Summary
Plastisitet av kjernefysiske arkitektur styres av dynamisk epigenetic mekanismer, inkludert ikke-koding RNAs, DNA metylering, nucleosome reposisjonering samt histone komposisjon og modifisering. Her beskriver vi en Formaldehyde-Assisted isolasjon av regulatoriske elementer (FAIRE)-protokoll som tillater fastsetting av chromatin tilgjengelighet i en reproduserbare, billig og enkel måte.
Abstract
Aktuelle genuttrykk svar ekstracellulære Stikkordene, dvs vev - og avstamning-spesifikk genet transkripsjon, avhenger kritisk høyt angitte stater chromatin organisasjon. Det drivkraft arkitekturen av kjernen styres av flere mekanismer og figurer transcriptional utgang programmene. Derfor er det viktig å fastslå locus-spesifikke chromatin tilgjengelighet på en pålitelig måte som helst uavhengig av antistoffer, som kan være et potensielt forvirrende kilde til eksperimentell variasjoner. Chromatin tilgjengelighet kan måles ved ulike metoder, inkludert Formaldehyde-Assisted isolasjon av regulatoriske elementer (FAIRE) analysen, at fastsetting av de generelle chromatin tilgjengelighet i et relativt lavt antall celler. Her beskriver vi en FAIRE protokoll som tillater enkel, pålitelig og rask identifikasjon av genomisk områder med en lav protein innkvartering. I denne metoden DNA covalently bundet til chromatin proteiner med formaldehyd som crosslinking agent og skåret i små stykker. Gratis DNA er etterpå beriket med fenol: kloroform utvinning. Forholdet mellom gratis DNA bestemmes av kvantitative polymerasekjedereaksjons (qPCR) eller DNA sekvensering (DNA-seq) sammenlignet med en kontroll prøven representerer totalt DNA. Regionene med en løsere chromatin er anriket på gratis DNA prøve, slik at identifikasjon av genomisk regioner med lavere chromatin komprimering.
Introduction
Genomic DNA av eukaryote celler er tett pakket inn i nucleosomes, som må bli fjernet eller ombygd for å tillate samspillet av andre proteiner med DNA. Transcriptional aktivering av et gen vanligvis fører til en mer åpen konfigurasjon av nucleosomal strukturen, spesielt i 1 nucleosome1, for å lette transkripsjon av RNA polymerase. Også forekomme regulatoriske regioner som arrangører og enhancers dynamiske endringer i deres chromatin tilgjengelighet slik at samspillet med chromatin bestemmelsesord eller transkripsjon faktorer2. Flere tilnærminger har blitt utviklet for å identifisere disse nucleosome-fri regioner. Disse inkluderer følsomheten til nucleases som DNase jeg3 eller micrococcal nuclease4, som bare tilgang DNA når det ikke er tett pakket rundt nucleosomes. Andre metoder for identifikasjon av åpne chromatin eller gratis DNA inkluderer transposase-mediert integrering av retrotransposable elementer (analysen for Transposase tilgjengelig Chromatin, ATAC)5eller chromatin immunoprecipitation (ChIP) bruker antistoffer mot histones. Metoden FAIRE er ikke basert på kapasiteten til et enzym å nå DNA eller binding av et antistoff til et bestemt protein, men i stedet avhengig rensing av nucleosome-fri regioner av en fenol: kloroform utvinning6,7. I denne metoden DNA er covalently bundet til chromatin proteiner ved crosslinking agent formaldehyd og er skåret etterpå til små biter av sonication. Tett pakket chromatin områder vil ha rikelig DNA/protein krysskoblinger, mens DNA regioner med ingen eller få nucleosomes vil ha liten eller ingen krysskoblet DNA/protein komplekser. En fenol: kloroform utvinning renser