Summary
Dit protocol beschrijft het gebruik van een lichaam samenstelling analyzer en metabole dierlijke controlesysteem te karakteriseren lichaamssamenstelling en metabole parameters in muizen. Een model van de obesitas geïnduceerd door vetrijke voeding wordt gebruikt als een voorbeeld voor de toepassing van deze technieken.
Abstract
Wijzigingen in de samenstelling van het lichaam (vet of mager massa), metabole parameters zoals gehele lichaam zuurstofverbruik, energie-uitgaven, en het gebruik van substraat, en gedragingen zoals voedselinname en lichaamsbeweging kunnen geven belangrijke informatie met betrekking tot de onderliggende mechanismen van ziekte. Gezien het belang van de lichaamssamenstelling en metabolisme aan de ontwikkeling van obesitas en haar latere gevolgen, is het nodig om nauwkeurige maatregelen van deze parameters in de instelling van de pre-klinisch onderzoek. Vooruitgang in de technologie de afgelopen decennia hebben het mogelijk gemaakt te ontlenen deze maatregelen in knaagdier modellen in een niet-invasieve en longitudinale mode. Daarom zijn deze metabole maatregelen nuttig gebleken bij de beoordeling van de reactie van genetische manipulaties (bijvoorbeeld afvalrace of transgene muizen, knock-down virale of overexpressie van genen), experimentele drug/samengestelde screening en dieet, gedrags- of fysieke activiteit interventies. Hierin beschrijven we de protocollen die worden gebruikt voor het meten van de lichaamssamenstelling en metabole parameters met behulp van een dier monitoringsysteem in chow-gevoed en hoog vet dieet-gevoed muizen.
Introduction
Metabolisme ondersteunt vele aspecten van de normale cellulaire, orgel en fysiologie van het gehele lichaam. Bijgevolg, in de omgeving van verschillende aandoeningen, verbouwingen aan metabolisme kunnen rechtstreeks bijdragen tot de onderliggende aandoening of ongunstig kunnen worden beïnvloed als een neveneffect van de pathologie. Traditioneel, zijn metabole onderzoek en studies in de energiebalans geconcentreerd op het gebied van obesitas en verwante aandoeningen zoals insulineresistentie, pre diabetes, glucose-intolerantie, hart-en vaatziekten en diabetes. Dit onderzoek gerechtvaardigd is gezien de toenemende prevalentie van dergelijke voorwaarden wereldwijd en het individu, maatschappelijke, en economische kosten deze voorwaarden toebrengen. Als zodanig, de ontwikkeling van preventiestrategieën en nieuw therapeutics doel obesitas is een voortdurende doel in onderzoekslaboratoria over de hele wereld en preklinische Muismodellen zijn zwaar ingeroepen voor deze studies.
Terwijl weegt muizen en een betrouwbare beoordeling van gewichtstoename of -verlies biedt, biedt het geen een uitsplitsing van de verschillende componenten die deel van het gehele lichaam samenstelling (vet massa, vetvrije massa, gratis water evenals andere onderdelen zoals bont en klauwen uitmaken). Het gewicht voor dikke pads op de voltooiing van de studies, zodra de muis overleden is een nauwkeurige maatstaf voor verschillende vet depots, maar kan alleen gegevens leveren voor een enkel tijdstip. Dientengevolge, is het vaak nodig om te schrijven meerdere cohorten voor het onderzoek naar de ontwikkeling van obesitas in tijd, aanzienlijk meer dierlijke, tijd en kosten. Het gebruik van dual-energy X-ray absorptiometrie (DEXA) biedt een aanpak om te beoordelen lichaam vet en mager weefsel inhoud en de onderzoeker om gegevens in een longitudinale mode te verkrijgen. Echter, de procedure vereist muizen narcose1, en herhaalde aanvallen van anesthesie kunnen beïnvloeden de ophoping van vetweefsel invloed hebben of andere aspecten van metabole verordening. EchoMRI maakt gebruik van nucleaire magnetische resonantie-relaxometry voor het meten van vet en magere massa, gratis water en totale vochtgehalte. Dit is haalbaar als gevolg van de oprichting van het contrast tussen de verschillende weefsel componenten, met verschillen in de duur, de amplitude en de ruimtelijke spreiding van de gegenereerde radiofrequenties, waardoor de afbakening en de kwantificering van elk weefseltype. Deze techniek is voordelig als het is niet-invasief, snelle, eenvoudige, geen verdoving of straling vereist, en, nog belangrijker is, is positief gevalideerd tegen chemische analyse2.
Een belangrijke overweging van obesitas en verwant onderzoek is de energie-balans-vergelijking. Terwijl vet accumulatie is ingewikkelder dan puur de energie in (voedselinname) versus energie uit (energie-uitgaven), zijn ze belangrijke factoren om te kunnen meten. Dagelijkse energie-uitgaven is het totaal van vier verschillende onderdelen: (1) basale energie-uitgaven (rust stofwisseling); (2) de energie-uitgaven als gevolg van het thermische effect van voedselconsumptie; (3) de energie die nodig is voor thermoregulatie; en (4) de energie besteed aan lichaamsbeweging. Zoals energie-uitgaven warmte genereert, kan warmteproductie meten door een dier (bekend als directe calorimetrie) worden gebruikt ter beoordeling van de energie-uitgaven. U kunt ook meting van geïnspireerd en verlopen concentraties van O2 en CO2, zodat voor de bepaling van het gehele lichaam O2 consumptie en CO2 productie, kunnen worden gebruikt als een manier om niet indirect meten (indirecte calorimetrie) warmte productie en dus energie-uitgaven te berekenen. Een toename van de voedselinname of een afname van de energie-uitgaven zullen muizen predisponeren tot gewichtstoename en opmerkingen van veranderingen in deze parameters kunnen leveren nuttige informatie waarschijnlijk mechanismen van actie in bepaalde modellen van obesitas. Een verwante metabole parameter van belang is de respiratoire ruilverhouding (RER), een indicator van het aandeel van substraat/brandstof (dat wil zeggen, koolhydraten of vet) die ondergaat metabolisme en wordt gebruikt om energie te produceren. Bijgevolg, meting van de voedselinname (energieverbruik) gecombineerd met fysieke activiteitenniveaus, O2 consumptie, RER en energie-uitgaven kan bieden een brede kennis van een organisme van metabole profiel. Een methode voor het verzamelen van dergelijke gegevens is het gebruik van een uitgebreide proefdier monitoring systeem (VENUSSCHELPEN), die is gebaseerd op de methode van de indirecte calorimetrie voor het meten van de energie-uitgaven en heeft de toegevoegde mogelijkheden voor het bepalen van de fysieke activiteitenniveaus (bundel einden) en voedselinname via schalen opgenomen in de meting-kamer.
