klaar om te beginnen is terwijl gelijktijdig het starten van een 10 tweede timer. Twee onderzoekers aan de achterkant van de scanner met de dosis spuiten in de hand, moeten alle 4 muizen tegelijk op de timer die tot nul te injecteren. Elke katheter met 50-100 µL zoutoplossing spoelen (afhankelijk van de lengte van de buis van de katheter — dat wil zeggen, de dood volume) Zorg ervoor dat de volledige dosis invoert de ader van de staart, en opnieuw verzegelen de buis opnieuw met behulp van een aansteker.
  4. Het meten van de dosis spuiten met behulp van een dosis kalibrator om een residuele radioactiviteit waarde (een tracer links in de spuit) te verkrijgen. Neem nota van de waarden en het tijdstip waarop dat ze zijn opgeslagen.
  5. Zodra de scan is voltooid, home de PET bed naar de oorspronkelijke positie met behulp van de horizontale "home" knop in de motie Configuratiescherm. De muizen uit de scanner te verwijderen en verwijder voorzichtig de katheter. Zachtjes druk uitoefenen op de cannulation site om te voorkomen dat overmatig bloeden.
  6. Het meten van de resterende activiteit in de katheter met behulp van een dosis kalibrator zoals hiervoor is beschreven.
  7. Als het muizen zijn terug te vorderen ervoor zorgen dit gebeurt in een warme omgeving (bijvoorbeeld in een doos met een verwarmde pad onder geheel of gedeeltelijk uit een handschoen gevuld met warm water) te verlichten van herstel. Als u van plan om de muizen euthanaseren, plaatst u de muizen in een cupje van de inductie met Isofluraan zodat ze verdoofde voorafgaand aan de euthanasie via perfusie blijven.
  8. Als u wilt reconstrueren van de gegevens, de post-processing beheren software niet openen (Zie Tabel of Materials), die zal automatisch reconstrueren elke scan met behulp van het histogramgegevens die de lst-bestand werd gegenereerd.

8. brain autoradiografie

  1. Voorafgaand aan het experiment, de digitale autoradiografie film te wissen door het wit licht gedurende 10-15 minuten te houden in een radioactiviteit-vrije zone tot gebruik bloot te leggen.
  2. 0,5 mL dosis spuiten voorbereiden op elke muis met ongeveer 1.0-1.5 mCi/37-56 MBq om ervoor te zorgen een dosis voldoende voor autoradiografie.
  3. Het meten van de radioactiviteit in de dosis spuit, met behulp van een dosis kalibrator, vóór injectie te verkrijgen van een nauwkeurige lezing van de activiteit.
  4. Cannulate zoals eerder is beschreven en muizen onmiddellijk in een gebied geschikt voor radioactiviteit te injecteren.
  5. Verwijderen van de katheter na injectie en de resterende radioactiviteit te meten.
  6. Laat de muizen in een verwarmde inductie kamer zodat ze verdoofde voorafgaand aan perfusie en euthanasie blijven.
  7. Euthanasie uitvoeren terwijl muizen zijn diep verdoofd (voortdurende inademing van 4% Isofluraan, 2 L/min 100% O2) via PBS perfusie en bilaterale Thoracotomie 30 min na [11C] DPA-713 injectie.
    1. Open de buikholte en snijden door het middenrif het hart bloot te stellen.
    2. Plaats een vlinder katheter infusie naald in het linkerventrikel van het hart en de juiste atrium en de vena cava inferior snip.
    3. Langzaam perfuse met PBS (~ 20-30 mL) met behulp van een spuit van 20 mL.
  8. Verwijder voorzichtig de hersenen van de schedel met behulp van Tang en schaar.
  9. Plaats de hersenen in een bevriezing mal gevuld met optimale scherpe temperatuur (OCT) vloeistof, waardoor ervoor dat de hersenen niveau en gecentreerd in de mal, met de bulbus bollen die gericht is op de inkepingen in de mal (om monumenten en afdrukstand eenmaal de hersenen is verwijderd uit de mal).
  10. Plaats mal op droog ijs voor 10-15 min of totdat de LGO ondoorzichtig wordt.
  11. Onmiddellijk plaats van elke schimmel in de cryostaat microtoom ingesteld op-18 ° C en equilibreer gedurende 10 minuten vóór montage.
  12. Schil weg de bevriezing schimmel en monteren van de hersenen naar de microtoom-platform met behulp van een kleine hoeveelheid vers OCT als de "lijm".
  13. Laat gemonteerd hersenen in de microtoom te bevriezen voor 2 min.
  14. Snijd door de hersenen tot de locatie van de lijn blootgesteld (dat wil zeggen, ROI is). De heer afbeelding gebruiken om te zoeken van het infarct in de hersenen van elk dier. Voor dMCAO moet dit consequent in de Somatosensorische cortex; de lengte van de lijn kan echter enigszins verschillen.
  15. Sectie de regio van de hersenen die verspreid over het infarct, plaatsen van 20 µm dik secties op glas Microscoop dia met het label met het nummer van de juiste muis.
  16. Open de autoradiografie cassette en lijn de bodem van de cassette met één vel Saran omslag. De dia's afdeling kant naar boven op de top van de saran omslag in de cassette en nemen nota van het standpunt van elke dia regelen. Optioneel, maak een foto van de plaatsing van de dia om te helpen met latere analyse.
  17. Zachtjes een andere laag van saran omslag plaats op bovenkant (na een wachttijd van ~ 2 min na verzameling van het laatste gedeelte van de hersenen - zodat het droog te houden aan de dia), en zorgvuldig plaats de digitale autoradiografie film (witte kant naar beneden) op de top van de dia's.
  18. Sluit de cassette strak en laat in een diepvriezer van-20 ° C, waardoor de secties verval op de film voor een voldoende blootstellingstijd (~ 5-10 halfwaardetijd).
  19. Scan de film na de blootstellingstijd met behulp van een fosfor imager voor het genereren van een digitale afbeelding voor latere analyse.

