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Medicine

Neuroinflammation 的 PET 成像 [11C] DPA-713 在小鼠缺血性中风模型中的应用

Published: June 14, 2018 doi: 10.3791/57243
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Radiology, Stanford University, 2Department of Neurology and Neurological Sciences, Stanford University

Summary

正电子发射层析成像 (PET) 转运体蛋白 18 kDa (TSPO) 提供了一种非侵入性的手段来可视化 neuroinflammation 在脑疾病的发展和进展中的动态作用。本协议描述 TSPO-PET 和前体显影在小鼠缺血性中风模型中检测 neuroinflammation。

Abstract

Neuroinflammation 是缺血性中风后病理级联的中心。非侵入性分子成像方法有可能对脑卒中某些 neuroimmune 相互作用的时间动力学和角色提供重要的洞察力。具体地说, 正电子发射断层扫描 (PET) 成像的转运体蛋白 18 kDa (TSPO), 一个标记的活化小胶质细胞和外周髓系体细胞, 提供了检测和跟踪 neuroinflammation在体内的手段。在这里, 我们提出了一个方法, 以准确量化 neuroinflammation 使用 [11C] N, n-二乙基-2-[2-(4-甲氧基苯基)-57-dimethylpyrazolo [15-a] 嘧啶-3-基] 乙酰胺 ([11C] DPA-713), 一个有希望的第二代 TSPO-PET放射性, 在大脑中动脉闭塞 (dMCAO) 与假手术小鼠相比。MRI 进行2天后 dMCAO 手术, 以确认中风和定义梗死的位置和体积。PET/计算机断层扫描 (CT) 成像术后6天 dMCAO, 以捕捉峰值增加的 TSPO 水平后中风。对 PET 图像进行定量测定, 以评估 dMCAO 和假鼠大脑和脾脏中 [11C] DPA-713 的摄取量, 以评估中枢和周围炎症水平。体内[11C]DPA-713 脑吸收是通过体内显影证实的。

Introduction

中风是第五大死因, 也是美国1残疾的主要原因。缺血性中风是绝大多数这些病例 (87%), 发生在血液流向大脑的局部中断 (例如,由血块或脂肪堆积)。随后减少了对受影响地区的氧气和养分供应, 并启动了复杂的病理级联, 导致脑卒中核心 (梗塞) 内的神经元死亡, 除了周围地区。Neuroinflammation 是导致这种损害的途径中的一个关键组成部分, 包括居民脑免疫细胞和浸润性外周免疫细胞 (中性粒细胞、T 细胞、B 细胞和单核巨噬细胞), 认为这有助于破坏性级联2,3。活化小胶质细胞和巨噬菌是这 neuroinflammatory 反应的中心, 报告的有害和有益的影响后, 缺血性中风2。因此, 必须评估这些细胞在中风后的体内贡献。

PET 是一种强大的3维分子成像技术, 通过使用标记为正电子 (β +) 放射放射性核素的特定分子 (如11C、 13N), 可以在体内可视化生物过程, 15O 和18F。这种非侵入性方法比体外方法 (如免疫组化) 有许多优点, 因为它允许实时获取分子信息, 在活着的完整的主题, 并允许纵向调查。PET 成像的 TSPO, 一个标记的活化小胶质细胞和外周髓系体细胞, 提供了一种手段, 以量化和跟踪体内的先天免疫细胞反应, 并可用于评估中风后炎症和反应治疗干预。TSPO, 以前称为外周型苯二氮受体, 是一个 18 kDa 蛋白, 被认为是在胆固醇运输和合成神经甾体4的作用。此外, 证据表明, TSPO 参与了 neuroinflammation 和神经元存活5,6, 报告说, 在许多神经系统疾病包括中风7的表达增加,痴呆症8, 帕金森病9和多发性硬化症10。TSPO 位于外线粒体膜上, 在周围有高度表达, 特别是在类固醇相关组织 (如腺体) 中, 以及在心脏、肾脏和肺部10中可见的中层水平。然而在健康的大脑中, TSPO 水平低, 主要受限于胶质细胞6,11。在脑卒中观察到的神经元损伤后, 中枢神经系统 (CNS) TSPO 水平显著增加。这种观察到的上调 TSPO 可以被利用在体内图像 neuroinflammation, 表达水平提供了准确的炎症严重性指标。因此, 该方法的目的是准确量化 neuroinflammation 在小鼠脑缺血性中风模型中的作用, TSPO PET。

针对 neuroinflammation 的 PET 成像, 研制了多种 TSPO 示踪剂。在这里, TSPO-PET 成像被描述使用 [11C] DPA-71312, 一个有希望的第二代 TSPO 示踪器, 它显示了增强信号的噪声和较低的非特定绑定比历史上使用 [11C] PK11195 13.以此方法为例, 选择了 dMCAO 小鼠中风模型14。该模型包括颞侧开颅术和远端大脑中动脉的永久性结扎, 导致体感皮层局灶性缺血。这有利于临床前中风的研究, 由于缺血性损伤的高重现性和低死亡率相关的模型。到目前为止, TSPO PET 成像研究尚未在 dMCAO 啮齿动物模型中报道。然而, 以往的 PET 成像研究使用大脑中动脉闭塞 (MCAO) 模型, 一个更严重和可变中风模型, 在小鼠和大鼠, 报告 TSPO 表达增加从3天和峰值7天后中风15, 16,17,18。因此, 我们进行了6天后 dMCAO 的 PET 成像与高 TSPO 表达一致。[11C]在同侧 (梗塞) 和对侧半球评估脑 DPA-713 吸收。TSPO-PET 结合结构 MRI, 可精确划定梗死和对侧区域的兴趣 (ROIs)。在这里, 我们描述了基于 atlas 和 MRI 驱动的 ROI 方法来计算 [11C] DPA-713 的吸收。放射性在脾脏中的摄取量也被评估以调查组间炎症的周围水平。这种方法有可能为脑卒中和其他神经系统疾病的时空动力学和特定 neuroimmune 交互作用提供重要的洞察力。

