Positronen-Emissions-Tomographie (PET) Bildgebung der Nyrianer Protein 18 kDa (bestreiten) bietet eine nicht-invasive Möglichkeit, die dynamische Rolle der Neuroinflammation in die Entwicklung und das Fortschreiten von Gehirnerkrankungen zu visualisieren. Dieses Protokoll beschreibt bestreiten-PET und ex-Vivo Autoradiographie um Neuroinflammation in einem Mausmodell der ischämischen Schlaganfall zu erkennen.
Neuroinflammation ist zentral für die pathologischen Kaskade nach ischämischen Schlaganfall. Nicht-invasive molekularen bildgebende Verfahren haben das Potenzial, kritische Einblicke in die zeitliche Dynamik und die Rolle von bestimmten Neuroimmune Interaktionen im Takt. Insbesondere stellt die Positronen-Emissions-Tomographie (PET) Bildgebung der Nyrianer Protein 18 kDa (bestreiten), ein Marker für aktivierte Mikroglia und peripheren myeloid Abstammung Zellen Mittel zum erkennen und verfolgen Neuroinflammation in Vivo. Hier präsentieren wir eine Methode, um genau quantifizieren Neuroinflammation mit [11C]N,N-Diethyl-2-[2-(4-methoxyphenyl)-5,7-dimethylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]acetamide ([11C] DPA-713), eine viel versprechende zweite Generation bestreiten-PET Radiotracer distale mittlere zerebrale Arterie Okklusion (dMCAO) im Vergleich zum Schein betrieben Mäuse. MRI wurde durchgeführt 2 Tage Post-dMCAO Chirurgie bestätigen Schlaganfall und Infarkt Lage und Volumen zu definieren. PET/Computertomographie Computertomographie (CT) Bildgebung erfolgte 6 Tage Post-dMCAO, die Spitze Anstieg bestreiten nach Schlaganfall zu erfassen. Quantifizierung der PET-Bildern wurde durchgeführt, um die Aufnahme von [11C] bewerten DPA-713 in Gehirn und Milz von Mäusen, dMCAO und Sham, zentrale und periphere Ebenen der Entzündung zu beurteilen. In vivo [11C] DPA-713 Gehirn Aufnahme wurde mit ex-Vivo Autoradiographie bestätigt.
Der Schlaganfall ist die fünfthäufigste Todesursache und eine der Hauptursachen der Behinderung in die Vereinigten Staaten1. Ischämischen Schlaganfall stellt eine überwältigende Mehrheit dieser Fälle (~ 87 %), auftritt, wenn lokalisierte des Blutflusses zum Gehirn (z. B. durch ein Blutgerinnsel oder fetthaltige Ablagerung Störung). Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoff in die betroffenen Gebiete sind gekürzt und eine komplexe Kaskade pathologische neuronale Todesfolge innerhalb des Kerns der Schlaganfall (Hirninfarkt) zusätzlich zu den umliegenden Gebieten eingeleitet. Neuroinflammation ist eine entscheidende Komponente in den Weg zu dieser führen, mit beiden resident Gehirn Immunzellen (Mikroglia) und peripheren Immunzellen (Neutrophile, T-Zellen, B-Zellen und Monozyten/Makrophagen) zu infiltrieren soll dazu beitragen zerstörerische Kaskade2,3. Aktivierte Mikroglia und Makrophagen stehen im Mittelpunkt dieses schwere Reaktion mit Berichte über schädliche und vorteilhafte Wirkungen nach ischämischen Schlaganfall2. Daher ist es unerlässlich, den in-Vivo -Beitrag dieser Zellen nach Schlaganfall zu bewerten.