den ikke-krysskoblet gratis DNA i den vandige fasen, mens DNA krysskoblet proteiner er fanget i organisk fenol fase eller vandig-organisk interphase sammen med proteiner. Kvantifisering av denne gratis DNA sammenlignet med en referanse til totalt DNA-prøve kan identifikasjon av regionene chromatin gratis. FAIRE metoden kan brukes for karakterisering av genomisk enkeltområder som beskrevet her, men passer også for identifikasjon av genomet hele chromatin tilgjengelighet når koplet til dyp sekvensering som beskrevet i ulike modeller8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. resultatene av FAIRE-seq og andre metoder som ATAC-seq er i stor grad overlappende14. Metoden FAIRE er en meget robust, billig og lett å utføre metoden for å identifisere nucleosome-fri områder. I motsetning til andre metoder, det krever ikke piloten eksperimenter for å bestemme riktig nivå av fordøyelsen som kreves for nucleases (DNase-seq, MNase-seq) eller transposases (ATAC-seq) og diskutert i detalj i en siste gjennomgang15. Parameterne bare justeres er sonication forhold og i noen tilfeller fiksering tiden. Dette dokumentet beskriver en enkel protokoll som skjematisk vises i figur 1 , og som ikke krever spesialutstyr enn en sonicator. Protokollen kan utføres i en rimelig kort tid og gjør FAIRE en enkel og pålitelig metode for å teste chromatin tilgjengelighet i en rekke ulike celletyper mellom lungekreft cellene11 primære celler fra musen lever16.
Protocol
1. dag 1: Cellekultur
- Kultur cellene skal analyseres til ønsket mengde. Cellen oppdrettsforholdene og media, avhenger av hvilke cellen under etterforskning.
Merk: I prinsippet alle eukaryote celle er mottakelig for en analyse av chromatin tilgjengelighet av FAIRE. For dette eksperimentet, 4 x 106 HEK-293T celler er sådd i en enkelt 10 cm rett i DMEM medium supplert med 10% (v/v) FBS og 1% (w/v) penicillin/streptomycin, og inkubert på 5% CO2 og 37 ° C 24 h til cellene kommer 70-80% samløpet (~ 8 x 10 6 celler per fat).
2. dag 2: Formaldehyd Crosslinking og cellen høsting
FORSIKTIG: Formaldehyd er svært giftig og må alltid brukes under avtrekksvifte. Bruk beskyttende klær (hansker og Laboratoriefrakk). Kast avfallet riktig.
- Legg formaldehyd direkte til celle kultur medium i avtrekksvifte å nå en siste konsentrasjon av 1% (v/v) (270 µL av 37% (v/v) formaldehyd å 10 mL av celle kultur medium). Inkuber i 10 min ved romtemperatur (20-25 ° C) og drepte platene manuelt hver 2 min.
Merk: Crosslinking tiden kan justeres etter hvilken celle. For fleste cellelinjer er 10 min av crosslinking tilstrekkelig. For vev, kan lengre incubations være nødvendig å tillate fiksering av alle celler. - Legge til glysin en siste konsentrasjon av 0.125 M å slukke formaldehyd (legge 500 µL av en 2.5 M glysin aksje til 10 mL av kultur medium). Inkuber i 5 minutter ved romtemperatur og drepte alle 2 min.
- Vask cellene 3 x med isen kalde PBS (8 g/L NaCl, 0.2 g/L KCl, 1,44 finans Na2HPO4 · 2t2O, 0,24 finans KH2PO4, justere pH 7,4 HCl eller NaOH). Sug opp mediet og vask direkte i cellen kultur parabol eller kolbe ved å legge 10 mL PBS. Gjenta dette trinnet to ganger å være veldig forsiktig ved løst tilhenger celler som HEK-293T. Legg PBS nøye ved siden av parabolen for å unngå avdeling av cellene.
- Etter tredje vask, resuspend cellen i 1 mL av is kaldt PBS og overføre slik 1,5 mL reaksjon på is. Bruk cellen skraper for å koble cellene når det er nødvendig.
