טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET) הדמיה של kDa חלבון 18 translocator (TSPO) מספק אמצעים לא פולשנית להמחיש את התפקיד דינמי של neuroinflammation בהתפתחות והתקדמות של מחלות המוח. פרוטוקול זה מתאר autoradiography TSPO-PET ו- ex-vivo כדי לזהות neuroinflammation במודל של עכברים של שבץ איסכמי.
Neuroinflammation הוא מרכזי המפל פתולוגיים בעקבות שבץ איסכמי. פולשני שיטות הדמיה מולקולרית יש פוטנציאל לספק תובנות קריטי הדינמיקה טמפורלית ואת התפקיד של אינטראקציות מסוימות neuroimmune המוחי. באופן ספציפי, טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET) הדמיה של translocator חלבון 18 kDa (TSPO), סמן של מיקרוגלייה מופעל ותאים מיאלואידית שושלת היוחסין היקפיים, מספק אמצעים כדי לזהות ולעקוב אחר neuroinflammation vivo בתוך. כאן, אנו מציגים שיטה לכמת במדויק את neuroinflammation באמצעות [11C]N,N-Diethyl-2-[2-(4-methoxyphenyl)-5,7-dimethylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]acetamide ([11ג] DPA-713), מבטיח דור TSPO-PET . radiotracer, ב סגר דיסטלי עורק המוח התיכון (dMCAO) לעומת עכברים המופעלים באמצעות העמדת פנים. MRI היה יומיים בביצוע ניתוח פוסט-dMCAO לאשר שבץ ולהגדיר את המיקום לאוטם ואת אמצעי האחסון. דימות PET/Computed טומוגרפיה ממוחשבת (CT) בוצע 6 ימים פוסט-dMCAO ללכוד את העלייה שיא ברמות TSPO בעקבות שבץ. כימות של חיית המחמד תמונות נערך על מנת להעריך את ספיגת [11ג] DPA-713 במוח ובחוט הטחול של עכברים dMCAO, דמה כדי להעריך את רמות מרכזי והיקפי של דלקת. אין ויוו [11ג] ספיגת DPA-713 המוח אושר באמצעות שמחוץ autoradiography.
שבץ מוחי הוא הגורם המוביל החמישי של המוות, הגורם העיקרי לנכות ארצות הברית1. שבץ איסכמי מייצג את הרוב המכריע של המקרים (~ 87%), המתרחשים כאשר יש לשפות אחרות הפרעה בזרימת הדם למוח (למשל, על ידי קריש דם או פיקדון שומניים). לאחר מכן מופחתים אספקת חמצן, מזין האזורים הנגועים, מפל פיפטות מורכבים מאותחלת והתוצאה מוות עצביים בתוך תוכו שבץ מוחי (אירוע) בנוסף האזורים הסמוכים. Neuroinflammation היא רכיב קריטי השביל המוביל אל הנזק הזה, עם שני תאים חיסוניים המוח תושב (מיקרוגלייה) וחשבתי שחדר תאים חיסוניים היקפיים (נויטרופילים, תאי T, תאים B ו ומונוציטים/macrophages) לתרום זה אשד הרסני2,3. מיקרוגלייה מופעל ו מקרופאגים הן גורם מרכזי זה תגובה neuroinflammatory, עם דיווחים על תופעות מזיקות וגם מועיל בעקבות שבץ איסכמי2. לכן, זה הכרחי כדי להעריך את התרומה ויוו של תאים אלה בעקבות שבץ.
חיית המחמד הוא עוצמה תלת-ממדי מולקולרית הדמיה טכניקה המאפשרת ויזואליזציה של הביולוגיה תהליכים ויוו באמצעות מולקולות ספציפיות המסומנת פוזיטרון (β +) פולטות radionuclides 11ג, 13N, 15O ו- 18פ שיטה לא פולשנית זו יש יתרונות רבים על פני שיטות vivo לשעבר (למשל, אימונוהיסטוכימיה) הוא מאפשר רכישת מידע מולקולרי בזמן אמת, המחיה שלם נושאים, ומאפשר לחקירה האורך. הדמיית לחיות מחמד של TSPO, סמן של מיקרוגלייה מופעל ותאים מיאלואידית שושלת היוחסין היקפיים, מספק אמצעים כדי לכמת ולנהל מעקב אחר התגובות תא החיסון מולדים בתוך הגוף, יכול להיות מנוצל כדי להעריך דלקת לאחר שבץ מוחי, תגובה טיפולית התערבויות. TSPO, שנקראה הקולטן ההיקפית מסוג בנזודיאזפינים, הוא חלבון 18 kDa זה הוא האמין לשחק תפקיד תעבורה כולסטרול הסינתזה של neurosteroids4. יתר על כן, הראיות עולה כי TSPO מעורב neuroinflammation ו עצביים הישרדות5,6, עם דיווחים על ביטוי מוגבר בהפרעות נוירולוגיות רבות מעורבים דלקת כולל קו7, דמנציה8, מחלת פרקינסון9 וטרשת נפוצה10. TSPO ממוקם על ממברנות מיטוכונדריאלי החיצוני, מתבטאת במיוחד בפריפריה, בעיקר ברקמות סטרואידים המשויך (למשל, בלוטות) ועם רמות ביניים ראיתי את הלב, הכליות והריאות10. עם זאת במוח בריא, רמות TSPO הן נמוך, מוגבל בעיקר עכשיו, דונלד6,11. על פגיעה עצביים, כמו זו נצפתה שבץ, רמות TSPO במערכת העצבים המרכזית (CNS) להגביר באופן משמעותי. זו נצפתה קולטנים upregulation של TSPO אפשר לנצל את התמונה neuroinflammation ויוו, עם רמות הביטוי מתן אינדיקטור מדוייק של חומרת דלקת לפיכך, מטרת שיטה זו היא לכמת במדויק את התרומהויוו של neuroinflammation במודל של עכברים של שבץ איסכמי באמצעות TSPO-פט
המשדרים TSPO מרובים פותחו עבור חיית המחמד הדמיה של neuroinflammation. . הנה, TSPO-PET הדמיה מתואר באמצעות [11ג] DPA-71312, מבטיח דור TSPO מעקב, אשר הראו משופרת אות רעש, תנמיך לא ספציפית מחייב מאשר בשימוש יותר מבחינה היסטורית [11ג] PK11195 13 . לדוגמה, נבחר המודל העכבר dMCAO של שבץ זו השיטה14. מודל זה כרוך זמני ואז קבע מצדו של דיסטלי עורק המוח התיכון, והתוצאה היא מוקד איסכמיה של קליפת המגע. זהו יתרון במחקר קליניים שבץ בשל הפארמצבטית גבוהה של נזק איסכמי ושיעורי תמותה נמוך הקשורים עם מודל זה. עד כה, מחקרי הדמיה TSPO-PET טרם דיווח במודל מכרסמים dMCAO. עם זאת, חיית המחמד הדמיה מחקרים קודמים באמצעות מודל סגר (MCAO) בעורק האמצעי, מודל שבץ חמור יותר ומשתנה, עכברים, חולדות, דיווחו TSPO ביטוי להגדיל יום 3, שיא סביב יום 7 קו שלאחר15, 16,17,18. לפיכך, אנו לבצע PET הדמיה 6 ימים פוסט-dMCAO יעלה בקנה אחד עם הביטוי TSPO גבוהות. [11ג] ספיגת DPA-713 במוח נאמד בחולשת (infarcted), contralateral ההמיספרות. TSPO-PET היה בשילוב עם MRI מבניים, המאפשר תיחום מדויק של לאוטם ואזורים contralateral עניין (ROIs). כאן נתאר הן מבוססת על אטלס והן בגישה מונחית MRI רועי לחישוב ספיגת DPA-713 [11ג]. ספיגת radiotracer ב הטחול הוערכה גם לחקור את רמות היקפיים של דלקת בין קבוצות. בשיטה זו יש פוטנציאל לספק תובנות קריטי הדינמיקה ייתכן ואת התפקיד של האינטראקציות ספציפי neuroimmune שבץ ומחלות נוירולוגיות אחרות.
פרוטוקול הציג מתאר שיטה כימות של neuroinflammation בעכברים dMCAO ואת דמה באמצעות [11ג] DPA-713-פט TSPO-PET הוא סמן ההדמיה ובדוקים נרחב ביותר בשביל להמחיש ומדידת neuroinflammation ויוו לתאריך. ביטוי TSPO הוא upregulated על עכשיו, דונלד במוח בעת דלקת יאפשר את זיהוי פולשני ו כימות של neuroinflammation. יתר על כן, זאת שיטה מאוד לתרגום, שהופך אותו כלי חשוב במחקר הקליני והן קליניים. פרוטוקול זה ותוצאות נציג לסמן את התאמת השימוש [11ג] DPA-713 מחמד כדי לזהות ולעקוב אחר שינויים neuroinflammatory קו וחוסר אחרים הפרעות נוירולוגיות ויוו.
במחקר זה, dMCAO הניתוח בוצע שימוש בעכברים נקבה בת 3 חודשים C57BL/6. מודל זה נבחר כפי זה מעורר לאוטם לשחזור מאוד מוגבלת קליפת המגע, מתן מודל של איסכמיה מוקד קבוע עם השתנות נמוך לעומת דגמים אחרים של שבץ (למשל, האמצעי מוחית עורקית סגר (MCAO) שיטה פילמנט)14. הדמיה לחיות מחמד של קו הדגמים יש את היתרון של המכיל אזור להפניה פנימית במוח עבור כל חיה באמצעות ROIs בתוך האונה contralateral. מאז יהיו קצת דלקת כי תוצאות הניתוח לבד, חשוב לכלול עכברים שעברו ניתוח דמה עיצוב המחקר, לפיה גולגולת ובוצע מניפולציה של קרומי המוח ללא חסימה בעורק. גולגולת לבד יכול לגרום להפרעה שבבסיס הרקמות עצביים, הקדמה של פתוגנים שמוביל תגובות חיסוניות עצמאית של קו20. קצת דלקת לאחר ניתוח דמה ולכן צפוי, וצריך להעריך במקביל dMCAO כדי לא לכלול את האפשרות של האות עקב ניתוח לבד. כדי להימנע כולל דלקת כתוצאה מהניתוח ללא קו בניתוח עוקבה dMCAO, מר הדמיה להתבצע כדי לאשר ניתוח מוצלח שבץ ופיתוח לאוטם. MRI מספק גם מסגרת התייחסות מבניים, אשר חיוני כדי לשרטט במדויק את לאוטם ואת contralateral ROIs. בנוסף, עיבוד תמונה מדויקת כולל תמונה הרישום והגדרת רועי נחוצים להבטיח כימות אמין.
מגבלות נוספות חייב להישמר בראש בעת עבודה עם C-11 הנקרא radiotracers ללימודי PET ו- autoradiography. זה הכרחי כדי לשקול מחצית החיים הקצר (20.33 דקות) של C-11, עם השימוש שלה בדרך כלל מוגבלת מרצים עם גישה ציקלוטרון באתר. נתיב התחבורה רדיואקטיביות המתאים, ניהול מינון ונקודות רכישת זמן-צריכה להיקבע מראש עם תוכנית מפורטת מוכנה מראש של זרימת העבודה של הניסוי כך הצוות יכול לעבוד במהירות וביעילות. העיצוב ואת הסידור של מחקר זה יש כבר המתוארים לאכלוס הדמיה של עכברים 4 בו-זמנית, כדי להגדיל את פלט נתונים השגה כאשר באמצעות מכשיר מעקב C-11. במידת האפשר, רצוי לאכול עכברים כל לצינוריות ומגיעה באמצע שלהם בדיקת ct בזמן רכיב המעקב של C-11 במתקן הדמיה כדי להבטיח ריקבון radiotracer מינימלי לפני הזרקת. פרוטוקול שלב אחר שלב זה מתבצע גם בצורה הטובה ביותר על ידי צוות המכיל לפחות 3 חוקרים כדי לאפשר תעלות מהירה, מינון מדידה, הזרקת מעקב, חיית המחמד סריקה של המוח חלוקתה לפני דעיכה רדיואקטיבית משמעותית. זה דורש שני אנשים לנהל את החניכה של הסריקה חיית המחמד, הזרקה של עכברים 4 כל בו זמנית. הסיבה לתחילת הרכישה מחמד רק לפני הזרקת נועד להבטיח שפרמקוקינטיקה ואת הדינמיקה של מעקב להפצה בדם ואזורים עניין במדויק, לגמרי נלכדים. שלבים רבים עשויים לדרוש אימונים מפרכים ותרגול כדי להבטיח את ניהולה של הניסוי. בפרט, פרוטוקול זה תלויה תעלות וריד הזנב מוצלחת של עכברים C57BL/6, אשר יכול להיות קשה, בגלל שיער כהה על הזנבות שלהם, והוא יכול להיות מאתגר יותר לאחר שבץ מוחי או אם בהדמיית העכברים באותו זמן מרובים-נקודות .
שיקול נוסף עבור הדמיה PET כולל הקלטה זהיר של radiotracer במינון של ממסר פעילות מידות, כולל את הזמן המדויק של המדידה. זה חיוני עבור תיקון מדויק דעיכה של המינון מוזרק בזמן הסריקה והוא משמש כדי להשיג של מדידה מדויקת של מעקב ספיגת (קרי, % מזהה/g) עבור כל רואי. זה הכרחי לדעת את הכמות המדויקת של רדיואקטיביות שהיו נוכחים בכל עכבר בזמנו של סריקה כדי להבטיח ניתוח תמונות מדויקות. לכן, מומלץ כדי לסנכרן את השעונים על המחשב סורק, מיגון כדי להימנע משגיאה בעת שימוש איזוטופים קצרת ימים כגון C-11.
כימות מדויק של התמונה חיית המחמד יכול גם להיות מוגבל על ידי למידת הדיוק של הגדרת והסורק. לכן כדי להבטיח כימות מדויק של PET/CT תמונות, חשוב לבצע בדיקות בקרת איכות עבור רכיבים CT וגם חיית המחמד של הסורק. בדיקות בקרת איכות CT כוללות מיזוג מקור רנטגן, כהה/אור ומרכז את הכיול קבע. ולידציות אלה וכולן נכונות עבור מערכת רעש וחייבים להיות שבוצעו לפני רכישת כמומלץ על ידי יצרן הסורק. ולידציות צריכה להתבצע גם עבור הסורק את חיית המחמד. פעולה זו בדרך כלל כרוכה סריקה סריקה “פאנטום רגיל / לחיות מחמד”, המכילה ריכוז ידוע של רדיואקטיביות. בעת הכנת התקן, עדיף להשתמש באותו והרדיוזוטופ במחקר, מנה דומה לזה מנוהל על עכבר אחת באמצעי אחסון דומה לגוף של עכבר, ורכישת אותו פרמטרים כמו הדמיה בעלי חיים. מזרק 20 מ”ל מלא radiotracer מדולל במים משמש על התקן של פרוטוקול זה, עם חיית המחמד עוקבות הדמיה התוצאות המשמשת לחישוב מקדם תיקון בהתבסס על המינון בפועל נמדדת הגלאי כיול. היחס תיקון ניתן ליישם את הנתונים הדמיה שרכש את הניסוי כדי להבטיח כימות מדויק של מעקב ספיגת אזורים מעניינים בתמונות חיית המחמד. זה חשבונות עבור טווח פוזיטרון רדיונוקלידים בחינת בכל פעילות רקע נוכח ביום של סריקה. כמו מיגון הוא חלק בלתי נפרד של הדור של פקטור התיקון הזה, זה הכרחי כי הציוד הזה הוא גם מכוילים באופן קבוע על פי הנחיות היצרן.
כאשר עורכים שמחוץ autoradiography חשוב לבחור נקודת הזמן האופטימלי עבור המתת חסד לאחר ההזרקה, כדי להבטיח גבוהה אות-על-רקע region(s) של עניין. שלושים דקות לאחר ההזרקה נבחרתי autoradiography DPA-713 [11ג] שימוש בנתונים שנרכש במהלך דינמי חיית המחמד הדמיה –קרי, ה- ויוו טק דינמי כמדריך, תוך כדי לקיחה בחשבון גם זמן מחצית החיים הקצר של C-11, הפעם מעורב סעיף ולחשוף את רקמת המוח לאחר החילוץ. בהתחשב בכך, autoradiography DPA-713 [11ג] חייב להתבצע על קבוצה נפרדת של עכברים כדי לאפשר הזרקת מינון גבוה יותר DPA-713 [11ג] ו- 30 דקות לנקודת הזמן עבור זלוף, המתת חסד תחת הרדמה. ביצוע יישום קטן ויוו חיית המחמד מחקר פיילוט עם עכברים 3-4 לפני ביצוע שמחוץ autoradiography תהיה שימושית לקביעת נקודת הזמן האופטימלי עבור autoradiography. התחשבות שמחוץ autoradiography נוסף הוא לשחזר את העכברים לאחר ההזרקה או לשמור אותם מרדימים עד המתת חסד. לשמור אותם מרדימים מחקה את התנאים של הסריקה ומבטיחה קינטיקה הפצה או הפרשה radiotracer לא ישונה על ידי שחזור. יתר על כן, הדבר מונע סטרס נוספים על העכברים על ידי הימנעות שחזור אינדוקציה עוקבות. לבסוף, תוספת שימושית בפרוטוקול שמחוץ יהיה להעריך את הנזק האזורי פרוסות המוח משמש autoradiography ויה immunohistochemical מכתים (לאחר דעיכה רדיואקטיבית) כדי ליצור תמונה ברזולוציה גבוהה של מיקום לאוטם ו נפח.
שכן, ישנם מגבלות עם השימוש של מכשיר מעקב C-11 מבוסס ניתן לשנות פרוטוקול זה בקלות עבור מעקב TSPO לשימוש עם F-18 (half-life של מין 109.77) מבוסס, אשר עשוי להיות יותר הרלוונטיים מיקומים ללא ציקלוטרון באתר. בנוסף, פרוטוקול זה מתאר את השימוש מלכודת הדמיה 4-עכבר. אמנם שיטה זו תפוקה גבוהה אופטימלית כאשר באמצעות מכשיר מעקב C-11, פרוטוקול זה ניתן לשינוי עבור אלה באמצעות עכבר אחת הדמיה מיטות. תכנון קפדני והכשרה עקבי הטכניקות המתוארות ב פרוטוקול זה יוביל הדור של שפע של נתונים באמצעות [11ג] DPA-713, אשר יכול להיות מיושם בקלות לחקור את התפקיד של neuroinflammation המחלה כביטוי ו התקדמות במודלים מכרסמים אחרים של הפרעות נוירולוגיות. יתר על כן, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי להעריך את התגובה ויוו immunomodulatory הרפוי מכוון מיקרוגלייה/מקרופאגים.
The authors have nothing to disclose.
המחברים רוצה להודות המעבדה Buckwalter (במיוחד ד ר טוד. פיטרסון) עבור מתן המודל העכבר, ביצוע הניתוחים dMCAO, העמדת פנים. בנוסף, ברצוננו תודה תומס Liguori מן Invicro לסיוע טכני שלו עם VivoQuant התמונה ניתוח תוכנה, ד ר טים דויל, ד ר לורה פיזאני, ד ר Frezghi הבטה מהחיה קטן SCi3 הדמיה מתקן באוניברסיטת סטנפורד לעצה שלהם, סיוע בפיתוח פרוטוקול זה הדמיה, והמוסד Radiochemistry (במיוחד ד ר ג’ון פארק) על עזרתם עם הסינתזה של [11ג] DPA-713.
Inveon PET/CT scanner | Siemens | Version 4.2 | |
MRI scanner | Varian | 7 Telsa | |
ParaVision software | Bruker | Version 6.0.1 | MRI operating software |
VivoQuant software | InVicro | Version 2.5 | Image analysis software |
Inveon Research Workspace software | Siemens | Version 4.2 | Scanner operating software. Includes microQView, the post-processing managing software |
Dose calibrator | Capintech | CRC-15 PET | |
Typhoon phosphor imager 9410 | GE Healthcare | 8149-30-9410 | |
Butterfly catheters | SAI Infusion Technologies | BFL-24 | 27.5 G needle |
1 mL syringes | BD | ||
Insulin syringes | BD | 329461 | 0.5 mL insulin syringes with needle |
20 mL syringe | VWR | BD302831 | BD Syringe Slip Tip Graduated |
Tissue glue | Santa Cruz Animal Health | sc-361931 | 3 mL |
Heat lamp | Fluker | 27002 | 5.5" reptile heat lamp with clamp and switch |
0.9% sterile saline | Pfizer | 00409-4888-10 | 0.9% sodium chloride for injection, 10 mL |
Eye lubricant | Watson Rugby | PV926977 | Artificial Tears Lubricant Eye Ointment, 1/8 oz |
Chux absorbent sheets | ThermoFisher Scientific | 1420662 | Disposable absorbent padding |
Iris scissors | World Precision Instruments | 503708-12 | 11.5cm, Straight, 12-pack |
Surgical tape | 3M Durapore | 1538-0 | 1/2"X10 yard roll, silk, hypoallergenic |
Mouse PET bed | In house | 4 mouse PET bed | |
Lighter | Bic | UDP2WMDC | |
Isoflurane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | Isothesia, inhalation anesthetic, 250 mL |
Oxygen | Praxiar | UN1072 | Compressed gas |
Autoradiography cassette | Cole Palmer | EW-21700-34 | Aluminum, 8" x 10" |
Autoradiography film | GE Life Sciences | 28-9564-78 | Storage Phosphor Screen BAS-IP SR 2025 E Super Resolution, 20 × 25 cm, screen only |
Microtome blades | ThermoFisher Scientific | 30-508-35 | MB35 Premier Disposable, 34° cutting angle |
Microtome | Microm | HM 550 | |
Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Superfrost™ Plus Microscope Slides |
OCT liquid | VWR | 25608-930 | Formulation of water-soluble glycols and resins for cryostat sectioning at temperatures of -10°C (14°F) and below |
Freezing molds | Poly sciences | 18646A-1 | Disposable paraffin molds |
Saran wrap | Saran | 25700001300 | |
Disinfectant | Virkon S |