PET ist eine leistungsstarke 3-dimensionale Molekulare bildgebende Verfahren, die ermöglicht die Visualisierung der biologischen Prozesse in Vivo durch den Einsatz von bestimmten Molekülen, beschriftet mit Positronen (β +) emittierende Radionuklide wie 11C, 13N, 15O und 18F. Diese nicht-invasive Methode hat viele Vorteile gegenüber Ex-Vivo -Methoden (z. B. Immunohistochemistry) wie es den Erwerb von molekularen Informationen in Echtzeit in lebendigen intakten Subjekten ermöglicht und longitudinalen Untersuchung ermöglicht. Haustier Bildgebung bestreiten, ein Marker für aktivierte Mikroglia und peripheren myeloid Abstammung Zellen stellt ein Mittel zur Quantifizierung und angeborene immun-Zell-Reaktionen innerhalb des Körpers zu verfolgen und kann genutzt werden, um Entzündungen nach Schlaganfall und Reaktion auf therapeutische bewerten Interventionen. Bestreiten, früher bekannt als die peripheren Typ Benzodiazepin-Rezeptor ist ein 18 kDa-Protein, die geglaubt wird, um eine Rolle in Cholesterin-Transport und die Synthese von neurosteroiden4. Darüber hinaus Anhaltspunkte dafür, dass Neuroinflammation und neuronale überleben5,6, mit Berichten über erhöhte Ausdruck in vielen neurologischen Erkrankungen mit Entzündungen einschließlich Schlaganfall7bestreiten beteiligt ist, Demenz-8, der Parkinson-Krankheit9 und Multiple Sklerose10. Bestreiten befindet sich im äußeren mitochondrialen Membranen und drückt sich besonders in der Peripherie, insbesondere Steroid zugehörigen Gewebe (z. B. Drüsen) und mit Zwischenebenen in Herz, Nieren und Lunge10gesehen. Aber im gesunden Gehirn, bestreiten Niveaus sind niedrig und beschränkt sich hauptsächlich auf Glia6,11. Bei der neuronalen Verletzung, wie im Takt bestreiten Ebenen in das zentrale Nervensystem (ZNS) deutlich erhöhen. Diese beobachteten Hochregulation der bestreiten kann Bild Neuroinflammation in vivo mit Ausdruck Ebenen bietet eine genaue Anzeige der Entzündung schwere genutzt werden. Daher ist das Ziel dieser Methode genau Quantifizierung derin Vivo -Beitrags von Neuroinflammation in einem Mausmodell des ischämischen Schlaganfalls mit bestreiten-PET.
Mehreren bestreiten Tracer wurden entwickelt für die PET-Bildgebung des Neuroinflammation. Hier bestreiten-PET-Bildgebung wird beschrieben mit [11C] DPA-71312, eine viel versprechende zweite Generation bestreiten Tracer, die gezeigt hat, dass verstärkte Signal gegenüber Rauschen und unspezifischen Bindung als die historisch verwendet [11C] zu senken PK11195 13 . Als Beispiel wurde die dMCAO-Maus-Modell der Schlaganfall für diese Methode14gewählt. Dieses Modell beinhaltet zeitliche Kraniotomie und dauerhafte Unterbindung der distale mittlere zerebrale Arterie, wodurch fokale Ischämie des somatosensorischen Kortex. Dies ist vorteilhaft in der präklinischen Schlaganfall-Forschung durch die hohe Reproduzierbarkeit der ischämischen Schäden und niedrige Sterblichkeitsraten verbunden mit diesem Modell. Bis heute haben bestreiten-PET bildgebende Studien noch im dMCAO Nagetier Modell gemeldet werden. Jedoch frühere PET bildgebenden Studien mit dem mittleren zerebralen Arterie Okklusion (MCAO)-Modell, eine schwerer und Variable Schlaganfall-Modell bei Mäusen und Ratten, berichtet bestreiten Ausdruck, von Tag 3 und Peak ca. 7. Tag nach Schlaganfall15zu erhöhen, 16,17,18. Daher führten wir PET imaging 6 Tage Post-dMCAO mit erhöhten bestreiten Ausdruck zusammenfallen. [11C] DPA-713-Aufnahme im Gehirn wurde in ipsilateral (infarzierte) bewertet und kontralateralen Hemisphäre. Bestreiten-PET wurde mit strukturellen MRT ermöglicht präzise Abgrenzung der Infarkt und kontralateralen Regionen von Interesse (ROIs) kombiniert. Hier beschreiben wir eine Atlas-basierte und ein MRT-gesteuerte ROI-Ansatz [11C] DPA-713 Aufnahme berechnen. Radiotracer Aufnahme in Milz wurde auch bewertet, um periphere Ebenen der Entzündung zwischen Gruppen zu untersuchen. Diese Methode hat das Potenzial, kritische Einblicke in die raumzeitliche Dynamik und die Rolle der spezifischen Neuroimmune Interaktionen in Schlaganfall und anderen neurologischen Erkrankungen.
