Positronemissionstomografi (PET) billeddannelse af translocator protein 18 kDa (TSPO) giver en non-invasiv måde at visualisere den dynamiske rolle, neuroinflammation i udvikling og progression af hjernesygdomme. Denne protokol beskriver TSPO-PET og ex vivo Autoradiografi for at registrere neuroinflammation i en musemodel af iskæmisk slagtilfælde.
Neuroinflammation er centrale for den patologiske cascade efter iskæmisk slagtilfælde. Non-invasiv molekylær billeddannelse metoder har potentiale til at give kritisk indsigt i den tidsmæssige dynamics og rolle i visse neuroimmune interaktioner i streg. Specifikt, giver Positron Emission tomografi (PET) billeddannelse af translocator protein 18 kDa (TSPO), en markør for aktiverede mikroglia og perifere myeloid-slægt celler, mulighed for at registrere og spore neuroinflammation in vivo. Vi præsenterer her, en metode til at nøjagtigt kvantificere neuroinflammation bruger [11C]N,N-Diethyl-2-[2-(4-methoxyphenyl)-5,7-dimethylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]acetamide ([11C] DPA-713), en lovende anden generation TSPO-PET radiotracer, i distale midt cerebral arterieokklusion (dMCAO) i forhold til sham-drives mus. Mr blev udført 2 dage post-dMCAO kirurgi at bekræfte slagtilfælde og definere infarkt placering og volumen. PET/Computed Tomography (CT) scanning blev udført 6 dage post-dMCAO til at fange peak forhøjelsen af TSPO niveauer efter slagtilfælde. Kvantitering af PET billeder blev udført for at vurdere udbredelsen af [11C] DPA-713 i hjernen og milten af dMCAO og sham mus at vurdere centrale og perifere niveauer af betændelse. In vivo [11C] DPA-713 hjerne optagelsen blev bekræftet ved hjælp af ex vivo Autoradiografi.
Slagtilfælde er den femte mest almindelige dødsårsag og en væsentlig årsag til invaliditet i USA1. Iskæmisk slagtilfælde repræsenterer et overvældende flertal af disse sager (~ 87%), der sker, når der er lokaliserede forstyrrelser i blodgennemstrømningen til hjernen (f.eks. af en blodprop eller fede indskud). Ilt og næringsstoffer forsyninger til de ramte områder er efterfølgende reduceret og en kompleks patologiske kaskade initieres resulterer i neuronal død inden for slagtilfælde core (infarkt) ud over de omkringliggende områder. Neuroinflammation er en afgørende komponent i den vej, der fører til denne skade, med både hjemmehørende hjernen immunceller (mikroglia) og infiltrerer perifere immunceller (neutrofiler, T-celler, B-celler og monocytter/makrofager) menes at bidrage til dette destruktive kaskade2,3. Aktiveret mikroglia og makrofager er central for dette neuroinflammatory svar, med rapporter om skadelige og gavnlige virkninger efter iskæmisk slagtilfælde2. Det er således nødvendigt at vurdere disse celler efter slagtilfælde i vivo bidrag.