In dit protocol bieden wij een rechttoe-rechtaan-beschrijving van het gebruik van een lichaam samenstelling analyzer te beoordelen van de lichaamssamenstelling in muizen en een metabole dierlijke controlesysteem voor het meten van aspecten van het metabolisme. Overwegingen en beperkingen voor deze technieken zullen worden besproken en voorgestelde methoden voor analyse, interpretatie en gegevensvertegenwoordiging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten beschreven werden goedgekeurd door de Alfred medische onderzoek onderwijs Precinct dier ethische Commissie (AMREP AEC) en muizen ontvingen humane zorg in overeenstemming met de nationale gezondheids- en medische onderzoek Raad (NHMRC) van Australië-richtsnoeren inzake Dierlijke proefneming. Dieren werden toegediend van hun voorgeschreven dieet en water ad libitum en ondergebracht in een temperatuur gecontroleerde omgeving (~ 21-22 ° C) met een licht 12 h en 12 h-donker cyclus. Zeven weken oude mannelijke muizen (op de achtergrond van een C57Bl/6J) werden gevoed ofwel gewone normale chow dieet (energie inhoud 14.3 MJ/kg, bestaande uit 76% van kJ uit koolhydraten, 5% vet, 19% eiwit; zie tabel van materialen) of voor vet-voeding deGroep op hoog, een hoog vet dieet (HFD) () energie inhoud 19 MJ/kg, bestaande uit 36% van kJ uit koolhydraten, 43% vet, 21% eiwit, specialiteit Feeds) voor 3 weken. Lichaamsgewicht en lichaam samenstelling metingen met behulp van een EchoMRI machine werden wekelijks gemaakt terwijl de metabole controle analyse plaatsgevonden in een KOKKELS na 3 weken het dieet heeft.
1. lichaam samenstelling Analyzer Procedure
Opmerking: Om optimaal te functioneren, moet de EchoMRI 4-in-1 gebruikt in dit protocol worden opgenomen binnen een ruimte waar de temperatuur van de lucht is stabiel en schommelt niet. Idealiter moet dit voortdurend worden gecontroleerd. Verplaatsen van de machine en onderbrekingen aan de macht moet ook worden vermeden indien mogelijk. Als de voeding is onderbroken en het systeem moet opnieuw worden opgestart, kunt u ten minste 2-3 uur voor de machine om op te warmen voordat u deze opnieuw. Voordat u begint, moet u zorgen dat u het juiste persoonlijke beschermingsmiddelen dragen.
- Vóór het scannen muizen, uitvoeren van een test systeem op het lichaam samenstelling analyzer machine. Dit gaat met behulp van een ijkstandaard (hierna aangeduid als een canola olie systeem test sample (kosten)) voor het testen van de nauwkeurigheid van het instrument en om ervoor te zorgen dat is er geen drift in de juistheid ervan.
- Open de systeemsoftware, vervolgens klikt u op de werkbalkknop System Test of gelijktijdig indrukken van 'Alt + Y'.
- Voordat de systeem-test wordt uitgevoerd door de computer, wacht een herinnering om te verifiëren dat de juiste kosten (in dit geval de muis-specifieke kosten) heeft gelegd binnen de gantry van het systeem ( Figuur 1). Zodra is bevestigd dat dit inderdaad het geval is, accepteren om door te gaan met de test, die enkele minuten in beslag zal nemen.
- Zodra de test systeem is overgegaan, voortzetten voorwaarts scannen.
- Als de systeem-test mislukt, herhaalt u het systeem test.
- Als de machine blijft buiten het bereik (geven dat een afwijking heeft plaatsgevonden), kan de kalibratie nodig om de situatie te verhelpen zijn. Vul dit door de aanwijzingen te volgen of als beschreven in de gebruikershandleiding die op moment van aankoop. Als het probleem zich blijft voordoen, Controleer de handmatige3 of het probleem melden aan het ondersteuningsteam van de fabrikant en zoeken verder instructie.
- Plaats de muizen in een kleine, dierlijke monsterhouder (lange cilinder) om hen opgenomen terwijl het in de machine te houden. Om dit te doen, plaats de houder horizontaal, pak de muis en plaatst u deze in de opening van de cilinderkop eerst. Langzaam en zorgvuldig brengen de houder aan de verticale positie, zodat de muis op de bodem van de cilinder en klaar voor analyse.
- Eenmaal binnen de houder, plaatst u een scheidingsteken als u wilt beperken de bewegingen van de muis tijdens de meetperiode. In sommige gevallen, met uiterst actieve muizen, het mogelijk moet het scheidingsteken op zijn plaats met uw vingertop houden.
Opmerking: Vertrouwd de muizen met plaatsing in de houders van de specimen vóór hun eerste analyse om stress te verminderen. Het gebruik van een rood gekleurde dierlijke monsterhouder kunt ook verminderen de potentiële stressrespons, zoals de muizen voelen dat ze in het donker. - Binnen de software, selecteer een map (map werkbalk) gegevens opslaan naar en maken van een bestandsnaam.
- Indien nodig, de hoeveelheid willekeurige ruis in het vet en mager metingen te verminderen door het verhogen van het aantal primaire ophopingen van de scan. Zodra de software wordt gestart, de primaire ophopingen is ingesteld op een aanbevolen standaardwaarde voor algemene dagelijks gebruik; tenzij er een specifieke reden om te veranderen van deze parameters, zal de standaardinstellingen voor het vereiste niveau van precisie geven aan gebruikers.
- Indien niet geïnteresseerd in het verkrijgen van gegevens voor gratis water en de totale hoeveelheid water, uit te schakelen de water-fase door te selecteren op het tabblad om nee te zeggen. Hierdoor zal significante beperking van de duur van de scan en de doorvoer verbeteren.
- De scan starten door het selecteren van "start scannen" of door op F5 te drukken op het toetsenbord. Alle relevante gegevens over het dier invoeren (bijvoorbeeld dier ID, lichaamsgewicht, enz.) en druk op "ok" of F5 om te beginnen de scan, die ongeveer 1 minuut duurt.