Die vorgestellte Protokoll beschreibt eine Methode zur Quantifizierung von Neuroinflammation in dMCAO und Sham Mäuse mit [11C] DPA-713-PET. Bestreiten-PET ist der am häufigsten untersuchten bildgebenden Biomarker zur Visualisierung und Neuroinflammation in Vivo bis heute messen. Bestreiten Ausdruck ist hochreguliert auf Gliazellen im Gehirn während einer Entzündung der nicht invasiven Erkennung und Quantifizierung von Neuroinflammation bei schönem. Darüber hinaus ist es eine höchst übersetzbar Technik, so dass es ein wertvolles Werkzeug in der klinischen und präklinischen Forschung. Dieses Protokoll und repräsentative Ergebnisse unterstreichen die Eignung mit [11C] DPA-713 PET zu erkennen und zu überwachen, schwere Veränderungen bei Schlaganfall und anderen neurologischen Störungen in Vivo.
In dieser Studie wurde die dMCAO Operation mit 3-Monate-alten C57BL/6 weiblichen Mäusen durchgeführt. Dieses Modell wurde gewählt, da es ein hoch reproduzierbare Infarkt beschränkt auf somatosensorischen Cortex, die Modellcharakter für die permanente fokale Ischämie mit geringer Variabilität im Vergleich zu anderen Modellen des Schlaganfalls (z. B. mittlere zerebrale arterielle hervorruft Okklusion (MCAO)-Filament-Methode)14. PET-Bildgebung der Schlaganfall-Modelle hat den Vorteil, die eine interne Referenz-Region im Gehirn für jedes Tier mit ROIs innerhalb der kontralateralen Hemisphäre enthalten. Da gibt es einige Entzündungen, dass Ergebnisse aus der Chirurgie allein, es wichtig ist, gehören Mäuse, die Farce in das Design der Studie, wobei operiert Kraniotomie und Manipulation der Hirnhaut ohne Arterie Okklusion durchgeführt wurde. Kraniotomie allein führt zu Störungen an der zugrunde liegenden neuronalen Gewebe und Krankheitserreger zu Immunreaktionen unabhängig vom Takt20. Einige Entzündungen nach Schein Chirurgie auszugehen ist und parallel zur dMCAO des Signals durch Operation allein auszuschließen bewertet werden sollen. Um zu vermeiden, einschließlich Entzündung infolge der Operation ohne Schlaganfall in dMCAO Kohortenanalyse, muss MR-Tomographie durchgeführt werden, um erfolgreiche Schlaganfall Chirurgie und Infarkt Entwicklung bestätigen. MRI bietet auch einen strukturellen Bezugsrahmen, der genaue zeichnen den Infarkt und kontralateralen ROIs unerlässlich ist. Darüber hinaus genaue Bildverarbeitung einschließlich Bild-Registrierung und ROI Definition sind erforderlich, um zuverlässige Quantifizierung zu gewährleisten.
