Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

PET-billeddannelse af Neuroinflammation ved hjælp af [11C] DPA-713 i en musemodel af iskæmisk slagtilfælde

Published: June 14, 2018 doi: 10.3791/57243
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Radiology, Stanford University, 2Department of Neurology and Neurological Sciences, Stanford University

Summary

Positronemissionstomografi (PET) billeddannelse af translocator protein 18 kDa (TSPO) giver en non-invasiv måde at visualisere den dynamiske rolle, neuroinflammation i udvikling og progression af hjernesygdomme. Denne protokol beskriver TSPO-PET og ex vivo Autoradiografi for at registrere neuroinflammation i en musemodel af iskæmisk slagtilfælde.

Abstract

Neuroinflammation er centrale for den patologiske cascade efter iskæmisk slagtilfælde. Non-invasiv molekylær billeddannelse metoder har potentiale til at give kritisk indsigt i den tidsmæssige dynamics og rolle i visse neuroimmune interaktioner i streg. Specifikt, giver Positron Emission tomografi (PET) billeddannelse af translocator protein 18 kDa (TSPO), en markør for aktiverede mikroglia og perifere myeloid-slægt celler, mulighed for at registrere og spore neuroinflammation in vivo. Vi præsenterer her, en metode til at nøjagtigt kvantificere neuroinflammation bruger [11C]N,N-Diethyl-2-[2-(4-methoxyphenyl)-5,7-dimethylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]acetamide ([11C] DPA-713), en lovende anden generation TSPO-PET radiotracer, i distale midt cerebral arterieokklusion (dMCAO) i forhold til sham-drives mus. Mr blev udført 2 dage post-dMCAO kirurgi at bekræfte slagtilfælde og definere infarkt placering og volumen. PET/Computed Tomography (CT) scanning blev udført 6 dage post-dMCAO til at fange peak forhøjelsen af TSPO niveauer efter slagtilfælde. Kvantitering af PET billeder blev udført for at vurdere udbredelsen af [11C] DPA-713 i hjernen og milten af dMCAO og sham mus at vurdere centrale og perifere niveauer af betændelse. In vivo [11C] DPA-713 hjerne optagelsen blev bekræftet ved hjælp af ex vivo Autoradiografi.

Introduction

Slagtilfælde er den femte mest almindelige dødsårsag og en væsentlig årsag til invaliditet i USA1. Iskæmisk slagtilfælde repræsenterer et overvældende flertal af disse sager (~ 87%), der sker, når der er lokaliserede forstyrrelser i blodgennemstrømningen til hjernen (f.eks. af en blodprop eller fede indskud). Ilt og næringsstoffer forsyninger til de ramte områder er efterfølgende reduceret og en kompleks patologiske kaskade initieres resulterer i neuronal død inden for slagtilfælde core (infarkt) ud over de omkringliggende områder. Neuroinflammation er en afgørende komponent i den vej, der fører til denne skade, med både hjemmehørende hjernen immunceller (mikroglia) og infiltrerer perifere immunceller (neutrofiler, T-celler, B-celler og monocytter/makrofager) menes at bidrage til dette destruktive kaskade2,3. Aktiveret mikroglia og makrofager er central for dette neuroinflammatory svar, med rapporter om skadelige og gavnlige virkninger efter iskæmisk slagtilfælde2. Det er således nødvendigt at vurdere disse celler efter slagtilfælde i vivo bidrag.

PET er en kraftfulde 3-dimensionelle molekylær billeddannelse teknik, der giver mulighed for visualisering af biologiske processer i vivo ved hjælp af specifikke molekyler, mærket med positron (β +) udsender radionuklider 11C, 13Nielsen, 15O og 18F. Denne ikke-invasiv metode har mange fordele i forhold til ex vivo metoder (fx Immunhistokemi) som det tillader erhvervelse af Molekylær information i realtid, i levende intakt fag, og giver mulighed for langsgående undersøgelse. PET billedbehandling af TSPO, en markør for aktiverede mikroglia og perifere myeloid-slægt celler, giver et middel til at kvantificere og spore medfødte immun celle svar inden for kroppen, og kan udnyttes til at vurdere betændelse efter slagtilfælde og respons på terapeutiske interventioner. TSPO, tidligere kendt som perifere-typen benzodiazepin-receptor, er en 18 kDa protein, der menes at spille en rolle i kolesterol transport og syntesen af neurosteroids4. Desuden tyder på, at TSPO er involveret i neuroinflammation og neuronal overlevelse5,6, med rapporter om øget udtryk i mange neurologiske sygdomme der involverer betændelse herunder slagtilfælde7, demens8, Parkinsons sygdom9 og multipel sklerose10. TSPO er beliggende på ydre mitokondrie membraner og er stærkt udtrykt i periferien, især i steroid knyttet væv (f.eks, kirtler) og med mellemliggende niveauer set i hjertet, nyrer og lunger10. Men i en sund hjerne, TSPO niveauer er lav og begrænset primært til glia6,11. Ved neuronal skade, som den, der observeres i streg, TSPO niveauer i centralnervesystemet (CNS) stige betydeligt. Denne observerede opregulering af TSPO kan udnyttes til billede neuroinflammation in vivo med udtryk niveauer giver en præcis indikator for betændelse sværhedsgraden. Målet med denne metode er derfor at nøjagtigt kvantificerei vivo bidrag af neuroinflammation i en musemodel af iskæmisk slagtilfælde ved hjælp af TSPO-PET.

Flere TSPO røbestoffer er blevet udviklet til PET-billeddannelse af neuroinflammation. Her, TSPO-PET imaging er beskrevet ved hjælp af [11C] DPA-71312, en lovende anden generation TSPO tracer, som har vist forbedret signal til støj og lavere ikke-specifik binding end de mere historisk brugt [11C] PK11195 13 . Som et eksempel, blev dMCAO musemodel af slagtilfælde valgt til denne metode14. Denne model indebærer tidsmæssige kraniotomi og permanent ligatur af den distale midt cerebral arterie, resulterer i fokal iskæmi af somatosensoriske cortex. Dette er fordelagtigt i prækliniske slagtilfælde forskning skyldes høj reproducerbarhed af iskæmisk skade og lav dødelighed forbundet med denne model. Til dato har TSPO-PET imaging studier endnu skal rapporteres i dMCAO gnaver model. Men tidligere PET billeddiagnostiske undersøgelser ved hjælp af den midterste cerebral arterie okklusion (MCAO) model, en mere alvorlig og variable slagtilfælde model, hos både mus og rotter, har rapporteret TSPO udtryk at stige fra dag 3 og peak omkring dag 7 efter slagtilfælde15, 16,17,18. Dermed, vi udførte PET imaging 6 dage post-dMCAO sammenfaldende med forhøjede TSPO udtryk. [11C] DPA-713 optagelse i hjernen blev vurderet i ipsilaterale (infarcted) og kontralaterale halvkugler. TSPO-PET blev kombineret med strukturelle Mr, giver mulighed for præcis afgrænsning af infarkt og kontralaterale regioner af interesse (ROIs). Her beskriver vi både et atlas-baseret og en Mr-drevet ROI henvendelse hen til kalkulere [11C] DPA-713 optagelse. Radiotracer optagelse i milten blev også vurderet for at undersøge perifere niveauer af betændelse mellem grupper. Denne metode har potentialet til at levere kritisk indsigt i spatiotemporelle dynamics og rollen som specifikke neuroimmune interaktioner i slagtilfælde og andre neurologiske sygdomme.