- Nadat de gegevens zijn verkregen, verwijder de dierlijke houder met de muis uit de machine en plaats van het dier terug in zijn kooi. Zodra alle dieren zijn gescand, de gegevens exporteren voor grondigere analyse en betere sortering.
- Vóór en na gebruik grondig schoon de dierlijke houders volgens de instructies van de fabrikant. Als deze houders zijn opgebouwd uit acryl kunststof, isopropyl alcohol en ethyl alcohol moet worden vermeden omdat ze leiden tot kunnen scheuren van de houders en/of snelle verslechtering van de houder, waardoor de kans op breuk. In plaats daarvan gebruik warm afwaswater oplossing, of, als verdere ontsmettingsmiddel vereist is, gebruikt u F10 (bij een verdunning van 1:125) of andere ontsmettingsmiddelen of schoonmaak sprays (Zie Tabel van materialen) en vervolgens veeg af.
2. metabole dier controle systeem Procedure
Opmerking: Het systeem vereist ~ 2 h opwarmen te stabiliseren. Als de machine is uitgeschakeld, moet het worden ingeschakeld om de Zirconia cel die moet worden verwarmd tot 725 ° C. Ook plaatsen wij in het algemeen muizen in de lichaam samenstelling analyzer een dag voorafgaand aan het invoeren van het dier controlesysteem om eventuele problemen met terughoudendheid stress te voorkomen.
- Controleer de computer aangesloten op het dierlijke controle systeem is ingeschakeld en open het programma van het besturingselement. Selecteer de "Utility Oxymax" optie in het menu gereedschap te leiden van de pompen.
- Waterflessen met passende water vullen, wegen en inspecteren van de gezondheid van de muizen en indelen van voedsel. Als de voedselinname te meten in het systeem, kunt u overwegen poederen van het voedsel. Vul de hoppers voedsel door indrukken van de veer platform en tip voedsel in de trechter. Zorg ervoor dat het voedsel hopper en de fles water helemaal vol om ervoor te zorgen dat er genoeg voedsel en water voor het laatst de experimentele spreektijd.
- Controleer de status van de drierite/droogmiddel; Als met behulp van een kleur indicator, moet het zijn blauw en dus droog, maar als het roze/paars, het heeft aanzienlijke vocht absorptie en moet worden vervangen of bijgevuld.
- Controleer de toestand van de ammoniak val en ademkalk en vervang indien nodig. Als de val van ammoniak is verbonden vervangen twee tegelijk, wanneer de tweede val tekenen van een kleurverandering toont, de eerste. Een toename van de CO-2 offset kan ook betekenen dat de noodzaak ter vervanging van de ademkalk.
Opmerking: Droogmiddel kan in een oven gedroogd en opnieuw gebruikt worden, maar we volgen de aanbevelingen van de fabrikant van het systeem te gebruiken verse telkens. - Het monteren van de kamers. Om dit te doen, plaats de trechter van voedsel op het evenwicht, dan plaatst u de vergaderzaal op de top met de geperforeerde platform dat de vloer van de kamer ingevoegd wordt. Zorgvuldig plaatst u de muisaanwijzer in de zaal en bevestig het deksel van het systeem met de voorkant en terug van clips en veilig voordat de waterfles positionering en bevestiging. Als voorzorgsmaatregel, moet u opnieuw alle kamer deksels, muizen en water (figuur 2A-D) controleren.
Opmerking: Afhankelijk van de grootte van de muizen bestudeerd, het kan noodzakelijk zijn om de hoogte van de ruimten boven de hopper voedsel zodat de muizen hebben toegang tot het eten maar niet genoeg ruimte die ze direct bovenop de feeder slapen kunnen. - Zoals het is aanbevolen dat de gas-sensoren voor elk experiment worden gekalibreerd, kalibreert u het systeem.
- Gebruik een gas van bekende samenstelling (0,5% CO2, 20,5% O2, evenwicht stikstof). De gastank kalibratie verbinden met het systeem via een regelgever en slang. Inschakelen en garanderen de tank output druk is het lezen van 5-10 psi.
Opmerking: Sommige systemen zal een tweede tank, slang en regelaar voor gebruik van zuivere stikstof als een "offset" gas hebben. Het systeem dat we opereren in plaats daarvan maakt gebruik van ademkalk voor het genereren van CO2 vrije lucht. - Volgt u de procedures voor het kalibreren van zowel de O-2 en CO2 sensoren. Selecteer "kalibratie" in het menu Extra en achtereenvolgens kalibreren zowel de O-2 en CO2. Voordat het kalibreren ervoor zorgen dat monster 1) en referentie-stromen zijn 0.400 LPM, 2) de Zirconia O2 sensor temperatuur is 725 ° C (± 1 ° C), 3) van het monster en verwijzing drogere en luchtpompen zijn op, en 4) het kalibratiegas is aangesloten en ingeschakeld.
- Indien nodig, bij het kalibreren van de O2 sensor, enigszins past u de offset regelaar op de voorkant van de zuurstofsensor zirconia om een O2 verhouding waarde van 1.0000 (± 0.0002). Dit is om ervoor te zorgen dat er binnen aanvaardbare grenzen (gemarkeerd in groen lettertype in het display van de software op het computerscherm).
- Na succesvolle O2 en CO2 sensor kalibratie, schakelt u de gasfles kalibratie en loskoppelen van de slang van de regulator. Na kalibratie, moeten O2 voor referentie lucht (atmosfeer) lezen 20.92 (± 00.02). Als kalibratie buiten tolerantie, herhalen, en verwijzen naar de gidsen van de fabrikant voor probleemoplossing. Bij gebreke hiervan, contact op met de fabrikant voor nadere instructies.
- Gebruik een gas van bekende samenstelling (0,5% CO2, 20,5% O2, evenwicht stikstof). De gastank kalibratie verbinden met het systeem via een regelgever en slang. Inschakelen en garanderen de tank output druk is het lezen van 5-10 psi.
- Doorgaan met experimentele opstelling. Selecteer "experimentele bestand openen" in het menu van het experiment. Selecteer de juiste sjabloon (bijvoorbeeld muis). Definieer de parameters van het experiment dat moet worden geregistreerd onder de 'setup' in het menu van het experiment (bijvoorbeeld muis ID, gewicht, groep, etc.) deselecteert u alle kamers niet in gebruik en selecteer de locatie voor het experiment om gered te worden.