Zusätzliche Einschränkungen müssen im Auge behalten werden bei der Arbeit mit c-11 mit der Bezeichnung Radiotracer für PET und Autoradiographie Studien. Es ist zwingend notwendig, um die kurze Halbwertszeit (20,33 min) von c-11, mit seiner Verwendung in der Regel beschränkt auf Forschungsinstitute mit vor-Ort-Zyklotron Zugang zu betrachten. Entsprechenden Radioaktivität Transportroute, Dosis Verwaltung und Akquisition Zeitpunkten müssen vorab mit einem vorbereiteten ausführlichen Plan des Workflows des Experiments ermittelt werden, so dass das Team schnell und effizient arbeiten kann. Die Gestaltung und Einrichtung dieser Studie worden angepasst Bildgebung 4 Mäuse gleichzeitig, die Datenausgabe erhältlich zu erhöhen, wenn ein c-11-Tracer mit umrissen. Wenn möglich, es empfiehlt sich, alle Mäuse kanülierte haben und in der Mitte ihrer CT-Scan mit der Zeit kommt die c-11-Tracer in der bildgebenden Einrichtung um minimale Radiotracer Verfall vor der Injektion zu gewährleisten. Dieses schrittweise Protokoll erfolgt auch am besten durch ein Team mit mindestens 3 Forscher, um schnelle Kanülierung, Dosis-Messung, Tracer Einspritzung, PET-Scanning und Gehirn-Schnitt vor erheblichen radioaktiven Zerfall zu ermöglichen. Es erfordert zwei Menschen, die Einleitung der PET-Scan und Injektion von alle 4 Mäuse gleichzeitig durchzuführen. Der Grund für den Beginn der PET-Übernahme kurz vor Injektion besteht darin, dass die Pharmakokinetik und die Dynamik der tracerverteilung im Blut und Regionen von Interesse genau und vollständig erfasst werden. Viele Schritte erfordern energische Ausbildung und Praxis zum reibungslosen Ablauf des Experiments zu gewährleisten. Dieses Protokoll ist insbesondere abhängig von erfolgreichen Schweif Vene Kanülierung der C57BL/6 Mäusen, die durch dunkle Haare auf ihren Schwänzen schwierig sein kann, und möglicherweise schwieriger geworden, nach Schlaganfall aufgetreten ist oder wenn die gleichen Mäuse zu mehreren Zeitpunkten imaging .
Ein weiterer Aspekt für PET-Bildgebung beinhaltet sorgfältige Erfassung der Radiotracer Dosis und Restmüll Aktivität Messungen, einschließlich den genauen Zeitpunkt der Messung. Dies ist wichtig für die genaue Verfall Korrektur der injizierten Dosis zum Zeitpunkt des Scans und wird verwendet, um eine genaue Messung der Tracer-Aufnahme (z. B. % ID/g) für jede ROI zu erzielen. Es ist zwingend notwendig, um die genaue Menge an Radioaktivität kennen, die zum Zeitpunkt des Scannens um genaue Bildanalyse zu gewährleisten in jeder Maus vorhanden war. Daher ist es ratsam, die Uhren auf dem Scanner Computer und dosiseichgerät um Fehler zu vermeiden, bei Verwendung von kurzlebigen Isotopen wie c-11 zu synchronisieren.
Genaue Quantifizierung der PET-Bild kann auch durch die Genauigkeit des Scanners und Set-up beschränkt werden. Daher um genaue Quantifizierung der PET/CT Bilder zu gewährleisten, ist es wichtig, die Durchführung von Qualitätskontrollen für die CT und PET-Komponenten des Scanners. CT Qualitätskontrollen gehören x-ray Source Klimaanlage, hell/dunkel und Center off Set Kalibrierungen. Diese Kalibrierungen Messen und für Systemgeräusche und muss korrekt durchgeführt vor dem Erwerb durch den Scannerhersteller empfohlen. Kalibrierungen sollte auch für die PET-Scanner durchgeführt werden. Dies umfasst in der Regel Scannen einen “standard / PET Phantom” Scan, mit einer bekannten Konzentration von Radioaktivität. Wenn Sie den Standard vorbereiten, empfiehlt es sich, verwenden die gleichen Radioisotopen verwendet in der Studie, eine vergleichbare, die Dosis an, die zu einem einzigen Mausklick in einem Volumen ähnlich wie der Körper eine Maus, und der gleichen Parameter als tierische Bildgebung verabreicht. Eine 20 mL Spritze mit Wasser verdünnt Radiotracer gefüllt ist mit die daraus resultierenden PET imaging Ergebnisse zur Berechnung eines Korrekturfaktors basierend auf die tatsächliche Dosis gemessen an der Kalibrierung-Detektor für den Standard in diesem Protokoll verwendet. Das Korrektur-Verhältnis kann auf die Bilddaten erwarb das Experiment dazu genaue Quantifizierung der Tracer-Aufnahme in Regionen von Interesse in PET-Bildern angewendet werden. Diese Konten für die Positronen-Palette des Radionuklids zusätzlich unter Berücksichtigung jeder Hintergrundaktivität auf den Tag des Scannens. Als die dosiseichgerät fester Bestandteil der Generation dieser Korrekturfaktor ist, ist es unerlässlich, dass dieses Gerät auch regelmäßig nach den Herstellerrichtlinien kalibriert ist.
Bei der Durchführung von ex-Vivo Autoradiographie ist es wichtig, wählen Sie einen optimalen Zeitpunkt für Euthanasie nach Injektion, hohe Signal-zu-Hintergrund in Region(en) von Interesse. Dreißig Minuten nach der Injektion gewählt [11C] DPA-713 Autoradiographie mit Daten, die während der dynamischen PET-Bildgebung –d. h. die in Vivo dynamische TAC als Leitfaden, auch unter Berücksichtigung der kurzen Halbwertszeit von c-11 und der Zeit beteiligt, Abschnitt und setzen das Hirngewebe nach der Extraktion. Vor diesem Hintergrund [11C] DPA-713 Autoradiographie muss durchgeführt werden, auf eine separate Kohorte von Mäusen erlauben für die Injektion von einer höheren [11C] DPA-713-Dosis und eine 30-minütige Zeit-Punkt für Durchblutung und Euthanasie in Narkose. Durchführung einer kleinen in Vivo wird PET Pilotstudie mit einer 3-4-Mäuse vor der Durchführung von ex-Vivo Autoradiographie zur Bestimmung des optimalen Zeitpunkt für Autoradiographie hilfreich sein. Eine weitere Überlegung für ex-Vivo Autoradiographie ist ob die Mäuse nach der Injektion zu erholen oder halten sie betäubt bis Euthanasie. Halten sie betäubt imitiert die Bedingungen des Scans und sorgt für die Radiotracer Verteilung oder Ausscheidung Kinetik sind durch Wiederherstellung nicht verändert. Darüber hinaus verhindert dies zusätzlichen Druck auf die Mäuse durch die Vermeidung von Erholung und nachfolgende Induktion. Schließlich wäre eine sinnvolle Ergänzung des ex-Vivo -Protokolls in den Gehirnscheiben für Autoradiographie über immunhistochemische Färbung (nach radioaktiven Zerfall) um ein hochauflösendes Bild der Infarkt Lage zu erzeugen verwendet regionale Schadensbewertung und Volumen.