9. dynamische PET beeldanalyse

  1. Open de software van de analyse van de afbeelding (Zie Tabel van materialen) en klik op het pictogram 'open data' Laad de afbeelding CT (als de bron) en het "gegevens toevoegen" pictogram te laden van de dynamische PET (als referentie).
  2. Uitvoeren van een visuele controle van de kwaliteit van de gegevens via de tijdreeksen operator in het drop-down menu: selecteer Referentie ("ref") en "global" en toepassing van een passende min en maximum voor de kleurenschaal. Visualiseer de dynamische PET data frame voor frame, radioactiviteit opname verifiëren en controleren voor elke motie kunstdiscours binnen de scan.
  3. Maak een gemiddelde PET beeld met behulp van de "rekenkundige operator".
    1. Kies "average geselecteerd", 'ref' te deselecteren en zorgen voor ingang 1 ("Inp1"), ingang 2 ("Inp2") en input ster ("Inp *"-de rest van de PET-frames bevat in de scan) zijn geselecteerd voor het maken van een gemiddelde van alle frames van de PET.
    2. Ga naar het tabblad "data manager" (DM) en sleep de gemiddelde afbeelding tot de positie van de "Ingang1" voor visualisatie doeleinden. Herverdeling van de kleurenschaal door te klikken op de automatische berekening in het hulpprogramma "min-max".
  4. Registreer de CT naar het gemiddelde PET-bestand met behulp van de functie "automatische 3D" in het "re-orientation/registratie" drop-down menu.
    1. Selecteer "ref" en "Inp1", en kies "stijf", "snel", 'Inp1-Ref' registratie. Visueel controleren de registratie in alle 3 dimensies en handmatig aanpassen indien nodig op het tabblad van de "handmatige 3D" met behulp van de "vertaling" en "rotation" functies.
    2. Wanneer tevreden met de registratie, selecteer "Inp2" en "Inp *", en toegepast op alle PET frames door te klikken op het vinkje. Klik met de rechtermuisknop op de bestanden CT en PET in de DM en opslaan als raw.
  5. Bijsnijden van het brein van een muis op een tijdstip voor de analyse van de hersenen met behulp van de CT als een gids: Selecteer "bijsnijden" uit het drop-down menu en sleep de grenzen van de afbeelding wilt bijsnijden van het hoofd van de muis onder de hersenstam. Opnieuw oriënteren de PET- en CT-beelden met behulp van de functie "handmatige 3D heroriëntatie" zoals hierboven beschreven, zodat de schedel recht in alle dimensies is.
  6. Laden in de heer afbeelding voor die muis (in DICOM formaat) via de knop "gegevens toevoegen" op de top links van de interface. De MR met behulp van de "handmatige 3D heroriëntatie" verplaatsen en aanpassen aan de schedel in de CT-afbeelding (zorg ervoor dat alle modaliteiten in dezelfde afdrukstand).
  7. Teken de lijn ROI op het beeld van de heer met behulp van de "3D ROI tool".
    1. De PET-visualisatie uitschakelen door het uit te schakelen op het tabblad visuele controller (VC) en gebruik alleen de MR en de CT te trekken van de ROI.
    2. Klikt op de "add ROI" Maak een nieuwe ROI en noem deze "infarct". Selecteer de "spline tool", links klikken om te trekken van de rand van de ROI en klik met de rechtermuisknop om het te sluiten.
    3. Herhaal tot alle segmenten omvat de streek, om ervoor te zorgen niet te vangen een van de schedel in de ROI, met de beste praktijken te verlaten een voxel kloof tussen de rand van de schedel en beroerte ROI.
  8. Genereer een contralaterale ROI met behulp van het infarct volume.
    1. Maak een nieuwe ROI en geef deze het label "contralaterale". Klik met de rechtermuisknop op de ROI Infarct en selecteert u "exporteren". Sleep de ROI naar positie 2 ("Inp1").
    2. Met enige "Inp1" geselecteerd, een links rechts flip met behulp van de functie van "exploitant" in het menu "heroriëntatie/registratie" van toepassing. Vink het vakje "ROI", kies "view only" en handmatig de nieuwe ROI te verplaatsen naar de identieke regio aan de contralaterale zijde. Selecteer de "rekenkunde" operator en een scalaire vermenigvuldiging van 2 gelden voor de nieuwe ROI, onafhankelijke kwantificering van ROIs toelaat.
    3. Terug naar de 3D ROI tool. Ga naar het tabblad "deskundige en experimentele" en klik op de knop "importeren ROI". Inp1 selecteren in het dialoogvenster voor het laden van het nieuwe volume als de contralaterale ROI.
  9. Klik met de rechtermuisknop op de gemiddelde PET afbeelding en ontladen en het huisdier weer inschakelt. Het genereren van de resultaten van de kwantitatieve opname met behulp van het pictogram "export resultaten" binnen de 3D ROI tool.