- Zorg ervoor de schalen hebben zijn getarreerde als het meten van de voedselinname en beginnen met het vastleggen van gegevens door het selecteren van de "Looppas" in het menu van het experiment. Gegevens vastgelegd voor de verschillende lengtes van tijd afhankelijk van het fenotype, institutionele richtsnoeren inzake dierlijke isolatie en systeemgebruik.
Opmerking: In onze handen, het experiment wordt routinematig uitgevoerd gedurende 48 uur, met de eerste 24 h gebruikt als acclimatisatie aan de nieuwe omgeving en de tweede 24 h gebruikt voor data-analyse. De verzamelperiode is gebaseerd op hoe lang de onderzoeker wil houden hun muizen afzonderlijk gehuisvest en dierenethiek goedkeuring afhankelijk. Als alternatief, als bepalingen bestaan, muizen kunnen worden geacclimatiseerd in de kamers voorafgaand aan in het systeem worden geplaatst en aangesloten. Elke kamer is ongeveer eenmaal elke 13 min gemeten wanneer een 12 kamer-systeem in gebruik. - Regelmatig controleren en monitoren van de resultaten die zijn behaald, terwijl de muizen in het systeem zijn om het welzijn van dieren en dat passende gegevens worden verzameld. Elk onderwerp mei zitten kundig worden in dit stadium opgespoord en verholpen. Controleer op elke muis elke ochtend en avond wanneer zij in het systeem zijn.
- Controleer de metabole lusje bij de bovenkant van de pagina bestand gegevens voor de verzamelde gegevens in real-time voor elke muis met betrekking tot de zuurstof verbruik, RER en energie-uitgaven. Ondertussen, beam pauzes en voedselconsumptiegegevens kunnen worden gesitueerd in de tabbladen van de activiteit en voeding, respectievelijk. Controleer of de "O2 In" is het lezen van rond 20.90-20.94, de "CO2 In" is rond 0.040 - 0.050, de RER is tussen 0,7 en 1, en het debiet is constant op 0,5 - 0,6 L/min.
- Controleer dat de muizen toegang tot voedsel en water hebben en dat ze elk consumeren met regelmatige tussenpozen. Zorgen die geen tekenen van nood zoals de graven op de geperforeerde vloer niet demonstreren. Ook het controleren van de resultaten die worden weergegeven.
- Bij de voltooiing van de toegewezen experimentele tijd, selecteer "stop" menu van het experiment en de resultaten exporteren (als CSV-bestand, bestand > exporteren > genereren onderwerp CSV van) voor analyse.
- Inspecteer de gezondheid van de muizen, wegen en vervolgens terug te keren naar hun huis kooien.
- Muizen kunnen worden vijandig tegenover elkaar na scheiding, dus controleren zodra ze weer samen zijn gehuisvest.
- Demonteren van de kooien, het verwijderen van overtollig voedsel uit hoppers en tip ontlasting, urine, en voedsel van de kooien. Onderdompelen van de flessen en sippers in verdunde oplossing van de T-bac, geniet, en schoon van de andere componenten in een verdunde bleekwater oplossing. Spoelen met schoon water en lucht laat droog.
- Berekenen van metabole parameters met de software. De software maakt gebruik van een aantal vergelijkingen te verstrekken van de definitieve gegevens output4.
Voor de berekening van de zuurstof en de CO2-productie: zuurstofverbruik: VO2 (LPM)= VikO2i - VoO2o; Koolstofdioxide productie: VCO2 (LPM)= VoCO2o-VikCO2i
Waar: Vik = de input ventilatie tarief (LPM), V-o = de uitvoer ventilatie tarief (LPM), O2i = de O2 concentratie aan input, O2o = de O2 concentratie aan output, CO2i = de CO2 concentratie op input, CO2o = de CO2 -concentratie aan uitgang.
Voor de berekening van de RER: RER = VCO2 / VO2. Merk op dat eiwit oxidatie niet gemeten werd en daarom het gen niet werd gecorrigeerd voor dit.
Voor de berekening van energie-uitgaven: energie-uitgaven: CV = 3.815 + 1.232* RER
Warmte (Kcal/h)) = CV * VO2. Waar: CV is de calorische waarde (de relatie tussen de warmte en het volume van zuurstofverbruik). Dit is afgeleid van "The elementen van the Science of Nutrition" de tabel Lusk, samengesteld door Graham Lusk genoemd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De resultaten gezien in Figuur 3 weergegeven een typische verandering in samenstelling lichaamsparameters op hoge vet voeding, zoals gemeten via EchoMRI. Op basislijn was er geen verschil in elke parameter gemeten (figuur 3A-F). Echter na slechts 1 week hoge vet voeding, was er een aanzienlijke toename in lichaamsgewicht, vet massa, en massale vetpercentage in de HFD-groep (figuur 3A,B,D). De omvang van de verschillen tussen de twee groepen voor deze maatregelen blijven stijgen over het dieet van 3 weken. Vetvrije massa, gratis water en totale watergehalte (Figuur 3 c,E,F) niet verschillen tussen de groepen op elk punt van de tijd. Het kan ook worden gezien dat de chow gevoed muizen blijven zetten op gewicht over de onderzoeksperiode (figuur 3A), en dat dit was te wijten aan een toename in de vetvrije massa (Figuur 3 c) in plaats van een vet massa verhogen (figuur 3B).