PET er en kraftfulde 3-dimensionelle molekylær billeddannelse teknik, der giver mulighed for visualisering af biologiske processer i vivo ved hjælp af specifikke molekyler, mærket med positron (β +) udsender radionuklider 11C, 13Nielsen, 15O og 18F. Denne ikke-invasiv metode har mange fordele i forhold til ex vivo metoder (fx Immunhistokemi) som det tillader erhvervelse af Molekylær information i realtid, i levende intakt fag, og giver mulighed for langsgående undersøgelse. PET billedbehandling af TSPO, en markør for aktiverede mikroglia og perifere myeloid-slægt celler, giver et middel til at kvantificere og spore medfødte immun celle svar inden for kroppen, og kan udnyttes til at vurdere betændelse efter slagtilfælde og respons på terapeutiske interventioner. TSPO, tidligere kendt som perifere-typen benzodiazepin-receptor, er en 18 kDa protein, der menes at spille en rolle i kolesterol transport og syntesen af neurosteroids4. Desuden tyder på, at TSPO er involveret i neuroinflammation og neuronal overlevelse5,6, med rapporter om øget udtryk i mange neurologiske sygdomme der involverer betændelse herunder slagtilfælde7, demens8, Parkinsons sygdom9 og multipel sklerose10. TSPO er beliggende på ydre mitokondrie membraner og er stærkt udtrykt i periferien, især i steroid knyttet væv (f.eks, kirtler) og med mellemliggende niveauer set i hjertet, nyrer og lunger10. Men i en sund hjerne, TSPO niveauer er lav og begrænset primært til glia6,11. Ved neuronal skade, som den, der observeres i streg, TSPO niveauer i centralnervesystemet (CNS) stige betydeligt. Denne observerede opregulering af TSPO kan udnyttes til billede neuroinflammation in vivo med udtryk niveauer giver en præcis indikator for betændelse sværhedsgraden. Målet med denne metode er derfor at nøjagtigt kvantificerei vivo bidrag af neuroinflammation i en musemodel af iskæmisk slagtilfælde ved hjælp af TSPO-PET.
Flere TSPO røbestoffer er blevet udviklet til PET-billeddannelse af neuroinflammation. Her, TSPO-PET imaging er beskrevet ved hjælp af [11C] DPA-71312, en lovende anden generation TSPO tracer, som har vist forbedret signal til støj og lavere ikke-specifik binding end de mere historisk brugt [11C] PK11195 13 . Som et eksempel, blev dMCAO musemodel af slagtilfælde valgt til denne metode14. Denne model indebærer tidsmæssige kraniotomi og permanent ligatur af den distale midt cerebral arterie, resulterer i fokal iskæmi af somatosensoriske cortex. Dette er fordelagtigt i prækliniske slagtilfælde forskning skyldes høj reproducerbarhed af iskæmisk skade og lav dødelighed forbundet med denne model. Til dato har TSPO-PET imaging studier endnu skal rapporteres i dMCAO gnaver model. Men tidligere PET billeddiagnostiske undersøgelser ved hjælp af den midterste cerebral arterie okklusion (MCAO) model, en mere alvorlig og variable slagtilfælde model, hos både mus og rotter, har rapporteret TSPO udtryk at stige fra dag 3 og peak omkring dag 7 efter slagtilfælde15, 16,17,18. Dermed, vi udførte PET imaging 6 dage post-dMCAO sammenfaldende med forhøjede TSPO udtryk. [11C] DPA-713 optagelse i hjernen blev vurderet i ipsilaterale (infarcted) og kontralaterale halvkugler. TSPO-PET blev kombineret med strukturelle Mr, giver mulighed for præcis afgrænsning af infarkt og kontralaterale regioner af interesse (ROIs). Her beskriver vi både et atlas-baseret og en Mr-drevet ROI henvendelse hen til kalkulere [11C] DPA-713 optagelse. Radiotracer optagelse i milten blev også vurderet for at undersøge perifere niveauer af betændelse mellem grupper. Denne metode har potentialet til at levere kritisk indsigt i spatiotemporelle dynamics og rollen som specifikke neuroimmune interaktioner i slagtilfælde og andre neurologiske sygdomme.
Den præsenterede protokol beskriver en metode til kvantificering af neuroinflammation i dMCAO og sham mus bruger [11C] DPA-713-PET. TSPO-PET er den mest udbredte undersøgte imaging biomarkør for visualisering og måling af neuroinflammation i vivo til dato. TSPO udtryk er upregulated om glia i hjernen under betændelse tillader ikke-invasiv påvisning og kvantificering af neuroinflammation. Derudover er det en meget oversætbare teknik, hvilket gør det til et værdifuldt værktøj i både kliniske og prækliniske forskning. Denne protokol og repræsentative resultater fremhæve egnethed ved hjælp af [11C] DPA-713 PET at registrere og overvåge neuroinflammatory ændringer i slagtilfælde og andre neurologiske lidelser i vivo.