  10. Extra split hersenen analyse uitvoeren indien gewenst (dat wil zeggen, geautomatiseerde ROI generatie recht ten opzichte van de linker hersenen halfrond regio's met behulp van een 3D-muisaanwijzer hersenen atlas plugin module voor Vivoquant software).
    1. Re-vracht naar de geregistreerde PET/CT-beelden.
    2. De muis hersenen atlas importeren door te klikken op de "geavanceerde modules"-menu en selecteren van het gereedschap 3D hersenen atlas. Selecteer "alle regio's links/rechts" in de "geavanceerde instellingen" en klik "run" om te importeren van de 3D atlas.
    3. Handmatig de atlas passen binnen de hersenen met behulp van de schedel als een rand.
    4. De atlas ervoor te zorgen dat "importeren 3D ROI" is aangevinkt voor het genereren van een werkblad van resultaten voor alle 14 linker en rechter hemisfeer ROIs (medulla cerebellum, veroorzaakt, pons, schors, hippocampus, thalamus, hypothalamus, striatum, pallidum, bulbus bollen, re-stormloop Corpus callosum en witte stof).
  11. Kwantificeren van tracer opname in de milt met behulp van de scanner besturingssoftware (zie tabel van materialen).
    1. PET- en CT-beeldbestanden laden door te wijzen ze in de database en te klikken op "algemene analyse".
    2. Klik op het tabblad registratie en co registreren PET- en CT-beelden te klikken op het pictogram "stijve" registratie".
    3. Klik op het tabblad ROI kwantificering, klik op het icoon "create ROI" en noem deze milt.
    4. Kies het "sphere" tool om te tekenen van milt ROIs met behulp van de CT-bestand ter referentie, ervoor te zorgen is er geen overlapping met de opname van de nier (de PET-afbeelding gebruiken en signaal om te voorkomen dat spill-over van de nieren).
    5. Bewerk de ROIs om consistente ROI volumes tussen dieren.
  12. Een standaard correctie waarde berekenen voor normalisatie van de opname.
    1. De PET/CT-gegevens laden in de standaard scan en maak een cilinder ROI omvat de 20 mL spuit met behulp van de "handmatige 3D ROI" tool.
    2. Het verkrijgen van het niveau van radioactiviteit die deel uitmaakt van de standaard met behulp van het pictogram van het werkblad.
    3. Kunt dit nCi/cc-resultaat en de oorspronkelijke opgenomen radioactiviteit voor de standaard (dat wil zeggen, de dosis kalibrator meting van de standaard in nCi/cc) maken een correctiefactor voor PET opname waarden. Dat wil zeggen, verdeel de radioactiviteit van de standaard opgenomen door de dosis kalibrator door de radioactiviteit berekend op basis van de afbeelding van de PET van de standaard.
  13. Gebruik de dosis activiteiten en tijd van metingen tot verval juist op het tijdstip van verwerving van het huisdier voor alle muizen (dwz berekenen de activiteit van de dosis aan het begin van de PET-scan).
  14. Herhaal voor de restwaarden en aftrekken van de gecorrigeerde dosis van verval voor de berekening van de exacte activiteit elk dier ontvangen.
  15. Na het toepassen van deze correctie verval, ook de standaard correctie om ervoor te zorgen dat de gegevens op de juiste activiteitenniveau zijn van toepassing. Zorgen dat deze correcties worden toegepast op de resultaten van handmatig getekende ROI en de hersenen atlas ROI gegevens betrokken hersengebieden voor dMCAO locatie (dat wil zeggen, de cortex, hippocampus en striatum).
  16. De %ID/g voor alle ROIs met behulp van de volgende vergelijking berekenen: %ID/g = (ROI radioactiviteit in nCi/cc / verval gecorrigeerde dosis ontvangen in nCi/cc) x 100. %ID/g worden uitgezet als functie van de tijd met behulp van grafische software voor het genereren van tijd activiteit curven voor elke ROI.
  17. Gebruik scannersoftware voor visualisatie en figuur generatie van de uiteindelijke afbeelding. Normaliseren van beelden volgens de verval gecorrigeerde dosis ontvangen door elke muis op het moment van scannen, zorgen voor alle afbeeldingen op dezelfde %ID/g schaal.
    Opmerking: dit is nodig om een nauwkeurige vergelijking van de beelden van verschillende muizen en/of afbeeldingen uit studies uitgevoerd op verschillende dagen

10. autoradiografie beeldanalyse

  1. Open de digitale afbeelding (.gel-bestand) in ImageJ software. Aanpassen van de helderheid en het contrast aan visueel drempelwaarde het beeld en een passende kleur "opzoektabel" toepassen.
    Opmerking: Royal lijkt meest nauwkeurig op de kleurenschaal gebruikt in PET.
  2. De ROI-manager gebruiken voor het handmatig tekenen ROIs rond infarct en bijbehorende contralaterale regio's.
  3. Gebruik de functie voor het kwantificeren van de intensiteit van de gemiddelde pixel van elke ROI en exporteren van resultaten. Uitgezet met behulp van statistische software.