Zoals te zien in Figuur 4, drie weken van hoge vet voeding geleid tot een aantal wijzigingen gedetecteerd in het metabole dier monitoringsysteem. VO2 wanneer niet gecorrigeerd voor lichaamsgewicht was significant hoger in de zwaardere hoog vet gevoed muizen (figuur 4A). Met name, resulteerde normalisering van VO2 via twee verschillende factoren in twee verschillende uitkomsten. Normalisatie tot totale lichaamsgewicht leidde tot geen verschil in VO2 tussen de standaard chow gevoed en hoog vet gevoed muizen, terwijl de normalisatie tot magere massa geproduceerd een significant verschil (figuur 4B,C). Deze resultaten tonen aan dat normalisering van VO2 gegevens door te delen door massale variabelen significant beïnvloed de resultaten, en voorzichtigheid moet worden betracht bij de interpretatie van VO2 gegevens wanneer het wordt uitgedrukt in een zodanige. Zie voor een gedetailleerde bespreking van hoe Express-VO2 gegevens en de effecten van verschillende parameters normaliseren de uitstekende discussie in Tschop, et al.. 5 in hun gids voor de analyse van muis energiemetabolisme, Tschop en collega's stellen voor het gebruik van de analyse van co variantie (ANCOVA) statistisch het ondervragen van de effecten van lichaamsgewicht of lichaamssamenstelling op energie-uitgaven en voedsel inname gegevens . In dit geval blijkt een ANCOVA wilt uitvoeren op de gegevens die worden weergegeven in figuur 4A, met behulp van lichaamsgewicht als de covariate, dat er geen statistisch significant verschil tussen de normale chow en HFD bestaat, dus die aangeeft dat zodra boekhouding voor lichaamsgewicht, er is geen verschil in zuurstofverbruik tussen de fracties. Dit resultaat kan gemakkelijk worden gevisualiseerd wanneer u VO2 tegen lichaamsgewicht uitzet als een scatterplot zoals weergegeven in Figuur 4 d. Plotten VO2 tegen lichaamsgewicht (Figuur 4 d) toont aan dat de VO2 gegevens bij de zwaardere dieren meer zuurstof verbruiken over een gemeenschappelijke gedragslijn ten opzichte van lichaamsgewicht, liggen. Van de nota, plotten VO2 tegen vetvrije massa toont aan dat de VO2 gegevens op twee verschillende lijnen ten opzichte van de vetvrije massa (figuur 4E liggen).
RER was beduidend lager in het hoge vet gevoed muizen, die vet gebruik aangeeft over koolhydraten gebruik bij toediening van de hoog vet dieet (figuur 5A). Energie-uitgaven (warmte) zonder normalisatie steeg in de zwaardere dieren, waarschijnlijk als gevolg van de dieren met meer metabolisch actief weefsel (figuur 5B), met dit verschil verloren eenmaal genormaliseerd naar lichaamsgewicht (figuur 5C). Merk ook op de stijging van de VO-2, RER en energie-uitgaven in de donker cyclus in vergelijking met de lichte cyclus wanneer de muizen actiever zijn. Deze verschillen vertegenwoordigen de klassieke dagelijkse wijzigingen in metabolisme die zich in muizen voordoen. Hoewel in dit voorbeeld hebben we de gegevens verdeeld in 12 h-blokken, opsplitsing van de gegevens verder in kleinere tijdperken van de tijd ook nuttig kan zijn. Fysieke activiteitenniveaus zijn ook een factor die bijdragen aan de energie-uitgaven. Deze waren niet verschillend tussen groepen, wat suggereert dat een afname van de beweging niet de bestuurder van de zwaarlijvige fenotype in het hoge vet gevoed muizen (figuur 5D was).
De andere kant van de energie-balans-vergelijking is de hoeveelheid energie die wordt verbruikt en het lichaam binnenkomt. Om te kijken naar dit aspect van het metabolisme geanalyseerd wij de hoeveelheid voedsel die de muizen verbruikt terwijl in het metabole dier monitoringsysteem. Zoals kan worden waargenomen in figuur 6A, aten de muizen dezelfde hoeveelheid voedsel zoals gemeten gewichts- of wanneer genormaliseerd naar lichaamsgewicht (figuur 6B). (ANCOVA kan opnieuw worden gebruikt om de impact van het lichaamsgewicht over de voeding.) Normalisering van de voedselinname te lichaamsgewicht kan een belangrijke stap te overwegen als energie-uitgaven ook op gewicht, dus elke kant van de vergelijking van de energie in evenwicht te houden heeft zijn genormaliseerd worden. Hoewel de muizen dezelfde hoeveelheid voedsel aten, is het belangrijk voor de energiedichtheid van elk van de diëten gebruikt ter verantwoording. Rekening houdend met deze factor, observeren we de muizen op de HFD verbruiken meer energie (Figuur 6 c) en van deze experimenten is het waarschijnlijk dat zulks zit toer de zwaarlijvige fenotype. Dat is, omdat de muizen nemen aan meer energie, maar ze zijn niet proportioneel besteden meer energie, hun obesitas kan worden toegeschreven aan energie-opslag.
Statistieken
Alle gegevens in dit document worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaardafwijking van het gemiddelde (SEM). Statistische significantie werd vastgesteld op p < 0.05. * geeft aan p < 0,05, ** geeft p < 0,01, *** geeft p < 0.001, en n = 6 per groep, tenzij aangegeven. De onderzoekers konden worden verblind de dieet groep interventie als gevolg van een verschil in kleur van de diëten. De muizen werden willekeurig gekozen over welke voeding zij werden gegeven.
Figuur 1 : Juiste plaatsing van de kosten van de muis en kleine dierlijke monsterhouder met muizen binnen het lichaam samenstelling analyzer. Het uitvoeren van de test van een systeem met behulp van een ijkstandaard (kosten) of voor het scannen van muizen binnen de kleine dierlijke monsterhouder, elk binnen de gantry van systeem. De rode pijlen geven de cilinder waarin de muizen zal deel uitmaken van het invoeren van de gantry van de machine.
Figuur 2 : Vergadering van afzonderlijke ruimten. A) de voedsel hopper plaatsen in het midden van het saldo. B) het platform invoegen in elke kamer kamer en plaats over de hopper. C) plaats van muizen in de kamers individueel en veilige deksel. D) plaatst u de fles water en zet vast.
Figuur 3 : Body samenstelling analyse meer dan 3 weken van een hoog vet dieet. A) lichaamsgewicht, B) vet massa, C) leun massa, D) vet massa percentage, E) gratis watergehalte, en F) total watergehalte. Circles vertegenwoordigen normale chow dieet, pleinen vertegenwoordigen HFD. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Metabole parameters metabole controle systeem dierproeven verkregen na 3 weken van de respectieve diëten. Muizen gehuisvest waren in de kamers voor 48 uur met de eerste 24 h fungeert als vertrouwd. De gegevens uit de tweede 24 h werd geanalyseerd en gepresenteerd in deze cijfers. A) Raw VO2 tarieven, B) VO2 genormaliseerd naar lichaamsgewicht C) VO2 genormaliseerd naar vetvrije massa, D) scatterplot voor niet-gecorrigeerde VO2 (totale 24u periode naar lichaam) wegen, t en E) niet-gecorrigeerde VO2 aan vetvrije massa. A-C Witte staven normale chow dieet, zwarte balken vertegenwoordigen hoog vet dieet. D-E Circles vertegenwoordigen normale chow dieet, pleinen vertegenwoordigen HFD. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : A) de ruilverhouding van de luchtwegen (RER), B) hitte (energie-uitgaven), en C) warmte genormaliseerd naar lichaamsgewicht. D) activiteitenniveaus berekend als de som van de ambulant X en Y dimlicht pauzes en Z lichtbundel pauzes. Witte staven normale chow dieet; zwarte balken vertegenwoordigen HFD.