I denne undersøgelse, blev dMCAO kirurgi udført ved hjælp af 3-måned-forhenværende C57BL/6 hunmus. Denne model blev valgt som det giver anledning til en meget reproducerbare infarkt begrænset til somatosensoriske cortex, give en model af permanent fokal iskæmi med lav variation i forhold til andre modeller af slagtilfælde (fx midterste cerebral arteriel okklusion (MCAO) glødetrådens metode)14. PET billeddannelse af slagtilfælde modeller har fordelen, der indeholder en intern henvisning region i hjernen for hvert dyr ved hjælp af ROIs i de kontralaterale halvkugle. Da der vil være nogle inflammation, resultaterne fra kirurgi alene, det er vigtigt at medtage mus, der undergik sham operation i forsøgsdesign, hvorved kraniotomi og manipulation af meninges uden arterieokklusion blev udført. Craniotomy alene kan resultere i forstyrrelser til underliggende neuronal væv og indførelsen af patogener fører til immunrespons uafhængigt af slagtilfælde20. Nogle betændelse efter sham operation forventes derfor og bør vurderes parallelt med dMCAO til at udelukke muligheden for signal på grund af kirurgi alene. For at undgå herunder betændelse som følge af kirurgi uden streg i dMCAO kohorte analyse, skal hr. imaging foretages for at bekræfte vellykket slagtilfælde kirurgi og infarkt udvikling. Mr giver også en strukturel referenceramme, som er afgørende for præcist tegne infarkt og kontralaterale ROIs. Derudover nøjagtig billed oparbejdelse herunder billede registrering og ROI definition er nødvendige for at sikre pålidelig kvantificering.
Yderligere begrænsninger skal holdes for øje, når du arbejder med C-11 mærket radiotracers til PET og Autoradiografi undersøgelser. Det er bydende nødvendigt at overveje de kort halveringstid (20.33 min) af C-11, med dets anvendelse, generelt begrænset til forskningsinstitutioner med on-site cyclotron adgang. Passende radioaktivitet transport route, dosis administration og erhvervelse tid-punkter skal bestemmes på forhånd med en forberedte detaljeret plan over arbejdsgangen for eksperimentet således at holdet kan arbejde hurtigt og effektivt. Design og opsætning af denne undersøgelse er blevet skitseret for at rumme billeddannelse af 4 mus samtidig at øge data output opnåelige, når du bruger en C-11 tracer. Hvis det er muligt, er det tilrådeligt at have alle mus kanylerede og midt i deres CT scanning af tiden C-11 tracer ankommer til billedbehandling mulighed for at sikre minimal radiotracer forfald inden injektionen. Denne trinvise protokol er også bedst foretages af et hold, der indeholder mindst 3 forskere til at tillade hurtig cannulation, dosis måling, tracer injektion, PET scanning og hjernen skæring før betydeligt radioaktivt henfald. Det kræver to personer til at gennemføre iværksættelsen af PET-scanning og injektion af alle 4 mus samtidigt. Årsagen til begynder PET erhvervelse lige før injektion er at sikre farmakokinetik og dynamikken i tracer distribution i blod og områder af interesse er præcist og helt fanget. Mange trin kan kræve energisk uddannelse og praksis at sikre smidig afvikling af eksperimentet. Denne protokol er især afhængige af vellykket hale vene cannulation af C57BL/6 mus, som kan være vanskelig på grund af mørkt hår på deres haler, og kan blive mere udfordrende efter slagtilfælde har fundet sted, eller hvis imaging de samme mus på flere tidspunkter .
En anden overvejelse for PET imaging inkluderer omhyggelig optagelse af radiotracer dosis og resterende aktivitet målinger, herunder det nøjagtige tidspunkt for målingen. Dette er afgørende for nøjagtig henfald korrektion af den injicerede dosis på tidspunktet af scanningen og anvendes til at opnå en nøjagtig måling af tracer optagelse (dvs., %-ID/g) for hver ROI. Det er bydende nødvendigt at kende det nøjagtige beløb af radioaktivitet, der var til stede i hvert mus på tidspunktet for scanning for at sikre nøjagtig billedanalyse. Det er derfor tilrådeligt at synkronisere ure på scanner computeren og dosis kalibrator at undgå fejl, når du bruger kortlivede isotoper som C-11.