Protocol

Alle dyreforsøg blev gennemført i overensstemmelse med de Administrative Panel på Laboratory Animal Care (APLAC) på Stanford Universitet, et program, der er akkrediteret af Association for evaluering og akkreditering af Laboratory Animal Care. Før denne procedure blev tre måneder gamle C57BL/6 hunmus dMCAO opereret standard procedure og sterile forhold14.

1. strukturelle Mr (2 dage Post-dMCAO kirurgi)

  1. Åbn den driver software (Se Tabel af materialer) og set-up erhvervelse ved at oprette en ny eksamen. Vælg localizer og turborare T2 sekvenser i paletten Stifinder og trække i vinduet eksamen.
  2. Sikre den respiratoriske og varme sonder til musen sengen med bløde tape, og læg en stribe af beskyttende absorberende polstring over både at skabe et sterilt miljø.
  3. Vedhæfte en Varmeflade til animalsk sengen og drej på blæseren, så den varme luft er på og holde musen opvarmet. Bruge et elektronisk overvågningssystem til at sikre kropstemperatur og åndedræt sats vedligeholdes på passende niveauer for varigheden af scanningen.
  4. Bedøver mus i en induktion kammer ved hjælp af 3% isofluran begyndelsen, derefter opretholde på 1-2% (2 L/min, 100% O2). Sikre en varme pude er slået til under induktion kammer holde musen varm under induktion. Når bedøvede, anvende øje lubricant på musen til at undgå tørring og dannelsen af hornhinde sår.
    1. Tænd anæstesi systemet (isofluran 1-2%, 2 L/min. 100% O2) forbundet til MR-scanneren og overføre dyret til musen seng.
    2. Position mus hoved-liggende på bid bar og fix øret barer på plads, og sørg for, de ikke stikker uden for diameteren af sengen.
    3. Skub RF spolen over musen hovedet og skubbe coil og bed til boring, markedsføring det specifikt for isocenter.
    4. Erhverve localizer for at se mus holdning i alle 3 dimensioner og bruge dette billede til at definere lydstyrken for T2 turborare (TE: 33 ms, TR: 2.500 ms, 2 gennemsnit, 17 skiver, 0.083 x 0,92 mm opløsning, 2 min. 40 sec samlede tid) erhvervelse. dMCAO kirurgi resultater i en infarkt i den somatosensoriske cortex14; Derfor, sørge for denne region er dækket i T2-vægtede billedet.
    5. Ophæve mus fra scanneren og genoprette mus i en opvarmet kammer.

2. PET/CT kalibreringer og Workflow Setup (6 dage Post-dMCAO kirurgi)

  1. Oprette en billeddannelse workflow i scanner-driver software til at omfatte en CT dæmpning erhvervelse, 60-minutters C-11 dynamiske PET erhvervelse (350-650 keV niveau diskrimination, 3.438 ns sammenfald rude), histogram (20 frames: 5 x 15 sek, 4 x 1 min., 11 x 5 min; med døde tid korrektion) og en 3DOSEM-OP genopbygning (2 gentagelser, 18 delmængder) at skabe 128 x 128 x 159 billeder med 0.776 x 0.776 x 0,96 mm voxel størrelse.
  2. Udføre x-ray kilde condition via panelet CT kalibrering placeret i øverste venstre hjørne af grænsefladen. Denne kalibrering foretages ugentligt eller før scanningen hvis systemet ikke har været anvendt i de seneste 48 timer.
  3. Udføre mørk/lys (D/L) og center offset (C/O) kalibreringer.
    1. Tryk på CT kalibrering for (X) i øverste venstre på grænsefladen.
    2. Vælg D/L og C/O til CT-filen, som du vil køre, fjerne sengen fra paafyldningsanordningen og køre D/L kalibrering.
    3. Indsæt kalibrering værktøj bed i scanneren og køre C/O kalibrering, og sørg for at skifte valg på grænsefladen til "kalibreringsværktøj" i stedet for "70 mm palet".
  4. Fjern kalibreringsværktøj og vende tilbage til standard PET bed, og sørg for at ændre valget på grænsefladen tilbage til "70 mm palet".
  5. Sikre en 4-mus imaging seng på scanner platform ved hjælp af tape og vedhæfte anæstesi slangen (fig. 1A). Sikre at isofluran strømmer gennem rør og at der er nogen kinks.
  6. Skubbe sengen frem så det er i midten af field of view (FOV), Luk CT døren og opnå en spejder visning af CT til at sikre, at sengen er i den korrekte position.
  7. Udføre en "standard" kalibrering af PET/CT-scanneren bruger en in-house fremstillede phantom indeholdende en kendt dosis af C-11 løsning som en stråling kilde.
    1. Forberede en 20 mL sprøjte fyldt med sporstof dosis svarende til der gives til en mus (~ 250-350 µCi/9 - 13 MBq af C-11 tracer fortyndet i saltvand).
    2. Optage aktiviteten i standard ved hjælp af en dosis kalibrator og Bemærk målingen.
    3. Gennemføre en PET/CT-scanning af standard bruger de nøjagtige samme parametre, der skal bruges til billedet mus (som beskrevet ovenfor). Gøre denne ugentligt for at oprette en korrektionsfaktor for PET-scanner til at gælde de billeddiagnostiske data.

3. arbejdsområde Setup for PET/CT billeddannelse

  1. Oprette et sterilt miljø ved hjælp af et desinfektionsmiddel med virucide (Se Tabel af materialer) og placere beskyttende absorberende polstring på alle overflader.
  2. Sikre isofluran og ilt tanke er passende fyldt.
  3. Forberede hale vene katetre ved at udfylde en 1 mL sprøjte (udstyret med en 27,5 G kanyle tip) med 0,9% natriumchlorid (sterilt saltvand) og rødmen gennem en 27,5 G, 24 cm sommerfugl kateter. Skær vingerne af kateteret før cannulating at sikre, at de ikke blokere for visningen af hale vene og hjælpe med lethed af omflytning mus ind i scanneren uden fortrænger kateteret.
  4. Sikre, at alle væsentlige udstyr er lagt ud på den arbejdsstation, herunder reservedele "flush" sprøjter (fyldt med sterilt saltvand), øje lubricant, ethanol podninger, varmelamper, forberedt katetre (fyldt med saltvand), kirurgisk tape, væv lim, 0,5 mL dosis sprøjter, saks, og en lettere at forsegle kateteret efter vellykket placering i halen vene (figur 1B).