Figuur 6 : Voedsel inname gegevens verkregen in het systeem voor de finale 24 h. A) voedselinname in gram, B) voedselinname genormaliseerd naar lichaamsgewicht en C) berekende energie-inname. n = 4-5 (3 muizen waren uitgesloten vanwege het maken van een grote puinhoop met hun eten). Witte staven normale chow dieet; zwarte balken vertegenwoordigen HFD. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritische stappen
De hierin beschreven protocollen bieden een voorbeeld van de wijze waarop aan de samenstelling van het lichaam van de maatregel en diverse metabole parameters in muizen met behulp van een lichaam samenstelling analyzer en een metabole dier monitoringsysteem. Voor beide technieken is het van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de machines optimaal werken, en om dit te doen, het absoluut noodzakelijk is dat de onderzoeker een test systeem voor het lichaam samenstelling analyzer voert en naar een bekende gassamenstelling voor de metabole kalibreert dierlijke controle systeem voorafgaand aan het gebruik van de apparatuur. Dit zorgt voor meer samenhang van resultaten en de mogelijkheid om op te sporen van potentiële problemen met de machine.
De manier waarop gegevens voor de metabole controle dierproeven is genormaliseerd is ook vitaal belang om de geldigheid van de resultaten van de techniek. Zoals aangegeven in onze representatieve resultaten (figuur 4A-E) VO2 kan worden gemeld op een aantal verschillende manieren: de absolute tarief (L/min), ten opzichte van het lichaamsgewicht van de muis (mL/kg * min), of ten opzichte van de vetvrije massa (mL/kgLBM * min) als deze gegevens beschikbaar is (bijvoorbeeld verkregen uit een lichaam samenstelling analyzer). Afhankelijk van het fenotype, kan het dienstig meer te normaliseren de waarden een bepaalde manier uit alle potentiële bias te sluiten. Bijvoorbeeld, als een dier heeft verhoogd lichaamsgewicht, ze hebben meer weefsel dat is beschikbaar en in staat om zuurstof verbruiken en natuurlijk hun energie-uitgaven is hoger. Normaliseren tot totale lichaam massa wellicht niet de beste optie als het zal bias naar de waarneming van een daling van zuurstofverbruik per eenheid van massa, hoewel het zuurstofverbruik van de weefsels niet afwijken. Als alternatief voor het normaliseren van lichaamsgewicht, kan een normaliseren met de vetvrije massa van de muis. Als mager weefsel massa is primair verantwoordelijk voor zuurstofverbruik, en vetvrije massa is meestal ongewijzigde of slechts bescheiden verschillend tussen experimentele groepen, normalisatie op deze manier kan een meer representatieve manier van uitdrukken VO2 gegevens. Opgemerkt moet worden dat de magere massa compartiment uit veel verschillende weefsels, allen met verschillende stofwisseling bestaat, en bijgevolg normalisatie op deze manier kan niet juist zijn of inzicht in welke magere massa component is het besturen van de wijzigen. Ook uitsluit het van de bijdrage van het vet massa onderdeel op metabolisme.
Gezien deze problemen, is een alternatieve statistisch gebaseerde methode ook voorgestelde5,6. Analyse van de covariantie () ANCOVA) is een statistische toets waarmee de vergelijking van een variabele (bijvoorbeeld energie-uitgaven) uit meerdere groepen terwijl correctie voor andere factoren of variabelen genoemd covariates. In deze wijze factoren zoals lichaamsgewicht, vetmassa en vetvrije massa kunnen worden opgenomen als variabelen die van invloed zijn energie-uitgaven, maar zelfs deze methode heeft zijn eigen specifieke veronderstellingen6, met inbegrip van het feit dat het gebruik van meerdere variabelen in ANCOVA te dreigt vervalt het tenzij de variabelen onafhankelijk van elkaar zijn. Er lijkt geen perfecte of universeel overeengekomen één manier om te normaliseren en VO2 of energie uitgaven gegevens te presenteren, het kan dienstig zijn voor het weergeven en presenteren van de gegevens op een aantal manieren om de duidelijkste beeld van het fenotype aan de lezer. Fysieke activiteitenniveaus kunnen verhogen zuurstofverbruik en dus in dieren die activiteit fenotypen (een toename of afname) hebben, kunnen ook moet rekening/normaliseren voor wijzigingen in beweging om te bepalen als dit geheel of gedeeltelijk kan rekening account voor elke wijziging in VO2.
Wijzigingen en probleemoplossing
De representatieve resultaten weergegeven in dit protocol werden verkregen uit experimenten uitgevoerd bij een kamertemperatuur van 21-22 ° C. De thermoneutral zone van een muis is ongeveer 30 ° C, zodat in een traditionele dierlijke huis met de temperatuur instellen tot 20-22 ° C voor menselijke comfort, een muis is onder thermische stress. Om dit tegen te, wordt niet-rillen thermogenese geactiveerd bij deze koudere temperaturen, wat resulteert in een omhoog tot een 2-fold stijging van de energie-uitgaven tussen muizen gehuisvest bij 20 ° C in vergelijking met die ondergebracht bij 30 ° C7. Het milieu huisvesting van muizen is een belangrijke overweging voor deze experimenten is gebleken dat de huisvesting van muizen op thermoneutrality de ontwikkeling van een aantal voorwaarden versterken kan zoals atherosclerose8 en hoog vet dieet-geïnduceerde 9van de pathogenese van non-alcoholische vette leverziekte (NAFLD). Omgevingstemperatuur is daarom ook een belangrijke overweging bij het uitvoeren van experimenten in een metabole dier controlesysteem, zoals een fenotype aanwezig zijn bij bepaalde temperaturen kunnen maar niet bij anderen, die kunnen op een potentiële mechanisme van wijzen zou actie. Een dergelijk scenario zou een fenotype waarbij de activering van de aangeworven beige vet, waarbij een grotere hoeveelheid van dit weefsel voor een grotere stijging van de thermogenese onder koeler voorwaarden10 zorgt. Dus kan het nodig zijn om te wijzigen de milieu instellen die beschreven in deze huidige experimenten en uit te voeren van de experimenten onder meerdere milieu temperaturen is te krijgen van een nauwkeurige voorstelling van de werkelijke metabole status van het model. Voor het oplossen van problemen als gevolg van technische fouten, wellicht contact opnemen met de fabrikanten rechtstreeks voor instructie. Als er problemen zijn met dit soort lichaam samenstelling analyzer is het aanbevolen om een Herhaal scant test uitvoert, die loopt van 25 scans tegen de kosten. Het bedrijf heeft deze gegevens nodig voor de diagnostiek. Op dezelfde manier met de metabole dierlijke systeem van toezicht, als er zich problemen voordoen, verzamelen de gegevensbestanden van de laatste keer dat het systeem goed werkte en de bestanden uit wanneer de problemen ontstaan zodat steun een waarschijnlijke diagnose kunnen.