Representative Results

Muizen onderging MRI om te controleren of de succesvolle lijn en [11C] DPA-713 PET werd uitgevoerd door het scannen van 4 muizen tegelijk. PET, CT, en MIJNHEER beelden waren samen ingeschreven vóór handmatig hersenen ROIs opstellen en uitvoeren van de semi-automatische split hersenen atlas analyse, om te onderzoeken tracer opname in ipsilaterale en contralaterale regio's (Figuur 2).

PET/CT-beelden en tijd activiteit curven (TAC-radiotracer activiteit als een functie van de tijd) weergegeven verhoogde [11C] DPA-713 opname in de ipsilaterale versus contralaterale hemisferen (Figuur 3A). Kwantificering van dynamische PET hersenen beelden, met behulp van vatte gegevens van 50-60 min, bleek een aanzienlijke toename van de tracer opname (% ID/g) in de ipsilaterale (infarcted) in vergelijking met het contralaterale halfrond in dMCAO, maar niet in sham muizen met behulp van het handmatig getekend ROI benadering (Figuur 3B). Verhoogde opname werd ook waargenomen in de ipsilaterale halfrond tussen dMCAO en sham muizen. Geen significante verschillen tussen ipsilaterale en contralaterale hemisferen werden waargenomen met behulp van de aanpak van de atlas, waarschijnlijk als gevolg van de atlas ROIs wordt groter dan de grootte van het infarct (meestal beperkt tot de Somatosensorische cortex), daarom verdunnen de signaal. Echter, algemene verhoogde opname in dMCAO ten opzichte van sham werd waargenomen voor alle ROIs, die is uitgelijnd met de vorige rapporten met behulp van MCAO model muizen, verhoogde TSPO expressie in gebieden buiten de infarct19demonstreren. Ipsilaterale/contralaterale ratio's werden verhoogd in het dMCAO versus sham muizen met behulp van beide benaderingen; Dit verschil was echter alleen belangrijk in de cortex die met behulp van de atlas aanpak van de hersenen als gevolg van grotere afwijking in de benadering van de ROI. Dit kan worden overwonnen door het verhogen van het aantal muizen in elke groep. Kwantificering van [11C] DPA-713 opname in milt toonde geen significante verschillen tussen groepen (Figuur 4).

Hersenen dMCAO muis PET imaging resultaten werden bevestigd door ex vivo hoge resolutie digitale autoradiografie (Figuur 5). Verhoogde [11C] DPA-713 opname werd waargenomen in infarcted weefsel met te verwaarlozen signaal in het omgevende gezonde hersenweefsel. Kwantificatie van deze beelden bleek ipsilaterale contralaterale verhouding variërend van 1.4 tot 2.09 bij dMCAO muizen.