Nøjagtig PET billede kvantificering kan også begrænses af nøjagtigheden af scanner og set-up. Dermed for at sikre nøjagtig kvantificering af PET/CT billeder, er det vigtigt at foretage kvalitetskontrol kontrol for både CT og PET komponenter af scanneren. CT kvalitetskontrol kontrol omfatter X-ray kilde condition, mørk/lys og center off sæt kalibreringer. Disse kalibreringer måle og korrekt for system støj og skal være udført forud for erhvervelse, som anbefalet af scannerproducenten. Kalibreringer bør også udføres til PET-scanneren. Dette involverer typisk scanning en “standard / PET phantom” scanning, der indeholder en kendt koncentration af radioaktivitet. Ved udarbejdelsen af standarden, er det bedst at bruge de samme radioisotop, der anvendes i undersøgelsen, en tilsvarende dosis til at gives til en enkelt mus i et volumen svarende til kroppen af en mus, og den samme erhvervelse parametre som animalske imaging. En 20 mL sprøjte fyldt med radiotracer fortyndes i vand bruges til standard i denne protokol, med de efterfølgende PET imaging resultater anvendes til at beregne en korrektionsfaktor, der er baseret på den faktiske dosis målt ved kalibrering detektor. Korrektion ratio kan anvendes til billeddiagnostiske data erhvervet i eksperimentet at sikre nøjagtig kvantificering af tracer optagelse i regioner af interesse i PET billeder. Dette udgør positron vifte af radionuklid ud over at overveje enhver baggrund aktivitet til stede på dagen for scanning. Som dosis kalibrator er en integreret del af generation af denne korrektionsfaktor, er det bydende nødvendigt, at dette udstyr også er kalibreret jævnligt ifølge retningslinjerne for producenten.
Ved gennemførelse af ex vivo Autoradiografi er det vigtigt at vælge en optimale tidspunkt for aktiv dødshjælp efter injektion, til at sikre høj signal til baggrunden i forvejen af interesse. Tredive minutter efter injektion blev valgt for [11C] DPA-713 Autoradiografi ved hjælp af data opnået under dynamiske PET imaging –dvs. at i vivo dynamisk TAC’er som en guide, mens også i betragtning af den korte half-life af C-11 og tid involverede afdeling og udsætte hjernevæv efter ekstraktion. I betragtning heraf [11C] DPA-713 Autoradiografi skal udføres på en separate kohorte af mus til at tillade injektion af en højere [11C] DPA-713 dosis og 30 minutters tidspunkt for perfusion og aktiv dødshjælp under anæstesi. Udfører en lille i vivo vil PET pilotundersøgelse med en 3-4 mus inden udførelse ex vivo Autoradiografi være nyttigt for fastlæggelse af det optimale tidspunkt for Autoradiografi. En yderligere vederlag for ex vivo Autoradiografi er om at inddrive musene efter injektion eller holde dem bedøvede indtil eutanasi. At holde dem bedøvede efterligner betingelserne af scanningen og sikrer radiotracer distribution eller udskillelse kinetik ikke, ændres af recovery. Desuden, dette forhindrer yderligere stress på mus ved at undgå opsving og efterfølgende induktion. Endelig et nyttigt supplement til ex vivo -protokollen ville være at vurdere de regionale skader i hjernen skiver bruges til Autoradiografi via immunhistokemisk farvning (efter radioaktivt henfald) til at generere en høj opløsning billede af infarkt placering og volumen.