Beperkingen
Terwijl het lichaam samenstelling analyzer uitstekende gegevens over hele lichaam vet accumulatie biedt, staat het niet toe voor de bepaling van regionaal obesitas depots. Dit is belangrijk op het gebied van obesitas onderzoek, aangezien niet alle vet is hetzelfde, met de locatie die het vet heeft opgelopen en de functionele eigenschappen wordt bijzonder belangrijk. Inderdaad, de beschermende effecten van onderhuids vet depots (of metabolisch gezond vet) geweest beschreven11. Micro-berekend tomografie (micro-CT) kan onderscheid maken tussen subcutane en viscerale vet12, mogelijk van magnetische resonantie beeldvorming (MRI) analyse13. Gebruik van deze technieken kan nadere informatie op de site van obesitas accumulatie. De metabole dier controlesysteem ook heeft zijn beperkingen. Terwijl de totale dagelijkse energie-uitgaven kan worden gemeten, is het systeem niet kunnen onderscheiden tussen de verschillende componenten die deel van energie-uitgaven uitmaken. Een verdere beperking van het systeem is dat het is mogelijk dat obesitas zonder een meetbare afname van de energie-uitgaven via deze soorten systemen, zelfs onafhankelijk van voedsel/energie-inname wijzigingen gedetecteerd ontwikkelen kan. Studies hebben aangetoond dat kleine dalingen van energie-uitgaven, die aanzienlijke genoeg te veroorzaken van doorslaggevende invloed krijgen op de lange termijn, over de korte termijn14,15, krachtig in dergelijke metabole systemen kunnen niet worden gedetecteerd 16. Hoewel we een n 6 per groep in de huidige studie gebruikt hebben om aan te tonen van deze methodologie als een voorbeeld studie, vereist voor het detecteren van kleine verschillen in de energie-uitgaven die aan obesitas waarschijnlijk bijdragen kunnen veel meer muizen5. Vooruitgang in de resolutie voor detection in deze systemen en de mogelijkheid om deze soorten studies uit te voeren over een langere periode zal steun in het vermogen om deze kleine maar belangrijke wijzigingen te herkennen. We hebben met betrekking tot de meting van de voedselinname, meestal waargenomen dat 24u voedselinname in muizen gehuisvest binnen het metabole dier monitoringsysteem is lager dan in de kooi zou worden waargenomen, waarschijnlijk als gevolg van de redenen zoals hierboven besproken. Dus, naast het controleren van de voedselinname in dit systeem, beoordelen we bovendien voedselinname in de home kooien van muizen. Terwijl dit alleen in een situatie waar muizen van bepaalde experimentele groepen afzonderlijk worden gehuisvest gebeuren kan, heeft het voordeel dat in de buurt van permanente dagelijkse evaluatie. De onderzoeker gewoon weegt de hoeveelheid voedsel in de bak op een bepaald tijdstip van de dag, altijd goed voor voedsel verspreid over de kooi, en vervolgens verdeelt deze totale hoeveelheid voedsel geconsumeerd door het aantal muizen in de kooi aanwezig.
Toekomstige toepassingen
Terwijl binnen dit overzicht we obesitas verworven via hoog vet voeding als een voorbeeld van een staat van de ziekte waar meting lichaamssamenstelling en metabole parameters nuttig zijn, dat het gebruik van deze apparatuur is verre van beperkt tot dit onderzoeksveld gebruikt hebben. Het gebruik van deze technieken is ook waardevol wanneer studeren ziekten zoals diabetes, hart-en vaatziekten, leeftijdsgebonden sarcopenie, broosheid, kanker-cachexia, muscular dystrophie en lipodystrofie. Terwijl de initiële kosten van de aankoop van dergelijke infrastructuur is groot, de mogelijkheid om het gebruik van de apparatuur over meerdere en divers gebied van medisch onderzoek matigt deze initiële kosten. Bovendien zijn lopende reagens en verbruiksgoederen kosten minimaal voor deze machines; preventief onderhoud en onderhoud moeten echter worden beschouwd en begroot.