Figure 1
Figuur 1: PET-Scanner en werkruimte Set-up. Alle werkruimten waren bedekt met beschermende absorberende opvulling een steriele omgeving te creëren. (A) na kalibraties, een 3D-gedrukte muis bed, uitgerust voor 4 muizen tegelijkertijd denkbaar was beveiligd in de scanner of de neus cones voor alle 4 muizen aangesloten op de narcose. (B) noodzakelijke uitrusting voor het huisdier imaging bereid waren van tevoren, met inbegrip van zoutoplossing gevulde 27.5 G katheters, oog smeermiddel, ethanol swabs, warmte lampen, chirurgische tape, lijm weefsel, 0,5 mL dosis spuiten, schaar en een aansteker. (C) voor radiotracer injectie, plaats saline-flush spuiten en schaar aan de achterkant van de scanner. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: Ipsilaterale/contralaterale ROI en rechts/links-Split halfrond Brain Atlas PET afbeelding analyseproces. Beeldanalyse software werd gebruikt om te bepalen van de opname van de tracer ipsilaterale en contralaterale regio van belang (ROIs) met behulp van handmatig getrokken ROIs en een semi-automatische 3D split-brain atlas-aanpak. Automatische 3D PET/CT-registratie werd uitgevoerd gevolgd door handmatige registratie van de hersenen MRI binnen de bijbehorende muis schedel gedefinieerd in de CT-afbeelding. Met het gereedschap 3D ROI gewend was handmatig tekenen ipsilaterale (rood) en contralaterale (groen) ROIs met behulp van het infarct op de MRI als referentie. Voor de split-brain benadering, was de 3D muis van de links/rechts-split hersenen atlas geladen en gemonteerd binnen de schedel zoals gedefinieerd door de CT-afbeelding. Hersenen ROIs gebruikt voor kwantificering in deze 3D muis hersenen atlas opgenomen links Cortex (donkergrijs), links Hippocampus (blauwe Korenbloem) links Striatum (diep roze), rechts Cortex (tomaat rood), rechts Hippocampus (groen) en rechts Striatium (cyaan). De opname van [11C] DPA-713 in elke regio werd verkregen in nCi/cc en werd later geconverteerd naar %ID/g door het normaliseren van de verval-gecorrigeerde dosis op moment van scannen voor elke muis. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Vertegenwoordiger In Vivo [11C] DPA-713 hersenen opname in DMCAO en Sham muizen. (A) dynamische PET/CT-beelden en TAC's tonen verhoogde [11C] DPA-713 opname in de ipsilaterale cortex van muizen die onderging DMCAO (n = 3) en een lichte stijging voor sham (n = 3) muizen, met DMCAO muizen aan te tonen een significant groter bediend contrast in percentage ingespoten dosis tussen het infarct en de contralaterale zijde van de hersenen (%ID/g). (B) PET kwantificering (50-60 min opgeteld) bleek aanzienlijk verhoogde opname in de ipsilaterale ROI met behulp van de ROI-aanpak en in de cortex (Ctx) met behulp van de split-brain atlas-aanpak. Geen significante verschillen werden gevonden in de hippocampus (HC) of het striatum (Str). Verhoogde ipsilaterale om contralaterale verhoudingen werden gezien met behulp van zowel analyse benaderingen maar was alleen statistisch significant in de Ctx met behulp van de hersenen atlas aanpak. * (p < 0,05), *** (p < 0.001) Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: Vertegenwoordiger In Vivo [11C] DPA-713 milt opname in dMCAO en Sham muizen. (A) [11C] DPA-713 dynamische PET/CT afbeeldingen tonen van milt ROIs in dMCAO (n = 3) en sham (n = 3) muizen. (B) kwantitatieve resultaten tonen geen significante resultaten in milt opname tussen dMCAO en sham muizen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5 : Vertegenwoordiger autoradiografie resultaten. Digitale autoradiografie beelden tonen verhoogde [11C] DPA-713 opname in de ipsilaterale t.o.v. contralaterale halfrond. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

Het gepresenteerde protocol beschrijft een methode voor de kwantificering van neuroinflammation in dMCAO en sham muizen met behulp van [11C] DPA-713-PET. TSPO-PET is de meest onderzochte imaging biomerker voor het visualiseren en meten van neuroinflammation in vivo tot nu toe. TSPO expressie is upregulated op glia in de hersenen tijdens de ontsteking waardoor de niet-invasieve detectie en kwantificering van neuroinflammation. Het is bovendien een zeer vertaalbare techniek, waardoor het een waardevol hulpmiddel in zowel klinisch en preklinisch onderzoek. Dit protocol en de representatieve resultaten wijzen op de geschiktheid van het gebruik van [11C] DPA-713 PET te detecteren en te controleren neuroinflammatoire wijzigingen in de streek- en andere neurologische aandoeningen in vivo.

In deze studie werd dMCAO chirurgie uitgevoerd met behulp van de 3-maand-oude C57BL/6 vrouwelijke muizen. Dit model werd gekozen als het leidt tot een zeer reproduceerbaar infarct beperkt tot de Somatosensorische cortex, een model van permanente focal ischemie te voorzien van lage variabiliteit ten opzichte van andere modellen van een beroerte (bijvoorbeeld midden cerebrale arterial de methode van de gloeidraad van de occlusie (MCAO)),14. HUISDIER beeldvorming van beroerte modellen heeft het voordeel dat met de regio voor een interne verwijzing in de hersenen voor elk dier met behulp van ROIs binnen het contralaterale halfrond. Aangezien er sommige ontsteking dat resultaten van de operatie alleen, het is belangrijk om op te nemen van muizen die schijnvertoning geopereerd in het ontwerp van de studie, waarbij craniotomy en manipulatie van de hersenvliezen zonder occlusie van de arteria werd uitgevoerd. Craniotomy alleen kan leiden tot verstoring van de onderliggende neuronale weefsel en de invoering van ziekteverwekkers leiden tot immuunresponsen onafhankelijk van lijn20. Sommige ontsteking na sham chirurgie wordt daarom verwacht en parallel aan de dMCAO uit te sluiten van de mogelijkheid van signaal als gevolg van de operatie alleen moet worden beoordeeld. Om te voorkomen met inbegrip van ontsteking als gevolg van de operatie zonder streek in dMCAO cohort analyse, moet MIJNHEER imaging plaatsvinden om te bevestigen van de succesvolle lijn chirurgie en infarct ontwikkeling. MRI biedt ook een structurele referentiekader, die van essentieel belang voor het nauwkeurig tekenen het infarct en contralaterale ROIs. Daarnaast zijn accurate beeldverwerking met inbegrip van beeldregistratie en ROI definitie noodzakelijk zijn om betrouwbare kwantificering.