Protocol

所有动物研究都是按照斯坦福大学实验动物护理管理小组 (亚太) 进行的, 这是一个由实验室动物护理评估和鉴定协会认证的项目。在这一程序之前, 三月大的 C57BL/6 雌性小鼠在标准程序和无菌条件14下接受 dMCAO 手术。

1. 结构 MRI (术后2天 dMCAO 手术)

  1. 打开操作软件 (见材料表), 通过创建新的考试来设置购置。在 "调色板资源管理器" 中选择本地化和 turborare T2 序列, 然后拖到 "考试" 窗口中。
  2. 使用软胶带将呼吸和热探针固定到鼠标床上, 并在两者之间放置一条保护性吸收填料, 以创造一个无菌环境。
  3. 将空气加热器连接到动物床上, 打开风扇, 使暖空气打开并保持鼠标加热。使用自动监测系统, 以确保在扫描期间在适当的水平保持体温和呼吸率。
  4. 麻醉在感应腔内使用3% 异氟醚最初, 然后维持在 1-2% (2 升/分, 100% O2)。确保在感应腔下打开热垫, 使鼠标在感应过程中保持温暖。一旦麻醉, 将眼润滑剂应用于鼠标, 以避免干燥和角膜溃疡的形成。
    1. 打开麻醉系统 (异氟醚 1-2%, 2 升/分钟 100% O2) 连接到 MRI 扫描仪和转移到老鼠床上的动物。
    2. 将鼠标头部放置在咬杆上, 并固定耳棒到位, 确保它们不会凸出在床的直径之外。
    3. 将射频线圈滑过鼠标头, 将线圈和床推入孔内, 并将其专门放置在 isocenter 上。
    4. 获取定位仪以查看所有3维中的鼠标位置, 并使用此图像定义 T2 turborare 的音量 (TE:33 ms, TR: 2500 毫秒, 2 平均值, 17 切片, 0.083 x 0.92 毫米分辨率, 2 分钟40秒总时间) 获取。dMCAO 手术导致体感皮层14梗死;因此, 确保该区域覆盖在 T2-weighted 映像中。
    5. 从扫描仪中取出鼠标, 并在加热室中恢复小鼠。

2. PET/CT 校准和工作流设置 (dMCAO 手术后6天)

  1. 在扫描仪操作软件中创建一个成像工作流, 包括 CT 衰减采集, 60 分钟 C-11 动态 PET 采集 (350-650 凯文水平判别, 3.438 ns 重合窗), 直方图 (20 帧: 5 x 15 秒, 4 x 1 分钟, 11 x 5 分钟; 带死时间校正) 和 3 dosem 重建 (2 个迭代, 18 个子集) 创建 128 x 128 x 159 图像与 0.776 x 0.776 x 0.96 毫米体素大小。
  2. 通过位于界面左上角的 CT 校准面板执行 x 射线源调节。如果系统在过去48小时内未使用过, 则必须每周或在扫描前进行此校准。
  3. 执行暗/光 (d-/升) 和中心偏移 (C/O) 校准。
    1. 按下界面左上的 CT 校准按钮 (X)。
    2. 选择要运行的 CT 文件的 d-/升和 C/O, 从龙门中取出床并运行 d/a 校准。
    3. 将校准工具床插入扫描仪并运行 C/O 校准, 确保将接口上的选择切换为 "校准工具", 而不是 "70 mm 调色板"。
  4. 卸下校准工具并返回标准 PET 床, 确保将界面上的选择更改回 "70 mm 调色板"。
  5. 使用磁带将4鼠标的成像床固定在扫描仪平台上, 并附上麻醉油管 (图 1a)。确保异氟醚流经管道, 并没有任何缺陷。
  6. 推床向前, 所以它是在视野的中心 (FOV), 关闭 ct 门, 并获得一个侦察视角的 ct, 以确保床在正确的位置。
  7. 使用内部制造的幻像作为辐射源, 对 PET/CT 扫描仪进行 "标准" 校准, 其中包含已知剂量的 C-11 溶液。
    1. 准备一个20毫升注射器填充的示踪剂剂量相当于一只老鼠 (~ 250-350 µCi/9-13 MBq C-11 示踪盐稀释)。
    2. 使用剂量校验仪记录标准中的活动, 并记下测量时间。
    3. 使用与图像小鼠相同的参数 (如上文所述), 对标准进行 PET/CT 扫描。每周执行此项以创建 PET 扫描仪应用于成像数据的校正因子。

3. PET/CT 成像的工作空间设置

  1. 使用带有 virucide 的消毒剂 (见材料表), 并在所有表面放置保护性吸收填料, 创造一个无菌环境。
  2. 确保氟醚和氧气罐充分填充。
  3. 用0.9% 氯化钠 (无菌生理盐水) 填充1毫升注射器 (装有27.5 克针尖) 并通过27.5 克24厘米的蝶导管冲洗, 准备尾静脉导管。在 cannulating 前切断导管的翅膀, 以确保它们不会挡住尾部静脉的视线, 并帮助他们轻松地将老鼠移入扫描仪而不取代导管。
  4. 确保所有必要的设备都布置在工作站上, 包括备用的 "冲洗" 注射器 (填充无菌生理盐水)、眼润滑剂、乙醇拭子、热灯、准备好的导管 (预填充生理盐水)、外科胶带、组织胶水、0.5 毫升剂量注射器、剪刀, 和一个打火机, 以密封导管后成功放置在尾部静脉 (图 1B)。