Da der er begrænsninger ved brug af en C-11 baseret tracer, kan denne protokol nemt ændres til brug med en F-18 (halveringstid på 109.77 min.) baseret TSPO sporstof, som kan være mere anvendelig til steder uden en on-site cyclotron. Derudover beskriver denne protokol brugen af en 4-mus imaging set-up. Selvom denne high throughput metode er optimal, når du bruger en C-11 tracer, kan denne protokol også ændres for dem, der benytter enkelt mus imaging senge. Omhyggelig planlægning og konsekvent træning i de teknikker, der er skitseret i denne protokol vil føre til generation af et væld af data ved hjælp af [11C] DPA-713, som let kan blive til sonde rollen som neuroinflammation i sygdommen manifestation og progression i andre gnavere modeller af neurologiske lidelser. Desuden, denne teknik kan bruges til at vurdere i vivo svar til immunmodulerende therapeutics rettet mod mikroglia/makrofager.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Buckwalter lab (især Dr. Todd Peterson) for at levere musemodel og udfører dMCAO og sham operationer. Derudover vil vi gerne takke Thomas Liguori fra Invicro til hans teknisk bistand med VivoQuant billede analyse software, Dr. Tim Doyle, Dr. Laura Pisani, Dr. Frezghi Habte fra den SCi3 lille dyr imaging facilitet på Stanford for deres rådgivning og hjælp til at udvikle denne billeddannelse protokol og radiokemi facilitet (især Dr. Jun Park) for deres hjælp med syntesen af [11C] DPA-713.
Inveon PET/CT scanner | Siemens | Version 4.2 | |
MRI scanner | Varian | 7 Telsa | |
ParaVision software | Bruker | Version 6.0.1 | MRI operating software |
VivoQuant software | InVicro | Version 2.5 | Image analysis software |
Inveon Research Workspace software | Siemens | Version 4.2 | Scanner operating software. Includes microQView, the post-processing managing software |
Dose calibrator | Capintech | CRC-15 PET | |
Typhoon phosphor imager 9410 | GE Healthcare | 8149-30-9410 | |
Butterfly catheters | SAI Infusion Technologies | BFL-24 | 27.5 G needle |
1 mL syringes | BD | ||
Insulin syringes | BD | 329461 | 0.5 mL insulin syringes with needle |
20 mL syringe | VWR | BD302831 | BD Syringe Slip Tip Graduated |
Tissue glue | Santa Cruz Animal Health | sc-361931 | 3 mL |
Heat lamp | Fluker | 27002 | 5.5" reptile heat lamp with clamp and switch |
0.9% sterile saline | Pfizer | 00409-4888-10 | 0.9% sodium chloride for injection, 10 mL |
Eye lubricant | Watson Rugby | PV926977 | Artificial Tears Lubricant Eye Ointment, 1/8 oz |
Chux absorbent sheets | ThermoFisher Scientific | 1420662 | Disposable absorbent padding |
Iris scissors | World Precision Instruments | 503708-12 | 11.5cm, Straight, 12-pack |
Surgical tape | 3M Durapore | 1538-0 | 1/2"X10 yard roll, silk, hypoallergenic |
Mouse PET bed | In house | 4 mouse PET bed | |
Lighter | Bic | UDP2WMDC | |
Isoflurane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | Isothesia, inhalation anesthetic, 250 mL |
Oxygen | Praxiar | UN1072 | Compressed gas |
Autoradiography cassette | Cole Palmer | EW-21700-34 | Aluminum, 8" x 10" |
Autoradiography film | GE Life Sciences | 28-9564-78 | Storage Phosphor Screen BAS-IP SR 2025 E Super Resolution, 20 × 25 cm, screen only |
Microtome blades | ThermoFisher Scientific | 30-508-35 | MB35 Premier Disposable, 34° cutting angle |
Microtome | Microm | HM 550 | |
Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Superfrost™ Plus Microscope Slides |
OCT liquid | VWR | 25608-930 | Formulation of water-soluble glycols and resins for cryostat sectioning at temperatures of -10°C (14°F) and below |
Freezing molds | Poly sciences | 18646A-1 | Disposable paraffin molds |
Saran wrap | Saran | 25700001300 | |
Disinfectant | Virkon S |