Merk: Når du starter med et begrenset materiale, bruke lav DNA-bindende rør for å unngå eksempel tap under prosedyren. - Sentrifuger i 5 min på 300 x g på 4 ° C i en avkjølt tabletop sentrifuge. Kast nedbryting av nøye aspirating det.
3. celle Lysis og Chromatin fragmentering
- Resuspend celle pellet i 1 mL FAIRE lyseringsbuffer (1% (w/v), 10 mM EDTA, 50 mM Tris HCl pH 8.1, 10 µg/mL leupeptin, 10 µg/mL aprotinin, 2 mM PMSF), og resuspend celler av nøye pipettering opp og ned flere ganger. Inkuber etter 20 min på is. Lagre prøvene ved-80 ° C på dette trinnet hvis nødvendig.
- Sonicate krysskoblet DNA å klippe det til en gjennomsnittlig størrelse på 200-300 bp. Spesifikke innstillingene for sonicator må bestemmes for hver kilde av prøver og brukte sonication enheten. Uansett sikre at DNA er effektivt skåret. En optimalisering trinn for DNA fjerning er beskrevet under trinn 5,14. Cool prøvene på is under sonication å unngå oppvarming av prøven.
- Sentrifuge utvalget for 15 min og 13 000 x g på 4 ° C.
- Overføre nedbryting slik ny reaksjon. Delt eksemplene i 100 µL dele. Lagre prøvene ved-80 ° C, hvis nødvendig.
Merk: Protokollen kan avbrytes på dette punktet.
4. de-crosslinking kontroll DNA
- Ta en 100 µL aliquot fra trinn 3.4 å reversere krysskobling og brukes som en referanse for totalt DNA. Legge til 10 µL av RNase-A (10 mg/mL) og ruge 1t på 37 ° C.
- Legge til 10 µL av proteinasen K (20 mg/mL). Bruk en programmerbar thermo-blokk til å ruge 4 h på 37 ° C og deretter 6 h 65 ° C deler proteiner og reversere krysskoblinger. Endelig holde prøvene på 4 ° C før protokollen blir gjenopptatt og går videre til trinn 5.
Merk: Protokoller FAIRE bruke chromatin prøver fra celler som ikke er krysskoblet som referanse, dermed avskaffe behovet for de-crosslinking11. Det faktum at disse prøvene ikke er krysskoblet kan føre til forskjeller i sonication effektivitet eller DNA stabilitet, derfor bruken av totale DNA referanse prøver som har gjennomgått den samme fremgangsmåten som testprøvene er mer nøyaktig.
5. dag 3: Fenol: kloroform rensing av DNA
- Ta den ikke-de-krysskoblet aliquot fra trinn 3.4. Legge til 10 µL av RNase-A (10 mg/mL) og ruge 1t på 37 ° C.
- Ta ikke-de-krysskoblet aliquot skjemaet step 5.1 og de-krysskoblet prøven fra trinn 4.2 og utføres parallelt. Legge til H2O å nå et endelig antall 300 µL.
- Legg 300 µL av fenol: kloroform: isoamyl alkohol (25:24:1) i en avtrekksvifte og vortex kraftig.
FORSIKTIG: Fenol er korrosiv og giftige og må brukes alltid under avtrekksvifte. Bruk beskyttende klær (hansker og Laboratoriefrakk), kontroller at reaksjonen rørene er tett lukket, og fjerne avfallet riktig. - Sentrifuge for 10 min 13 000 x g på 4 ° C.
- Nøye overføre 280 µL av øvre vandige fasen til en ny reaksjon tube. Pass på ikke å ta alle partikler fra interphase som også inneholder proteiner. Forkaste gjenværende lavere fasen som løsemiddel matavfall.
- Gjenta trinn 5.3 til 5,5 og nøye overføre 270 µL av øvre vandige fasen til en ny reaksjon tube.
- Legge til 270 µL av kloroform avtrekksvifte og vortex kraftig.