4. 动物制剂和插管

  1. 称量老鼠以确定允许注射到每只老鼠体内的最大体积 (即,示踪剂量和任何生理盐水都不得超过体重的 10%)。
  2. 麻醉小鼠在诱导室使用3% 异氟醚和维持在 1-2% (2 升/分 100% O2)。
  3. 对每只老鼠应用眼润滑剂, 通过踏板反射 (脚趾夹) 确认麻醉。必要时调整麻醉水平。
  4. 将鼠标放在装有鼻锥的加热床上, 以 1-2% (2 升/分钟 100% O2) 交付异氟醚。
  5. 当鼠标被麻醉时, 使用以下协议执行尾静脉插管:
    1. 将鼠标放在它的一侧, 露出侧脉之一, 而头部则留在鼻锥中。
    2. 用热灯加热尾部, 小心不要过热或烫伤尾部, 用酒精擦拭拭去静脉, 并对注射部位进行消毒。
    3. 将针与斜角保持在一起, 并使其与静脉在一个尖锐的角度对齐。
    4. 轻轻地施加压力, 以刺穿皮肤和水平的针, 所以它是符合静脉。
    5. 轻轻向前推几毫米过去的斜角, 使针进入静脉。
    6. 确认导管是通过管理一个小 (10-20 µL) 冲洗盐水。生理盐水应使注射器顺畅, 静脉应清除。如果观察到有任何阻力或背压, 很可能导管不在静脉内, 而重新尝试插管是可取的。如果观察到凝血, 使用肝素 (每毫升生理盐水1000单位肝素) 插管设置和冲洗。
      注意: 我们已经评估了在小鼠的兴趣, 并没有肝素插管, 因为没有发现凝血, 单独生理盐水用于插管。
    7. 使用一小滴纸巾, 然后用手术胶带将导管固定在尾部, 以确保导管在将鼠标转移到扫描仪时保持不动。
    8. 从导管末端取出冲洗注射器, 用打火机封端, 确保研究员不靠近任何异氟醚或乙醇。
    9. 重复3个额外的老鼠, 以便所有4只老鼠被扫描的是空心和准备。
  6. 打开麻醉流 (2.5% 异氟醚, 2 升/分钟 100% O2) 连接到 PET/CT, 并仔细定位的小鼠容易在扫描仪床上, 确保导管保持到位, 每个鼠标的头部是直和安全的鼻锥内。用柔软的手术胶带将每只老鼠的头部和身体贴在床上, 确保呼吸不受放置胶带的限制。记录每个鼠标的位置, 以便为图像分析提供正确的位置和组分配。
  7. 保持小鼠在整个过程中加热 (例如,使用热灯或热空气泵系统, 以确保老鼠保持温暖不过热)。监测所有小鼠的呼吸率, 无论是使用开放的龙门或通过远程监测系统使用呼吸垫, 并改变麻醉水平的必要。

5. CT 采集

  1. 一旦动物在床上安全, 呼吸稳定, 打开激光十字头发, 移动扫描床, 使它们与所有四只老鼠的大脑对齐。将扫描仪床移至采集位置 (位置 3), 使鼠标的大脑尽可能靠近 FOV 中心。
  2. 获取鼠标的侦察视图图像以验证其位置 (使用200毫米 FOV), 并在必要时通过拖动接口上的 FOV 框来调整位置。单击扫描仪软件中的 "启动工作流" 以开始 CT 扫描, 确保选择 "显示交互式用户提示", 以便在跟踪器注入之前手动启动 PET 扫描。

6. [11C] DPA-713 剂制剂

  1. 综合 [11C] DPA-713 如前所述12, 确保您穿着适当的 PPE (个人防护设备) 来处理放射性物质, 包括实验室外套、手套和个人手指和身体剂量计。确保定期更换手套以防止放射性污染, 并在可能时增加与放射源的距离。
  2. 使用镊子小心地转移放射性瓶后, 铅盾。
  3. 为每只含有约250-350 µCi/9-13 MBq 100-200 µL 体积的老鼠准备0.5 毫升剂量注射器, 以确保足够的剂量用于60分钟动态 PET 扫描 (应根据同位素和时间线半衰期确定剂量的研究设计, 与体积取决于鼠标的重量)。
  4. 使用剂量校验仪设置为 C-11, 在靠近插管部位的地方测量活动, 并记录测量和注射的次数, 以启用衰变校正。在 CT 结束前绘制剂量以限制衰变, 并确保每只老鼠注射所需的放射性水平。
  5. 验证剂量注射器中没有气泡, 然后再测量活动并注射到每只老鼠身上。