4. dyr forberedelse og Cannulation

  1. Veje mus for at bestemme den maksimale lydstyrke lov til at blive injiceret i hvert mus (dvs. mængden af tracer og enhver saltvand administreret må ikke overstige 10% af kropsvægten).
  2. Bedøver mus i en induktion kammer ved hjælp af 3% isofluran og fastholde på 1-2% (2 L/min. 100% O2).
  3. Anvende øje lubricant hver mus og bekræfte anesthetization via pedal refleks (tå knivspids). Eventuelt justere anæstesi niveauer.
  4. Placer musen på et opvarmet seng monteret med en næse kegle hen til levere isofluran på 1-2% (2 L/min. 100% O2).
  5. Mens musen er bedøvede, udføre hale vene cannulation ved hjælp af følgende protokol:
    1. Placer musen på sin side til at afsløre en af de laterale vener, mens hovedet forbliver i næsen kegle.
    2. Varm halen bruger en varmelampe, være omhyggelig med ikke at overophede eller brænde halen og svaber med en alkohol-serviet til at spile venen og sterilisere injektionsstedet.
    3. Hold nålen med facet og justere det med venen på en spids vinkel.
    4. Let lægge pres at punktere huden og udjævner nålen, så det er i overensstemmelse med venen.
    5. Skub forsigtigt frem et par millimeter forbi facet så nålen ind i venen.
    6. Bekræfte kateteret er i ved at administrere en lille (10-20 µL) flush af saltvand. Saltvand bør forlade sprøjten glat og venen bør klart. Hvis nogen modstand eller tilbage pres er observeret, er det sandsynligt kateteret er ikke i venen og igen forsøger cannulation er tilrådeligt. Hvis størkne konstateres, skal du bruge heparin (1.000 enheder heparin pr. mL saltvand) for cannulation installation og rødmen.
      Bemærk: Vi har vurderet cannulation med og uden heparin i mus stamme af interesse, og da ingen koagulation blev observeret, saltvand alene blev brugt til cannulations.
    7. Sikre kateter til halen med en lille dråbe af væv lim, efterfulgt af kirurgisk tape, for at sikre, at kateteret er fortsat immobile, når du overfører mus til scanneren.
    8. Fjern flush sprøjten fra slutningen af kateteret og forsegle slut med lighter, at sikre, at forskeren er ikke i nærheden af enhver isofluran eller ethanol.
    9. Gentag for 3 ekstra mus, så alle 4 mus skal scannes er kanylerede og forberedt.
  6. Tænd anæstesi strømmen (2,5% isofluran, 2 L/minut 100% O2) forbundet til PET/CT og omhyggeligt stilling mus udsat i scannerpladen, sikre katetre forbliver på plads og hver musen hovedet er lige og sikker i næsen kegle. Tape hovedet og kroppen af hver mus i seng med bløde kirurgisk tape, sikre vejrtrækning er ikke begrænset af placeringen af båndet. Registrere placeringen af hver musen til at give mulighed for korrekt placering og gruppe tildelingen til billedanalyse.
  7. Holde mus opvarmet under hele proceduren (f.eks. ved hjælp af en varmelampe eller varm luft pumpesystem til at sikre mus holdes varm uden overophedning). Overvåge respirationsfrekvens af alle mus, enten visuelt hvis bruger en åben gantry eller gennem en remote monitoring system ved hjælp af respiratorisk puder, og ændre anæstesi niveauer efter behov.

5. CT erhvervelse

  1. Når dyrene er sikker i sengen og respiration er stabil, aktivere laser på tværs af hår og flytte den scanning bed så at de justeres med hjernen hos alle fire mus. Flytte scannerpladen erhvervelse position (position 3) med hjerner af mus som tæt på centrum af FOV som muligt.
  2. Erhverve en spejder se billede af mus til at kontrollere deres position (brug en 200 mm FOV), og justere holdning ved at trække boksen FOV på grænsefladen, hvis nødvendigt. Klik på "Start arbejdsproces" i scannersoftwaren begynde CT-scanning, og sørg for at vælge "Vis interaktiv bruger prompter" så PET-scanning kan startes manuelt inden tracer injektionen.

6. [11C] DPA-713 dosis forberedelse

  1. Syntetisere [11C] DPA-713 som tidligere beskrevet12, at sikre, at du iført passende PPE (personlige værnemidler) til håndtering af radioaktivitet, herunder en laboratoriekittel, handsker og personlige finger og krop dosimetre. Sikre du ændre handsker regelmæssigt for at undgå radioaktiv forurening, og øge din afstand fra den radioaktive kilde, når det er muligt.
  2. Bruge pincet til at omhyggeligt overføre radiotracer hætteglasset bag en bly skjold.
  3. Forberede hver mus indeholdende ca 250-350 µCi/9-13 MBq i 100-200 µL volumen til at sikre en passende for en 60-minutters dynamisk PET scanning dosis 0,5 mL dosis sprøjter (dosis bør fastlægges i betragtning half-life af isotop og tid-line af undersøgelsen design, med lydstyrken afhængigt af musen vægt).
  4. Foranstaltningen aktivitet ved hjælp af en dosis kalibrator indstillet til C-11, placeret i umiddelbar nærhed til webstedet cannulation og optage gange måling og injektion aktivere henfald korrektion. Udarbejde doserne, lige før CT enderne til at begrænse forfald og sikre det ønskede niveau af radioaktivitet vil blive injiceret i hvert mus.
  5. Kontroller, at der er ingen luftbobler i dosis sprøjte før måling af aktiviteten og indblæsning i hvert mus.

7. PET erhvervelse

  1. Når musene automatisk videre fra CT til PET, indstille bagsiden af scanner til [11C] DPA-713 injektion (figur 1C). Placere beskyttende absorberende polstring på en afsats og sikre saks og lighter er på side.
  2. Snip forseglet kateteret slanger med saks, check kateter linjer er klart af nogen bobler, og bekræfte kanylen er stadig i venen ved at udføre en 10-20 µL saltvand flush. Indlæse målte dosis sprøjter fra trin 6.4 til hver af de 4 katetre, at holde styr på hvilken dosis blev givet til hver mus.
  3. Klik på "OK", når PET-scanning er klar til at starte mens du samtidig starter en 10 anden timer. Har to forskere bag på scanner med dosis sprøjter i hånden til at injicere alle 4 mus samtidig på timeren når nul. Skyl hver kateter med 50-100 µL af saltvand (afhængigt af længden af kateter slange — dvs. den dødvolumen) for at sikre den fulde dosis træder hale vene, og igen forsegle slangesættet igen ved hjælp af en lighter.
  4. Måle dosis sprøjter ved hjælp af en dosis kalibrator for at opnå en resterende radioaktivitet værdi (enhver tracer tilbage i sprøjten). Læg mærke til værdierne og det tidspunkt, de er registreret.
  5. Når scanningen er færdig, home kæledyr seng til den oprindelige position ved hjælp af den vandrette "hjemme" knap i forslaget Kontrolpanel. Fjerne mus fra scanneren og fjern forsigtigt kateteret. Forsigtigt lægge pres på cannulation stedet for at forhindre overdreven blødning.
  6. Måle den resterende aktivitet i kateteret ved hjælp af en dosis kalibrator som tidligere beskrevet.
  7. Hvis mus skal inddrives sikre dette sker i et varmt miljø (f.eks. i en boks med en opvarmet pad nedenunder eller indeholder en handske, fyldt med varmt vand) til at lette inddrivelsen. Hvis planlægger at aflive mus, skal du placere mus i en induktion salen indeholdende isofluran, således at de forbliver bedøvet før eutanasi via perfusion.
  8. For at rekonstruere data, åbne post-processing administrerende software (Se Tabel af materialer), som automatisk vil genopbygge hver scanning ved hjælp af histogramdata, der blev genereret fra lst-fil.