Merk: Dette trinnet brukes til å fjerne eventuelle gjenværende fenol fra utvalget. - Sentrifuge for 10 min 13 000 x g på 4 ° C.
- Nøye overføre 250 µL av øvre vandige fasen til en ny reaksjon tube, ta vare ikke for å bære alle partikler fra interphase. Forkaste gjenværende prøven løsemiddel matavfall.
- Legg til 25 µL av 5 M NaCl og 250 µL av isopropanol. Legge til 5 µL av glykogen (20 mg/mL) som bærer DNA. Bland godt invertere rør og ruge for 20 min ved romtemperatur. Sentrifuge for 10 min 13 000 x g på 4 ° C til å fremkalle DNA.
- Vask DNA pellets med 400 µL av 70% (v/v) etanol. Sentrifuge for 10 min 13 000 x g på 4 ° C.
- Sug opp nedbryting nøye og la pellet tørke i 10 min ved romtemperatur. Resuspend 100 µL TE buffer (10 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA).
- Inkuber ikke-de-krysskoblet gratis DNA prøve 4 h på 65 ° C fjerne mellom DNA krysskoblinger. Lagre prøver på 20 ° C.
- Kvantifisere mengden DNA bruker et spektrofotometer og kjøre en aliquot for å kontrollere fragment størrelsen på en 2% (w/v) agarose gel. Justere klipping tid og intensitet, avhengig av resultatene av DNA størrelse analyse av agarose gel geleelektroforese, for å få en gjennomsnittlig størrelse på 200-300 bp.
6. fastsettelse av gratis Versus totale DNA av kvantitative sanntid PCR (qRT-PCR)
- Forholdet mellom nucleosome-gratis DNA (i det følgende referert til som gratis DNA) versus totalt DNA bestemmes av qRT PCR17,18. Eksempler kan også bli kvantitativt analysert microarray hybridisering eller dyp sekvenser for genomet hele bestemmelser.
- Utforme qPCR primere for regionene skal testes og positive og negative kontroller.
Merk: Egnet positiv kontrollene er primere ligger bak aktivt transkribert housekeeping gener som ACTB, GAPDH, TPI1 eller TUBA1A (koding β-utgangen, GAPDH, TPI eller α-Tubulin). Aktuelle negative kontroller finnes i heterochromatin regioner eller genet ørkener. Andre passende negative kontroller kan utformes i genomisk regioner ved dynamisk regulert locus under etterforskning kontroll for lokal kopi nummer forskjeller (tabell 1). - Fortynne DNA-prøver å en final konsentrasjon av 10 ng/µL med TE buffer og hensyn til fortynningsfaktoren for de siste beregningene (se trinn 6.5).
- Sette opp en qPCR reaksjon i triplicates i en 96-brønns plate, med følgende reaksjonen blanding per brønn: mal DNA: 20 ng (2 µL), frem primer 200 nM (0,4 µL av en 5 µM aksje), omvendt primer 200 nM (0,4 µL av en 5 µM aksje) , en kommersiell klar til bruk reaksjonen blanding som inneholder grønt fargebad (5 µL fra en 2 x lager) og H2O til 10 µL.
- Kjøre i en sanntid qPCR enhet, bruke absolutte kvantifisering modus, og bestemme Ct prøvene med forskjellige primer parene. Beregne forholdet mellom utvinning av gratis DNA totale DNA for hver primer bruker følgende formel hensyntatt fortynning faktorene fra trinn 6.3:
Representant resultater og en eksempel beregning er gitt i tabell 2. - For å kompensere for forskjeller prøver, normalize til positiv kontroll utvinningen forholdet:
Representative Results
Vi har brukt metoden FAIRE måle forskjeller i chromatin tilgjengeligheten av MHC klasse II gener i HEK293T celler som publiserte19. MHC klasse II koding gener som er uttrykt i antigen presentere celler (APCs), enten constitutively eller som svar på cytokin signalering20. Uttrykket av MHCII gener er drevet av en aktivator kompleks som binder seg til bestemte DNA elementer, kalt XY bokser, i selskapet samt enhancers disse genene21,22. Dette gjenspeiles på nivået av chromatin, som åpenbart av våre FAIRE analyse av utvalgte regioner i MHC klasse II gener HLA-DPB1 og HLA-DMA. Disse viste at chromatin er åpen regionene omfatter XY bokser, mens det er mer kompakt genet organer (figur 2).