Net zo min als magere massa verkregen via lichaam samenstelling analyse kan een factor belangrijk normalisatie voor zuurstofverbruik afgeleid van het metabole dier controlesysteem, kan bepaling van de magere massa ook worden gebruikt om te normaliseren drugtest/doseringen. Bijvoorbeeld, in metabole studies is het alledaags een intraperitoneaal of orale glucose tolerantie test (GTT), of een intraperitoneaal insuline tolerantie test (ITT) uit te voeren. Deze tests onderzoeken de mogelijkheid van een muis te ontdoen van een lading van glucose of reageren op insuline. Wijzigingen in de niveaus van de glucose van het bloed in reactie op deze tests geeft informatie over het niveau van gehele lichaam glucose en insuline tolerantie in het model. Traditioneel, is de bolus van het glucose en insuline toegediend bij deze proeven gedoseerd volgens het lichaamsgewicht van de muis. Echter als modellen van obesitas vet massa in de vetvrije massa accumuleren, kan doseren per lichaamsgewicht vertekening het zwaardere model naar glucose-intolerantie in een GTT als zij meer glucose ontvangen. Dit is de wijten aan het feit dat de lever, de skeletspieren en de hersenen, organen die beschikken over het merendeel van de glucose in de postprandiale staat17, zijn onderdelen van de lean massameting en zelden of mild wijzigen in de meeste modellen. In een ITT wanneer gedoseerd aan lichaamsgewicht, lijkt een zwaarder model dat zou meer insuline daarentegen gevoeliger voor de effecten van insuline te verlagen, puur omdat het heeft gekregen een grotere hoeveelheid glucose. Als de onderzoeker toegang tot lichaam samenstellingsgegevens heeft kan de vetvrije massa dus de meest geschikte maatregel, in tegenstelling tot de massa van het gehele lichaam, voor dergelijke dosering berekeningen18. Nemen dit verdere, kan magere massa gegevens die zijn verkregen uit lichaam samenstelling analyse ook worden gebruikt om de dosis experimentele drugs als de behoefte ontstaan aan account voor vetvrije massa op de uitsluiting van vet massa. Een andere toepassing van het metabole dier monitoringsysteem dat is niet besproken of aangetoond in dit manuscript is verbonden met die een ingesloten gemotoriseerde loopband naar het systeem zodat de metabole parameters hierin besproken kan ook worden gemeten tijdens oefening.
De procedures die worden beschreven in dit overzicht kunnen worden gebruikt om te karakteriseren lichaamssamenstelling en diverse metabole parameters in muizen. Deze maatregelen zijn van toepassing op een groot aantal onderzoeksgebieden en belangrijke informatie voor de karakterisering van een fenotype kunnen verschaffen. Via deze methoden verkregen gegevens kunnen ook bewijzen naar onderliggende mechanismen rijden een bijzondere metabole fenotype. Verdere ontwikkeling en verfijning van deze technologieën kunnen onderzoekers om hun bevindingen naar therapeutische resultaten vooruit te gaan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken het personeel van de Alfred medisch onderzoek en onderwijs Precinct Animal Services (AMREP AS) team voor hun hulp en verzorging van de muizen in deze studie gebruikt en voor de steun van de operationele infrastructuur ondersteunen regeling van de Victoriaanse staat Regering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 in 1 system | EchoMRI | 4 in 1 system | Whole body composition analyser |
| Canola oil test sample (COSTS) | EchoMRI | Mouse-specific (contact company for cat number) | |
| Animal specimen holder | EchoMRI | 103-E56100R | |
| Delimiter | EchoMRI | 600-E56100D | |
| 12 chamber system | Columbus Instruments | Custom built | Metabolic Caging System; includes control program |
| Drierite | Fisher Scientific | 238988 | CLAMS consumable |
| Calibration gas tank | Air Liquide | Mixed to order | Gas calibration (0.5% CO2, 20.5% O2, balance nitrogen). |
| Normal chow diet | Specialty Feeds | Irradiated mouse and rat diet | |
| High fat diet | Specialty Feeds | SF04-001 | |
| Balance | Mettler Toledo | PL202-S | Balance for weighing mice |
| TexQ Disinfectant spray | TexWipe | ||
| Hydrogen Peroxide cleaning solution | TexWipe | TX684 |
References
- Chen, W., Wilson, J. L., Khaksari, M., Cowley, M. A., Enriori, P. J. Abdominal fat analyzed by DEXA scan reflects visceral body fat and improves the phenotype description and the assessment of metabolic risk in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 303 (5), E635-E643 (2012).
- Kovner, I., Taicher, G. Z., Mitchell, A. D. Calibration and validation of EchoMRI whole body composition analysis based on chemical analysis of piglets, in comparison with the same for DXA. Int J Body Compos Res. 8 (1), 17-29 (2010).
- EchoMRI. Software User Manual: Whole body composition analyzer. , (2016).
- Columbus Instruments. Oxymax for Windows User Manual. , September (2014).
- Tschop, M. H., et al. A guide to analysis of mouse energy metabolism. Nat Methods. 9 (1), 57-63 (2011).
- Speakman, J. R. Measuring energy metabolism in the mouse - theoretical, practical, and analytical considerations. Front Physiol. 4, (2013).
- Swoap, S. J., et al. Vagal tone dominates autonomic control of mouse heart rate at thermoneutrality. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (4), H1581-H1588 (2008).
- Tian, X. Y., et al. Thermoneutral housing accelerates metabolic inflammation to potentiate atherosclerosis but not insulin resistance. Cell Metab. 23 (1), 165-178 (2016).
- Giles, D. A., et al. Thermoneutral housing exacerbates nonalcoholic fatty liver disease in mice and allows for sex-independent disease modeling. Nat Med. 23 (7), 829-838 (2017).
- Lee, M. W., et al. Activated type 2 innate lymphoid cells regulate beige fat biogenesis. Cell. 160 (1-2), 74-87 (2015).
- Kusminski, C. M., et al. MitoNEET-driven alterations in adipocyte mitochondrial activity reveal a crucial adaptive process that preserves insulin sensitivity in obesity. Nat Med. 18 (10), 1539-1549 (2012).
- Judex, S., et al. Quantification of adiposity in small rodents using micro-CT. Methods. 50 (1), 14-19 (2010).
- Chaurasia, B., et al. Adipocyte ceramides regulate subcutaneous adipose browning, inflammation, and metabolism. Cell Metab. 24 (6), 820-834 (2016).
- Matthews, V. B., et al. Interleukin-6-deficient mice develop hepatic inflammation and systemic insulin resistance. Diabetologia. 53 (11), 2431-2441 (2010).
- Tschop, M., Smiley, D. L., Heiman, M. L. Ghrelin induces adiposity in rodents. Nature. 407 (6806), 908-913 (2000).
- Garcia, M. C., et al. Mature-onset obesity in interleukin-1 receptor I knockout mice. Diabetes. 55 (5), 1205-1213 (2006).
- Kowalski, G. M., Bruce, C. R. The regulation of glucose metabolism: Implications and considerations for the assessment of glucose homeostasis in rodents. Am J Physiol Endocrinol Metab. 307 (10), E859-E871 (2014).
- McGuinness, O. P., Ayala, J. E., Laughlin, M. R., Wasserman, D. H. NIH experiment in centralized mouse phenotyping: the Vanderbilt experience and recommendations for evaluating glucose homeostasis in the mouse. Am J Physiol Endocrinol Metab. 297 (4), E849-E855 (2009).