7. 宠物收购

  1. 一旦鼠标自动从 CT 到 PET, 设置扫描器的背面为 [11c] DPA-713 注入 (图 1c)。放置在窗台上的保护性吸收填料, 并确保剪刀和打火机的手。
  2. 用剪刀剪密封导管, 检查导管线是否有气泡, 确认套管仍在静脉内, 执行10-20 µL 盐水冲洗。将测量过的剂量注射器从步骤6.4 加载到4个导管中的每一个, 记录给每只老鼠的剂量。
  3. 当 PET 扫描准备就绪, 同时启动10秒计时器时, 单击 "确定"。有两名研究员在扫描仪背面与剂量注射器在手, 以注射所有4只老鼠同时在定时器达到零。冲洗每个导管与50-100 µL 生理盐水 (取决于导管管的长度-即死容积), 以确保充分剂量进入尾部静脉, 并再次密封油管再次使用打火机。
  4. 使用剂量校验仪测量剂量注射器, 以获得残余放射性值 (在注射器中留下的任何示踪剂)。记下所记录的值和时间。
  5. 扫描完成后, 使用运动控制面板中的水平 "home" 按钮将 PET 床放到原来的位置。从扫描仪中取出鼠标并小心地取出导管。轻轻按压插管部位, 防止出血过多。
  6. 用先前描述的剂量校验仪测量导管中的残余活性。
  7. 如果老鼠要恢复, 确保这是在一个温暖的环境中 (例如,在一个装有加热垫的盒子里, 或者里面装满温水的手套) 来缓解恢复。如果计划弄死老鼠, 将小鼠放进含有异氟醚的诱导腔内, 使它们在安乐死前保持麻醉, 通过灌注。
  8. 要重建数据, 请打开后处理管理软件 (参见材料表), 它将使用从开始文件生成的直方图数据自动重构每个扫描。

8. 脑显影

  1. 在实验之前, 通过将数字显影胶片暴露在白色光线下10-15 分钟, 并保持在无放射性区域, 直到使用。
  2. 为每只含有大约 1.0-1.5 mCi/37-56 MBq 的老鼠准备0.5 毫升剂量注射器, 以确保足够的显影剂量。
  3. 在注射前用剂量校验仪测量剂量注射器中的放射性, 以获得对活动的准确读数。
  4. Cannulate 如前所述, 并立即在适合放射性的区域注射老鼠。
  5. 注射后取出导管, 测量残余放射性。
  6. 将老鼠留在加热的感应腔内, 使它们在灌注和安乐死之前保持麻醉。
  7. 进行安乐死, 而小鼠深麻醉 (持续吸入4% 异氟醚, 2 升/分钟 100% O2) 通过 PBS 灌注和双侧切口30分钟后-[11C] DPA-713 注射液。
    1. 打开腹腔, 切开隔膜, 露出心脏。
    2. 将蝶导管输液针插入心脏左心室, 并剪右心房和下腔静脉。
    3. 用20毫升注射器慢慢地灌注与 PBS (~ 20-30 毫升)。
  8. 用镊子和剪刀小心地从头骨中取出大脑。
  9. 将大脑放置在充满最佳切削温度 (OCT) 液体的冷冻模具中, 确保大脑在模具中处于水平和中心位置, 并将嗅觉灯泡定向到模具中的凹槽 (一旦大脑提供地标和定位从模具中删除)。
  10. 将模具放在干冰上 10-15 分钟, 或直到 OCT 变得不透明。
  11. 立即将每个模具放在恒温器切片设置为-18 °c, 并在安装前平衡10分钟。
  12. 用少量新鲜的 OCT 作为 "胶水", 剥去冷冻模, 将大脑装入切片平台。
  13. 留在切片的大脑冻结2分钟。
  14. 切片通过大脑, 直到中风的位置暴露 (即ROI)。使用 MR 图像定位每个动物大脑中的梗塞。对于 dMCAO, 这应始终在体感皮层;然而, 中风的长度可能稍有不同。
  15. 部分大脑跨越梗塞的区域, 将20µm 厚的切片放置在用适当的鼠标编号标记的玻璃显微镜幻灯片上。
  16. 打开显影盒和线底部的卡带与一页的保鲜膜。将幻灯片部分并排排列在盒式包装的顶部, 并记下每张幻灯片的位置。还可以选择幻灯片放置的图片, 以帮助以后进行分析。
  17. 轻轻地放置另一层的保鲜膜上 (等待2分钟后收集最后的大脑部分-允许它干燥和坚持幻灯片), 并小心地把数字显影胶片 (白色的一面朝下) 在幻灯片上。
  18. 把卡带紧紧地关上, 放在一个-20 摄氏度的冰箱里, 允许部分在胶片上腐烂, 以获得足够的曝光时间 (5-10 半衰期)。
  19. 使用荧光粉成像仪在曝光时间后对胶片进行扫描, 生成数字图像进行后续分析。