Eksempel for beregninger, i dette bestemte eksperimentet, vi utvannet totalt DNA-prøve 10 ganger (fortynningsfaktoren 10), og gratis DNA prøve var ikke forsvinner (fortynningsfaktoren for 1) for den qRT PCR. Cts innhentet for de ulike regionene testet og beregningene innhenting av siste gjenoppretting prosenter og relativ utvinning prosenter er oppført i tabell 2. Disse relative utvinning forholdene ble oppnådd med ACTB selskapet som positive kontrollen. Merk at disse beregningene for en av replikat brukes til å generere resultatene som vises i figur 2.
I en annen sammenheng, var chromatin tilgjengelighet testet i en modell for induserbart genuttrykk. I dette tilfellet ble raske endringer i chromatin komprimering svar på pro-inflammatoriske stimulans tumor nekrose faktor (TNF) målt. HeLa celler ble venstre ubehandlet eller stimulert med TNF 1t, etterfulgt av FAIRE måle chromatin komprimering på arrangøren regionen kontrollere uttrykket av genet koding av TNF-responsive cytokin interleukin 8 (IL8). Disse resultatene viste en kraftig økt chromatin tilgjengelighet på IL8 promoter av TNF-stimulert celler (Figur 3). Tilgjengelighet på IL-8 selskapet etter TNF stimulering er enda høyere enn i ACTB selskapet viser en dramatisk chromatin ombygging i denne regulatoriske regionen. Utvinningen forholdet innhentet i dette tilfellet er høyere enn oppnådd i regionen som positive kontrollen (ACTB promoter) er relative utvinningen forholdet høyere enn.
Figur 1: The FAIRE arbeidsflyten. Cellene er krysskoblet direkte i cellen kultur kolbe eller rett ved å legge formaldehyd (A). Etter slukke av formaldehyd, er celler vasket tre ganger med isen kalde PBS (B), og overført til en reaksjon rør der de er resuspended i FAIRE lyseringsbuffer og sonicated hvis du vil skråstille DNA (C). En aliquot på den utpakkede chromatin er de-krysskoblet ved oppvarming til 65 ° C, for å få den totale DNA referansen (D), og etterpå gratis DNA trekkes ut ved hjelp av fenol: kloroform både fra krysskoblet og de-krysskoblet dele (E). Endelig DNA er kvantifisert, og forholdet mellom gratis vs totalt DNA er beregnet (F). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: bestemmelse av chromatin tilgjengelighet i MHC klasse II genet klyngen i HEK293T celler. HEK293T celler ble analysert av FAIRE. Forholdet mellom gratis versus totale DNA (dvs., relativ utvinningen forholdet) ble fastslått for arrangøren av ACTB genet som en positiv kontroll, et heterochromatin område på Chr. 12 som negativ kontroll, og regulatoriske regioner og gene meldingsteksten i MHC klasse II gener HLA-DMA og HLA-DPB1. Den øvre delen viser en skjematisk fremstilling av locus og plasseringen av primerne. Feilfelt representerer standard avvik fra to biologiske gjentak målt i triplicates. Figuren ble endret fra en publisert rapport19. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: endringer i DNA tilgjengelighet på IL8 selskapet svar på TNF behandling. HeLa celler ble stimulert med TNF (20 ng/mL) for 1 h og analysert av FAIRE. Forholdet mellom gratis versus totalt DNA ble fastslått for arrangøren av ACTB (positiv kontroll), et heterochromatin område på Chr. 12 (negativ kontroll) og IL8 promoter. Feilfelt representerer standard feil av gjsnitt (SEM) fra tre biologiske gjentak målt i duplikater. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: optimalisering av sonication. Chromatin utvunnet fra 293T cellene var sonified en fokusert sonicator med riktige rør (Tabell for materiale). Chromatin var sonicated for den angitte tid med gjentakelser av 30 s med følgende innstillinger: peak strøm 150, plikt faktor 15 sykluser per briste 500, etterfulgt av 30 s: peak strøm 2.5, plikt faktor 15 sykluser per briste 500. Den resulterende chromatin var de-krysskoblet, renset av fenol: kloroform utvinning og lastet inn i en 2% agarose gel. En ethidium-bromide farget gel vises, og plasseringen av molekylvekt markører angis i bp. I dette eksperimentet, ble optimal chromatin størrelsen (200-300 bp) oppnådd etter 20 min på sonication. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Primer | Sekvens |
| ACTB-arrangøren-F | AAAGGCAACTTTCGGAACGG |
| ACTB-arrangøren-R | TTCCTCAATCTCGCTCTCGC |
| Chr. 12 negative kontroll-F | ATGGTTGCCACTGGGGATCT |
| Chr. 12 negative control-R | TGCCAAAGCCTAGGGGAAGA |
| HLA-DMA-XY-boksen-F | CATCAGTCACTGGGGAGACG |
| HLA-DMA-XY-boksen-R | GCTTCCCAGCCCAGTTACAT |
| HLA-DMA-5'-F | GGAGAGAACAATCTCCGCTTCA |
| HLA-DMA-5'-R | AGCTGCTATGTGTGGTTGGT |
| HLA-DMA-3-F | TGGGGACCTAGTTAGGGAGC |
| HLA-DMA-3-R | AGATCCATGGGAGGAGGCTT |
| HLA-DPB1-XY-boksen-F | GTCCAATCCCAGGGTCACAG |
| HLA-DPB1-XY-boksen-R | TGAAAAGAGCTGCAGTCAGGA |
| HLA-DPB1-5'-F | GCGTGTTCATGTCTGCATCC |
| HLA-DPB1-5'-R | TGATCCTCAGAGCCTGGACA |
| HLA-DPB1-3-F | CCAGCCTAGGGTGAATGTTT |
| HLA-DPB1-3-R | GCCTGGGTAGAAATCCGTCA |
| IL8 Promoter-F | GTGATGACTCAGGTTTGCCCT |
| IL8 Promoter-R | CTTATGGAGTGCTCCGGTGG |
Tabell 1: Primere for qPCR.
Tabell 2: eksempel beregninger av FAIRE Relative utvinning forholdstall. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
FAIRE er en robust og rimelig metode slik at identifisering av nucleosome-fri regioner. Den er basert på prinsippet om at DNA pakket rundt nucleosomes lett kan krysskoblet til histones. En fenol: kloroform utvinning brukes til å skille ikke-krysskoblet og protein-gratis DNA fragmenter fra protein-bundet DNA, som ligger i nedre fenol fase og i noen grad interphase (figur 1). Derfor er nucleosome-fri regionene overrepresentert i fraksjonen av gratis DNA i den vandige fasen. En rekke publikasjoner beskriver detaljert protokoller av FAIRE. metode23,24,25,26, som kan bli konsultert for å utfylle fremgangsmåten som er beskrevet her.
I likhet med andre metoder for å bestemme chromatin strukturen, FAIRE metoden også kritisk avhenger optimal klipping av DNA. Hvis fragmenter er for lang, vil en nucleosome-fri region være maskert av tilstøtende chromatin-bundet DNA. Hvis fragmenter er for små, blir gjenkjenning av qPCR eller dyp sekvensering svært vanskelig. Derfor sonication av DNA er en viktig parameter som må kontrolleres og optimalisert for å få fragmenter rundt 200-300 bp lengde, som representerer 1-2 nucleosomes (Figur 4).