8. brain Autoradiografi

  1. Før forsøget, skal du slette digital Autoradiografi filmen ved at udsætte det til hvid lys for 10-15 min og holde i et radioaktivitet-fri område indtil brug.
  2. Forberede hver mus indeholdende ca 1,0-1,5 mCi/37-56 MBq at sikre en passende for Autoradiografi dosis 0,5 mL dosis sprøjter.
  3. Måle radioaktivitet i dosis sprøjten, ved hjælp af en dosis kalibrator, før injektion til at få en præcis aflæsning af aktiviteten.
  4. Kanyleres som tidligere beskrevet og injicere mus straks i et område, der er egnet til radioaktivitet.
  5. Fjerne kateteret efter injektion og måle den resterende radioaktivitet.
  6. Lade mus i en opvarmet induktion kammer, så de forbliver bedøvet før perfusion og aktiv dødshjælp.
  7. Udføre eutanasi, mens mus er dybt bedøvet (løbende indånding af 4% isofluran, 2 L/min. 100% O2) via PBS perfusion og bilaterale torakotomi 30 min efter [11C] DPA-713 injektion.
    1. Åbn i bughulen og skære igennem mellemgulvet til udsætte hjertet.
    2. Indsæt en sommerfugl kateter infusion nål ind i venstre hjertekammer af hjertet, og snip højre atrium og ringere vena cava.
    3. Langsomt perfuse med PBS (~ 20-30 mL) ved hjælp af en 20 mL sprøjte.
  8. Fjern forsigtigt hjernen fra kraniet ved hjælp af saks og pincet.
  9. Sted hjerne i en indefrysning skimmel fyldt med optimal opskæring temperatur (OCT) væske, gør sikker på, at hjernen er niveau og centreret inden for skimmel, med de olfaktoriske pærer orienteret mod hakkene i formen (for at give vartegn og orientering når hjernen fjernes fra formen).
  10. Sted mug på tøris for 10-15 min. eller indtil OLT bliver uigennemsigtigt.
  11. Umiddelbart placerer hver mug i kryostaten mikrotomen sat til-18 ° C, og Blandingen henstår i 10 min før montering.
  12. Skræl væk formen frysning og montere hjernen til mikrotomen platform ved hjælp af en lille mængde af frisk OLT som "lim".
  13. Forlade monteret hjernen i mikrotom til at fryse i 2 min.
  14. Skær gennem hjernen, indtil slagtilfælde placering er udsat (dvs., ROI). Find infarkt i hjernen af hvert dyr ved hjælp af hr. billede. For dMCAO bør dette konsekvent i den somatosensoriske cortex; længden af slagtilfælde kan dog variere lidt.
  15. Afsnit regionen af hjernen spanning infarkt, placere 20 µm tykt sektioner på glas objektglas mærket med passende mus nummer.
  16. Åbn Autoradiografi kassette og linje i bunden af kassetten med ét ark med Saran wrap. Arrangere dias sektion side op på toppen af saran wrap i kassetten og notere placeringen af hvert lysbillede. Du kan eventuelt tage et billede af diaset placering hjælp til senere analyse.
  17. Blidt sted endnu et lag af saran wrap på toppen (efter at have ventet ~ 2 min efter samling af sidste hjernen sektion - gør det muligt at tørre og overholde diaset) og omhyggeligt placere digital Autoradiografi film (hvide side vender nedad) oven på diasene.
  18. Luk kassetten stramt og efterlade i en-20 ° C fryser, så sektionerne for at tænderne på filmen til en passende eksponeringstid (~ 5-10 halveringstider).
  19. Skan filmen efter eksponeringstid ved hjælp af en fosfor imager til at generere et digitalt billede til efterfølgende analyse.