9. 动态 PET 图像分析

  1. 打开图像分析软件 (见资料表), 点击 "打开数据" 图标加载 CT 图像 (作为源) 和 "追加数据" 图标加载动态 PET (作为参考)。
  2. 通过下拉菜单中的时间序列运算符对数据执行视觉质量控制: 选择引用 ("ref") 和 "全局", 并为颜色刻度应用适当的最小和最大值。通过框架可视化动态 PET 数据帧, 验证放射性吸收和检查扫描中的任何运动混淆。
  3. 使用 "算术运算符" 创建平均 PET 图像。
    1. 选择 "平均选定的", 不选 "ref", 并确保输入 1 ("Inp1"), 输入 2 ("Inp2") 和输入星 ("中"-包括扫描中的 pet 帧的其余部分), 以创建一个平均所有的 pet 框架。
    2. 转到 "数据管理器" 选项卡 (DM), 并将平均图像拖动到 "input1" 位置以进行可视化。通过单击 "最小最大" 工具中的自动计算, 重新分配颜色刻度。
  4. 在 "重新定位/注册" 下拉菜单中使用 "自动 3D" 功能, 将 CT 记录到普通 PET 文件中。
    1. 选择 "ref" 和 "Inp1", 并选择 "刚性", "快速", "Inp1 到 ref" 注册。在所有3维度中目视检查注册, 并在 "手动 3D" 选项卡中使用 "平移" 和 "旋转" 功能手动调整。
    2. 当对注册满意时, 选择 "Inp2" 和 "中 *", 并通过单击复选标记应用于所有 PET 框架。右键单击 DM 中的 CT 和 PET 文件, 并保存为 raw。
  5. 用 CT 作为指南, 一次裁剪一只老鼠的大脑进行脑分析: 从下拉菜单中选择 "裁剪", 然后拖动图像边界, 将鼠标头部裁剪到脑干下方。用上面描述的 "手动3D 方向调整" 功能重新定位 PET 和 CT 图像, 使头骨在所有尺寸中都是直的。
  6. 使用接口左上的 "追加数据" 按钮在 MR 图像中加载该鼠标 (以 DICOM 格式)。移动 MR 使用 "手动3D 重新定位", 并适合在 CT 图像内的头骨 (确保所有模式都在同一方向)。
  7. 使用 "3D ROI 工具" 绘制 MR 图像上的描边 ROI。
    1. 在可视控制器选项卡 (VC) 中取消对 PET 的可视化, 并仅使用 MR 和 CT 绘制 ROI。
    2. 点击 "添加 roi" 按钮, 创建一个新的 roi, 并命名为 "梗塞"。选择 "样条工具", 左击可绘制 ROI 边框, 右键单击可将其关闭。
    3. 重复所有包含中风的切片, 确保不捕捉 ROI 中的任何头骨, 最好的做法是在头骨边界和中风 ROI 之间留下一个体素间隙。
  8. 使用梗塞容积生成对侧 ROI。
    1. 创建新的 ROI 并将其标记为 "对侧"。右键点击梗塞 ROI, 选择 "导出"。将 ROI 拖动到位置 2 ("Inp1")。
    2. 只有 "Inp1" 选定, 在 "重新定位/注册" 菜单中使用 "运算符" 功能, 应用左右翻转。勾选 "ROI" 框, 选择 "仅查看", 并手动将新的 ROI 移动到对侧的相同区域。选择 "算术" 运算符, 并将2的标量乘法应用于新的 ROI, 允许 ROIs 的独立量化。
    3. 返回 3D ROI 工具。转到 "专家和实验" 选项卡, 然后单击 "导入 ROI" 按钮。从对话框中选择 Inp1, 以将新卷作为对侧 ROI 加载。
  9. 右键单击平均 pet 图像并卸载它, 然后将宠物重新打开。使用 3D ROI 工具中的 "导出结果" 图标生成量化摄取结果。
  10. 如果需要的话, 执行额外的分裂脑分析 (即,使用3D 鼠标大脑地图集插件模块 Vivoquant 软件, 自动 ROI 生成右与左脑半球区域)。
    1. 重新加载已注册的 PET/CT 图像。
    2. 通过点击 "高级模块" 菜单和选择3D 脑地图集工具, 导入鼠标大脑图谱。在 "高级设置" 中选择 "所有区域左/右", 然后单击 "运行" 以导入3D 地图集。
    3. 在大脑中使用头骨作为边界手动调整地图集。
    4. 重新运行 atlas 确保 "导入 3D ROI" 被检查, 以生成所有14左右半球 ROIs (髓质, 小脑, 中脑, 脑桥, 皮质, 海马, 丘脑, 下丘脑, 纹状体, 螺旋体, 嗅球的结果电子表格,胼胝体和白色物质)。
  11. 使用扫描仪操作软件定量测定脾脏中的示踪物摄取量 (见材料表)。
    1. 通过在数据库中突出显示它们并单击 "常规分析" 来加载 PET 和 CT 图像文件。
    2. 点击注册标签和共同注册的 PET 和 CT 图像点击 "刚性注册" 图标。
    3. 点击 roi 量化标签, 点击 "创建 roi" 图标, 并命名为脾脏。
    4. 选择 "球体" 工具, 以提取脾脏 ROIs 使用 CT 文件供参考, 确保没有重叠与肾脏摄取 (使用 PET 图像和信号, 以避免溢出肾脏)。
    5. 编辑 ROIs 以保持动物之间的 ROI 卷一致。
  12. 计算吸收规范化的标准校正值。
    1. 从标准扫描中加载 PET/CT 数据, 并使用 "手动 3D roi" 工具创建一个包含20毫升注射器的气缸 ROI。
    2. 使用电子表格图标获取标准中包含的放射性水平。
    3. 使用这一结果和原始记录的放射性的标准 (即剂量校验仪测量的标准在癌症/cc), 以创建一个矫正因子的宠物摄取值。即, 用标准的 PET 图像计算出的放射性, 除以剂量校验仪记录的放射性标准。
  13. 使用剂量活动和测量时间的衰变正确的时间, 宠物获得所有的老鼠 (i. e计算在 pet 扫描开始时的剂量活动)。
  14. 重复的残余值和减去从衰变修正剂量, 以计算准确的活动, 每一个动物收到。
  15. 应用此衰减校正后, 还应应用标准校正以确保数据处于正确的活动水平。确保这些更正应用于手动绘制的 roi 结果, 以及脑图谱 roi 数据相关的大脑区域 dMCAO 位置 (即皮质、海马和纹状体)。
  16. 使用以下公式计算所有 ROIs 的%ID/g:%ID/克 = (在/cc 中获得的 ROI 放射性) x 100。绘制%ID/g 作为时间的函数, 使用图形软件为每个 ROI 生成时间活动曲线。
  17. 使用扫描仪软件进行最终的图像可视化和图形生成。根据每只鼠标在扫描时接收到的衰减校正剂量对图像进行规范化, 确保所有图像都在相同的%ID/g 刻度上。
    注意: 这是必要的, 以便能够准确地比较不同的老鼠和/或图像从不同的时间进行的研究的图像