Aanvullende beperkingen moeten in mening worden gehouden bij het werken met C-11 radiotracers voor huisdier en autoradiografie studies gelabeld. Het is noodzakelijk dat de korte halfwaardetijd (20.33 min) van C-11, met het gebruik ervan in het algemeen beperkt tot onderzoeksinstellingen met on-site cyclotron toegang. Passende radioactiviteit transport route, toediening en acquisitie tijd-punten moeten worden bepaald op voorhand met een vooraf bereid gedetailleerd plan van de workflow van het experiment zodat het team snel en efficiënt kunt werken. Het ontwerp en de opzet van deze studie heeft uitgestippeld om beeldvorming van 4 muizen tegelijk toe de gegevens output kan worden verkregen bij het gebruik van een C-11-tracer aan te passen. Indien mogelijk is het raadzaam om alle muizen gecanuleerd en in het midden van hun CT-scan, tegen de tijd dat de C-11-tracer arriveert bij de beeldvorming faciliteit om minimale radiotracer verval vóór injectie. Dit stapsgewijze protocol wordt ook best uitgevoerd door een team met tenminste 3 onderzoekers te voorzien van snelle cannulation, meting van de dosis, tracer injectie, huisdier scannen en hersenen afdelen voorafgaand aan belangrijke radioactief verval. Het vereist twee mensen uit te voeren van de inleiding van de PET-scan en injectie van alle 4 muizen tegelijk. De reden voor het begin van de overname van de PET net vóór injectie is om ervoor te zorgen dat de farmacokinetiek en de dynamiek van tracer distributie in bloed en regio's van belang worden nauwkeurig en volledig vastgelegd. Veel stappen kunnen vereisen krachtige training en praktijk om de goede werking van het experiment. Dit protocol is in het bijzonder afhankelijk van succesvolle staart veneuze cannulation van C57BL/6 muizen, die kan moeilijk te wijten aan de donkere haren aanwezig op hun staarten, en kan meer uitdagende na beroerte heeft plaatsgevonden of als het dezelfde muizen op meerdere tijdstippen-imaging .

Een andere overweging voor PET imaging bevat zorgvuldige registratie van radiotracer dosis en resterende activiteit metingen, met inbegrip van het exacte tijdstip van de meting. Dit is essentieel voor nauwkeurige verval correctie van de geïnjecteerde dosis op het moment van de scan en wordt gebruikt voor het verkrijgen van een nauwkeurige meting van tracer opname (dat wil zeggen, % ID/g) voor elke ROI. Het is noodzakelijk om te weten de exacte hoeveelheid radioactiviteit die aanwezig zijn in elke muis op het moment van scannen om ervoor te zorgen nauwkeurige beeldanalyse was. Het is daarom aan te raden om de klokken op de computer van de scanner en de dosis kalibrator om fout te vermijden bij het gebruik van korte duur isotopen zoals C-11 te synchroniseren.

Kwantificering van de afbeelding nauwkeurig huisdier kan ook worden beperkt door de nauwkeurigheid van de scanner en de set-up. Vandaar om ervoor te zorgen nauwkeurige kwantificering van PET/CT-beelden, is het belangrijk voor het uitvoeren van kwaliteitscontroles voor zowel de CT en huisdier componenten van de scanner. CT kwaliteitscontrole controles omvatten X-ray bron airconditioning, donker/licht en center uit set kalibraties. Deze kalibraties meten en juiste voor systeem lawaai en moet worden uitgevoerd vóór de overname zoals aanbevolen door de fabrikant van de scanner. Kalibraties moeten ook worden uitgevoerd voor de PET-scanner. Dit betekent meestal dat een scan van de "standaard / huisdier phantom", dat een bekende concentratie van radioactiviteit scannen. Bij de voorbereiding van de standaard, is het het beste gebruik van de dezelfde isotoop gebruikt in de studie, een vergelijkbare dosis die toegediend aan een enkele muis in een volume die vergelijkbaar is met het lichaam van een muis, en de overname van dezelfde parameters als dierlijke imaging. Een 20 mL spuit gevuld met radiotracer verdund in water wordt gebruikt voor de norm in dit protocol, met de latere PET imaging resultaten gebruikt voor het berekenen van een correctiefactor op basis van de werkelijke dosis, gemeten door de detector van de kalibratie. De verhouding van de correctie kan worden toegepast op de imaging gegevens verworven in de experiment om ervoor te zorgen nauwkeurige kwantificering van tracer opname in regio's van belang in PET beelden. Dit verklaart het positron-bereik van de radionuclide naast overweegt elke achtergrond activiteit aanwezig op de dag van het scannen. Als de dosis kalibrator een integraal onderdeel van de generatie van deze correctiefactor is, is het noodzakelijk dat deze apparatuur ook regelmatig gekalibreerd volgens de richtlijnen van de fabrikant.