9. dynamisk PET billedanalyse

  1. Åbn billede analyse software (Se Tabel af materialer), og klik på ikonet "åbne data" til at indlæse CT billede (som kilde) og "Føj data" ikonet for at indlæse den dynamiske PET (som reference).
  2. Udføre en visuel kvalitetskontrol af data via operatoren tidsserier i drop-down menuen: Vælg reference ("ref") og "globale" og anvende en passende min og Maks for farveskalaen. Visualisere den dynamiske PET data indramme af indramme, kontrollere radioaktivitet optagelse og kontrol for enhver bevægelse tilintetgør inden scanningen.
  3. Oprette en gennemsnitlig PET billedet ved hjælp af operatoren"aritmetiske".
    1. Vælg "gennemsnit valgt", uegennyttig "ref" og sikre input 1 ("Inp1"), input 2 ("Inp2") og input star ("Inp *"-omfatter resten af PET rammer i scanningen) er valgt at oprette et gennemsnit af alle PET rammer.
    2. Gå til fanen "data manager" (DM), og træk det gennemsnitlige billedet op til "input1" holdning til visualisering formål. Omfordele farveskalaen ved at klikke på den automatiske beregning i værktøjet "min-max".
  4. Registrere CT til filen gennemsnitlige PET ved hjælp af funktionen "automatisk 3D" i rullemenuen "re-orientation/registrering".
    1. Vælg "ref" og "Inp1", og vælg "stiv", "hurtig", "Inp1 til Ref" registrering. Visuelt kontrollere registrering i alle 3 dimensioner og manuelt justeres om nødvendigt i fanen "Manuel 3D" ved hjælp af funktionerne "oversættelse" og "rotation".
    2. Når tilfreds med registreringen, skal du vælge "Inp2" og "Inp *", og gælder for alle PET rammer ved at klikke på hakket. Højreklik på filerne CT og PET i DM og gemme som rå.
  5. Beskære hjerne af en mus på et tidspunkt for hjernen analyse ved hjælp af CT som en guide: Vælg "beskæring" fra drop-down menuen og træk billedet grænserne for at beskære lederen af musen under hjernestammen. Re orientere PET og CT billederne ved hjælp af funktionen "Manuel 3D omlægning" som beskrevet ovenfor, så at kraniet er lige i alle dimensioner.
  6. Indlæse i hr. billed for at mus (i DICOM-format) ved hjælp af knappen "Føj data" på toppen til venstre for grænsefladen. Flytte hr. ved hjælp af den "manuelle 3D omlægning" og passe til kraniet inden for CT-billede (Sørg for at alle modaliteter er i den samme retning).
  7. Tegne streg ROI på hr. billedet ved hjælp af "3D ROI tool".
    1. Slukke PET visualisering ved at fravælge det under fanen visuelle controller (VC) og brug kun MR og CT til at tegne ROI.
    2. Klik på "add ROI" knappen for at oprette en ny ROI og navngiv den "infarkt". Vælg "spline værktøj", venstre klikke for at trække grænsen ROI og højreklik for at lukke den.
    3. Gentag med alle skiver omfatter slagtilfælde, og sørg for ikke at fange nogen af kraniet i ROI, med bedste praksis at forlade en voxel kløft mellem kraniet grænse og slagtilfælde ROI.
  8. Generere en kontralaterale ROI med infarkt volumen.
    1. Opret en ny ROI og mærke det "kontralaterale". Højreklik på infarkt ROI og vælge "Eksporter". Træk ROI til position 2 ("Inp1").
    2. Kun "Inp1" markeret, anvende en venstre højre flip ved hjælp af funktionen "operatør" i menuen "omlægning/registrering". Kryds i boksen "ROI" og vælge "Vis kun" manuelt flytte den nye ROI til regionen identisk på de kontralaterale side. Vælg den "aritmetiske" operatør og anvende en skalar multiplikation af 2 til den nye ROI, tillader uafhængige kvantificering af ROIs.
    3. Vende tilbage til værktøjet 3D ROI. Gå til fanen "ekspert og eksperimenterende" og klik på knappen "Importer ROI". Vælg Inp1 i dialogboksen for at indlæse den nye volumen som de kontralaterale ROI.
  9. Højreklik på den gennemsnitlige PET billede og læsse det og tænd PET tilbage. Generere kvantitative udbredelse resultaterne ved hjælp af ikonet "eksportere resultater" i værktøjet 3D ROI.
  10. Udføre yderligere split hjernen analyse, hvis det ønskes (dvs. automatiseret ROI generation af højre versus venstre hjernen halvkugle områder ved hjælp af en 3D mus hjernen atlas plugin modul for Vivoquant software).
    1. Re-load registrerede PET/CT billederne.
    2. Importere mus hjernen atlas ved at klikke på menuen "Avanceret moduler" og vælge værktøjet 3D hjerne atlas. Vælg "alle regioner left/right" i "avancerede indstillinger" og klik på "Kør" for at importere 3D atlas.
    3. Manuelt passe atlas i hjernen ved hjælp af kraniet som kant.
    4. Kør igen atlas og sørg for, at "importere 3D ROI" er markeret til at generere et regneark med resultaterne for alle 14 venstre og højre hjernehalvdel ROIs (medulla, cerebellum, midbrain, pons, cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, striatum, pallidum, olfaktoriske pærer, Corpus callosum og hvide substans).
  11. Kvantificere tracer optagelse i milten ved hjælp af scanneren opererer software (se tabel af materialer).
    1. Indlæse PET og CT billedfiler ved at markere dem i databasen og klikke på "generel analyse".
    2. Klik på fanen registrering og co registrere PET og CT billeder at klikke på ikonet "stive registrering".
    3. Klik på fanen ROI kvantificeringen, skal du klikke på ikonet "Opret ROI" og navngiv den milt.
    4. Vælg værktøjet "kugle" at tegne milt ROIs ved hjælp af filen CT for reference, at sikre, at der ikke er nogen overlapning med nyre optagelse (ved hjælp af PET billede og signalere at undgå afsmitning fra nyrerne).
    5. Redigere ROIs for at opretholde konsekvent ROI mængder mellem dyr.
  12. Beregne en standard korrektion værdi for optagelse normalisering.
    1. Indlæse data om PET/CT fra den standard scanning og oprette en cylinder ROI omfatter 20 mL sprøjten ved hjælp af værktøjet "Manuel 3D ROI".
    2. Få radioaktivitetsmængden indeholdt i standarden ved hjælp af ikonet regneark.
    3. Brug denne nCi/cc resultat og den oprindelige registrerede radioaktivitet til standard (dvs., dosis kalibrator måling af standard i nCi/cc) til at oprette en korrektionsfaktor for PET optagelse værdier. Det vil sige, opdele radioaktivitet af den standard, der er registreret af dosis kalibrator af radioaktivitet beregnes fra PET billede af standard.
  13. Bruge dosis aktiviteter og tidspunktet for at tænderne korrekt at PET anskaffelsestidspunkt målinger for alle mus (i.e beregne dosis aktivitet i starten af PET-scanning).
  14. Gentag for de resterende værdier og trække fra den decay korrigerede dosis til at beregne den nøjagtige aktivitet hvert dyr fået.
  15. Efter dette forfald korrektion, også anvende den standard korrektion for at sikre dataene, der er på den rigtige aktivitetsniveau. Sikre, at disse korrektioner er anvendt på manuelt udtrukne ROI resultater, og hjernen atlas ROI data relevante hjerneregioner for dMCAO placering (dvs., cortex, hippocampus og striatum).
  16. Beregning af %ID/g for alle ROIs ved hjælp af følgende ligning: %ID/g = (ROI radioaktivitet i nCi/cc / henfald korrigeret dosis modtaget i nCi/cc) x 100. Plot %ID/g som funktion af tiden bruger graftegning software til at generere tid aktivitet kurver for hver ROI.
  17. Brug scannerens software til endelige billede visualisering og tal generation. Normalisere billeder efter forfald korrigeret dosis modtaget af hver mus på tidspunktet af scanningen, at sikre, at alle billeder er på samme %ID/g-skalaen.
    Bemærk: Dette er nødvendigt for at muliggøre nøjagtig sammenligning af billeder fra forskellige mus og/eller billeder fra undersøgelser udført på forskellige dage

10. Autoradiografi billedanalyse

  1. Åbn det digitale billede (.gel fil) i ImageJ software. Justere lysstyrke og kontrast til visuelt tærskel billedet og anvende en passende farve "opslagstabellen".
    Bemærk: Royal mest præcist ligner farveskalaen bruges i PET.
  2. Bruge ROI manager til manuelt tegne ROIs omkring infarkt og tilsvarende kontralaterale regioner.
  3. Brug funktionen til at kvantificere den gennemsnitlige pixel intensiteten af hver ROI og eksportere resultaterne. Plot ved hjælp af statistisk software.

Representative Results

Mus undergik Mr for at kontrollere succes slagtilfælde og [11C] DPA-713 PET blev udført ved at scanne 4 mus samtidigt. PET, CT, og hr. billeder var Co registreret før manuelt tegning hjernen ROIs og udføre halvautomatiske split hjernen atlas analyse for at undersøge tracer optagelse i ipsilaterale og de kontralaterale regioner (figur 2).

PET/CT billeder og tid aktivitet kurver (TAC-radiotracer aktivitet som funktion af tiden) vise øget [11C] DPA-713 optagelse i den ipsilaterale versus kontralaterale hjernehalvdele (fig. 3A). Kvantificering af dynamiske PET hjernen billeder, ved hjælp af opsummerede data fra 50-60 min., viste en betydelig stigning i tracer optagelse (% ID/g) i den ipsilaterale (infarcted) i forhold til de kontralaterale halvkugle i dMCAO, men ikke i sham mus bruger den manuelt udtrukne ROI tilgang (fig. 3B). Øget optagelse blev også observeret i den ipsilaterale halvkugle mellem dMCAO og sham mus. Ingen væsentlige forskelle mellem ipsilaterale og kontralaterale halvkugle blev observeret ved hjælp af atlas tilgang, sandsynligvis på grund af atlas ROIs bliver større end størrelsen på infarkt (normalt begrænset til den somatosensoriske cortex), derfor fortynding af signal. Imidlertid blev samlede øget optagelse i dMCAO i forhold til sham observeret for alle ROIs, som flugter med tidligere rapporter ved hjælp af MCAO modelmus, demonstrere øget TSPO udtryk i regioner uden for infarkt19. Ipsilaterale/kontralaterale nøgletal blev øget i dMCAO versus sham mus bruger begge tilgange; men denne forskel var kun signifikant i cortex ved hjælp af hjernen atlas tilgang på grund af større varians i ROI tilgang. Dette kan løses ved at øge antallet af mus i hver gruppe. Kvantificering af [11C] DPA-713 optagelse i milten viste ingen væsentlige forskelle mellem grupperne (figur 4).