10. 显影图像分析

  1. 在 ImageJ 软件中打开数字图像 (. 凝胶文件)。调整亮度和对比度以直观地阈值图像, 并应用适当的颜色 "查找表"。
    注意: 皇家最准确地类似于 PET 中使用的颜色刻度。
  2. 使用 ROI 管理器手动绘制梗塞和相应的对侧区域周围的 ROIs。
  3. 使用度量函数来量化每个 ROI 和导出结果的平均像素强度。使用统计软件进行绘制。

Representative Results

小鼠进行 MRI 检查成功的中风, 并通过扫描4小鼠同时进行 [11C] DPA-713 PET。PET、CT 和 MR 图像在手动绘制脑 ROIs 和执行半自动分裂脑图谱分析之前进行了联合注册, 以调查同侧和对侧区域的示踪物摄取情况 (图 2)。

PET/CT 图像和时间活动曲线 (口香糖-放射性活动作为时间的函数) 显示增加 [11C] DPA-713 吸收在同侧半球 (图 3a)。定量的动态 PET 脑图像, 使用总结数据从50-60 分钟, 显示显着增加的示踪剂摄取 (% ID/g) 在同侧半球 (梗死) 相比, 在 dMCAO, 但不是在假鼠使用人工绘制ROI 方法 (图 3B)。dMCAO 和假鼠在同侧半球也观察到了增加的摄取量。使用 atlas 方法观察到同侧半球之间没有显著差异, 可能是由于 atlas ROIs 大于梗塞的大小 (通常限于体感皮层), 因此稀释了信号。然而, 所有 ROIs 对 dMCAO 的总摄取量比假的增加, 这与以前使用 MCAO 模型小鼠的报告一致, 表明在梗塞19以外地区的 TSPO 表达增加。dMCAO 与假鼠同时使用两种方法增加同侧/对侧比值;然而, 由于 ROI 方法的差异较大, 这种差异仅在大脑皮层使用大脑图谱方法时才显著。这可以通过增加每组老鼠的数量来克服。定量的 [11C] DPA-713 的摄取在脾脏显示没有显著差异组 (图 4)。

脑 dMCAO 小鼠 PET 成像结果经活体高分辨率数字显影证实 (图 5)。增加 [11C] DPA-713 的摄取在梗死组织中观察到, 在周围健康的脑组织中可忽略的信号。这些图像的定量显示与对侧比从1.4 到2.09 的 dMCAO 小鼠。

Figure 1
图 1:PET 扫描仪和工作区设置.所有工作区都覆盖在保护性吸收填料, 以创造一个无菌环境。(a)校准后, 一张 3 d-打印的小鼠床, 同时配有4只小鼠的成像设备, 用于所有4只麻醉小鼠的扫描仪和鼻锥。(B)预先准备了 PET 成像所需的设备, 包括含盐水的27.5 克导管、眼润滑剂、乙醇拭子、热灯、外科胶带、组织胶水、0.5 毫升注射器、剪刀和打火机。(C)放射性注射时, 将盐水冲洗注射器和剪刀放在扫描仪背面。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2:同侧/对侧 ROI 和右/左分裂半球脑图谱的 PET 图像分析过程.利用人工绘制的 ROIs 和半自动化3D 分裂脑图谱方法, 利用图像分析软件确定了同侧和对侧区域的示踪物摄取量 (ROIs)。自动 3D PET/CT 注册后进行人工注册的大脑 MRI 在相应的鼠标头骨定义的 CT 图像。3D ROI 工具用于手动绘制同侧 (红色) 和对侧 (绿色) ROIs 使用 MRI 梗塞作为参考。对于分裂大脑的方法, 3D 左/右分裂小鼠大脑图谱被加载和安装在头骨中的 CT 图像定义。脑 ROIs 用于定量在这个3D 鼠标大脑图谱包括左皮层 (深灰色), 左海马体 (矢车菊蓝色), 左纹状体 (深粉红色), 右皮层 (番茄红色), 右海马 (绿色), 右 Striatium (青色)。在每一个区域获得 [11C] DPA-713 的吸收, 并随后转换为%ID/g 通过正常化的衰减校正剂量时, 每只老鼠扫描。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 代表体内[11C] DPA-713 DMCAO 和假鼠的脑吸收。(A)动态 PET/CT 图像和口香糖显示增加 [11C] DPA-713 在小鼠的同侧皮层接受 DMCAO (n = 3) 和轻微增加假 (n = 3) 操作小鼠, 与 DMCAO 小鼠表现显着更大的与脑梗塞和对侧侧的比例注射剂量的对比 (%ID/g)。(B) PET 量化 (50-60 分钟总结) 显示, 使用 ROI 方法和在皮质 (Ctx) 使用分裂脑图谱方法显著增加了同侧 roi 的吸收。海马 (HC) 或纹状体 (Str) 无明显差异。使用两种分析方法均能提高同侧比对侧比, 但 Ctx 使用脑图谱方法在统计学上有显著意义。* (p < 0.05), ** (p < 0.001)请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4:代表体内[11C] DPA-713 dMCAO 和假鼠的脾吸收。(A) [11C] DPA-713 动态 PET/CT 图像显示脾脏 ROIs 在 dMCAO (n = 3) 和假 (n = 3) 小鼠。(B)定量结果表明, dMCAO 和假鼠在脾脏摄取方面没有显著的结果。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5: 代表显影结果.数字显影图像显示增加 [11C] DPA-713 吸收在同侧半球相比。请单击此处查看此图的较大版本.