Bij het uitvoeren van ex vivo autoradiografie is het belangrijk om een optimale tijd-punt voor euthanasie Kies na injectie, om te zorgen voor hoge signaal-naar-achtergrond in regio('s) van belang. Dertig minuten na injectie werd gekozen voor [11C] DPA-713 autoradiografie met behulp van gegevens die zijn verkregen tijdens dynamische PET beeldvorming -dat wil zeggen, de in vivo dynamische TAC's als een gids, terwijl ook gezien de korte halfwaardetijd van C-11 en de tijd betrokken afdeling en bloot de hersenweefsel na extractie. Gezien dit, [11C] DPA-713 autoradiografie moet worden uitgevoerd op een aparte cohort van muizen te maken voor de injectie van een hogere [11C] DPA-713 dosis en een 30 minuten tijd-punt voor perfusie en euthanasie onder verdoving. Uitvoeren van een kleine in vivo zal pilootstudie van het huisdier met een 3-4 muizen vóór het uitvoeren van ex vivo autoradiografie zitten hulpvaardig voor de bepaling van het optimale tijdstip voor autoradiografie. Een extra overweging voor ex vivo autoradiografie is of te herstellen van de muizen na injectie of houd ze verdoofd tot euthanasie. Houden ze verdoofd bootst de voorwaarden van de scan en zorgt voor de verspreiding of uitscheiding kinetiek van radiotracer niet worden gewijzigd door herstel. Bovendien voorkomt dit extra stress op de muizen door het vermijden van terugwinning en latere inductie. Ten slotte zou een nuttige toevoeging aan het protocol ex vivo te beoordelen van de regionale schade in de hersenen plakjes gebruikt voor autoradiografie via immunohistochemische kleuring (na radioactief verval) voor het genereren van een afbeelding met hoge resolutie van infarct locatie en volume.

Als er beperkingen aan het gebruik van een C-11 gebaseerd tracer, kan dit protocol eenvoudig worden aangepast voor gebruik met een F-18 (halfwaardetijd van 109.77 min) gebaseerd TSPO tracer, die mogelijk meer toepassing op locaties zonder een on-site cyclotron. Bovendien, beschrijft dit protocol het gebruik van een 4-muis imaging set-up. Hoewel deze methode van hoge-doorvoer optimaal is bij gebruik van een C-11-tracer, kan het zijn dat dit protocol ook worden gewijzigd voor degenen met behulp van één muis imaging bedden. Zorgvuldige planning en verenigbare opleiding in de technieken die worden beschreven in dit protocol zal leiden tot de generatie van een schat aan gegevens met behulp van [11C] DPA-713, die gemakkelijk kan worden toegepast op de sonde van de rol van neuroinflammation in manifestatie van de ziekte en progressie in andere knaagdieren modellen van neurologische aandoeningen. Deze techniek kan bovendien worden gebruikt ter beoordeling van de reactie in vivo op immunomodulerende therapeutics gericht microglia/macrofagen.