Hjernen dMCAO mus PET imaging resultater blev bekræftet af ex vivo høj opløsning digitale Autoradiografi (figur 5). Øget [11C] DPA-713 optagelsen blev observeret i infarcted væv med ubetydelig signal i omkringliggende raske hjernevæv. Kvantificering af disse billeder viste ipsilaterale kontralaterale fordelingerne spænder fra 1.4 til 2,09 i dMCAO mus.

Figure 1
Figur 1: PET Scanner og arbejdsområdet Set-up. Alle arbejdsområder var dækket i beskyttende absorberende polstring til at oprette et sterilt miljø. (A) efter kalibreringer, en 3D-trykt mus seng, udstyret til imaging 4 mus samtidigt var sikret i scanner og næse kegler for alle 4 mus attacheret anæstesi. (B) nødvendigt udstyr til PET-billeddannelse blev udarbejdet på forhånd, herunder saltvand fyldt 27,5 G katetre, øje lubricant, ethanol podninger, varmelamper, kirurgisk tape, væv lim, 0,5 mL dosis sprøjter, saks og en lighter. (C) til radiotracer injektion, placere saltvand-flush sprøjter og saks bag på scanneren. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Ipsilaterale/kontralaterale ROI og højre/venstre-Split halvkugle hjerne Atlas PET billede analyse proces. Billedanalyse software blev brugt til at bestemme tracer optagelse i ipsilaterale og kontralaterale regioner af interesse (ROIs) ved hjælp af manuelt trukket ROIs og en semi-automatiske 3D split-brain atlas tilgang. Automatisk 3D PET/CT registrering blev gennemført efterfulgt af manuel registrering af hjerne MRI inden for tilsvarende mus kraniet defineret i CT billede. Værktøjet 3D ROI blev brugt til at manuelt tegne ipsilaterale (rød) og kontralaterale (grøn) ROIs bruger infarkt på Mr som reference. Den split-brain tilgang, var 3D venstre/højre-split mus hjernen atlas indlæst og monteret i kraniet, som defineret af CT billede. Hjernen ROIs bruges til kvantificering i denne 3D mus hjernen atlas inkluderet venstre Cortex (mørkegrå), venstre Hippocampus (Kornblomst blå), venstre Striatum (dyb Pink), højre Cortex (tomat rød), højre Hippocampus (grøn) og højre Striatium (Cyan). Optagelsen af [11C] DPA-713 i hver region blev opnået i nCi/cc og blev efterfølgende omdannet til %ID/g af normalisering til henfald-korrigeret dosis på tidspunktet for scanning for hver mus. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Repræsentant In Vivo [11C] DPA-713 hjernen optagelse i DMCAO og Sham mus. (A) dynamiske PET/CT billeder og TAC viser øget [11C] DPA-713 optagelse i ipsilaterale cortex af mus, der undergik DMCAO (n = 3) og en lille stigning for fingeret (n = 3) drives mus, med DMCAO mus viser signifikant større kontrasten i procent injiceres dosis mellem infarkt og kontralaterale side af hjernen (%ID/g). (B) PET kvantificering (50-60 min opsummerede) viste signifikant øget optagelse i ipsilaterale ROI benytter metoden ROI og i cortex (Ctx) ved hjælp af metoden split-brain atlas. Der fandtes ingen væsentlige forskelle i hippocampus (HC) eller striatum (Str). Øget ipsilaterale til kontralaterale nøgletal blev set ved hjælp af både analyse nærmer sig, men var kun statistisk signifikant i Ctx bruger hjernen atlas tilgang. * (p < 0,05), *** (p < 0,001) venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Repræsentative In Vivo [11C] DPA-713 milt optagelse i dMCAO og Sham mus. (A) [11C] DPA-713 dynamisk PET/CT billeder viser milt ROIs i dMCAO (n = 3) og humbug (n = 3) mus. (B) kvantitative resultater viser ingen væsentlige resultater i milten optagelsen mellem dMCAO og sham mus. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Repræsentant Autoradiografi resultater. Digital Autoradiografi billeder demonstrere øget [11C] DPA-713 optagelse i den ipsilaterale sammenlignet med kontralaterale halvkugle. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Den præsenterede protokol beskriver en metode til kvantificering af neuroinflammation i dMCAO og sham mus bruger [11C] DPA-713-PET. TSPO-PET er den mest udbredte undersøgte imaging biomarkør for visualisering og måling af neuroinflammation i vivo til dato. TSPO udtryk er upregulated om glia i hjernen under betændelse tillader ikke-invasiv påvisning og kvantificering af neuroinflammation. Derudover er det en meget oversætbare teknik, hvilket gør det til et værdifuldt værktøj i både kliniske og prækliniske forskning. Denne protokol og repræsentative resultater fremhæve egnethed ved hjælp af [11C] DPA-713 PET at registrere og overvåge neuroinflammatory ændringer i slagtilfælde og andre neurologiske lidelser i vivo.

I denne undersøgelse, blev dMCAO kirurgi udført ved hjælp af 3-måned-forhenværende C57BL/6 hunmus. Denne model blev valgt som det giver anledning til en meget reproducerbare infarkt begrænset til somatosensoriske cortex, give en model af permanent fokal iskæmi med lav variation i forhold til andre modeller af slagtilfælde (fx midterste cerebral arteriel okklusion (MCAO) glødetrådens metode)14. PET billeddannelse af slagtilfælde modeller har fordelen, der indeholder en intern henvisning region i hjernen for hvert dyr ved hjælp af ROIs i de kontralaterale halvkugle. Da der vil være nogle inflammation, resultaterne fra kirurgi alene, det er vigtigt at medtage mus, der undergik sham operation i forsøgsdesign, hvorved kraniotomi og manipulation af meninges uden arterieokklusion blev udført. Craniotomy alene kan resultere i forstyrrelser til underliggende neuronal væv og indførelsen af patogener fører til immunrespons uafhængigt af slagtilfælde20. Nogle betændelse efter sham operation forventes derfor og bør vurderes parallelt med dMCAO til at udelukke muligheden for signal på grund af kirurgi alene. For at undgå herunder betændelse som følge af kirurgi uden streg i dMCAO kohorte analyse, skal hr. imaging foretages for at bekræfte vellykket slagtilfælde kirurgi og infarkt udvikling. Mr giver også en strukturel referenceramme, som er afgørende for præcist tegne infarkt og kontralaterale ROIs. Derudover nøjagtig billed oparbejdelse herunder billede registrering og ROI definition er nødvendige for at sikre pålidelig kvantificering.

Yderligere begrænsninger skal holdes for øje, når du arbejder med C-11 mærket radiotracers til PET og Autoradiografi undersøgelser. Det er bydende nødvendigt at overveje de kort halveringstid (20.33 min) af C-11, med dets anvendelse, generelt begrænset til forskningsinstitutioner med on-site cyclotron adgang. Passende radioaktivitet transport route, dosis administration og erhvervelse tid-punkter skal bestemmes på forhånd med en forberedte detaljeret plan over arbejdsgangen for eksperimentet således at holdet kan arbejde hurtigt og effektivt. Design og opsætning af denne undersøgelse er blevet skitseret for at rumme billeddannelse af 4 mus samtidig at øge data output opnåelige, når du bruger en C-11 tracer. Hvis det er muligt, er det tilrådeligt at have alle mus kanylerede og midt i deres CT scanning af tiden C-11 tracer ankommer til billedbehandling mulighed for at sikre minimal radiotracer forfald inden injektionen. Denne trinvise protokol er også bedst foretages af et hold, der indeholder mindst 3 forskere til at tillade hurtig cannulation, dosis måling, tracer injektion, PET scanning og hjernen skæring før betydeligt radioaktivt henfald. Det kræver to personer til at gennemføre iværksættelsen af PET-scanning og injektion af alle 4 mus samtidigt. Årsagen til begynder PET erhvervelse lige før injektion er at sikre farmakokinetik og dynamikken i tracer distribution i blod og områder af interesse er præcist og helt fanget. Mange trin kan kræve energisk uddannelse og praksis at sikre smidig afvikling af eksperimentet. Denne protokol er især afhængige af vellykket hale vene cannulation af C57BL/6 mus, som kan være vanskelig på grund af mørkt hår på deres haler, og kan blive mere udfordrende efter slagtilfælde har fundet sted, eller hvis imaging de samme mus på flere tidspunkter .

En anden overvejelse for PET imaging inkluderer omhyggelig optagelse af radiotracer dosis og resterende aktivitet målinger, herunder det nøjagtige tidspunkt for målingen. Dette er afgørende for nøjagtig henfald korrektion af den injicerede dosis på tidspunktet af scanningen og anvendes til at opnå en nøjagtig måling af tracer optagelse (dvs., %-ID/g) for hver ROI. Det er bydende nødvendigt at kende det nøjagtige beløb af radioaktivitet, der var til stede i hvert mus på tidspunktet for scanning for at sikre nøjagtig billedanalyse. Det er derfor tilrådeligt at synkronisere ure på scanner computeren og dosis kalibrator at undgå fejl, når du bruger kortlivede isotoper som C-11.

Nøjagtig PET billede kvantificering kan også begrænses af nøjagtigheden af scanner og set-up. Dermed for at sikre nøjagtig kvantificering af PET/CT billeder, er det vigtigt at foretage kvalitetskontrol kontrol for både CT og PET komponenter af scanneren. CT kvalitetskontrol kontrol omfatter X-ray kilde condition, mørk/lys og center off sæt kalibreringer. Disse kalibreringer måle og korrekt for system støj og skal være udført forud for erhvervelse, som anbefalet af scannerproducenten. Kalibreringer bør også udføres til PET-scanneren. Dette involverer typisk scanning en "standard / PET phantom" scanning, der indeholder en kendt koncentration af radioaktivitet. Ved udarbejdelsen af standarden, er det bedst at bruge de samme radioisotop, der anvendes i undersøgelsen, en tilsvarende dosis til at gives til en enkelt mus i et volumen svarende til kroppen af en mus, og den samme erhvervelse parametre som animalske imaging. En 20 mL sprøjte fyldt med radiotracer fortyndes i vand bruges til standard i denne protokol, med de efterfølgende PET imaging resultater anvendes til at beregne en korrektionsfaktor, der er baseret på den faktiske dosis målt ved kalibrering detektor. Korrektion ratio kan anvendes til billeddiagnostiske data erhvervet i eksperimentet at sikre nøjagtig kvantificering af tracer optagelse i regioner af interesse i PET billeder. Dette udgør positron vifte af radionuklid ud over at overveje enhver baggrund aktivitet til stede på dagen for scanning. Som dosis kalibrator er en integreret del af generation af denne korrektionsfaktor, er det bydende nødvendigt, at dette udstyr også er kalibreret jævnligt ifølge retningslinjerne for producenten.

Ved gennemførelse af ex vivo Autoradiografi er det vigtigt at vælge en optimale tidspunkt for aktiv dødshjælp efter injektion, til at sikre høj signal til baggrunden i forvejen af interesse. Tredive minutter efter injektion blev valgt for [11C] DPA-713 Autoradiografi ved hjælp af data opnået under dynamiske PET imaging -dvs. at i vivo dynamisk TAC'er som en guide, mens også i betragtning af den korte half-life af C-11 og tid involverede afdeling og udsætte hjernevæv efter ekstraktion. I betragtning heraf [11C] DPA-713 Autoradiografi skal udføres på en separate kohorte af mus til at tillade injektion af en højere [11C] DPA-713 dosis og 30 minutters tidspunkt for perfusion og aktiv dødshjælp under anæstesi. Udfører en lille i vivo vil PET pilotundersøgelse med en 3-4 mus inden udførelse ex vivo Autoradiografi være nyttigt for fastlæggelse af det optimale tidspunkt for Autoradiografi. En yderligere vederlag for ex vivo Autoradiografi er om at inddrive musene efter injektion eller holde dem bedøvede indtil eutanasi. At holde dem bedøvede efterligner betingelserne af scanningen og sikrer radiotracer distribution eller udskillelse kinetik ikke, ændres af recovery. Desuden, dette forhindrer yderligere stress på mus ved at undgå opsving og efterfølgende induktion. Endelig et nyttigt supplement til ex vivo -protokollen ville være at vurdere de regionale skader i hjernen skiver bruges til Autoradiografi via immunhistokemisk farvning (efter radioaktivt henfald) til at generere en høj opløsning billede af infarkt placering og volumen.