Discussion

该协议描述了使用 [11C] DPA-713-PET 对 dMCAO 和假鼠 neuroinflammation 进行量化的方法。TSPO PET 是目前最广泛研究的影像生物标志物, 用于可视化和测量 neuroinflammation。TSPO 表达是上调在脑胶质细胞炎症允许无创检测和量化的 neuroinflammation。此外, 它是一种高度翻译的技术, 使它成为一个宝贵的工具, 在临床和临床前的研究。该协议和代表性的结果突出了使用 [11C] DPA-713 PET 检测和监测中风和其他神经系统疾病在体内的 neuroinflammatory 改变的适用性。

本研究采用3月大的 C57BL/6 雌性小鼠进行 dMCAO 手术。这一模型的选择, 因为它导致一个高度可重现性梗塞局限于体感皮层, 提供了一个永久性局灶缺血的模型与其他中风模型 (如大脑中动脉, 低变异性)闭塞 (MCAO) 灯丝法)14。脑卒中模型的 PET 成像具有在大脑中包含一个内部参考区域的优势, 每个动物使用 ROIs 在对侧半球。由于手术后会产生一些炎症, 因此在研究设计中包括接受假手术的小鼠是很重要的, 即在没有动脉闭塞的情况下, 对脑膜进行开颅和手法治疗。单开颅手术可能会导致潜在的神经组织中断, 并引入病原体, 导致免疫应答独立于中风20。因此, 假手术后的一些炎症是预期的, 应该与 dMCAO 平行评估, 以排除仅因手术而导致信号的可能性。为了避免在 dMCAO 队列分析中包括没有中风的手术引起的炎症, mr 成像必须进行, 以确认成功的中风手术和梗塞的发展。MRI 也提供了一个结构参考框架, 这是必不可少的准确绘制梗死和对侧 ROIs。此外, 还需要准确的图像处理, 包括图像配准和 ROI 定义, 以确保可靠的量化。

当与 C-11 标记 radiotracers 进行 PET 和显影研究时, 必须牢记额外的限制。必须考虑短半衰期 (20.33 分钟) 的 C-11, 其使用一般限于研究机构, 现场回旋接入。必须事先确定适当的放射性运输路线、剂量管理和采集时间点, 并预先准备好实验工作流程的详细计划, 使团队能够快速有效地工作。这项研究的设计和建立已经概述, 以适应4小鼠的成像同时增加数据输出时, 使用 C-11 示踪剂。如果可能的话, 最好在 C-11 示踪器到达成像设备时, 让所有的老鼠空心化, 并在 CT 扫描中进行, 以确保注射前的放射性衰减最小。这一步步协议最好是由至少3位研究人员进行, 以便在重大放射性衰变之前快速插管、剂量测量、示踪剂注射、PET 扫描和脑切片。这需要两个人进行 PET 扫描和注射所有4只老鼠同时进行。在注射前开始 PET 采集的原因是为了保证血液和感兴趣区域的示踪剂分布的药代动力学和动力学得到准确和完全的捕获。许多步骤可能需要进行有力的训练和练习, 以确保实验的顺利运行。特别是, 这个协议依赖于成功的尾静脉插管的 C57BL/6 小鼠, 这可能是困难的, 因为深色的头发呈现在他们的尾巴上, 可能会变得更具挑战性的中风后发生或如果在多个时间点成像相同的老鼠.

PET 成像的另一个考虑因素包括仔细记录放射性剂量和残余活动测量, 包括确切的测量时间。这对于在扫描时注入剂量的精确衰减校正是必不可少的, 并且用于获得对每个 ROI 的示踪剂摄取量 (即% ID/g) 的精确测量。在扫描时, 要知道每只老鼠的放射性确切量, 以确保准确的图像分析。因此, 最好同步扫描仪计算机上的时钟和剂量校验仪, 以避免在使用 C-11 等短命同位素时出现错误。

精确的 PET 图像量化也可以被扫描仪的精度和设置所限制。因此, 为了确保准确量化的 PET/ct 图像, 重要的是进行质量控制检查的 CT 和 pet 部件的扫描仪。CT 质量控制检查包括 x 射线源调节, 暗/光, 和中心关闭设置校准。这些校准措施和正确的系统噪音, 必须在收购之前按照扫描仪制造商的建议执行。对 PET 扫描仪也应进行校准。这通常包括扫描 "标准/宠物幻影" 扫描, 其中包含已知的放射性浓度。在制定标准时, 最好使用与研究中使用的放射性同位素相同的放射性核素, 这一剂量与老鼠体内的一只小鼠相比, 与动物成像的采集参数相同。在本议定书中, 用放射性稀释的20毫升注射器作为标准, 随后的 PET 成像结果用于根据校准探测器测量的实际剂量计算校正系数。该校正比可应用于实验获得的成像数据, 以确保对 PET 图像感兴趣区域的示踪剂摄取进行准确量化。除了考虑扫描当天出现的任何背景活动外, 这也说明了放射性核素的正电子范围。由于剂量校验仪是这一校正因子生成的一个组成部分, 因此必须根据制造商指南定期校准该设备。

在进行体外显影时, 选择注射后安乐死的最佳时间点是很重要的, 以确保感兴趣区域的高信号到背景。三十分钟后注射是选择 [11C] DPA-713 显影使用在动态 PET 成像中获得的数据-即, 在体内动态口香糖作为指导, 同时也考虑到 C-11 的短半衰期和时间参与切片并在提取后暴露脑组织。考虑到这一点, [11C] DPA-713 显影必须在单独的一组小鼠上进行, 以允许注射更高的 [11C] DPA-713 剂量和30分钟的时间点用于麻醉下灌注和安乐死。在进行体外显影前对3-4 只小鼠进行小体内 PET 试验研究将有助于确定显影的最佳时间点。另外一个考虑的是体内显影是在注射后恢复小鼠, 还是将其麻醉直到安乐死。让他们麻醉模仿扫描的条件, 并确保放射性分布或排泄动力学不改变的恢复。此外, 这可以防止对小鼠的额外压力, 避免恢复和随后的诱导。最后, 一个有用的补充, 在前体协议将是评估的区域损害的脑切片用于显影通过免疫组化染色 (放射性衰变后), 以产生高分辨率图像的梗塞地点和体积。

由于使用基于 C-11 的跟踪器有限制, 因此可以很容易地修改此协议, 以便使用 F-18 (半衰期为109.77 分钟) 的 TSPO 跟踪程序, 这可能更适用于没有现场回旋加速器的位置。此外, 此协议还描述了使用4鼠标映像设置的情况。虽然这种高通量方法在使用 C-11 示踪器时是最佳的, 但对于使用单鼠标成像床的那些协议也可能进行修改。对本议定书所概述的技术进行周密的规划和一致的培训将导致使用 [11C] DPA-713 生成大量数据, 这可以很容易地用于探讨 neuroinflammation 在疾病表现中的作用和神经系统疾病的其他啮齿动物模型的进展。此外, 这项技术可以用来评估在体内对小胶质细胞的免疫调节疗法的反应。

Disclosures

作者声明没有利益冲突。

Acknowledgments

作者感谢 Buckwalter 实验室 (特别是托德. 彼得森博士) 提供老鼠模型和执行 dMCAO 和假手术。此外, 我们还要感谢 Invicro 的托马斯 Liguori 为他的技术援助与 VivoQuant 图像分析软件, Tim 道尔博士, 劳拉 Pisani, Frezghi 博士 Habte 从 SCi3 小动物成像设施在斯坦福的意见和协助开发这一成像协议, 和放射化学设施 (特别是钧博士公园) 为他们的帮助与综合 [11C] DPA-713。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Inveon PET/CT scanner Siemens Version 4.2
MRI scanner Varian 7 Telsa
ParaVision software Bruker Version 6.0.1 MRI operating software
VivoQuant software InVicro Version 2.5 Image analysis software
Inveon Research Workspace software Siemens Version 4.2 Scanner operating software. Includes microQView, the post-processing managing software
Dose calibrator Capintech CRC-15 PET
Typhoon phosphor imager 9410 GE Healthcare 8149-30-9410
Butterfly catheters SAI Infusion Technologies BFL-24 27.5 G needle
1 mL syringes BD
Insulin syringes BD 329461 0.5 mL insulin syringes with needle
20 mL syringe  VWR BD302831 BD Syringe Slip Tip Graduated
Tissue glue Santa Cruz Animal Health sc-361931 3 mL
Heat lamp Fluker 27002 5.5" reptile heat lamp with clamp and switch
0.9% sterile saline Pfizer 00409-4888-10 0.9% sodium chloride for injection, 10 mL
Eye lubricant Watson Rugby PV926977 Artificial Tears Lubricant Eye Ointment, 1/8 oz
Chux absorbent sheets ThermoFisher Scientific 1420662 Disposable absorbent padding
Iris scissors World Precision Instruments 503708-12 11.5 cm, Straight, 12-pack
Surgical tape 3M Durapore 1538-0 1/2" x 10 yard roll, silk, hypoallergenic
Mouse PET bed In house 4 mouse PET bed
Lighter Bic UDP2WMDC
Isoflurane Henry Schein NDC 11695-6776-2 Isothesia, inhalation anesthetic, 250 mL
Oxygen Praxiar UN1072 Compressed gas
Autoradiography cassette Cole Palmer EW-21700-34 Aluminum, 8" x 10"
Autoradiography film GE Life Sciences 28-9564-78 Storage Phosphor Screen BAS-IP SR 2025 E Super Resolution, 20 × 25 cm, screen only
Microtome blades ThermoFisher Scientific 30-508-35 MB35 Premier Disposable, 34° cutting angle
Microtome Microm HM 550
Microscope slides Fisher Scientific 12-550-15 Superfrost™ Plus Microscope Slides
OCT liquid VWR 25608-930 Formulation of water-soluble glycols and resins for cryostat sectioning at temperatures of -10°C (14°F) and below
Freezing molds Poly sciences 18646A-1 Disposable paraffin molds
Saran wrap Saran 25700001300
Disinfectant Virkon S

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References

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医学 问题 136 Neuroinflammation 转运体蛋白 18 kDa (TSPO) 正电子发射层析成像 (PET) 磁共振成像 (MRI) 神经影像学 中风 小鼠。
Neuroinflammation 的 PET 成像 [<sup>11</sup>C] DPA-713 在小鼠缺血性中风模型中的应用
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Chaney, A. M., Johnson, E. M.,… More

Chaney, A. M., Johnson, E. M., Cropper, H. C., James, M. L. PET Imaging of Neuroinflammation Using [11C]DPA-713 in a Mouse Model of Ischemic Stroke. J. Vis. Exp. (136), e57243, doi:10.3791/57243 (2018).

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