Disclosures

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Acknowledgments

De auteurs bedank het Buckwalter lab (vooral Dr. Todd Peterson) voor de verlening van de muismodel en uitvoeren van de dMCAO en sham operaties. Wij willen bovendien Thomas Liguori van Invicro bedanken voor zijn technische bijstand met VivoQuant afbeelding analysesoftware, Dr. Tim Doyle, Dr. Laura Pisani, Dr. Frezghi Habte van de SCi3 klein dier imaging faciliteit in Stanford voor hun advies en bijstand bij de ontwikkeling van dit imaging protocol, en de radiochemie faciliteit (vooral Dr. Jun Park) voor hun hulp bij de synthese van [11C] DPA-713.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Inveon PET/CT scanner Siemens Version 4.2
MRI scanner Varian 7 Telsa
ParaVision software Bruker Version 6.0.1 MRI operating software
VivoQuant software InVicro Version 2.5 Image analysis software
Inveon Research Workspace software Siemens Version 4.2 Scanner operating software. Includes microQView, the post-processing managing software
Dose calibrator Capintech CRC-15 PET
Typhoon phosphor imager 9410 GE Healthcare 8149-30-9410
Butterfly catheters SAI Infusion Technologies BFL-24 27.5 G needle
1 mL syringes BD
Insulin syringes BD 329461 0.5 mL insulin syringes with needle
20 mL syringe  VWR BD302831 BD Syringe Slip Tip Graduated
Tissue glue Santa Cruz Animal Health sc-361931 3 mL
Heat lamp Fluker 27002 5.5" reptile heat lamp with clamp and switch
0.9% sterile saline Pfizer 00409-4888-10 0.9% sodium chloride for injection, 10 mL
Eye lubricant Watson Rugby PV926977 Artificial Tears Lubricant Eye Ointment, 1/8 oz
Chux absorbent sheets ThermoFisher Scientific 1420662 Disposable absorbent padding
Iris scissors World Precision Instruments 503708-12 11.5 cm, Straight, 12-pack
Surgical tape 3M Durapore 1538-0 1/2" x 10 yard roll, silk, hypoallergenic
Mouse PET bed In house 4 mouse PET bed
Lighter Bic UDP2WMDC
Isoflurane Henry Schein NDC 11695-6776-2 Isothesia, inhalation anesthetic, 250 mL
Oxygen Praxiar UN1072 Compressed gas
Autoradiography cassette Cole Palmer EW-21700-34 Aluminum, 8" x 10"
Autoradiography film GE Life Sciences 28-9564-78 Storage Phosphor Screen BAS-IP SR 2025 E Super Resolution, 20 × 25 cm, screen only
Microtome blades ThermoFisher Scientific 30-508-35 MB35 Premier Disposable, 34° cutting angle
Microtome Microm HM 550
Microscope slides Fisher Scientific 12-550-15 Superfrost™ Plus Microscope Slides
OCT liquid VWR 25608-930 Formulation of water-soluble glycols and resins for cryostat sectioning at temperatures of -10°C (14°F) and below
Freezing molds Poly sciences 18646A-1 Disposable paraffin molds
Saran wrap Saran 25700001300
Disinfectant Virkon S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Benjamin, E. J., et al. Heart disease and stroke statistics-2017 update: A report from the american heart association. Circulation. 135 (10), 146-603 (2017).
  2. Jin, R., Yang, G., Li, G. Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells. J Leukoc Biol. 87 (5), 779-789 (2010).
  3. Wang, Q., Tang, X. N., Yenari, M. A. The inflammatory response in stroke. J Neuroimmunol. 184 (1-2), 53-68 (2007).
  4. Brown, R. C., Papadopoulos, V. Role of the peripheral-type benzodiazepine receptor in adrenal and brain steroidogenesis. Int Rev Neurobiol. 46, 117-143 (2001).
  5. Papadopoulos, V., Lecanu, L., Brown, R. C., Han, Z., Yao, Z. X. Peripheral-type benzodiazepine receptor in neurosteroid biosynthesis, neuropathology and neurological disorders. Neuroscience. 138 (3), 749-756 (2006).
  6. Scarf, A. M., Kassiou, M. The translocator protein. J Nucl Med. 52 (5), 677-680 (2011).
  7. Cerami, C., Perani, D. Imaging neuroinflammation in ischemic stroke and in the atherosclerotic vascular disease. Curr Vasc Pharmacol. 13 (2), 218-222 (2015).
  8. Stefaniak, J., O'Brien, J. Imaging of neuroinflammation in dementia: a review. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 87 (1), 21-28 (2016).
  9. Gerhard, A. TSPO imaging in parkinsonian disorders. Clin Transl Imaging. 4, 183-190 (2016).
  10. Airas, L., Rissanen, E., Rinne, J. O. Imaging neuroinflammation in multiple sclerosis using TSPO-PET. Clin Transl Imaging. 3, 461-473 (2015).
  11. Fan, J., Lindemann, P., Feuilloley, M. G., Papadopoulos, V. Structural and functional evolution of the translocator protein (18 kDa). Curr Mol Med. 12 (4), 369-386 (2012).
  12. James, M. L., et al. Synthesis and in vivo evaluation of a novel peripheral benzodiazepine receptor PET radioligand. Bioorg Med Chem. 13 (22), 6188-6194 (2005).
  13. Boutin, H., et al. 11C-DPA-713: A novel peripheral benzodiazepine receptor PET ligand for in vivo imaging of neuroinflammation. J Nucl Med. 48 (4), 573-581 (2007).
  14. Doyle, K. P., Buckwalter, M. S. A mouse model of permanent focal ischemia: distal middle cerebral artery occlusion. Methods Mol Biol. 1135, 103-110 (2014).
  15. Wang, Y., et al. [(18)F]DPA-714 PET imaging of AMD3100 treatment in a mouse model of stroke. Mol Pharm. 11 (18), 3463-3470 (2014).
  16. Domercq, M., et al. PET Imaging with [(18)F]FSPG evidences the role of system xc(-) on brain inflammation following cerebral ischemia in rats. Theranostics. 6 (11), 1753-1767 (2016).
  17. Toth, M., et al. Acute neuroinflammation in a clinically relevant focal cortical ischemic stroke model in rat: longitudinal positron emission tomography and immunofluorescent tracking. Brain Struct Funct. 221 (3), 1279-1290 (2016).
  18. Walter, H. L., et al. In vivo analysis of neuroinflammation in the late chronic phase after experimental stroke. Neuroscience. 292, 71-80 (2015).
  19. Rojas, S., et al. Imaging brain inflammation with [(11)C]PK11195 by PET and induction of the peripheral-type benzodiazepine receptor after transient focal ischemia in rats. J Cereb Blood Flow Metab. 27 (12), 1975-1986 (2007).
  20. Glazier, S. S., O'Rourke, D. M., Graham, D. I., Welsh, F. A. Induction of ischemic tolerance following brief focal ischemia in rat brain. J Cereb Blood Flow Metab. 14 (4), 545-553 (1994).

Tags

Geneeskunde kwestie 136 Neuroinflammation translocator eiwit 18 kDa (TSPO) positron emissie tomografie (PET) magnetische resonantie imaging (MRI) neuroimaging beroerte muizen.
HUISDIER beeldvorming van Neuroinflammation met behulp van [<sup>11</sup>C] DPA-713 in een muismodel van ischemische beroerte
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chaney, A. M., Johnson, E. M.,… More

Chaney, A. M., Johnson, E. M., Cropper, H. C., James, M. L. PET Imaging of Neuroinflammation Using [11C]DPA-713 in a Mouse Model of Ischemic Stroke. J. Vis. Exp. (136), e57243, doi:10.3791/57243 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter