Positron emissions tomografi (PET) avbildning av translocator protein 18 kDa (TSPO) ger en icke-invasiv sätt att visualisera dynamisk roll neuroinflammation i utveckling och progression av hjärnsjukdomar. Det här protokollet beskriver TSPO-PET och ex vivo autoradiografi för att upptäcka neuroinflammation i en musmodell av ischemisk stroke.
Neuroinflammation är central för den patologiska kaskad efter ischemisk stroke. Icke-invasiv molekylär avbildningsmetoder har potential att ge viktiga insikter i den temporala dynamiken och rollen av vissa Neuroimmuna interaktioner i stroke. Specifikt, ger positronemissionstomografi (PET) avbildning av translocator protein 18 kDa (TSPO), en markör för aktiverade mikroglia och perifera myeloisk-lineage celler, en möjlighet att upptäcka och spåra neuroinflammation i vivo. Här presenterar vi en metod för att exakt kvantifiera neuroinflammation använder [11C]N,N-Diethyl-2-[2-(4-methoxyphenyl)-5,7-dimethylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]acetamide ([11C] DPA-713), en lovande andra generation TSPO-PET radiotracer, i distala mellersta cerebral artärocklusion (dMCAO) jämfört med sham manövrerade möss. MRI var utfört 2 dagar post-dMCAO operation för att bekräfta stroke och definiera infarct läge och volym. PET/Computed Tomography (CT) imaging genomfördes 6 dagar post-dMCAO att fånga peak ökningen av TSPO nivåer efter stroke. Kvantitering av PET-bilder genomfördes för att utvärdera upptaget av [11C] DPA-713 i hjärnan och mjälte från dMCAO och sham möss att bedöma centrala och perifera nivåer av inflammation. In vivo [11C] DPA-713 hjärnan upptag bekräftades med ex vivo autoradiografi.
Stroke är den femte vanligaste dödsorsaken och en viktig orsak till handikapp i Sverige1. Ischemisk stroke representerar en överväldigande majoritet av dessa fall (~ 87%), som uppstår när det finns lokaliserade störningar i blodflödet till hjärnan (t.ex. av en blodpropp eller feta insättning). Syre och näringsämnen förnödenheter till de drabbade områdena reduceras därefter och en komplex patologisk kaskad initieras som leder till neuronala dödsfall inom stroke kärnan (infarkt) utöver de omgivande områdena. Neuroinflammation är en avgörande komponent i den väg som leder till denna skada, med både bosatt hjärnan immunceller (mikroglia) och infiltrera perifera immunceller (neutrofiler, T-celler, B-celler och monocyter/makrofager) trodde att bidra till detta destruktiva cascade2,3. Aktiverade mikroglia och makrofager är centrala i detta neuroinflammatoriska svar, med rapporter om både skadliga och nyttiga effekter efter ischemisk stroke2. Därför är det absolut nödvändigt att bedöma i vivo bidrag dessa celler efter stroke.
PET är en kraftfull 3-dimensionell molekylär imaging teknik som möjliggör visualisering av biologiska processer i vivo genom användning av specifika molekyler märkta med positron (β +) avger radionuklider såsom 11C, 13N, 15O och 18F. Denna icke-invasiva metod har många fördelar över ex vivo metoder (t.ex. immunhistokemi) som den tillåter förvärv av molekylär information i realtid, i levande intakt ämnen, och möjliggör longitudinell undersökning. PET imaging av TSPO, en markör för aktiverade mikroglia och perifera myeloisk-lineage celler, tillhandahåller ett sätt att kvantifiera och spåra medfödda immunceller svar i kroppen och kan användas för att bedöma inflammation efter stroke och svar till terapeutiska interventioner. TSPO, tidigare känd som den perifera-typen bensodiazepin receptorn, är en 18 kDa-protein som tros spela en roll i kolesterol transport och syntesen av neurosteroids4. Dessutom tyder på att TSPO är inblandade i neuroinflammation och neuronal överlevnad5,6, med rapporter om ökat uttryck i många neurologiska sjukdomar där inflammation inklusive stroke7, demens8, Parkinsons sjukdom9 och multipel skleros10. TSPO ligger på yttre mitokondriella membran och uttrycks mycket i periferin, särskilt i steroid omkringliggande vävnader (t.ex. körtlar) och med mellanliggande nivåer sett i hjärtat, njurarna och lungorna10. Men i den friska hjärnan, TSPO nivåer är låga och begränsad främst till glia6,11. Efter neuronal skada, som den som observerats i stroke, TSPO nivåer i centrala nervsystemet (CNS) öka betydligt. Denna observerade uppreglering av TSPO kan utnyttjas till bild neuroinflammation in vivo med uttrycket nivåer som ger en korrekt indikator inflammation svårighetsgrad. Därför är målet med denna metod att exakt kvantifierai vivo bidrag neuroinflammation i en musmodell av ischemisk stroke med TSPO-PET.
Flera TSPO spårämnen har utvecklats för PET-avbildning av neuroinflammation. Här, TSPO-PET imaging beskrivs med [11C] DPA-71312, en lovande andra generation TSPO tracer, som har visat förbättrat signal till buller och lägre icke-specifik bindning än mer historiskt används [11C] PK11195 13 . Som ett exempel valdes dMCAO musmodell av stroke för denna metod14. Denna modell innebär temporal kraniotomi och permanent ligering av den distala mellersta cerebral artär, som leder till fokal ischemi av somatosensoriska cortex. Detta är fördelaktigt i prekliniska strokeforskningen vederbörlig hög reproducerbarhet av ischemisk skada och låg dödlighet associerade med denna modell. Hittills har TSPO-PET imaging studier ännu rapporteras i dMCAO gnagare modellen. Dock tidigare PET imaging studier med mellersta cerebral artär ocklusion (MCAO) modell, en mer allvarlig och rörliga stroke modell, i både möss och råttor, har rapporterat TSPO uttryck att öka från dag 3 och peak runt dag 7 efter stroke15, 16,17,18. Därför utfört vi PET imaging 6 dagar post-dMCAO för att sammanfalla med förhöjda TSPO uttryck. [11C] DPA-713 upptag i hjärnan bedömdes i ipsilaterala (infarcted) och kontralaterala halvkloten. TSPO-PET kombinerades med strukturella MRI, möjliggör exakt avgränsning av infarkt och kontralaterala regioner av intresse (ROIs). Här beskriver vi både en atlas-baserad och en MRI-driven ROI metod att beräkna [11C] DPA-713 upptag. Radiotracer upptag i mjälte bedömdes också undersöka perifera nivåer av inflammation mellan grupperna. Denna metod har potential att ge viktiga insikter i spatiotemporal dynamics och rollen av specifika Neuroimmuna interaktioner i stroke och andra neurologiska sjukdomar.
Presenterade protokollet beskriver en metod för kvantifiering av neuroinflammation i dMCAO och sham möss använder [11C] DPA-713-PET. TSPO-PET är den mest undersökta imaging biomarkören för att visualisera och mäta neuroinflammation i vivo hittills. TSPO uttryck är uppreglerad på glia i hjärnan vid inflammation som tillåter icke-invasiv detektering och kvantifiering av neuroinflammation. Dessutom är det en mycket översättningsbara teknik, vilket gör den till ett värdefullt verktyg i både klinisk och preklinisk forskning. Detta protokoll och representativa resultat belysa lämplighet använda [11C] DPA-713 PET att upptäcka och övervaka neuroinflammatoriska förändringar i stroke och andra neurologiska sjukdomar i vivo.
I denna studie utfördes dMCAO kirurgi med 3-månad-gammal C57BL/6 honmöss. Denna modell valdes eftersom det ger upphov till en mycket reproducerbara infarct begränsas till somatosensoriska cortex, tillhandahålla en modell av permanent fokal ischemi med låg variabilitet jämfört med andra modeller av stroke (t.ex. mellersta cerebral arteriell ocklusion (MCAO) glödtrådens metod)14. PET imaging av stroke modeller har fördelen av innehåller en intern referens region i hjärnan för varje djur som använder ROIs inom den kontralaterala hemisfären. Eftersom det kommer att finnas vissa inflammation att resultaten från operation ensam, det är viktigt att inkludera möss som opererades sham i studiedesign, whereby kraniotomi och manipulation av hjärnhinnorna utan artärocklusion utfördes. Kraniotomi ensam kan resultera i störningar till underliggande neuronal vävnad och införandet av patogener som leder till immunsvar som är oberoende av stroke20. Vissa inflammation efter bluff operation förväntas därför och bör utvärderas parallellt med dMCAO att utesluta möjligheten av signalen på grund av kirurgi ensam. För att undvika inklusive inflammation som följd av operationen utan stroke i dMCAO Kohortanalys, måste MR imaging utföras för att bekräfta lyckad stroke kirurgi och infarct utveckling. MRT ger också en strukturell referensram, vilket är mycket viktigt att noggrant rita infarct och kontralaterala ROIs. Dessutom korrekt bildbehandling inklusive bildregistrering och ROI definition är nödvändiga för att säkerställa tillförlitlig kvantifiering.
Ytterligare begränsningar måste hållas i åtanke när du arbetar med C-11 märkt radiotracers för PET och autoradiografi studier. Det är absolut nödvändigt att betrakta den korta halveringstiden (20,33 min) för C-11, med dess användning som allmänt begränsas för att forskningsinstitut med hotellets cyklotron tillgång. Lämpliga radioaktivitet transportled, dosering och förvärvet tidpunkter måste fastställas i förväg med en färdiga detaljerad plan av arbetsflödet av experimentet så att teamet kan arbeta snabbt och effektivt. Design och installation av denna studie har beskrivits för att rymma avbildning av 4 möss samtidigt för att öka data utdata kan erhållas när du använder C-11 spårämne. Om möjligt, är det tillrådligt att ha alla möss kanylerade och mitt i deras datortomografi när C-11 spårämne anländer till tänkbar möjlighet att säkerställa minimal radiotracer förfall före injektion. Detta stegvisa protokoll är också bäst utförs av ett team som innehåller minst 3 forskare att möjliggöra snabb kanylering, dosimetri, tracer injektion, PET-kamerateknik och hjärnan snittning före betydande radioaktivt sönderfall. Det krävs två personer att genomföra inledandet av i PET-bilden och injektion av alla 4 möss samtidigt. Anledningen till början PET förvärvet precis före injektion är att säkerställa farmakokinetik och dynamiken i tracer distribution i blod och regioner av intresse är korrekt och fullständigt erövrat. Många steg kan kräva intensiv utbildning och praktik att säkerställa väl fungerande experimentet. Detta protokoll är särskilt beroende av framgångsrika svans ven kanylering av C57BL/6 möss, vilket kan vara svårt på grund av mörkt hår på deras svansar, och kan bli mer utmanande efter stroke har inträffat eller om imaging samma möss vid flera tidpunkter .
En annan faktor för PET imaging inkluderar försiktig inspelning av radiotracer dos och kvarvarande verksamhet mätningar, inklusive den exakta tidpunkten för mätningen. Detta är viktigt för korrekt decay korrigering av den injicerade dosen vid tiden för skanningen och används för att få en korrekt mätning av upptag av spårsubstans (dvs % ID/g) för varje ROI. Det är viktigt att veta den exakta mängden radioaktivitet som var närvarande i varje mus vid tidpunkten för skanning för att säkerställa korrekt bildanalys. Därför är det tillrådligt att synkronisera klockorna på skannern dator och dos kalibrator att undvika fel när du använder kortlivade isotoper såsom C-11.
Korrekt PET bild kvantifiering kan också begränsas av riktigheten av skannern och set-up. Därför för att säkerställa korrekt kvantifiering av PET/CT-bilder, är det viktigt att utföra kvalitetskontroller för både CT och PET komponenter i skannern. CT kvalitetskontroller inkluderar röntgen källa luftkonditionering, mörk/ljus och center off set kalibreringar. Dessa kalibreringar mät och korrekt för systemet buller och måste vara utförd innan förvärvet som rekommenderas av tillverkaren av skannern. Kalibreringar bör också utföras för de PET-kamera. Detta innebär vanligtvis skannar en ”standard / sällskapsdjur phantom” scan, som innehåller en känd koncentration av radioaktivitet. När du förbereder standarden, är det bäst att använda den samma radioisotoper som används i studien, en jämförbar dos som administreras till en enda mus i en volym som är liknande till kroppen av en mus, och samma förvärv parametrar som djur imaging. En 20 mL spruta fylld med radiotracer utspädd i vatten används för standarden i detta protokoll, med efterföljande PET imaging resultaten används för att beräkna en korrigeringsfaktor baserat på faktisk dos mätt med kalibrering detektorn. Förhållandet korrigering kan tillämpas på de imaging uppgifter som erhållits i experimentet att säkerställa exakt kvantifiering av upptag av spårsubstans i regioner av intresse i PET-bilder. Detta står för positron spänna av radionukliden förutom att överväga någon bakgrund aktivitet på dagen för skanning. Eftersom dosen kalibratorn är en integrerad del av generationen av denna korrektionsfaktor, är det absolut nödvändigt att denna utrustning också kalibreras regelbundet enligt tillverkarens riktlinjer.
När genomför ex vivo autoradiografi är det viktigt att välja en optimal tidpunkt för dödshjälp efter injektion, för att säkerställa hög signal till bakgrunden i regionerna av intresse. Trettio minuter efter injektion valdes för [11C] DPA-713 autoradiografi med hjälp av data som förvärvats under dynamiska PET imaging –dvs de i vivo dynamiska TAC som en guide, samtidigt också med tanke på den korta halveringstiden för C-11 och tid inblandade att avsnitt och exponera hjärnvävnaden efter extraktion. Med tanke på detta, [11C] DPA-713 autoradiografi måste utföras på en separat kohort av möss att möjliggöra injektion av en högre [11C] DPA-713 dos och 30 minuters tid-punkten för perfusion och eutanasi under narkos. Utför en liten in-vivo kommer att PET pilotstudie med en 3-4 möss innan ex vivo autoradiografi vara till hjälp för att bestämma den optimala tidpunkten för autoradiografi. En tilläggsköpeskilling för ex vivo autoradiografi är om att återvinna möss efter injektion eller hålla dem sövd tills dödshjälp. Att hålla dem sövda härmar villkoren för sökningen och säkerställer radiotracer distribution eller utsöndring kinetik inte ändras av återhämtning. Dessutom förhindrar detta ytterligare stress på möss genom att undvika återställning och därpå följande induktion. Slutligen ett användbart tillägg till protokollet ex vivo skulle vara att bedöma de regionala skador i hjärnan skivor används för autoradiografi via immunhistokemisk färgning (efter radioaktivt sönderfall) för att generera en högupplöst bild av infarct läge och volym.
Eftersom det finns begränsningar med hjälp av en C-11 baserat tracer, kan detta protokoll lätt ändras för användning med en f-18 (halveringstid på 109.77 min) baserat TSPO tracer, som kan vara mer tillämplig på platser utan en Hotellets cyklotron. Dessutom beskriver det här protokollet användning av en 4-mus imaging set-up. Även om denna hög genomströmning metod är optimal när du använder en C-11 tracer, ändras också detta protokoll för dem som använder enkel mus imaging sängar. Noggrann planering och konsekvent utbildning i de tekniker som beskrivs i detta protokoll kommer att leda till skapandet av ett välstånd data med [11C] DPA-713, som lätt kan tillämpas sond neuroinflammation i sjukdom manifestation roll och progression i andra gnagare modeller av neurologiska sjukdomar. Dessutom skulle denna teknik kunna användas att bedöma den i vivo svaren på immunmodulerande therapeutics riktar mikroglia/makrofager.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Buckwalter labbet (särskilt Dr Todd Peterson) för att tillhandahålla musmodell och utför de dMCAO och bluff operationerna. Dessutom vill vi tacka Thomas Liguori från Invicro för hans tekniskt bistånd med VivoQuant bild analys programvara, Dr Tim Doyle, Dr. Laura Pisani, Dr Frezghi Habte från SCi3 små djur imaging anläggning vid Stanford för deras råd och hjälp för att utveckla detta protokoll-avbildning, och radiokemi facility (särskilt Dr. Jun Park) för deras hjälp med syntesen av [11C] DPA-713.
Inveon PET/CT scanner | Siemens | Version 4.2 | |
MRI scanner | Varian | 7 Telsa | |
ParaVision software | Bruker | Version 6.0.1 | MRI operating software |
VivoQuant software | InVicro | Version 2.5 | Image analysis software |
Inveon Research Workspace software | Siemens | Version 4.2 | Scanner operating software. Includes microQView, the post-processing managing software |
Dose calibrator | Capintech | CRC-15 PET | |
Typhoon phosphor imager 9410 | GE Healthcare | 8149-30-9410 | |
Butterfly catheters | SAI Infusion Technologies | BFL-24 | 27.5 G needle |
1 mL syringes | BD | ||
Insulin syringes | BD | 329461 | 0.5 mL insulin syringes with needle |
20 mL syringe | VWR | BD302831 | BD Syringe Slip Tip Graduated |
Tissue glue | Santa Cruz Animal Health | sc-361931 | 3 mL |
Heat lamp | Fluker | 27002 | 5.5" reptile heat lamp with clamp and switch |
0.9% sterile saline | Pfizer | 00409-4888-10 | 0.9% sodium chloride for injection, 10 mL |
Eye lubricant | Watson Rugby | PV926977 | Artificial Tears Lubricant Eye Ointment, 1/8 oz |
Chux absorbent sheets | ThermoFisher Scientific | 1420662 | Disposable absorbent padding |
Iris scissors | World Precision Instruments | 503708-12 | 11.5cm, Straight, 12-pack |
Surgical tape | 3M Durapore | 1538-0 | 1/2"X10 yard roll, silk, hypoallergenic |
Mouse PET bed | In house | 4 mouse PET bed | |
Lighter | Bic | UDP2WMDC | |
Isoflurane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | Isothesia, inhalation anesthetic, 250 mL |
Oxygen | Praxiar | UN1072 | Compressed gas |
Autoradiography cassette | Cole Palmer | EW-21700-34 | Aluminum, 8" x 10" |
Autoradiography film | GE Life Sciences | 28-9564-78 | Storage Phosphor Screen BAS-IP SR 2025 E Super Resolution, 20 × 25 cm, screen only |
Microtome blades | ThermoFisher Scientific | 30-508-35 | MB35 Premier Disposable, 34° cutting angle |
Microtome | Microm | HM 550 | |
Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Superfrost™ Plus Microscope Slides |
OCT liquid | VWR | 25608-930 | Formulation of water-soluble glycols and resins for cryostat sectioning at temperatures of -10°C (14°F) and below |
Freezing molds | Poly sciences | 18646A-1 | Disposable paraffin molds |
Saran wrap | Saran | 25700001300 | |
Disinfectant | Virkon S |