Gibt es Einschränkungen bei der Verwendung eines Tracers c 11 basiert, kann dieses Protokoll leicht für die Verwendung mit einer f-18 (Halbwertszeit von 109,77 min) basierte bestreiten Tracer für Standorte ohne eine vor-Ort-Zyklotron möglicherweise geändert werden. Dieses Protokoll beschreibt darüber hinaus die Verwendung einer 4-Maus-imaging-Aufstellung. Obwohl diese Hochdurchsatz-Methode optimal ist, wenn eine c-11-Tracer verwenden, kann dieses Protokoll auch für diejenigen mit Mausklick imaging Betten geändert werden. Sorgfältige Planung und konsequente Erziehung in die in diesem Protokoll beschriebenen Techniken führt zu der Generation von einer Fülle von Daten mit [11C] DPA-713, die leicht angewendet werden können, die Rolle des Neuroinflammation in der Manifestation der Krankheit zu untersuchen und Progression in andere Nager-Modelle von neurologischen Erkrankungen. Darüber hinaus könnte diese Technik verwendet werden, die in Vivo -Reaktion auf immunmodulatorische Therapie richtet sich an Mikroglia/Makrophagen zu beurteilen.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren möchte Buckwalter Labor (vor allem Dr. Todd Peterson) für die Bereitstellung der Maus-Modell und die dMCAO und Schein-Operationen durchführen. Darüber hinaus möchten wir danken Thomas Liguori aus Invicro für technische Unterstützung mit VivoQuant Bildanalyse-Software, Dr. Tim Doyle, Dr. Laura Pisani, Dr. Frezghi Habte aus das SCi3 Tier imaging-Anlage an der Stanford University für ihre Ratschläge und Unterstützung bei der Entwicklung dieses bildgebenden Protokoll und die Radiochemie-Anlage (vor allem Dr. Jun Park) für ihre Hilfe mit der Synthese von [11C] DPA-713.
Inveon PET/CT scanner | Siemens | Version 4.2 | |
MRI scanner | Varian | 7 Telsa | |
ParaVision software | Bruker | Version 6.0.1 | MRI operating software |
VivoQuant software | InVicro | Version 2.5 | Image analysis software |
Inveon Research Workspace software | Siemens | Version 4.2 | Scanner operating software. Includes microQView, the post-processing managing software |
Dose calibrator | Capintech | CRC-15 PET | |
Typhoon phosphor imager 9410 | GE Healthcare | 8149-30-9410 | |
Butterfly catheters | SAI Infusion Technologies | BFL-24 | 27.5 G needle |
1 mL syringes | BD | ||
Insulin syringes | BD | 329461 | 0.5 mL insulin syringes with needle |
20 mL syringe | VWR | BD302831 | BD Syringe Slip Tip Graduated |
Tissue glue | Santa Cruz Animal Health | sc-361931 | 3 mL |
Heat lamp | Fluker | 27002 | 5.5" reptile heat lamp with clamp and switch |
0.9% sterile saline | Pfizer | 00409-4888-10 | 0.9% sodium chloride for injection, 10 mL |
Eye lubricant | Watson Rugby | PV926977 | Artificial Tears Lubricant Eye Ointment, 1/8 oz |
Chux absorbent sheets | ThermoFisher Scientific | 1420662 | Disposable absorbent padding |
Iris scissors | World Precision Instruments | 503708-12 | 11.5cm, Straight, 12-pack |
Surgical tape | 3M Durapore | 1538-0 | 1/2"X10 yard roll, silk, hypoallergenic |
Mouse PET bed | In house | 4 mouse PET bed | |
Lighter | Bic | UDP2WMDC | |
Isoflurane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | Isothesia, inhalation anesthetic, 250 mL |
Oxygen | Praxiar | UN1072 | Compressed gas |
Autoradiography cassette | Cole Palmer | EW-21700-34 | Aluminum, 8" x 10" |
Autoradiography film | GE Life Sciences | 28-9564-78 | Storage Phosphor Screen BAS-IP SR 2025 E Super Resolution, 20 × 25 cm, screen only |
Microtome blades | ThermoFisher Scientific | 30-508-35 | MB35 Premier Disposable, 34° cutting angle |
Microtome | Microm | HM 550 | |
Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Superfrost™ Plus Microscope Slides |
OCT liquid | VWR | 25608-930 | Formulation of water-soluble glycols and resins for cryostat sectioning at temperatures of -10°C (14°F) and below |
Freezing molds | Poly sciences | 18646A-1 | Disposable paraffin molds |
Saran wrap | Saran | 25700001300 | |
Disinfectant | Virkon S |