En annen parameter som kan påvirke sluttresultatet er crosslinking av utvalget. Selv om fiksering fremgangsmåten som er beskrevet her er gyldig for de fleste cellelinjer, forskeren må nøye vurdere dette trinnet for bestemt prøven under studien, særlig når benytter vev, hvor lengre fiksering ganger kan være nødvendig å tillate den formaldehyd å nå cellene i alle Vevsprøve.
I motsetning til andre metoder, for eksempel DNase jeg eller micrococcal nuclease overfølsomhet, ChIP eller ATAC, FAIRE ikke stole på en enzymatisk aktivitet eller spesifikke antistoffer, og derfor det trenger ikke titrering eller optimalisering av reaksjonen. Dette gjør FAIRE en ideell metode for å måle chromatin tilgjengelighet for labs med liten erfaring i feltet chromatin. I tillegg piloten eksperimenter er kun nødvendig for å optimalisere DNA klipping trinn og crosslinking tiden, når det er nødvendig.
Metoden ble opprinnelig utviklet i gjær6, men det har også blitt utvidet til pattedyrceller. DNA renset med FAIRE metoden kan brukes for dype sekvensering, slik at genomet hele karakterisering av chromatin status. Dette har allerede vist seg nyttig i en rekke studier8,9,10,11,12,13,19,27, 28.
Resultater fra FAIRE-seq eksperimenter viser et stort overlapp med resultatene av andre metoder som DNase-seq14, selv om noen differanser. Dette er på grunn av metodologiske forskjeller som for eksempel avslappet eller ombygd nucleosomes kan fortsatt hindre spalting av DNase jeg, mens disse DNA-områder vil være mindre utsatt for produserer DNA/protein krysskoblinger og dermed ville bli fastsatt som nucleosome-fri områder med FAIRE9. Også ikke-histone proteiner som RNA polymerases eller leser proteiner for epigenetic merker kan resultere i DNA/protein krysskoblinger og dermed ville bli tolket som protein-pakket områder FAIRE eksperimenter. Disse begrensningene er iboende til hver metode som brukes til fastsettelse av chromatin staten, dermed øke behovet for å bruke en kombinasjon av ulike metoder for å få en omfattende innsikt.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Tilman Borggrefe (Universitetet i Giessen) for vennlig deler sonication enheten. Arbeidet M.L.S. støttes av tilskudd fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (SCHM 1417/8-3), SFB/TRR81, SFB1021, SFB1213, Excellence klynge Cardio-pulmonal systemet (ECCPS, EXC 147/2), Deutsche Krebshilfe (111447) og IMPRS-HLR programmet av Max-Planck Society.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 | Carl Roth | A156.1 | |
| Glycogen, 20 mg/ml | Thermo Fisher | R0561 | |
| ABsolute QPCR Mix, SYBR-Green, Rox | Thermo Fisher | AB1162B | |
| Proteinase K, 20 mg/ml | Thermo Fisher | EO0491 | |
| RNase A, 10 mg/ml | Thermo Fisher | EN0531 | |
| Leupeptin | Sigma | L8511 | |
| Aprotinin | Sigma | A1603 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | 78830 | |
| milliTUBE 1 ml AFA Fiber | Covaris | 520130 | |
| Holder milliTUBE 1ml | Covaris | 500371 | |
| Covaris S220 Focused-ultrasonicator | Covaris | ||
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosistems | 4376600 |
References
- Struhl, K., Segal, E. Determinants of nucleosome positioning. Nat. Struct. Mol. Biol. 20 (3), 267-273 (2013).
- Calo, E., Wysocka, J. Modification of enhancer chromatin: what, how, and why? Mol. Cell. 49 (5), 825-837 (2013).
- Wu, C. The 5' ends of Drosophila heat shock genes in chromatin are hypersensitive to DNase I. Nature. 286 (5776), 854-860 (1980).
- Yuan, G. C., et al. Genome-scale identification of nucleosome positions in S. cerevisiae. Science. 309 (5734), 626-630 (2005).
- Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat. Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Nagy, P. L., Cleary, M. L., Brown, P. O., Lieb, J. D. Genomewide demarcation of RNA polymerase II transcription units revealed by physical fractionation of chromatin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (11), 6364-6369 (2003).
- Nagy, P. L., Price, D. H. Formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. , (2009).
- Krinner, S., et al. CpG domains downstream of TSSs promote high levels of gene expression. Nucleic Acids Res. , 1-14 (2014).
- Gomez, N. C., et al. Widespread Chromatin Accessibility at Repetitive Elements Links Stem Cells with Human Cancer. Cell Rep. 17 (6), 1607-1620 (2016).
- Gaulton, K. J., et al. A map of open chromatin in human pancreatic islets. Nat. Genet. 42 (3), 255-259 (2010).
- Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Res. 17 (6), 877-885 (2007).
- Hurtado, A., Holmes, K. A., Ross-Innes, C. S., Schmidt, D., Carroll, J. S. FOXA1 is a key determinant of estrogen receptor function and endocrine response. Nat. Genet. 43 (1), 27-33 (2011).
- Filion, G. J., et al. Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells. Cell. 143 (2), 212-224 (2010).
- Davie, K., et al. Discovery of transcription factors and regulatory regions driving in vivo tumor development by ATAC-seq and FAIRE-seq open chromatin profiling. PLoS Genet. 11 (2), e1004994 (2015).
- Meyer, C. A., Liu, X. S. Identifying and mitigating bias in next-generation sequencing methods for chromatin biology. Nat. Rev. Genet. 15 (11), 709-721 (2014).
- Du, J., et al. Chromatin variation associated with liver metabolism is mediated by transposable elements. Epigenetics Chromatin. 9 (1), 28 (2016).
- Skinner, D. Z. Real-Time PCR: Advanced Technologies and Applications. Crop Sci. 54 (1), 455 (2014).
- Nolan, T., Huggett, J., Sanchez, E. Good Practice Guide for the Application of Quantitative PCR (qPCR). Natl. Meas. Syst. , 50 (2013).
- Rodríguez-Gil, A., et al. The CCR4-NOT complex contributes to repression of Major Histocompatibility Complex class II transcription. Sci. Rep. 7 (1), 3547 (2017).
- Steimle, V., Siegrist, C. A., Mottet, A., Lisowska-Grospierre, B., Mach, B. Regulation of MHC class II expression by interferon-gamma mediated by the transactivator gene CIITA. Science. 265 (5168), 106-109 (1994).
- Choi, N. M., Majumder, P., Boss, J. M. Regulation of major histocompatibility complex class II genes. Curr. Opin. Immunol. 23 (1), 81-87 (2011).
- Ting, J. P. -Y., Trowsdale, J. Genetic control of MHC class II expression. Cell. 109 Suppl, S21-S33 (2002).
- Nammo, T., Rodríguez-Seguí, S. A., Ferrer, J. Mapping open chromatin with formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements. Methods Mol. Biol. 791, 287-296 (2011).
- Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA. Nat. Protoc. 7 (2), 256-267 (2012).
- Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. A detailed protocol for formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE). Curr. Protoc. Mol. Biol. , Chapter 21, Unit21.26 (2013).
- Giresi, P. G., Lieb, J. D. Isolation of active regulatory elements from eukaryotic chromatin using FAIRE (Formaldehyde Assisted Isolation of Regulatory Elements). Methods. 48 (3), 233-239 (2009).
- Jung, S., Angarica, V. E., Andrade-Navarro, M. A., Buckley, N. J., Del Sol, A. Prediction of Chromatin Accessibility in Gene-Regulatory Regions from Transcriptomics Data. Sci. Rep. 7 (1), 4660 (2017).
- Pique-Regi, R., et al. Accurate inference of transcription factor binding from DNA sequence and chromatin accessibility data. Genome Res. 21 (3), 447-455 (2011).