Da der er begrænsninger ved brug af en C-11 baseret tracer, kan denne protokol nemt ændres til brug med en F-18 (halveringstid på 109.77 min.) baseret TSPO sporstof, som kan være mere anvendelig til steder uden en on-site cyclotron. Derudover beskriver denne protokol brugen af en 4-mus imaging set-up. Selvom denne high throughput metode er optimal, når du bruger en C-11 tracer, kan denne protokol også ændres for dem, der benytter enkelt mus imaging senge. Omhyggelig planlægning og konsekvent træning i de teknikker, der er skitseret i denne protokol vil føre til generation af et væld af data ved hjælp af [11C] DPA-713, som let kan blive til sonde rollen som neuroinflammation i sygdommen manifestation og progression i andre gnavere modeller af neurologiske lidelser. Desuden, denne teknik kan bruges til at vurdere i vivo svar til immunmodulerende therapeutics rettet mod mikroglia/makrofager.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Buckwalter lab (især Dr. Todd Peterson) for at levere musemodel og udfører dMCAO og sham operationer. Derudover vil vi gerne takke Thomas Liguori fra Invicro til hans teknisk bistand med VivoQuant billede analyse software, Dr. Tim Doyle, Dr. Laura Pisani, Dr. Frezghi Habte fra den SCi3 lille dyr imaging facilitet på Stanford for deres rådgivning og hjælp til at udvikle denne billeddannelse protokol og radiokemi facilitet (især Dr. Jun Park) for deres hjælp med syntesen af [11C] DPA-713.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Inveon PET/CT scanner Siemens Version 4.2
MRI scanner Varian 7 Telsa
ParaVision software Bruker Version 6.0.1 MRI operating software
VivoQuant software InVicro Version 2.5 Image analysis software
Inveon Research Workspace software Siemens Version 4.2 Scanner operating software. Includes microQView, the post-processing managing software
Dose calibrator Capintech CRC-15 PET
Typhoon phosphor imager 9410 GE Healthcare 8149-30-9410
Butterfly catheters SAI Infusion Technologies BFL-24 27.5 G needle
1 mL syringes BD
Insulin syringes BD 329461 0.5 mL insulin syringes with needle
20 mL syringe  VWR BD302831 BD Syringe Slip Tip Graduated
Tissue glue Santa Cruz Animal Health sc-361931 3 mL
Heat lamp Fluker 27002 5.5" reptile heat lamp with clamp and switch
0.9% sterile saline Pfizer 00409-4888-10 0.9% sodium chloride for injection, 10 mL
Eye lubricant Watson Rugby PV926977 Artificial Tears Lubricant Eye Ointment, 1/8 oz
Chux absorbent sheets ThermoFisher Scientific 1420662 Disposable absorbent padding
Iris scissors World Precision Instruments 503708-12 11.5 cm, Straight, 12-pack
Surgical tape 3M Durapore 1538-0 1/2" x 10 yard roll, silk, hypoallergenic
Mouse PET bed In house 4 mouse PET bed
Lighter Bic UDP2WMDC
Isoflurane Henry Schein NDC 11695-6776-2 Isothesia, inhalation anesthetic, 250 mL
Oxygen Praxiar UN1072 Compressed gas
Autoradiography cassette Cole Palmer EW-21700-34 Aluminum, 8" x 10"
Autoradiography film GE Life Sciences 28-9564-78 Storage Phosphor Screen BAS-IP SR 2025 E Super Resolution, 20 × 25 cm, screen only
Microtome blades ThermoFisher Scientific 30-508-35 MB35 Premier Disposable, 34° cutting angle
Microtome Microm HM 550
Microscope slides Fisher Scientific 12-550-15 Superfrost™ Plus Microscope Slides
OCT liquid VWR 25608-930 Formulation of water-soluble glycols and resins for cryostat sectioning at temperatures of -10°C (14°F) and below
Freezing molds Poly sciences 18646A-1 Disposable paraffin molds
Saran wrap Saran 25700001300
Disinfectant Virkon S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Benjamin, E. J., et al. Heart disease and stroke statistics-2017 update: A report from the american heart association. Circulation. 135 (10), 146-603 (2017).
  2. Jin, R., Yang, G., Li, G. Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells. J Leukoc Biol. 87 (5), 779-789 (2010).
  3. Wang, Q., Tang, X. N., Yenari, M. A. The inflammatory response in stroke. J Neuroimmunol. 184 (1-2), 53-68 (2007).
  4. Brown, R. C., Papadopoulos, V. Role of the peripheral-type benzodiazepine receptor in adrenal and brain steroidogenesis. Int Rev Neurobiol. 46, 117-143 (2001).
  5. Papadopoulos, V., Lecanu, L., Brown, R. C., Han, Z., Yao, Z. X. Peripheral-type benzodiazepine receptor in neurosteroid biosynthesis, neuropathology and neurological disorders. Neuroscience. 138 (3), 749-756 (2006).
  6. Scarf, A. M., Kassiou, M. The translocator protein. J Nucl Med. 52 (5), 677-680 (2011).
  7. Cerami, C., Perani, D. Imaging neuroinflammation in ischemic stroke and in the atherosclerotic vascular disease. Curr Vasc Pharmacol. 13 (2), 218-222 (2015).
  8. Stefaniak, J., O'Brien, J. Imaging of neuroinflammation in dementia: a review. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 87 (1), 21-28 (2016).
  9. Gerhard, A. TSPO imaging in parkinsonian disorders. Clin Transl Imaging. 4, 183-190 (2016).
  10. Airas, L., Rissanen, E., Rinne, J. O. Imaging neuroinflammation in multiple sclerosis using TSPO-PET. Clin Transl Imaging. 3, 461-473 (2015).
  11. Fan, J., Lindemann, P., Feuilloley, M. G., Papadopoulos, V. Structural and functional evolution of the translocator protein (18 kDa). Curr Mol Med. 12 (4), 369-386 (2012).
  12. James, M. L., et al. Synthesis and in vivo evaluation of a novel peripheral benzodiazepine receptor PET radioligand. Bioorg Med Chem. 13 (22), 6188-6194 (2005).
  13. Boutin, H., et al. 11C-DPA-713: A novel peripheral benzodiazepine receptor PET ligand for in vivo imaging of neuroinflammation. J Nucl Med. 48 (4), 573-581 (2007).
  14. Doyle, K. P., Buckwalter, M. S. A mouse model of permanent focal ischemia: distal middle cerebral artery occlusion. Methods Mol Biol. 1135, 103-110 (2014).
  15. Wang, Y., et al. [(18)F]DPA-714 PET imaging of AMD3100 treatment in a mouse model of stroke. Mol Pharm. 11 (18), 3463-3470 (2014).
  16. Domercq, M., et al. PET Imaging with [(18)F]FSPG evidences the role of system xc(-) on brain inflammation following cerebral ischemia in rats. Theranostics. 6 (11), 1753-1767 (2016).
  17. Toth, M., et al. Acute neuroinflammation in a clinically relevant focal cortical ischemic stroke model in rat: longitudinal positron emission tomography and immunofluorescent tracking. Brain Struct Funct. 221 (3), 1279-1290 (2016).
  18. Walter, H. L., et al. In vivo analysis of neuroinflammation in the late chronic phase after experimental stroke. Neuroscience. 292, 71-80 (2015).
  19. Rojas, S., et al. Imaging brain inflammation with [(11)C]PK11195 by PET and induction of the peripheral-type benzodiazepine receptor after transient focal ischemia in rats. J Cereb Blood Flow Metab. 27 (12), 1975-1986 (2007).
  20. Glazier, S. S., O'Rourke, D. M., Graham, D. I., Welsh, F. A. Induction of ischemic tolerance following brief focal ischemia in rat brain. J Cereb Blood Flow Metab. 14 (4), 545-553 (1994).

Tags

Medicin sag 136 Neuroinflammation translocator protein 18 kDa (TSPO) positron emissions tomografi (PET) magnetisk resonans imaging (MR) neuroimaging slagtilfælde mus.
PET-billeddannelse af Neuroinflammation ved hjælp af [<sup>11</sup>C] DPA-713 i en musemodel af iskæmisk slagtilfælde
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chaney, A. M., Johnson, E. M.,… More

Chaney, A. M., Johnson, E. M., Cropper, H. C., James, M. L. PET Imaging of Neuroinflammation Using [11C]DPA-713 in a Mouse Model of Ischemic Stroke. J. Vis. Exp. (136), e57243, doi:10.3791/57243 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter